PARTENERI STROMALI IMPLICAłI ÎN ANGIOGENEZA DIN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE: STUDIU HISTOPATOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA TEZĂ DE DOCTORAT REZUMAT PARTENERI STROMALI IMPLICAłI ÎN ANGIOGENEZA DIN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE: STUDIU HISTOPATOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC Doctorand: CIUREA RALUCA NICULINA Conducător ştiinńific: Prof.Univ.Dr. SIMIONESCU CRISTIANA EUGENIA CRAIOVA 2011

2 CUPRINS INTRODUCERE 6 PARTEA GENERALĂ (STADIUL CUNOAŞTERII) CAPITOLUL I HISTOLOGIA ŞI HISTOFIZIOLOGIA MUCOASEI BUCALE 9 I.A. Histologia cavităţii bucale 9 I.B. Histofiziologia mucoasei orale 18 I.C. Markeri imunohistochimici ai structurilor normale ale mucoasei orale 20 CAPITOLUL II MECANISMUL CARCINOGENEZEI ORALE. FACTORI DE RISC AI CARCINOGENEZEI ORALE 21 II.A. Mecanismul carcinogenezei orale 21 II.B. Factori de risc ai carcinogenezei orale 25 CAPITOLUL III ANGIOGENEZA ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE 34 III.A. Date generale privind angiogeneza normală şi tumorală 34 III.B. Factori implicaţi în angiogeneza tumorală din carcinoamele scuamoase Orale 37 III.B.1. Factori proangiogeni implicaţi în angiogenza tumorală din carcinoamele scuamoase orale 38 III.B.2. Factori antiangiogeni implicaţi în angiogeneza tumorală din carcinoamele scuamoase orale 39 III.B.3. Parteneri stromali ai angiogenezei tumorale 40 III.C. Implicaţii diagnostice şi prognostice ale angiogenezei în patologia tumorală orală 42 OBIECTIVELE STUDIULUI 46 PARTEA SPECIALĂ (CONTRIBUŢII PROPRII) CAPITOLUL IV MATERIAL ŞI METODE 49 IV.A. Materialul cercetat 49 IV.B. Metode utilizate 50 CAPITOLUL V REZULTATE 58 V.A. Studiul histopatologic al carcinoamelor scuamoase orale 58 V.B. Studiul imunohistochimic al patenerilor celulari stromali în angiogeneza din carcinoamele scuamoase orale 90 V.B.1. Analiza elementelor stromale celulare (macrofage şi mastocite) şi vasculare la nivel intratumoral şi al frontului de invazie 91 V.B.1.1. Analiza densităţii şi a distribuţiei vaselor de sânge 91 V.B.1.2. Analiza densităţii şi a distribuţiei macrofagelor 96 V.B.1.3. Analiza densităţii şi a distribuţiei mastocitelor 102 V.B.2. Analiza elementelor stromale, a factorului de creştere vasculo-endotelial (VEGF) şi a receptorilor 1 şi 2 acestuia (VEGFR1 şi VEGFR2), la nivel intratumoral şi al frontului de invazie 110 2

3 V.B.2.1. Analiza imunomarcajului pentru VEGF 110 V.B.2.2. Analiza imunomarcajului pentru VEGFR1 şi VEGFR2 113 V.B.2.3. Studiul expresiei VEGF şi a receptorilor săi (VEGFR1 şi VEGFR2) şi a distribuţiei mastocitelor şi a macrofagelor 116 CAPITOLUL VI DISCUŢII 127 VI.A. Discutii asupra studiului histopatologic al carcinoamelor scuamoase orale 127 VI.B. Discuţii asupra studiului imunohistochimic al partenerilor celulari stromali în angiogenezei din carcinoamele scuamoase orale 143 VI.B.1. Analiza elementelor stromale, celulare şi vasculare, la nivel intratumoral şi al frontului de invazie 143 VI.B.2. Analiza elementelor stromale, a factorului de creştere vasculo-endotelial şi a receptorilor 1 şi 2 ai acestuia, la nivel intratumoral şi al frontului de invazie 151 CAPITOLUL VII CONCLUZII 159 BIBLIOGRAFIE 164 3

4 INTRODUCERE Interacţiunea tumoră-gazdă este o caracteristică complexă a progresiei tumorale şi un obiectiv ce în ce mai important al strategiilor anticanceoase. Aceasta implică interacţiunea între celulele canceroase, celulele imune efectoare şi celule inflamatorii, precum şi cu celulele stromale şi vascularizaţia tumorilor. Celulele neoplazice sunt influenţate de micromediul tumoral şi viceversa. Numeroase studii sugerează că micromediul tumoral specific din diferite structuri este capabil să influenţeze mai multe evenimente în cadrul progresiei tumorale, cum ar fi creşterea, moartea, diferenţierea, expresia genelor, migrarea şi invazia tumorală. Angiogeneza, factor important de prognostic în mai multe tumori, este un eveniment complex mediat de factorii angiogenici eliberaţi din celulele canceroase şi celulele imune al gazdei. Un rol important par să joace interrelaţiile celulelor tumorale cu diferiţii constituenţi celulari ai stromei înconjurătoare (micromediul tumoral), contibuind şi ele în acest mod la inducerea indirectă a angiogenezei. Între celulele tumorale şi creşterea stromei tumorale este iniţiată o relaţie bidirecţională, care favorizeaza creşterea tumorală. Acest aspect a fost raportat ca fiind asociat cu progresia, agresivitatea şi metastazele diferitelor tumori maligne, inclusiv carcinoamele scuamoase orale. Evenimentele inflamatorii pot crea un micromediu local capabil de promovarea creşterii şi progresiei tumorale. Celulele tumorale şi/sau celulele micromediului tumoral, răspund la hipoxia tumorală prin necroză, inflamaţie şi eliberarea unui număr de factori de creştere şi citokine, care sunt chemoatractive pentru monocite şi macrofage. La rândul lor, macrofagele secreta factori de creştere care afectează celulele tumorale sau endoteliul vaselor tumorale şi promovează recrutarea de celule inflamatorii secundare, cum ar fi mastocitele şi neutrofilele. La rândul lor celulele tumorale sprijină progresia prin susţinerea procesului inflamator si secreta citokine proangiogenice şi protumorigene. Menţionez că prezentul studiu a fost sustinut financiar cu fonduri provenite din următoarele proiecte de cerectare: Studiul angiogenezei si limfangiogenezei in carcinoamele scuamoase orale, Program Idei, cod CNCSIS 155, contract 257/ , finantat MEC-ANCS, director de grant Conf. Univ.Dr. MARGĂRITESCU Claudiu, perioadă de desfăşurare: septembrie septembrie Markeri proangiogeni şi antiangiogeni implicaţi în angiogeneza din carcinoamele scuamoase orale, Proiect tip Tineri Doctoranzi, cod CNCSIS 145, , director proiect Drd. CIUREA Raluca Niculina, perioadă de desfăşurare: septembrie septembrie

5 ANGIOGENEZA ÎN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE FACTORI IMPLICAŢI ÎN ANGIOGENEZA TUMORALĂ DIN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE Formarea "vascularizaţiei asociate tumorii", este denumit angiogeneză tumorală, proces esenţial pentru progresia tumorii. Angiogeneza tumorală este rezultatul unui dezechilibru între factorii pozitivi şi negativi angiogenici produse de ambele celulele tumorale şi gazdă [132]. FACTORI PROANGIOGENI IMPLICAŢI ÎN ANGIOGENZA TUMORALĂ DIN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE Factori proangiogeni cu acţiune directă. Printre proangiogenii direcţi se numără VEGF (factorul de creştere al endoteliului vascular) şi angiopoietinele 1 si 2. Conform nomenclaturii actuale, se recunosc trei tipuri de receptori VEGF tirozin-kinazici:vegfr-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1) şi VEGFR-3 (Flt-4). VEGF-ul acţionează specific pe celulele endoteliale vasculare producând: inducerea proliferării şi migrării celulelor endoteliale, precum şi permeabilizarea microvascularizaţiei, fiind de de ori mai potentă decât histamina. În acest fel facilitează fenomenul de neoangiogeneză în carcinoamle scuamoase orale. [5; 34; 84; 97]. PARTENERI STROMALI AI ANGIOGENEZEI TUMORALE Angiogeneza este un eveniment complex mediat de factorii angiogenici eliberaţi din celulele canceroase şi celulele imune al gazdei. Un rol important par să joace interrelaţiile celulelor tumorale cu diferiţii constituenţi celulari ai stromei înconjurătoare (micromediul tumoral), contibuind şi ele în acest mod la inducerea indirectă a angiogenezei. Macrofagele observate frecvent în stroma neoplaziilor maligne, au rol în medierea angiogenezei tumorale, în creşterea tumorală, în formarea stromei, metastazare şi degenerarea celulelor maligne. Rolul lor în angiogeneză este complex, prin producerea de factori proangiogeni, peste 20 de substanţe care stimulează proliferarea, migrarea şi diferenţierea celulelor endoteliale. Pot modula angiogeneza influenţând compoziţia matricii extracelulare şi în acest fel morfologia celulelor endoteliale şi creşterea neocapilarelor [107]. În carcinoamele scuamoase orale, celule neoplazice atrag monocitele circulante şi le activează devenind macrofage care secretă o serie de factori proangiogeni şi în plus secretă citochine ce acţionează într-o manieră paracrină asupra celulelor tumorale stimulând producerea unor nivele crescute de IL-8 şi VEGF [107;108]. Mastocitul pare a fi un promotor al angiogenezei normale şi tumorale, inclusiv în carcinoamele scuamoase orale [41]. Factori angiogenici inclusiv VEGF, bfgf şi factorul de creştere derivat din trombocite, au fost raportaţi ca stimulatori ai migrării mastocitare. Hipoxia ar putea determina celulele tumorale să elibereze factori angiogenetici, care la rândul lor ar putea determina mastocitele să migreze în zonele hipoxice ale tumorii. După migrarea în zonele hipoxice, mastocitele ar putea produce factori angiogenici care stimulează infiltrarea sporită cu mastocite [132]. 5

6 OBIECTIVELE STUDIULUI Cancerele orale reprezintă o problemă majoră de sănătate în lume datorită incidenţei crescute şi a ratei reduse de supravieţuire, precum şi prin defectele funcţionale şi cosmetice ce însoţesc boala şi tratamentul ei. Studiul propus urmăreşte stabilirea ratei expresiei principalilor factori proangiogeni şi a receptorilor lor ţintă cu valoare prognostică în carcinogeneza orală. prin studiul fenomenului de angiogeneza al carcinoamelor scuamoase orale care vizeaza identificarea celor mai importanţi factori proangiogeni implicaţi în carcinogeneza orală. Tema abordată este de mare actualitate ce decurge din necesitatea introducerii unor terapii cu agenţi antiangiogeni a căror ţintă este microvascularizaţia tumorală. Principalele obiective şi cele derivate ale prezentului studiu includ: 1. Analiza principalilor parametri clinici şi morfologici ai carcinoamelor scuamoase orale: studiul parametrilor clinci: sex, vârstă, topografie, factori de risc. studiul parametrilor morfologici: dimensiunile tumorilor, forma histopatologică, gradul de diferenţiere, profunzimea şi patternul invaziei, prezenţa/absenţa metastazelor, invazia marginilor de rezecţie chirurgicală, stadiul tumoral. 2. Stabilirea corelaţiilor semnificative statistic între parametrii clinici şi morfologici investigaţi; 3. Caracterizarea fenotipului angiogen al carcinoamelor scuamoase orale cu grade variate de diferenţiere: identificarea tipului de vase şi a gradului lor de maturare la nivel intratumoral şi al frontului de invazie, analiza comparativă a densităţii şi a distribuţiei vaselor la nivel intratumoral şi al frontului de invazie. 4. Identificarea relaţiei dintre elementele celulare stromale şi neovasele tumorale în carcinoamele scuamoase orale: analiza densitatăţii şi distribuţiei macrofagelor la nivel intratumoral şi al frontului de invazie, analiza densitatăţii şi distribuţiei mastocitelor la nivel intratumoral şi al frontului de invazie, stabilirea corelaţiilor semnificative statistic între elementele celulare (macrofage şi mastocite) şi cele vasculare, la nivel intratumoral şi al frontului de invazie. 5. Analiza gradului de implicare al elementelor celulare stromale în angiogeneza din carcinoamele scuamoase orale: analiza relaţiei macrofag - VEGF/VEGFR1/VEGFR2, analiza relaţiei mastocit - VEGF/VEGFR1/VEGFR2. 6. Stabilirea corelaţiilor semnificative statistic dintre elementele stromale, celulare şi vasculare, precum si cu parametrii clinici şi morfologici investigaţi. 6

7 MATERIAL ŞI METODE A. MATERIALUL CERCETAT Prezentul studiu a fost realizat pe o perioada de 4 ani, între anii , şi a cuprins un total de 372 de carcinoame scuamose orale. Materialul cercetat a fost reprezentat de material uman provenit de la pacienţi internaţi în Clinica de Chirurgie Oro-Maxilo-Facială a Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova. Pentru cazurile retrospective am utilizat şi blocurile de parafină din histoteca Laboratorului de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova. Pentru intervalul de timp luat în studiu s-au înregistrat un număr de 372 pacienţi diagnosticaţi cu neoplazii ale mucoasei orale. Din totalul de 372 de cazuri cu diagnosticul clinic de neoplazie a mucoasei orale cu diferite localizări, un număr de 115 cazuri au fost diagnosticate pe fragmente recoltate prin puncţie biopsică, iar 257 cazuri au fost diagnosticate pe piese de exereză chirugicală. B. METODE UTILIZATE Piesele de exereză chirurgicală şi fragmentele bioptice au fost prelucrate în Laboratorul de Anatomie Patologica al Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova conform tehnicii histopatologice uzuale. Prelucrarea fragmentelor s-a făcut cu ajutorul procesorului automat de tesuturi (HMS 760, Microm), apoi au fost colorate standard cu Hemalaum-Eozină şi în funcţie de caz, prin tehnici speciale de coloraţie speciale (Giemsa, albastru alcian safranină). Tehnica imunohistochimică s-a realizat pentru un lot de 60 de cazuri, utilizând ca metodă de lucru sistemul ABC (metoda complexelor streptavidină-biotină). În cazul reacţiilor imunohistochimice simple am utilizat LSAB+ System-HRP (DAKO, cod K0690). Developarea s-a realizat cu DAB (diaminobenzidină), marcajele fiind de culoare brună. Pentru reacţiile imunohistochimice duble şi pentru recţiile mixte, histochimice şi imunohistochimice, am utilizat LSAB 2 System-AP (DAKO, cod K0674), iar pentru developare am folosit BCIP/NBT (bromo-cloro-iodoxilfosfat şi nitro-blue-tetrazolium clorid), astfel că în aceste cazuri marcajul a avut culoarea albastru-închis sau Permanent Red, cu marcaj de culoare roşie. Perechile de anticorpi pentru care a fost realizată reacţia dublă, tipul reacţiei (imunohistochimică sau histochimică - imunohistochimică) şi scopul urmărit, sunt reprezentate de (tabel nr. 3): 7

8 Anticorpi Reacția Scopul CD105/ CD68 imunohistochimică Evaluare densitatii macrofagelor si corelarea cu densitatea vaselor CD105/triptază imunohistochimică Evaluare densitatii mastocitelor si corelarea cu densitatea vaselor VEGF-CD68 imunohistochimică Cuantificarea macrofagelor VEGF+ VEGF- imunohistochimică Cuantificarea mastocitelor VEGF+ TRIPTAZĂ VEGFR1-CD68 imunohistochimică Cuantificarea macrofagelor VEGFR1+ VEGFR1- TRIPTAZĂ imunohistochimică Cuantificarea mastocitelor VEGFR1+ VEGFR2-CD68 imunohistochimică Cuantificarea macrofagelor VEGFR2+ VEGFR2- imunohistochimică Cuantificarea mastocitelor VEGF+ TRIPTAZĂ VEGF/AAS histochimică/ Cuantificarea mastocitelor VEGF+ imunohistochimică VEGFR1/AAS histochimică/ imunohistochimică Cuantificarea mastocitelor VEGFR1+ VEGFR2/AAS histochimică/ imunohistochimică Cuantificarea macrofagelor VEGFR2+ Tabel nr. 3. Reacţiile duble folosite în investigarea morfologiei vaselor sanguine, precum şi a expresiei unora din factorii proangiogeni Am utilizat un tip particular de sistem peroxidazo-catalitic pentru detectarea vaselor neoformate (CD105) (CSA II Biotin Free Tyramide Signal Amplification, DAKO, cod K1497. Analiza imunohistochimică a urmărit expresia endoglinei (CD105) la nivelul celulelor endoteliale ale vaselor nou formate şi imunoexpresia VEGF şi a receptorilor săi -R1 şi -R2, precum şi relaţia acestora cu macrofagele şi mastocitele evidenţiate prin marcaje specifice (CD68, respectiv Triptaza). Pentru interpretarea reacţiilor obţinute am utilizat o cuantificare calitativă a factorului de creştere endotelial şi a receptorilor săi (VEGF,-R1, -R2) la nivel tumoral (marcaje simple) şi la nivelul unor elemente stromale (marcaje duble), în aceste cazuri fiind vorba despre colocalizări ale semnalului (slabă, moderată, intensă): Analiza morfometrică s-a realizat în scopul cuantificării vaselor de neoformaţie şi a elementelor stromal prin metoda hot spot. Rezultatul final a fost reprezentat de media aritmetică a vaselor din zonele selectate. Am utilizat softul de morfometrie tip cell- D+Particle Analysis care permite scanarea şi determinarea densităţii vasculare pe toată aria secţiunii. 8

9 REZULTATE A. STUDIUL HISTOPATOLOGIC AL CARCINOAMELOR SCUAMOASE ORALE Repartiţia pe ani calendaristici a celor 372 de carcinoame scuamoase orale examinate a relevat ca repartiţia cazurilor a fost relativ egală în primii trei ani luaţi în studiu. Incidenţamaximă a cazurilor a fost înregistrată în anul 2006, cu 102 cazuri (27,42%) Analizând repartiţia carcinoamelor scuamoase luate în studiu în funcţie de grupele de vârstă, am observat că tumorile au fost diagnosticate la pacienţi cu vârsta cuprinsă într-un interval larg, între decadele a II-a si a X-a de viaţă (tabel nr. 6). Grupe de varstă Nr. cazuri Procente % < > Tabel nr. 6. Repartiţia carcinoamelor orale pe grupe de vârstă Incidenţa pe sexe a leziunilor, a relevat o predominenţă netă a afecţiunilor la sexul masculin la care am găsit 299 din cele 372 de carcinoame orale luate în studiu. Dintre factorii de risc implicaţi în carcinogeneza orală, am putut obţine informaţii referitoare la fumat şi la consumul de alcool, asocierea acestor doi factori de risc. si despre leziuni preexistente la nivelul mucoasei cavităţii orale (tabel nr. 8). Factori de risc Fumat Alcool Asocieri Leziuni preexistente Nr. cazuri Procente% Tabel nr.8 Repartiţia cazuisticii în funcţie de factorii de risc Alt parametru analizat a fost localizarea leziunilor. Majoritatea tumorilor analizate au avut originea la nivelul buzelor (46,77) (tabel nr. 9). Localizare Buză Gingie Limbă Palat Planşeu Numar de cazuri Procente % Tabel nr. 9. Repartiţia leziunilor în funcţie de topografie Un alt parametru pe care l-am luat în calcul a fost dimensiunea tumorilor. Diametrul maxim tumoral s-a putut aprecia pentru doar 242 de cazuri, deoarece pentru restul de cazuri 9

10 s-au practicat doar biopsii în scop diagnostic, obţinându-se fragmente de 0,5-1 cm (tabel nr.10). Dimensiuni 2 cm (T1) 2-4 cm (T2) 4 cm (T3) 4 cm (T4) Nr cazuri Procente% Tabel nr.10 Repartiţia cazuisticii în funcţie de dimensiunile maselor tumorale Analiza tabelelor de incidenţă a arătat o corelaţie înalt semnificativă între localizarea labiala şi categoriile T1-T2 (p=0,027, chi pătrat = 4,912, pentru un grad 1 de liberatate), care a depăşit pragul intervalului de încredere de 95% (OR=3,14). Testul exact al lui Fisher a avut valoarea de 0,03, semnificând o corelaţie pozitivă între parametrii analizaţi. Localizarea linguală s-a corelat înalt semnificativ cu categoriile T3-T4 (chi pătrat=15,85, p=0,00), depăşind pragul de încredere de 95% (OR=6). Studiului histopatologic al celor 372 de carcinoame scuamoase a vizat aprecierea următorilor parametri: varietatea carcinomului scuamos, gradul de diferenţiere, stadiul progresiei tumorale, prezenţa celulelor maligne reziduale la nivelul marginilor de siguranţă chirurgicale. Pentru încadrarea histopatologică am utilizat tipizarea recomandată de World Health Organization (tabel nr. 13). Tipul carcinomului Cheratinizat Necheratinizat Adenoid scuamos Bazaloid Celule fusiforme Verucos Papilar Nr cazuri Procente% Tabel nr.13 Repartiţia cazuisticii în funcţie de varietatea histopatologică Am observat faptul că cele mai numeroase dintre carcinoamele scuamoase analizate au fost forme necheratinizate cu un număr de 197 de cazuri, constituind jumătate din cazuistica analizată (52.96 %). 10

11 Fig. 5 CSO cheratinizat, buza, col HE, Ob X4 Fig. 8 CSO necheratinizat, limba, Col HE, Ob X10 Fig. 9 CSO bazaloid, limba,col HE, Ob X4 Fig. 11 CSO acantolitic, buza, Col HE, Ob X4 Un alt criteriu histopatologic urmarit în studiul nostru a fost gradul de diferenţiere al carcinoamelor scuamoase. Privitor la gradul de diferenţiere al celulelor scuamoase neoplazice, carcinoamele studiate au fost: bine diferenţiate, moderat diferenţiate şi slab diferenţiate. Un alt parametru luat în cosideraţie în prezentul studiu a fost stadiul progresiei tumorale. Dintre cele 372 de carcinoame scuamoase orale, am putut aprecia stadiul progresiei tumorale doar în 257 de cazuri care au reprezentat piese de rezecţie chirurgicală, restul de 115 de cazuri fiind biopsii în scop diagnostic (tabel nr. 15). Stadiul progresiei tumorale Microcarcinom Carcinom invaziv fara metastaze ganglionare Carcinom invaziv cu metastaze ganglionare Nr cazuri Procente% Tabel nr. 15 Repartiţia cazuisticii în funcţie de stadiul progresiei tumorale Carcinoamele franc invazive însoţite de adenopatie metastatică au fost prezente în 10 cazuri, constituind 3,90% din cazuistica analizată: 2 dintre cazuri într-un ganglion ipsilateral (N1), un caz într-un ganglion limfatic ipsilateral (N2a), in 7 cazuri in mai multi ganglioni ipsilaterali (N2b). Patternul invaziei a fost: expansiv, infiltrativ sau a prezentat ambele carectere. Întrun număr de 10 cazuri, masele tumorale au prezentat emboli neoplazici în interiorul vaselor sangvine şi limfatice, prezent în carcinoamele scuamoase moderat şi slab diferenţiate.de asemenea, în alte 18 cazuri am observat aspecte de invazie neoplazică perineurală şi perivasculară. Pentru a aprecia gradul progresiei tumorale prin încadrarea pacienţilor în stadiul de boala corespunzător, am folosit sistemul de stadializare WHO Cele mai multe cazuri, respectiv 140 (60,60%) s-au încadrat în stadiul I (tabel nr.17): 11

12 Stadiul bolii Stadiul I Stadiul II Stadiul III Stadiul IV Nr cazuri Procente % Tabel nr. 17 Repartiţia cazurilor în funcţie de stadiul bolii Am efectuat o serie de teste statistice pentru a stabili corelaţii între parametrii luaţi în studiul histopatologic. Prin efectuarea testului chi pătrat, am obţinut corelaţii statistice semnificative între gradul de diferenţiere al tumorilor şi stadiul tumoral, dimensiunile tumorilor (T), precum şi numărul şi dimensiunile ganglionilor (N). Un alt parametru microscopic analizat în studiul nostru a fost reprezentat de prezenţa celulelor maligne reziduale la nivelul marginilor de siguranţă chirurgicale, (tabel nr.21): Limite de rezectie Invadate Neinvadate Nr cazuri Procente% Tabel nr. 21 Repartiţia cazuisticii în funcţie de prezenţa celulelor maligne reziduale la nivelul marginilor de siguranţă chirurgicale 12

13 B. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC AL PATENERILOR CELULARI STROMALI ÎN ANGIOGENEZA DIN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE Din totalul de 257 de cazuri de piese de exereză chirurgicală am selecţionat un număr total de 60 de cazuri pentru care am efectuat investigaţiile imunohistochice. B.1. ANALIZA ELEMENTELOR STROMALE CELULARE (MACROFAGE ŞI MASTOCITE) ŞI VASCULARE LA NIVEL INTRATUMORAL ŞI AL FRONTULUI DE INVAZIE.B.1.1. ANALIZA DENSITĂŢII ŞI A DISTRIBUŢIEI VASELOR DE SÂNGE Densitatea vasculară am analizat-o cu ajutorul imunomarcajului pentru endoglină (CD105). Densitatea medie vasculară la nivel intratumoral, a fost de 7,33 ±1,5 * vase/câmp microscopic la obiectiv x20, cu valori cuprinse între 5,83 şi 9,83. La nivelul frontului de invazie numărul mediu de vase pentru cazurile investigate a fost de 10,4±2,90 * vase/câmp microscopic la obiectiv x20, cu limite variind între 4 şi 44 (fig 35). Fig. 35 Imunomarcaj CD105 vase front de invazire tumorală, ob X10 Comparând mediile valorilor microdensităţii vasculare cuantificată cu ajutorul CD105 la nivel intratumoral şi al frontului de invazie, testul t-student a indicat o valoare p=0,0007, ceea ce a confirmat o distribuţie caracteristică a acestor elemente în ariile menţionate. B.1.2. ANALIZA DENSITĂŢII ŞI A DISTRIBUŢIEI MACROFAGELOR Am analizat densitatea macrofagelor CD68+ intratumoral şi la nivelul frontului de invazie. Densitatea macrofagelor intratumoral a avut o medie de 1,66±0,66 * elemente/câmp microscopic x20 ( * deviaţie standard), identificând maxim 5 elemente/câmp. Densitatea lor la nivel frontului de invazie a prezentat o medie de 2,86±4,4 * elemente/câmp microscopic x20, cu un maxim de 14 elemente/câmp. Densitatea macrofagelor a fost mai mare la nivelul frontului de invazie tumorală decât în tumoră. (fig 39) 13

14 Fig. 39 CSO moderat diferenţiat Imunomarcaj CD68/CD105 intratumoral, ob 20 Din punct de vedere statistic am constatat o corelaţie liniară între distribuţia vaselor şi cea a macrofagelor de la nivelul frontului de invazie (coeficient Pearson=0,63), precum şi absenţa unei astfel de corelaţii la nivelul ariei tumorale (coeficient Pearson= 0,067); testul t- Student a prezentat o valoare p=0,024, ceea ce indică distribuţia caracteristică a macrofagelor intratumoral şi la nivelul frontului de invazie tumorală, Nu am remarcat vreo corelare a densităţii macrofagice intratumoral şi la nivelul frontului de invazie tumorală, cu localizarea tumorii (Chi pătrat, p=0,21, respectiv p=0,051) sau cu stadiul de progresie tumorală (Chi pătrat, p=0,12, respectiv p=0,21). Totuşi, am observat că densitatea macrofagică intratumoral şi în frontul de invazie tumorală a fost superioară în ariile tumorale invazive, slab diferenţiate (Chi pătrat, p=0,20, respectiv p=0,03, valoare semnificativă) (fig 96) y = 0,5287x - 2,6313 R 2 = 0, CD105/CD68 Tumora CD105/CD68 Front Linear (CD105/CD68 Front) Linear (CD105/CD68 Tumora) y = 0,1719x + 0,4063 R 2 = 0, Fig. 96 Corelaţie liniară între distribuţia vaselor şi macrofagelor la nivel front de invazie (coeficient Pearson=0,63) şi absenţa unei astfel de corelaţii la nivelul ariei tumorale (coeficient Pearson= 0,067) B.1.3. ANALIZA DENSITĂŢII ŞI A DISTRIBUŢIEI MASTOCITELOR Densitatea mastocitară am apreciat-o prin imunoreacţia la triptaza mastocitară şi a fost identificată în toate cazurile selecţionate. Numărul mediu de mastocite intratumoral a fost de 2,53±0,4 * elemente/câmp microscopic x20 (1,66-4). La nivel front de invazie densitatea mastocitelor a avut o valoare medie de 6,13±3,2 * elemente/câmp microscopic x20 (4-9,33). Distribuţia mastocitelor atât la nivel tumoral, dar mai ales la nivelul ariilor invazive a fost în apropierea vaselor sau perivascular (fig 50). 14

15 Fig. 50 CSO bine diferenţiat, Imunomarcaj CD105/triptază distribuţia mastocitelor şi vaselor peritumoral, ob. X20 Analiza statistică a densităţii mastocitelor şi vaselor arată o corelaţie liniară între densitatea mastocitelor şi vaselor la nivel tumoral (coeficient Pearson=0,47) şi o slabă corelaţie liniară a acestor elemente la nivel front de invazie (coeficient Pearson=0,19) (fig. 97) y = 0,2521x + 3,511 R 2 = 0, y = 0,3438x + 0,0125 R 2 = 0,4397 CD105/Triptaza Tumora CD105/Triptaza Front Linear (CD105/Triptaza Front) Linear (CD105/Triptaza Tumora) Fig. 97 Corelaţie liniară între densitatea mastocitelor şi vaselor la nivel tumoral (coeficient Pearson=0,47) şi o slabă corelaţie liniară a acestor elemente la nivelul frontului de invazie (coeficient Pearson=0,19). Testul t-student de comparare a mediei densităţii mastocitare intratumoral şi la nivelul frontului de invazie a arătat valoare foarte semnificativă statistic pentru distribuţia mastocitelor (p= 3,23E-08). Acelaşi test a arătat o valoare foarte semnificativă statistic la compararea densităţii vasculare şi mastocitare la nivelul frontului de invazie tumorală (1,11E-08). Din punct de vedere morfologic, mastocitele au prezentat dimensiuni diferite şi diverse grade de degranulare (fig 56). Fig. 56 Imunomarcaj CD105/triptază mastocit intratumoral integru şi mastocit parţial degranulat, ob. X20 15

16 B.2. ANALIZA ELEMENTELOR STROMALE, A FACTORULUI DE CREŞTERE VASCULO-ENDOTELIAL (VEGF) ŞI A RECEPTORILOR 1 ŞI 2 ACESTUIA (VRGFR1 şi VEGER2), LA NIVEL INTRATUMORAL ŞI AL FRONTULUI DE INVAZIE Imunoreacţia pentru VEGF, VRGFR1 şi VEGER2 a fost identificată în toate cele 60 de cazuri selectate pentru acest studiu, la nivel tumoralavând o intensitate variabilă în citoplasma celulelor tumorale. B.2.1. ANALIZA IMUNOMARCAJULUI PENTRU VEGF Imunomarcajul VEGF a fost prezent în 91,6 % din cazurile analizate, fiind absent în 5 cazuri care au corespuns formelor moderat şi slab diferenţiate ale tumorilor. Expresia acestuia mai intensă în celulele tumorale comparativ cu endoteliul vaselor sanguine tumorale. În plus, a avut o intensitate mai mare la nivelul celulelor aflate în periferia insulelor tumorale şi a diminuat cu creşterea gradului de diferenţiere tumorală (fig 60, fig 61, fig 62). Fig. 60 CSO bine diferenţiat, VEGF marcaj intens al celulelor tumorale, ob X20 Fig. 61 CSO moderat diferenţiat, VEGF marcaj moderat al insulelor tumorale, ob X 20 Fig. 62 CSO slab diferenţiat, VEGF marcaj de intensitate scăzută la nivel tumoral, ob X20 B.2.2. ANALIZA IMUNOMARCAJULUI PENTRU VEGFR1 ŞI VEGFR2 Imunomarcajul VEGFR1 a fost prezent în 80 % din cazurile analizate, în timp ce pentru VEGFR2 a fost prezent în 65 % dintre acestea. Spre deosebire de VEGF, cazurile cu imunomarcaj absent au corespuns atât formelor bine, moderat şi slab diferenţiate. Imunomarcajul VEGFR1 şi VEGFR2 a fost prezent atât la nivelul celulelor carcinomatoase cât şi al endoteliilor vasculare. (fig 64). Nu am găsit nici o corelaţie legată de expresia VEGFR1 şi VEGFR2 cu parametrii histopatologici investigaţi. 16

17 Fig. 64 CSO bine diferenţiat, Imunomarcaj VEGFR1, ob X20 B.2.3. STUDIUL EXPRESIEI VEGF ŞI A RECEPTORILOR SĂI (VEGFR1 ŞI VEGFR2) ŞI A DISTRIBUŢIEI MASTOCITELOR ŞI A MACROFAGELOR Atât în cazul VEGF, cât şi în cazul receptorilor R1 şi R2 analizaţi la nivelul stromei tumorale şi în ariile invazive, am constatat pozitivarea unor elemente stromale, componente ale răspunsului inflamator sau adiacente vaselor. Am optat pentru dublul imunomarcaj al secţiunilor respective, pentru a demonstra colocalizarea expresiei imunohistochimice la nivelul elementelor stromale, lucru care demonstrează implicarea elementelor stromale în secreţia de factori angiogenici şi, în consecinţă, implicarea lor în angiogeneza tumorală. Reacţiile duble imunohistochimice VEGF/CD68, VEGFR1/CD68, VEGFR2/CD68 şi VEGF/Triptaza, VEGFR1/Triptaza, VEGFR1R2/Triptaza, au arătat că aceste elemente celulare au fost reprezentate în special de către macrofage şi mastocite ( fig 76). Fig. 76 Imunomarcaj VEGF/Triptază colocalizare mastocitară, peritumoral ob 100 Numărul de mastocite care au exprimat VEGFR1 şi VEGFR2 a fost în medie 18%, respectiv 10% din totalul acestor elemente, fără o distribuţie particulară intratumoral sau la nivelul frontului de invazie tumorală (fig 78). Au fost mai bine evidenţiate aspectele diferitelor grade de degranulare ale acestora, precum şi aspecte de mastocitoclazie (fig80, fig. 82, fig. 84). 17

18 Fig. 78 Imunomarcaj VEGFR2/Triptază colocalizare mastocitară, peritumoral, ob X100 Fig. 80 Imunomarcaj VEGF/AAS - mastocite cu forme şi dimensi diferite grade de degranula Fig. 82 CSO slab diferenţiat, Imunomarcaj VEGFR1/AAS mastocit degranulat şi mastocitoclazie intratumoral, ob X100 Fig. 84 CSO moderat diferenţiat, Imunomarcaj VEGFR2/AAS mastocit cu aspect de mastocitoclazie, ob X1 18

19 DISCUŢII A. DISCUŢII ASUPRA STUDIULUI HISTOPATOLOGIC AL CARCINOAMELOR SCUAMOASE ORALE 1. Analizând repartiţia carcinoamelor scuamoase luate în studiu în funcţie de grupele de vârstă si incidenţa pe sexe am remarcat repartiţia tumorilor în funcţie de grupele de vârstă si sex: 32,25% din cazuri sunt diagnosticate în decada a VII-a de viata, cu predominenţă netă la sexul masculin (80,38%); Datele similare din literatură menţionează că vârsta de predilecţie pentru diagnosticul cancerului oral este cuprinsă între de ani, iar vârsta medie a diagnosticului se situează în jur de 64 de ani, aproximativ 95 % dintre pacienţii diagnosticaţi cu carcinoame scuamoase orale având peste 40 de ani [155; 203]. În literatură datele similare referitoare la carcinoamele mucoasei orale apreciază că sexul masculin este afectat în proporţie de % din cazuri. În Franţa, carcinoamele orale constituie de departe cel mai frecvent tip de cancer la bărbat şi se situează pe locul al doilea în ceea ce priveşte decesele prin cancer. [157; 186]. Din studiul unor factori de risc implicaţi în carcinogeneza orală am putut obţine informaţii referitoare la fumat şi la consumul de alcool şi asocierea acestor doi factori de risc si leziuni preexistente la nivelul mucoasei cavităţii orale (cheilita actinică, eritroplazia, leucoplazia), pentru un numar de 286 de cazuri. Factori de risc dominanţi sunt consideraţi fumatul şi consumul cronic de alcool, ei regăsindu-se în antecedentele a 75 % dintre pacienţii cu cancere de cavitate orală şi în cele orofaringiale (23; 42). Alt parametru analizat a fost reprezentat de localizarea leziunilor. Datele rezultate din literatură indică faptul că localizarea linguală egalează toate celelalte localizări ale carcinoamelor scuamoase de la nivelul mucoasei orale, cu excepţia celei de la nivelul buzelor [28]. Pentru încadrarea histopatologică am utilizat tipizarea recomandată de OMS Formele cheratinizate şi cele necheratinizate ale carcinoamelor scuamoase au fost prezente în toate localizările, forma bazaloidă şi cu celule fusiforme am găsit-o la nivelul limbii şi al buzelor, în timp ce forma adenoidă a fost prezentă la nivelul buzelor, limbii şi intr-un caz la nivelul gingiei, carcinomul verucos a fost localizat lingual şi la nivelul buzei, iar carcinomul papilar a fost localizat la nivelul limbii. Privind gradul de diferentiere al carcinoamelor scuamoase. cele mai numeroase au fost cele bine diferenţiate. Datele din literatura sugerează ca majoritatea carcinoamelor scuamoase sunt moderat diferenţiate, deci gradul de diferenţiere are o valoare prognostică limitată, în comparaţie, de exemplu, cu valoarea pattern-ului de invazie [67]. Pattern-ul de invazie tumorală şi dimensiunea tumorii sunt de asemenea factori de prognostic semnificativi ai progresiei tumorale. [40; 61]. Stadiul progresiei tumorale l-am putut aprecia în 257 de cazuri. Microcarcinoamele diagnosticate în 16 cazuri, au reprezentat 6,22 % din toate carcinoamele scuamoase analizate. In 14 cazuri ele au fost localizate la nivelul buzei inferioare, iar dintre acestea, 5 cazuri s-au asociat cu modificări de cheilită actinică şi într-un caz cu cheratoza seboreica. Studii efectuate asupra carcinoamelor scuamoase orale sugerează că modificările de tip displazic prezente în epiteliul din vecinătatea proceselor canceroase indică natura multistadială a malignizării la acest nivel, reflectând progresia alterărilor fenotipice şi genotipice asociate cu carcinogeneza orală, care sustin ipoteza naturii multistadiale a acestui tip de cancer [33; 40; 46;178]. 19

20 Patternul invaziei în cazul tumorilor studiate a fost: expansiv, infiltrativ sau a prezentat ambele carectere. Se consideră că patternul tumorilor de la nivelul frontului de invazie al tumorilor poate fi unul din factorii importanţi de predicţie ai evoluţiei tumorilor. Astfel, prezenţa unui front de invazie sub formă de cordoane sau insule necoezive sau chiar sub formă de celule neoplazice izolate, se poate asocia cu un prognostic nefavorabil, prin creşterea riscului de metastazare, în timp ce tumorile cu un aspect compact al frontului de invazie, care cresc prin împingere (fenomenul numit pushing ), se asociază cu o evoluţie mai puţin agresivă şi risc scazut de metastazare [40; 67; 105; 180]. Carcinoamele franc invazive însoţite de adenopatie metastatică au fost prezente în 10 cazuri, constituind 3,90% din cazuistica analizată. Carcinoamele scuamoase orale au o tendinţă crescută la metastazare în ganglionii loco-regionali. Rata de supravieţuire la 5 ani este redusă cu 50% la pacienţii cu metastaze ganglionare prezente, comparativ cu cei fără metastaze ganglionare la care rata de supravieţuire la 5 ani este de aproximativ 80% [33; 46; 178]. Un alt obiectiv important a fost stadializarea corespunzătore a cazurilor studiate. Diametrul maxim tumoral s-a putut aprecia doar într-un număr de 257 de cazuri. Din cele 242 de cazuri, 10 dintre acestea (4,13%) au prezentat metastaze ganglionare, fiind încadrate în stadiile de boală corespunzătoare. Dintre cele 242 de cazuri pentru care s-a făcut stadializarea ptnm, cele mai multe cazuri, respectiv 147 (60,60%) s-au încadrat în stadiul I, urmate în ordinea frecvenţei de 68 de cazuri (28,14%) stadiul II, 26 cazuri (10,82%) stadiul III şi 1 caz (0,44%) în stadiul IV. Testul Chi pătrat indică faptul că există o puternică legătură între gradul de diferenţiere tumorală şi stadializarea tumorală, valoarea p apropiată de 1 exprimând o corelaţie înalt semnificativă între cei doi parametri. În acelaşi sens am observat o corelaţie înalt semnificativă între gradul de diferenţiere tumorală şi stadiul tumoral, valoarea p fiind apropiată de 1. A existat o corelaţie înalt semnificativă între gradul de diferenţiere tumorală şi categoria N a stadiului tumoral, valoarea p fiind < 0,0001. Asocierea dintre raportul de ganglioni limfatici implicaţi şi supravieţuirea pacienţilor cu carcinoame scuamoase orale nu a fost încă pe deplin elucidată. Anumite studii care au cercetat acest aspect printr-un studiu amplu populaţional epidemiologic şi cu posibilitatea de urmărire a supravieţuirii în timp a acestor pacienţi, au arătat că un număr mare de metastaze ganglionare este un factor predictiv puternic pentru o rată de supravieţuire scăzută [172]. Pattern-ul de invazie tumorală şi dimensiunea tumorii sunt de asemenea factori de prognostic semnificativi [61]. B. DISCUŢII ASUPRA STUDIULUI IMUNOHISTOCHIMIC AL PATENERILOR CELULARI STROMALI ÎN ANGIOGENEZEI DIN CARCINOAMELE SCUAMOASE ORALE B.1. ANALIZA ELEMENTELOR STROMALE, CELULARE ŞI VASCULARE, LA NIVEL INTRATUMORAL ŞI AL FRONTULUI DE INVAZIE Analiza densităţii şi distribuţia vasculară am efectuat-o prin marcajul cu CD105 care a fost prezent la nivelul citoplasmei celulelor endoteliale, în toate cazurile incluse în prezentul studiu. In raport cu clasificarea lui Gee şi colab. în CSO am observat predominenţa vaselor de tip imatur şi intermediar [65; 114]. Importanţa acestei caracterizări rezidă în posibilitatea ca fiecare din elementele structurale componente ale acestor vase de angiogeneză să devină ţintă terapeutică. Rezultatele obţinute confirmă ceea ce au demonstrat unele studii de specialitate şi anume că expresia CD105 se reduce pe măsură ce ne îndepărtăm de frontul de invazie 20

21 tumorală, CD105 fiind un marker cu senzitivitate crescută pentru celulele endoteliale ale vaselor de neoformaţie [96; 165; 118]. Analiza densităţii şi a distribuţiei macrofagelor. În prezentul studiu, densitatea macrofagelor la nivel intratumoral a avut o medie de 1,66±0,66 * elemente/câmp microscopic x20 ( * deviaţie standard), numărul maxim identificat fiind de 5 elemente/câmp. Densitatea acestor elemente la nivelul frontului de invazie a avut o medie de 2,86±4,4 * elemente/câmp microscopic x20, cel mai ridicat număr de elemente pe câmp fiind de 14. Nu am remarcat o corelare a densităţii macrofagice intratumoral şi la nivelul frontului de invazie tumorală cu localizarea tumorii (Chi pătrat, p=0,21, respectiv p=0,051) sau cu stadiul de progresie tumorală (Chi pătrat, p=0,12, respectiv p=0,21), însă aceasta a fost superioară la nivelul ariilor invazive slab diferenţiate (Chi pătrat, p=0,20, respectiv p=0,03, valoare semnificativă). Studiile privind rolul macrofagele asociate tumorilor în carcinoamele scuamoase ale capului şi gâtului au indicat faptul că expresia lor a fost semnificativ asociată cu etapele de invaziei tumorale, cu microdensitatea vasculară intratumorală şi cu factorii angiogenici [51;107]. Aceste constatări sugerează faptul că macrofagele asociate tumorilor pot juca un rol în angiogeneza din timpul progresiei cancerului oral. Macrofagele asociate tumorilor (TAM) secretă un număr important de factori proangiogeni membri ai marii familii de factori de creştere: VEGF, PDGF TGFα, FGF. S-a demonstrat că macrofagele asociate tumorilor sunt o importantă sursă independentă de cytokine proangiogene şi în carcinomul pulmonar [19]. Analiza densităţii şi a distribuţiei mastocitelor. Imunoreacţia la triptaza mastocitară a fost identificată în toate cazurile selecţionate. Numărul mediu de mastocite la nivel intratumoral a fost de 2,53±0,4 * elemente/câmp microscopic x20, cu valori cuprinse între 1,66 şi 4. Analiza statistică arată o corelaţie liniară între densitatea mastocitelor şi vaselor la nivel tumoral (coeficient Pearson=0,47) şi o slabă corelaţie liniară a acestor elemente la nivel front de invazie (coeficient Pearson=0,19). Testul t-student de comparare a mediei densităţii mastocitare intratumoral şi la nivelul frontului de invazie, a arătat o valoare foarte semnificativă pentru distribuţia mastocitelor (p= 3,23E-08). Acelaşi test a arătat o valoare foarte semnificativă la compararea densităţii vasculare şi mastocitare front de invazie (p=1,11e-08). Mastocitele au fost cel mai puţin investigate, în ciuda dovezilor acceptate privind rolul acestora în carcinogeneză [36]. Este cunoscută de multă vreme legătura între inflamaţia cronică şi cancer, majoritatea tumorilor prezentând infiltrate inflamatorii ce conţin numeroase mastocite, fapt ce naşte ipoteza implicării mastocitelor în tumorigeneză. Mastocitele exercită un efect mitogenic asupra celulelor tumorale prin factorii de creştere secretaţi (VGFR2, IL2) [72; 161]. Există o corelaţie semnificativă între mastocite şi microdensitatea vasculară în carcinoamele scuamoase orale (r = 0.5, P = 0,012), sugerând că mastocitele ar putea regla angiogeneza tumorală în carcinoamele scuamoase orale, probabil prin intermediul celulelor triptază pozitive [80; 169]. B.2. ANALIZA ELEMENTELOR STROMALE, A FACTORULUI DE CREŞTERE VASCULO-ENDOTELIAL ŞI A RECEPTORILOR 1 ŞI 2 AI ACESTUIA, LA NIVEL INTRATUMORAL ŞI AL FRONTULUI DE INVAZIE Analiza expresiei VEGF în carcinoamele scuamoase orale. Imunomarcajul VEGF a fost prezent în 91,6 % din cazurile analizate. Datele din literatură în ceea ce priveşte rata de expresie a VEGF în carcinoamle orale sunt contradictorii, procentul de cazuri pozitive pentru VEGF variind între % cu o valoare mediană de 77% [5; 84; 85; 96; 168; 191]. 21

22 Majoritatea studiilor asupra carcinoamelor orale au arătat că nu există o asociere semnificativă între nivelul expresiei VEGF şi gradul histologic al tumorii. În contradicţie cu acest lucru, alte studii, incluzându-l şi pe acesta au găsit o corelare semnificativă între expresia VEGF şi gradul histologic al tumorii, astfel că expresia VEGF a fost mai redusă în carcinoamele slab diferenţiate [84]. Supraproducţia de VEGF a fost identificată ca factor major ce stă la baza angiogenezei patologice şi a proliferării tumorale [65; 84]. În plus, s-a demonstrat că VEGF este un factor chemotactic pentru monocite. VEGF poate induce angiogeneza şi permeabilitatea vasculară. Ca şi factor de creştere a permeabilităţii vasculare, VEGF acţionează direct asupra endoteliului şi nu determină degranularea mastocitelor.. Toate aceste date referitoare la proprietăţile VEGF îl promovează ca pe un factor cu rol important în inflamaţie şi în angiogeneza normală şi patologică, proces care este asociat cu vindecarea plăgilor, dezvoltarea embrionului şi creşterea şi metastazarea tumorilor solide [90; 104; 188; 189]. Supraexpresia VEGF a fost raportată în carcinomul scuamos orofaringian, dar şi în carcinoamele scuamoase ale capului şi gâtului [112; 209]. Densitatea microvasculară crescută (MVD) a fost asociată cu un prognostic prost, în numeroase cancere inclusiv carcinoame scuamoase demonstrându-se o strânsă corelaţie între MVD şi expresia VEGF [112; 115; 136; 208]. Expresia VEGF a fost observată în macrofagele situate în vecinătatea ariilor de necroză din carcinoamele scuamoase laringiene. Recent Kyzas şi colab. [97] au găsit o corelaţie puternică între VEGF şi VEGFR2 în celulele canceroase ale carcinoamelor scuamoase ale capului şi gâtului. În plus ambele proteine au fost înalt exprimate mai ales în tumorile cu un grad mare de proliferare şi totodată ele s-au corelat şi cu o rată de supravieţuire mică. VEGF, VEGFR1 şi VEGFR2 în angiogeneza din carcinoamele scuamoase orale. În mod obişnuit angiogeneza tumorală la nivel oral era măsurată prin determinarea celei mai mari densităţi microvasculare (MVD) într-o mostră de ţesut sau prin estimarea volumului vascular. O microdensitate vasculară crescută a fost asociată cu prezenţa de metastaze şi/sau evoluţie nefavorabilă a bolii. Măsurarea microdensităţii vasculare pe secţiuni histologice nu reprezintă în mod necesar stadiul angiogenic al bolii [96]. Recent, numărătoarea după metoda lui Chalkey pentru a determina densitatea microvasculară a fost considerată preferenţială [97]. Mai multe studii au relevat o diferenţă semnificativă între angiogeneza de la nivelul frontului invaziv al tumorii comparativ cu angiogeneza de la nivelul centrului tumoral, astfel că, semnalele VEGF şi CD105 în microvascularizaţia tumorală a fost mai mare la nivelul frontului de invazie. Studii care au urmărit supravieţuirea pe 5 ani liberă de boală a unui lot de pacienţi, a demonstrat că rata de supravieţuire a pacienţilor ale căror tumori au avut expresie de intensitate scăzută a imunoexpresiei CD105 şi a VEGF, a fost semnificativ mai mare decât a celor cu expresie crescută a imunoexpresiei CD105 şi a VEGF [43; 125]. Utilizarea lui CD105 a fost mai precisă în a determina dinamica activităţii angiogenice tunorale dovedindu-se a fi un marker specific pentrtu endoteliul tumoral [113; 125; 133]. Nu s-a putut demonstra o corelaţie semnificativă între microdensitatea vasculară şi expresia VEGFR2 respectiv VEGFR1 [100]. Expresia VEGFR1 şi VEGFR2 nu s-a corelat cu vârsta, sexul şi gradul histologic în cazul pacienţilor cu tumori de cap şi gât, în schimb autorii au dovedit existenţa unei corelaţii semnificative între imunoexpresia celor doi receptori în cadrul carcinoamelor scuamoase orale şi de la limbă. În plus, expresia VEGFR2 s-a corelat puternic cu stadiul clinic al tumorii [115]. Analiza distribuţiei VEGF, VEGFR1, VEGFR2 şi a celulelor inflamatorii stromale- am efectuat-o prin dublu imunomarcaj: pentru macrofage (VEGF/CD68, VEGFR1/CD68, VEGFR2/CD68) şi pentru mastocite (VEGF/Triptaza, VEGFR1/Triptaza, VEGFR1R2/Triptaza). 22

23 Rezultatele obţinute în respectivul studiu demonstrează în mod surprinzător că imunoexpresia lui VEGF la nivelul celulelor stromale şi al macrofagelor asociate tumorilor se asociază cu creşterea ratei de supravieţuire [90]. Reacţiile imunohistochimice duble ale VEGF, VEGFR1, VEGFR2 cu Albastru alcian safranină, au permis observarea unor aspecte morfologice particulare ale mastocitelor. Astfel, în toate cazurile analizate am putut observa prezenţa de mastocite cu morfologie normală, cu granulaţii de culoare albastră alcianofile şi rare mastocite cu granulaţii roşii safraninofile. Unele studii au evidenţiat o creştere numerică a mastocitelor asociată cu un prognostic prost al unor neoplazii umane: melanom [151], carcinomul scuamos oral [83; 197], carcinomul scuamos al buzelor [154]. Recent, Mohtasham N şi colab. (2010) au găsit corelaţie semnificativă între microdensitatea mastocitelor şi microdensitatea vasculară, concluzionând că mastocitele ar promova progresia tumorii prin reglarea angiogenezei [128]. Datele similare din literatura de specialitate la care am avut acces au fost limitate, acesta reprezentând elementul de noutate pe care îl oferă prezenta lucrare. 23

24 CONCLUZII 1. Repartiţia tumorilor în funcţie de grupele de vârstă si sex: 32,25% din cazuri sunt diagnosticate în decada a VII-a de viata, cu predominenţă netă la sexul masculin (80,38%); 2. Factorii de risc ai carcinogenezei orale frecvent s-au asociat între ei - în special alcoolismul şi fumatul s-au regăsit în antecedetele pacienţilor în 9,33% şi respectiv 16,34 %, iar asocierea lor a fost prezentă la 64,60 % dintre cazurile analizate; 3. Localizarea leziunilor: majoritatea tumorilor au avut originea la nivelul buzelor (46,77%), urmata de localizarea linguală (22,31%), restul localizărilor fiind planşeul (14 %), palatul (10,20 %) şi gingia (6,72%); 4. Tipul histopatologic cel mai frecvent a fost reprezentată de forma necheratinizată a CSO (52.96%), urmată de forma cheratinizată a tumorilor (42,47%), CS adenoide (1,61%), CS bazaloide (1,61%), CS cu celule fusiforme si verucoase (0,54%) si un singur caz de CS papilar (0,27%). 5. Gradul de diferenţiere: formele bine diferenţiate au fost cele mai numeroase, faptul datorându-se probabil incidenţei maxime a acestora la nivelul buzelor (46,77%), ce au corespuns formelor cheratinizate ale carcinoamelor scuamoase şi celor de tip verucos. CS moderat diferenţiate au fost prezente în peste 1/3 dintre tumori (39,51 %), incluzând formele necheratinizate şi varietatea adenoidă. CS slab diferenţiate au inclus unele forme necheratinizate, carcinoamele bazaloide şi pe cele cu celule fusiforme (18,82 %), au avut incidenţă maximă la nivelul limbii; 6. Stadializarea ptnm: stadiul I - 60,60% din cazuri, stadiul II - 28,14% din cazuri, stadiul III - 10,82% din cazuri şi stadiul IVA - 0,44% din cazuri; 7. Testele statistice pentru parametrii histopatologici luaţi în studiu au indicat corelaţii între stadiul tumoral şi localizarea tumorii: corelaţie înalt semnificativă între localizarea de la nivelul buzelor şi stadiul T1-T2 (p=0,027), localizarea la nivelul limbii s-a corelat înalt semnificativ cu stadiul T3-T4 (p=0,00); corelaţie înalt semnificativă între gradul de diferenţiere şi stadializarea tumorală, valoarea p fiind apropiată de 1; 8. Analiza celor de 60 de cazuri de carcinoame scuamoase orale cu grade variate de diferenţiere pentru care am urmărit elementele stromale (CD68, triptaza, albastru alcian-safranină) şi vasculare (CD31, CD105, VEGF, VEGFR1, VEGFR2) atât la nivel intratumoral cât şi la nivelul frontului de invazie, a pus în evidenţă implicarea elementelor celulare stromale (macrofagele şi mastocitele) în angiogeneza din CSO; 9. Media valorilor MVD (CD105) intratumoral şi la frontului de invazie a confirmat distribuţia caracteristică a vaselor, numărul vaselor CD105 pozitive fiind superior la frontul de invazie (p=0,0007); 10. Compararea valorilor medii ale densităţii macrofagelor intratumoral şi la frontul de invazie (p=0,024), a indicat superioritatea numerică a macrofagelor din ariile de invazie tumorală față de cele intratumorale; 11. Corelaţie liniară între distribuţia vaselor şi macrofagelor la nivelul frontului de invazie (coeficient Pearson=0,63) şi absenţa unei astfel de corelaţii la nivelul ariei tumorale (coeficient Pearson= 0,067); 12. Evidenţierea monocitelor CD68+ în lumenul vaselor demonstrează originea macrofagelor tisulare în monocitele circulante; 13. Densitatea macrofagică a fost superioară la nivelul ariilor invazive slab diferenţiate (p=0,20, respectiv p=0,03), sugerând că macrofagele pot fi un predictor al agresivităţii tumorilor; 24