Universitatea de Medicină şi Farmacie Grigore T. Popa - Iaşi

Transcription

1 Universitatea de Medicină şi Farmacie Grigore T. Popa - Iaşi Coordonator ştiinţific Prof. univ. Eugen CARASEVICI Doctorand Anca HĂISAN IAŞI, 2014

2 CUPRINS INTRODUCERE 9 Cancerul mamar, o problemă de sănătate publică 9 1. GLANDA MAMARĂ Ontogeneza glandei mamare Dezvoltarea glandei mamare până la pubertate De la pubertate la concepţie Glanda mamară în sarcină şi lactaţie Glanda mamară la menopauză Tumorigeneza Consideraţii moleculare Rolul tranziţiei epitelio-mezenchimale în apariţia şi 14 progresia tumorală Clasificarea cancerului mamar ANGIOGENEZA Angiogeneza fiziologică Mecanisme principale ale formării vaselor sanguine 29 consideraţii generale Vasculogeneza embrionară Angiogeneza embrionară Angiogeneza post embrionară şi a adultului Angiogeneza fiziologică a aparatului reproducător 33 feminin Angiogeneza în glanda mamară ANGIOGENEZA PATOLOGICĂ Angiogeneza nontumorală Angiogeneza excesivă implicaţiile patologice Angiogeneza insuficientă implicaţii patologice Angiogenza tumorală Consideraţii generale Factori care induc angiogeneza tumorală Factori inhibitori ai angiogenezei tumorale Formele angiogenezei tumorale Rolul micromediului tumoral în neoangiogeneză IMPLICAREA SISTEMULUI IMUN Imagine de ansamblu asupra sistemului imun Imunosupravegherea Imunoeditare 52 ii

3 Imunomodularea şi inflamaţia Rolul sistemului imun înnăscut în dezvoltarea 53 tumorală 4.3. Componentele sistemului imun şi carcinogeneza 57 glandei mamare Rolul imunităţii dobândite: limfocite B Rolul imunităţii dobândite: limfocitele T Rolul limfocitelor T reglatorii Scorul imun, o posibilă nouă clasificare a 60 neoplaziilor 5. MOTIVAŢIE OBIECTIVELE ŞI PLANUL DE LUCRU MATERIAL ŞI METODĂ Statistica descriptivă a lotului studiat Recoltarea şi procesarea materialului bioptic Coloraţia Hematoxilin Eozină Imunohistochimia (IHC) Soluţiile tampon (wash buffers) Renaturare antigenică Diluţia şi diluentul anticorpilor Anticorpul primar Incubarea anticorpului primar Anticorpul secundar şi developarea reacţiei Controlul reacţiei Microscopie Microscopie optică Microscopie virtuală Citometrie tisulara Sistemul TissueFAXS Procedura de scanare a probelor Digitizarea probelor marcate pentru CD REZULTATE Rezultatele marcării vascularizaţiei CD Rezultatele marcarii macrofagelor - CD Rezultatele marcarii limfocitelor B CD Rezultatele marcarii limfocitelor Tcitotoxice CD STATISTICĂ Metode statistice, variabile Rezultatele prelucrării statistice Prelucrarea statistică a datelor descriptive pentru lotul 135 iii

4 studiat Prelucrarea statistică a rezultatelor obţinute Corelaţii statistice între markerii analizaţi pe diferite 153 compartimente în funcţie de supravieţuire 10. DISCUŢII Sistemul imun Carcateristicile micromediului tumoral Discuţii referitoare la vascularizaţie Discutii referitoare la macrofage Discutii referitoare la limfocitele B Discuţii referitoare la limfocitele T citotoxice Factorii care influenţează calitatea probelor fixate în 175 parafină CONCLUZII 177 ORIGINALITATE 178 PERSPECTIVE 178 BIBLIOGRAFIE 180 CUPRINS FIGURI FIGURA 1: CONTRIBUŢIA EMT LA PROGRESIA TUMORALĂ (MODIFICATĂ DUPĂ KALLURI & WEINBERG) FIGURA 2: GRADUL (NOTTINGHAM) HISTOLOGIC AL TUMORILOR MAMARE FIGURA 3: MECANISMUL ANGIOGENEZEI FIZIOLOGICE (MODIFICATĂ DUPĂ PAPETII & HERMAN) FIGURA 4: VASCULOGENEZĂ ŞI ANGIOGENEZĂ EMBRIONARĂ (MODIFICATĂ DUPĂ CHUG & FERRARA) FIGURA 5: EVENIMENTELE MORFOGENICE DIN TIMPUL VASCULARIZAŢIEI EMBRIONARE ŞI A ADULTULUI (MODIFICATĂ DUPĂ AUGUSTIN HG) FIGURA 6: FORMAREA DE NOI VASE ÎNMUGURIREA (MODIFICATĂ DUPĂ BERGERS & BENJAMIN) FIGURA 7: SWITCH-UL ANGIOGENIC (MODIFICATĂ DUPĂ BERGERS & BENJAMIN) FIGURA 8: MECANISMUL MOLECULAR AL AGIOGENEZEI TUMORALE (MODIFICATĂ DUPĂ PAPETTI & HERMAN) FIGURA 9: RECUNOAŞTEREA CANCERULUI DIRECT DE CĂTRE SISTEMUL IMUN ÎNNĂSCUT (MODIFICATĂ DUPĂ YANAN & ZENG) FIGURA 10: DESCRIEREA LOTULUI ÎN FUNCŢIE DE VÂRSTA PACIENTELOR iv

5 FIGURA 11: DESCRIEREA LOTULUI ÎN FUNCŢIE DE 65 STATUSUL HORMONAL FIGURA 12: DESCRIEREA LOTULUI ÎN FUNCŢIE DE 65 GLANDA MAMARĂ AFECTATĂ FIGURA 13: DESCRIEREA LOTULUI ÎN FUNCŢIE DE 66 RECEPTORUL ESTROGENIC FIGURA 14: DESCRIEREA LOTULUI ÎN FUNCŢIE DE 66 RECEPTORUL PROGESTERONIC FIGURA 15: DESCRIEREA LOTULUI ÎN FUNCŢIE DE 67 HER2/NEU FIGURA 16: DESCRIEREA LOTULUI FUNCŢIE DE 67 CLASIFICAREA MOLECULARĂ FIGURA 17: DISTRIBUŢIA LOTULUI ÎN FUNCŢIE DE 68 SUPRAVIEŢUIRE FIGURA 18: STADIALIZAREA TNM: TUMORĂ 68 FIGURA 19: STADIALIZAREA TNM: NODULI LIMFATICI 69 FIGURA 20: STADIALIZAREA TNM: METASTAZE 69 FIGURA 21: GRADUL HISTOLOGIC ÎN LOTUL STUDIAT LA 70 MOMENTUL INCLUDERII ÎN STUDIU FIGURA 22: IMAGINE DE SECŢIUNE COLORATĂ HE 73 FIGURA 23: LSAB METHOD (FIGURĂ MODIFICATĂ DUPĂ 75 KEY M DAKO) FIGURA 24: PROBĂ DE CARCINOM DUCTAL INVAZIV 90 MARCATĂ PENTRU RECEPTORUL ESTROGENIC FIGURA 25: HEMATOXILINĂ: COMPONENTA ALBASTRĂ 91 ÎMPREUNĂ CU IMAGINEA DIGITALĂ FOLOSITĂ PENTRU MĂSURĂTORI FIGURA 26: ESTROGEN RECEPTOR - DAB: COMPONENETA 91 MARO ÎMPREUNĂ CU IMAGINEA DIGITALĂ FOLOSITĂ PENTRU MĂSURĂTORI FIGURA 27: AFIŞAREA MĂSURĂTORILOR ÎN MOD TABELAR 92 FIGURA 28: HISTOGRAMA MĂSURĂTORILOR COMPOZIŢIEI 92 CELULARE DE ER-DAB FIGURA 29: SCATTERGRAMA CU INTENSITATEA DAB 93 VERSUS INTENSITATEA HEMATOXILINEI FIGURA 30: EVIDENŢIEREA PRIN CONTURURI A 93 CELULELOR ER-POZITIVE ŞI ER-NEGATIVE FIGURA 31: INSTANTANEU ÎN CADRUL PROIECTELOR 95 HISTOQUEST FIGURA 32: RAPORT STATISTIC INTERMEDIAR 97 FIGURA 33: IMAGINE VIRTUALĂ CU MARCAJ PENTRU 99 VASE (ANTI CD34) FIGURA 34: EXTRACŢIA CULORII MARO (DAB) 100 v

6 FIGURA 35: EXTRACŢIA CULORII ALBASTRE 100 (HEMATOXILINĂ) FIGURA 36: VALIDAREA DETECŢIEI 100 FIGURA 37: VERIFICAREA DETECŢIEI ŞI INTERPRETĂRII 101 AUTOMATE FIGURA 38: DIAGRAME FUNCŢIE DE CULOAREA 102 UTILIZATĂ FIGURA 39: SELECTAREA UNEI REGIUNI DE INTERES DE 103 TIP STROMA ASOCIATĂ TUMORII (TAS) MARCATĂ CU ANTI CD34, IDENTIFICATĂ PRINTR-UN CERC DE CULOARE VERDE FIGURA 40: ROI DE TIP TUMORAL 103 FIGURA 41: COMPARTIMENT INTRATUMORAL DE FRONT 104 INVAZIV (CERC ROŞU), ELEMENTELE IDENTIFICATE ÎN ZOOM-IN ÎN FEREATRA DIN DREAPTA FIGURA 42: ARIA ENDOTELIALĂ RELATIVĂ MARCATĂ ÎN 105 FIECARE COMPARTIMENT: STROMĂ (TAS), TUMORĂ (T), FRONT INVAZIV (IF) PENTRU ÎNTREG LOTUL DE PACIENŢI FIGURA 43: ARIA RELATIVĂ ENDOTELIALĂ MARCATĂ ÎN 106 CELE TREI COMPARTIMENTE INTRATUMORALE (TAS, T, IF), REPREZENTAREA COMPARATIVĂ ÎN FUNCŢIE DE AFECTAREA GANGLIONARĂ METASTATICĂ FIGURA 44: IMAGINE DE ANSAMBLU A ÎNTREGII SECŢIUNI 107 TISULARE MARCATE IMUNOHISTOCHIMIC CU CD68 FIGURA 45: NAVIGARE PE SECŢIUNE VIRTUALĂ MARCAJ 108 CD68 FIGURA 46: IDENTIFICAREA AUTOMATĂ A 109 MACROFAGELOR PRIN RULAREA PROGRAMULUI SPECIFIC FIGURA 47: DETALIILE SCATTEGRAMEI 110 FIGURA 48: ŞASE IMAGINI ALĂTURATE CARE REFLECTĂ 110 LOGICA ALGORITMILOR DE IDENTIFICARE FIGURA 49: VERIFICAREA DETECŢIEI PRIN EXTRACŢIA 111 CULORILOR FIGURA 50: ZONA DE STROMĂ ASOCIATĂ TUMORII (TAS) 112 FIGURA 51: ZONA DE TUMORĂ PROPRIU-ZISĂ (T) 112 FIGURA 52: ZONA DE FRONT INVAZIV (IF) 113 FIGURA 53: CUANTIFICAREA MACROFAGELOR ÎN CELE COMPARTIMENTE INTRATUMORALE DE INTERES TAS, T, IF ŞI PE SUBGRUPURI DE PACIENŢI (FĂRĂ METASTAZE GANGLIONARE N0), CU AFECTARE GANGLIONARĂ (N) ŞI PE TOT LOTUL STUDIAT FIGURA 54: SCHEMA MARCĂRII ENDOTELIALE ŞI 116 MACROFAGICE PE TOT LOTUL STUDIAT, 50 DE PACIENTE vi

7 FIGURA 55: SCHEMA MARCĂRII ENDOTELIILOR ŞI A 116 MACROFAGELOR PE SUBGRUPUL PACIENTELOR (N0) FIGURA 56: SCHEMA MARCĂRII VASCULARIZAŢIEI ŞI 117 INFLAMAŢIEI ÎN LOTUL PACIENTELOR CU METASTAZE GANGLIONARE (N) FIGURA 57: IMAGINE DE ANSAMBLU MARCATĂ PENTRU 118 LIMFOCITE B FIGURA 58: DETALII AL IMUNOMARCAJULUI CD FIGURA 59: FOCUS ASUPRA MARCĂRII LIMFOCITELOR B 119 FIGURA 60: ETAPE DE PROCESARE A IMAGINII 119 FIGURA 61: EXTRACŢIA AUTOMATĂ A CULORII MARO 120 (DAB) FIGURA 62: INSTANTANEU AL APLICAŢIEI ÎN TIMPUL 120 ANALIZEI MARCAJULUI CD20 + FIGURA 63: IMAGINE DE ANSAMBLU CU MARCAREA 121 CD20+ FIGURA 64: IMAGINE DE DETALIU AL FIGURE FIGURA 65: IMAGINE DE ZOOM-IN AL SECŢIUNII 122 REPREZENTATE ÎN FIGURE 63 FIGURA 66: ARIA RELATIVĂ MARCATĂ CD FIGURA 67: SECŢIUNE DIGITIZATĂ DE CARCINOM 123 INFILTRATIV DE GLANDĂ MAMARĂ MARCATĂ PENTRU LIMFOCITELE T CD8+ FIGURA 68: ALEGEREA ZONELOR DE INTERES: TAS, T, FI 124 FIGURA 69: VALIDAREA DETECŢIEI PRIN CONTURURI ŞI 125 MĂŞTI FIGURA 70: EXTRACŢIA HEMATOXILINEI PENTRU 125 PROBELE CD8+ FIGURA 71: EXTRACŢIA DAB-ULUI PENTRU PROBELE CD FIGURA 72: DETALII AL IMUNOMARCAJULUI CD FIGURA 73: ARIA RELATIVĂ MARCATĂ - CD8 127 FIGURA 74: COMPARAŢII ALE MARCAJELOR 128 LIMFOCITELOR B CD20+ ŞI TC CD8+ PENTRU TOT LOTUL FIGURA 75: COMPARAŢII ALE IMUNOMARCAJELOR 128 PENTRU SUBGRUPUL PACIENTELOR N0 FIGURA 76: COMPARAŢII ALE IMUNOMARCAJELOR 129 PENTRU PACIENTELE CU METASTAZE GANGLIONARE (N) FIGURA 77: MEDIA DE SUPRAVIEŢUIRE (PRELUCARE DIN 135 OUTPUT-UL SPSS) FIGURA 78: CORELAŢIA ÎNTRE DIMENSIUNEA TUMORII (T) 136 ŞI SUPRAVIEŢUIRE (PRELUARE DIN OUTPUT-UL SPSS) FIGURA 79: CORELAŢII ÎNTRE IMPLICAREA GANGLIONARĂ 136 (N) ŞI SUPRAVIEŢUIRE (PRELUARE DIN OUTPUT-UL SPSS) vii

8 FIGURA 80: : CORELAŢIA ÎNTRE METASTAZE (M) ŞI SUPRAVIEŢUIRE (PRELUARE DIN OUTPUT-UL SPSS) FIGURA 81: GRAFICUL SUPRAVIEŢUIRII ÎN FUNCŢIE DE GRADUL HISTOLOGIC (PRELUARE DIN OUTPUT-UL SPSS) FIGURA 82: GRAFICUL SUPRAVIEŢUIRII ÎN FUNCŢIE DE TIPUL MOLECULAR. (PRELUARE DIN OUTPUT-UL SPSS) FIGURA 83: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD34 ÎN FRONTUL INVAZIV FIGURA 84: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD34 ÎN TUMORĂ FIGURA 85: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD68 ÎN FRONT INVAZIV FIGURA 86: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD68 ÎN TUMORĂ FIGURA 87: CORELAŢII ÎNTRE COMPARTIMENTELE TAS-T- IF PENTRU CD20 FIGURA 88: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD20 ÎN FRONTUL INVAZIV FIGURA 89: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD20 ÎN TUMORĂ FIGURA 90: CORELAŢII ÎNTRE COMPARTIMENTELE TAS-T- IF PENTRU CD8 FIGURA 91: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD8 ÎN FRONTUL INVAZIV FIGURA 92: KAPLAN-MEIER ÎN FUNCŢIE DE CD8 ÎN TUMORĂ CUPRINS TABELE TABEL I: CLASIFICAREA TNM, T 16 TABEL II: CLASIFICAREA TNM, N 17 TABEL III: CLASIFICAREA TNM, M 17 TABEL IV: CLASIFICARE MOLECULARĂ (PRELUARE DIN 70 OUTPUT-UL SPSS) TABEL V: AREA REALTIVĂ MARCATĂ (REA) PE 105 COMPARTIMENTE (TAS, T, IF) PENTRU TOŢI PACIENŢII, DAR ŞI PENTRU SUBGRUPUL REPREZENTAT DE PACIENTELE FĂRĂ AFECTARE GANGIONARĂ (N0), CÂT ŞI PENTRU PACIENTELE CU METASTAZE GANGLIONARE (N>N0) TABEL VI: MARCAJELE MACROFAGICE ÎN CADRUL 113 SUBGRUPURILOR DE PACIENŢI TABEL VII: TABEL CU IDENTIFICAREA VASCULARIZAŢIEI 115 ŞI A INFILTRATULUI INFLAMATOR PE ZONE DE INTERES viii

9 TABEL VIII: ARIA RELATIVĂ MARCATĂ CD TABEL IX: ARIA RELATIVĂ MARCATĂ - CD8 127 TABEL XIII: CORELAŢII ÎNTRE VASCULARIZAŢIA DIN 140 DIFERITELE COMPARTIMENTE INTRATUMORALE ALE LOTULUI STUDIAT TABEL XIV: CORELAŢII STATISTICE DE VASCULARIZAŢIEI 140 DIN COMPARTIMENTELE ANALIZATE, ÎN FUNCŢIE DE CLASIFICAREA MOLECULARĂ A NEOPLASMULUI MAMAR. TABEL XV: ANALIZA STATISTICĂ A COMPARTIMENTELOR 144 INTRATUMORALE ÎN FUNCŢIA DE EXPRESIA MACROFAGELOR PENTRU TOT LOTUL DE PACIENTE TABEL XVI: ANALIZA STATISTICĂ COMPARATĂ A 144 MACROFAGELOR ÎN DIFERITE COMPARTIMENTE INTRATUMORALE ÎN GRUPUL PACIENTELOR FĂRĂ AFECTARE GANGLIONARĂ (N0) TABEL XVII: ANALIZA STATISTICĂ COMPARATĂ A 145 MACROFAGELOR ÎN DIFERITE COMPARTIMENTE INTRATUMORALE ÎN GRUPUL PACIENTELOR CU METASTAZE GANGLIONARE (N) TABEL XVIII : CORELAŢII LA NIVELUL 154 COMPARTIMENTULUI TUMORAL - 1 AN (TABELE PRELUATE DIN SPSS) TABEL XIX: CORELAŢII LA NIVELUL COMPARTIMENTULUI 155 TUMORAL - 2 ANI (TABELE PRELUATE DIN SPSS) TABEL XX: CORELAŢII LA NIVELUL COMPARTIMENTULUI 156 TUMORAL - 3 ANI (TABELE PRELUATE DIN SPSS) TABEL XXI: CORELAŢII LA NIVELUL COMPARTIMENTULUI 156 TUMORAL - 4 ANI (TABELE PRELUATE DIN SPSS) TABEL XXII: CORELAŢII LA NIVELUL 157 COMPARTIMENTULUI TUMORAL - 5 ANI (TABELE PRELUATE DIN SPSS) TABEL XXIII: CORELAŢII LA NIVELUL 158 COMPARTIMENTULUI TUMORAL - 6 ANI (TABELE PRELUATE DIN SPSS) TABEL XXIV: CORELAŢII LA NIVELUL 158 COMPARTIMENTULUI TUMORAL - 7 ANI (TABELE PRELUATE DIN SPSS) TABEL XXV: CORELAŢII LA NIVELUL FRONTUL DE 158 INVAZIE PRIMII 5 ANI (TABEL PRELUAT DIN SPSS) TABEL XXVI: REPERE ÎN EVOLUŢIA CUANTIFICĂRII 163 VASCULARIZAŢIEI ix

10 MOTIVAŢIE Tumorile solide, incluzand şi cancerul mamar, conţin multiple tipuri celulare aflate într-o interacţiune complexă cu matricea extracelulară şi dezvoltă procese asemănătoare organelor în dezvoltare, sau remodelărilor tisulare. Micromediul poate favoriza ori dimpotriva preveni progresia celulelor mutante. Celulele maligne pot instrui elementele celulare ale stromei în direcţia constituirii unui suport al creşterii. După cum dezvoltarea vaselor reprezintă o etapă esenţială în formarea şi diferenţierea organelor, vascularizarea tumorilor se produce prin procesul de comutare angiogenică în diferite stadii ale progresiei neoplazice fiind dependentă de contextul creat de micromediu şi infiltratul celular inflamator. Vascularizaţia tumorală este responsabilă de metastazare şi de anumite criterii de propagare a unor efecte metabolice sistemice nocive. Miza majoră a evaluărilor diagnostice primare şi de urmărire este descrierea (prin markeri prognostici şi eventuali predictori) mai eficientă pentru clasificarea diagnostică. Constelaţia de factori prognostici curentă este în continuă tatonare pentru ameliorarea capacităţii descriptive. Angiogeneza şi elementele celulare inflamatorii din micromediu pot constitui factori predictivi şi prognostici. Acum, când cercetarea ştiinţifică revendică rezultate cât mai exacte şi reproductibile este absolut evident că nevoia de exprimare prin scoruri prognostice a amplasării şi caracteristicilor celulare creşte presiunea de a utiliza diagnosticul informatizat în patologia oncologica. Computerul şi analiza computerizată gestionată de expertul uman au devenit standardul metodologic de infrastructură în variate patologii, inclusiv neoplaziile. Chiar şi cuantificarea automată ar putea însa omite informaţiile cu valoare prognostică, dacă nu se iau în considerare compartimentele tumorale, respectiv stroma asociată tumorii, zona de tumoră propriu-zisă şi frontul de invazie. Fiecare dintre aceste arii au particularităţi şi caracteristici care nuanţează expresia markerilor moleculari de studiat. 1

11 Diagnosticul informatizat în cancerul mamar este util inclusiv în validarea de noi markeri, printre care cei ce ţin de neoangiogeneză şi comportamentul infiltratului inflamator fiind promiţători în nuanţarea prognostică. Unificarea obiectivelor ştiinţifice cu cele tehnologice a condus la integrarea în analiza statistică a datelor derivate din analiza multimodală a ţesuturilor patologice şi a altor informaţii clinice relevante pentru a obţine o întelegere aprofundată a mecanismelor patogenice şi o ameliorare a diagnosticului şi prognosticului cu impact asupra individualizării tratamentului. OBIECTIVELE ŞI PLANUL DE LUCRU Scopul general al tezei de doctorat a fost analiza vascularizaţiei tumorale şi infiltratului inflamator în diferite arii ale masei neoplazice, diferite ca dinamică a procesului malign, pentru identificarea şi caracterizarea unor noi factori predictivi şi prognostici importanţi în orientarea terapeutică şi monitorizarea evoluţiei pacientelor cu cancer mamar. Un obiectiv metodologic al tezei a fost acela de a dezvolta o metodă reproductibilă de evaluare şi cuantificare, apelând la citometria tisulară automatizată ca instrument de achiziţie şi analiză a datelor furnizate de markerii neovascularizaţiei şi ai elementelor leucocitare de infiltrat inflamator raportate la heterogenitatea tumorală celulară şi stromală ca parametri prognostici în cancerul mamar. Planul de lucru a cuprins urmatoarele etape: Admiterea cazurilor conform criteriilor de selecţie în baza de lucru. Acest criterii au fost: tipul diagnosticului, disponibilitatea informaţională, tabloul morfopatologic al materialului bioptic tisular şi acceptul pacientului sau aparţinătorilor. Procesarea pieselor de exereză chirurgicală incluse în parafină în vederea marcării imunohistochimice a preparatelor histopatologice. Evaluarea calitativă şi analiza microscopică preliminară (sub asistenţa medicului anatomopatolog) pentru caracterizarea 2

12 elementelor fundamentale descriptive ale leziunilor, incluzând parametrii precum amploarea invaziei, a necrozei, a remodelării stromale, a infiltratului inflamator etc. Crearea bazei imagistice microscopice a pieselor colorate în HE, conţinând criteriile diagnostice. Stabilirea criteriilor pentru partajarea de compartimente relevante în secţiune referitoare la invazie, vascularizaţie şi context inflamator. Delimitarea şi inventarierea efectivă a distribuţiei de astfel de compartimente şi confirmarea validităţii pentru marcajele ulterioare. Această etapă a fost efectuată în concordanţă cu evaluarea medicului anatomopatolog. Efectuarea marcajelor IHC pentru fiecare marker (conform procedurilor noastre) asigurând calitatea corespunzătoare analizei digitale, validată optic de expertul uman. Efectuarea achiziţiei primare după validarea parametrilor de software necesari unei calităţi optime a fotografiilor tisulare. Integrarea imaginilor şi informaţiilor asociate în baza de date. Cuantificarea într-o manieră cantitativă, obiectivă şi reproductibilă a elementelor de vascularizaţie şi inflamaţie. Analiza comparativă a profilurilor de expresie a markerilor la nivelul compartimentelor tumorale şi a relevanţei lor prognostice şi salvarea informaţiilor în baza de date. Evidenţierea analizei digitale a probelor biologice marcate ca viitor standard în cuantificarea diferiţilor markeri ai funcţiei elementelor celulare neoplazice şi de micromediu tumoral. Pentru realizarea acestor obiective am alcătuit o bază de date ce a plecat de la 100 de paciente în stadiul iniţial. Dintre acestea 50 de cazuri au fost considerate ca fiind incomplet procesabile şi 50 de cazuri complet documentate. Pacientele au fost diagnosticate între anii cu carcinom ductal invaziv, fără altă specificare, diagnosticul fiind pus post operator pe baza rezultatului anatomopatologic obţinut prin colorarea cu hematoxilin-eozină a secţiunilor tumorale. Pentru desfăşurarea in continuare a analizei digitale, secţiunile etalate pe lamă au fost marcate prin tehnica imunohistochimică cu markeri endoteliali pentru vascularizaţie 3

13 (CD 34 ), pentru linia celulara monocit-macrofag (CD 68 ), CD 8 pentru limfocitele T citotoxice şi CD 20. pentru limfocitele B. Ulterior imaginile secţiunilor astfel colorate au fost achiziţionate cu ajutorul unei camere digitale, în final obţinându-se imaginea virtuală a întregii lame. Delimitarea zonelor de interes şi cuantificarea automata a marcărilor pozitive s-a obţinut cu ajutorul unui software dedicat analizei tisulare, ulterior datele obţinute fiind analizate statistic. Toate afirmaţiile au fost efectuate în contextul acordului cu medicul anatomopatolog. Acest plan de lucru reflectă soluţia noastră pentru atingerea obiectivelor tezei. MATERIAL ŞI METODĂ Studiul de faţă analizează 50 de paciente care reprezintă sublotul complet documentat al grupului iniţial de studiu (100 paciente), diagnosticate cu carcinom ductal invaziv. Pacientele au fost selectate din populaţia judeţului Iaşi şi operate la clinicile de chirurgie din Spitalul Judeţean Clinic de Urgenţă Sfântul Spiridon Iaşi. Criteriile de includere în lot au fost: absenţa comorbidităţilor importante asociate: altă neoplazie, diabet zaharat, TBC, boală renală cronică absenţa chimioterapiei, radioterapiei şi/sau a terapiei hormonale până la actul chirurgical acordul pacientelor sau a rudelor de gradul I diagnosticul anatomopatologic de CDI NOS blocul tumoral inclus în parafină în stare bună, având suprafaţa secţiunii diagnostice > de 1 cm 2, calitate histologică rezonabilă şi grosime suficientă pentru solicitări ulterioare Au fost excluse pacientele cu vârste extreme < 30 ani şi >70 ani şi cele care au decedat de altă cauză decât neoplazia. Monitorizarea eşantionului studiat a fost efectuată pe o perioadă de 10 ani, pacientele fiind diagnosticate cu carcinom ductal invaziv în perioada Pentru elaborarea bazei de date s-a obţinut avizul etic în cadrul cercetării doctorale de la Comisia de Etică din cadrul Şcolii 4

14 doctorale a Universitatii de Medicină şi Farmacie Gr. T. Popa Iaşi şi avizul etic al Comisiei de Etică din cadrul Spitalul Judeţean Clinic de Urgenţă Sfântul Spiridon Iaşi, cât şi avizul Şefului din Clinica Oncologică a Spitalul Judeţean Clinic de Urgenţă Sfântul Spiridon Iaşi (Anexa 1: Aviz etic) Din baza de date a Ambulatorului Oncologic Iaşi s-au extras 100 de foi de observaţie care corespundeau criteriilor de selecţie pentru cercetare. Din aceste 100 paciente, doar 50 au rămas în studiu, în urma aplicării criteriilor de includere/excludere şi a consimţământului informat. (Anexa 2: consimţământ informat) Imunohistochimia (IHC) În cadrul studiului doctoral am acordat o atenţie deosebită tehnicii imunohistochimice atât prin studierea literaturii de specialitate şi a forumurilor/site-urilor de profil, cât şi în realizarea cu acurateţe şi standardizarea paşilor tehnici, având drept scop realizarea unor marcaje cât mai clare din punct de vedere optic şi corecte morfologic. Noi am folosit în cadrul tehnicii, metoda LSAB, labeled streptavidin biotin, care foloseşte Ac secundari biotinilaţi care se leagă de Ac primari; şi apoi se conjugă şi cu complexul streptavidină peroxidază. Alegerea anticorpilor primari utilizaţi în studiul de faţă a fost efectuată după criteriile de performanţă enunţate de producători, dar şi în funcţie de aspectul financiar. Am optat pentru anti CD 34 anticorp monoclonal de iepure, ab81289 [EP373Y] de la Abcam, izoforma Ig G 1, diluţia optimă după testare fiind 1:200. Pentru identificarea macrofagelor am ales anticorpul primar monoclonal de şoarece anti CD 68 [KP 1 ], ab955, Abcam, izoforma IgG 1, utilizând diluţia 1:300. Limfocitele B au fost evidenţiat cu ajutorul anticorpului primar monoclonal de şoarece anti CD 20 [L26], ab9475, Abcam, izoforma IgG 2, în diluţia 1:50. Limfocitele T citotoxice, CD 8 +, au fost vizualizate cu ajutorul anticorpului primar de şoarece clona C8/144B, de la Dako, codul nr.: M7103, izoformă IgG 1, în diluţia 1:150. Toţi anticorpii au fost obţinuţi în format lichid necongelat. 5

15 Microscopie virtuală Plecând de la unele dezavantaje ale microscopiei optice, dar şi a unor cerinţe moderne privind redarea informaţiilor de tip imagine în diferite locaţii plasate diferit ca distanţă şi/sau ca timp, s-a observat în ultimul deceniu un interes crescând pentru microscopia virtuală. Această metodă are la bază mijloace optice similare microscopului, dar este augumentat prin mijloace digitale de stocare şi redare a informaţiei. Astfel, principiul de bază constă în realizarea a 3 etape: A. Scanarea preparatului cu un obiectiv cu o magnificare suficient de mare, astfel încât să se preteze la analiză pentru care a fost realizat acel preparat B. Redarea informaţiei digitale C. Analiza calitativă şi cantitativă, folosind unelte de adnotare Toate aceste etape sunt realizate de către un computer pe care rulează o aplicaţie sau o suită de aplicaţii special concepute pentru acest lucru. Computerul are rolul de coordonator principal al tuturor operaţiilor de comandă şi automatizare în ceea ce priveşte achiziţionarea de imagini. Tot acesta va reda informaţia digitală, şi va servi ca unealtă de analiză şi control pentru utilizatorul uman. Procedura de scanare a probelor Secţiunile marcate au fost digitizate şi analizate cu sistemul Tissue Faxs 3.5 (Tissue Gnostics Gmbh, Viena, Austria) care conţine un scaner şi un pachet de analiză tisulară (Tissue Quest şi Histoquest). Sistemul e format dintr-un microscop Zeiss imager Z2 echipat cu o cameră specială de scanare color Pixelink PL-632CF de 3 Megapixeli. Platanul monitorizat, produs de Maerzhauser conţine posibiltatea analizei a 8 lame simultan. Lumina albă a fost obţinută de la o lampă VISLED, bazată pe tehnologia LED, care a asigurat intensitatea luminoasă stabilă şi reproductibilă pe toată durata studiului. Computerul ataşat sistemului este un HPZ400 şi utilizează un procesor Intel Xenon W3565 de 3,2 GHz şi Windows 7, 32 bits. Etapa de achiziţie a imaginilor a fost efectuată cu o magnificaţie de 10X. Există posibilitatea tehnică să achiziţionăm la 20X, însă volumul de date generat era enorm, greu de stocat şi de 6

16 manipulat. S-a verificat şi achiziţia la 10X şi, considerându-se că se păstrează suficient detaliile morfopatologice şi se pot magnifica suficient prin funcţia computerului de zoom in, s-a realizat achiziţia pentru toate lamele la 10X. Setările microscopului au fost verificate zilnic inclusiv iluminarea Koehler, aşa cum este recomandat în manualul Zeiss Imager. Senzorul camerei foto a fost aliniat cu platanul, astfel încât unghiul dintre axele acestora a fost mai puţin de 0,01 grade, evitând astfel erorile de imagine datorate aliniamentului. Software-ul de scanare Tissue FAXS 3.5 a fost setat ca să stocheze imagini în format JPEG cu un indice de calitate de 95%. Lamele virtuale au fost realizate prin alipirea imaginilor achiziţionate. Voltajul lămpii a fost setat la 6 volţi, astfel încât analiza vizuală folosind ocularul să poată fi efectuată fără a modifica alte setări. Timpul de expunere al camerei a fost setat manual pe o imagine albă, astfel zgomotul de fond a avut o valoare de 235 pe toate canalele, respectiv roşu, verde şi albastru. Setarea automatic white balance a fost efectuată pe acelaşi spot. Gamma enhancement a fost comutat pe OFF (deci închis), impunând un comportament liniar al intensităţii luminoase. Toţi parametrii legaţi de lampă şi cameră au fost păstraţi într-un profil special de intensitate în cadrul Tissue FAXS, pentru a fi cu uşurintă accesaţi pentru toate lamele studiate, asigurându-se astfel o calitate invariabilă a imaginilor. Secţiunile tisulare scanate au necesitat 60 GB, pe un hard disk formatat NTFS; de asemenea, au fost stocate backups (variante de rezervă) pe un hard extern. Aria ţesutului scanat a întregului studiu a fost de mm 2. Definirea regiunilor de interes Iniţial s-a efectuat o analiză vizuală din punct de vedere anatomopatologic, a preparatelor virtuale. Astfel s-au delimitat zonele specifice de interes, respectiv zona de parenchim tumoral, stroma asociată tumorii şi frontul invaziv, zone alese după criterii morfopatologice. Pentru fiecare din aceste domenii s-au ales şi marcat cercuri de 1 mm diametru, utilizând instrumentul Standard Region of Interest (Roi), şi selectând aceste suprafeţe de formă circulară standard, pentru toate zonele de analizat. Fiecare din aceste Roi-uri a fost colorată, pentru uşurinţa identificării vizuale ulterioare, respectând un cod al culorilor ales de utilizator, respectiv stroma 7

17 verde, tumora albastru şi frontul invaziv roşu (pseudoculori virtuale). Această setare a facilitat identificarea rapidă şi analiză secundară, dar şi evaluare şi validare a celui de-al doilea anatomopatolog. Selecţia Roi-urilor a fost efectuată astfel încât s-au evitat ţesuturile pliate sau distruse în timpul procesării imunohistochimice, eventualele bule de aer sau artefacte. Validarea detecţiei ariei marcate După ce s-a efectuat analiza tuturor proiectelor, a fost efectuată şi validarea vizuală a identificării corecte a ariei măsurate (endoteliale, macrofagice etc.). fiecare proiect a fost redeschis şi s-a suprapus conturului vascular peste imaginile color. Vasele sangvine care nu au fost identificate de sistem datorită marcajului slab au fost selectate din Manual Correction Tool şi click pe Add event. Pe de altă parte, după cum se cunoaşte, CD 34 poate fi exprimat şi de fibroblaşti, astfel încât fibroblaştii marcaţi au fost îndepărtaţi, la fel ca şi artefactele, folosind Manual Correction Tool, respectiv Delete events. De la toţi cei 50 de pacienţi, numai 4 slide-uri virtuale au necesitat intervenţie manuală. Pentru fiecare marker s-a efectuat validarea optică umană şi-a s-au exclus marcajele considerate de mediul anatomopatolog nespecifice. Extracţia datelor cantitative Rezultatul măsurătorilor a fost exportat din cadrul proiectelor analizate şi validate, folosind modulul Batch Export care a generat o pagină Excel, conţinând toate datele relevante ale pacienţilor, respectiv aria totală analizată (AA) şi aria totală marcată (endotelială EA sau, la modul general, marcată SA - stained area ), pentru fiecare domeniu (stromă, tumoră, front invaziv) şi pentru fiecare pacient. (Figure 43) Măsurătorile derivate au fost calculate direct în Excel, una din cele mai relevante fiind relative stained area RSA (aria relativă marcată) calculată pentru fiecare domeniu după formula RSA = SA 100. Analiza statistică ulterioară AA a fost efectuată folosind SPSS 19, utilizând datele conţinute în fisierul Excel. 8

18 Alegerea domeniilor specifice Datorită faptului că angiogeneza tumorală este corelată cu stimuli chimici (hipoxia, acidoza), micromediul tumoral joacă un rol major în dezvoltarea vascularizaţiei. Dar, acest micromediu prezintă variaţii ale densităţii diferitelor proteine referitor la anumite domenii structural diferite: stromă, tumoră şi front invaziv. Astfel, studiul nostru implementează analiza specifică fiecărui domeniu, versus cuantificarea pe toată secţiunea, care nu poate pune în evidenţă variaţii în anumite perimetre, chiar în cadrul aceleiaşi probe tisulare. Nici hot-spot -urile şi nici scalele care aleg câmpuri întâmplătoare nu pot exprima variaţiile dintr-un anumit context morfologic. Faptul că studiul de faţă separă aceste zone specifice din punct de vedere morfologic şi realizează cuantificarea în aceeaşi manieră (aceeaşi suprafaţă), reprezintă un mod obiectiv de a enunţa diferenţele de vascularizaţie. Împărţirea secţiunii tisulare în zone particulare de interes aduce nu numai o specificitate mai mare a măsurătorilor, dar poate ajuta la dezvoltarea şi stratificarea criteriilor de risc, având în vedere că oferă informaţii detaliate comparativ cu măsurarea întregii arii tumorale. Standardizarea scanării Standardizarea digitizării a fost efectuată pentru a realiza o calitate constantă a imaginii pe întreg studiul. Lamele virtuale au inclus toată secţiunea tisulară astfel încât alegerea domeniilor a fost realizată în raport cu întreaga imagine a contextului morfologic. Dacă ar fi fost scanate doar câteva câmpuri microscopice nu s-ar fi putut face comparaţii, un al doilea utilizator n-ar mai fi avut acces la întreaga informaţie oferită de proba biologică. În cazul nostru, etapa de selecţie a compartimentelor tumorale este uşor de verificat şi de modificat dacă e necesar, în faza de reevaluare, putându-se efectua şi note pe lângă lama virturală. Procesul de cuantificare Măsurătorile studiului nostru au inclus parametrii legaţi de celulă comparativ cu MVD unde se cuantificau entităţi morfologice legate de vascularizaţie, noi focalizându-ne pe aria marcată relativă (RSA relative stained area) din anumite zone specifice. A urmat apoi o fază de validare, prin prisma evaluării contururilor obiectelor identificare de computer şi suprapunere peste 9

19 imaginea reală. A mai fost folosit ulterior şi un alt tip de validare al imaginii bazat pe măşti, reprezentări bazate pe nuanţe de gri etc. Acestă etapă de validare a luat în considerare şi morfologia aşteptată a structurilor marcate şi a permis îndepărtarea manuală a suprafeţelor marcate dar care nu erau vase sangvine sau macrofage limfocite, de exemplu fibroblaşti sau ţesut pliat sau zgomot de fond, artefacte. Pe parcursul analizei probelor de lal cei 50 de pacienţi, 4 probe virtuale au necesitat intervenţie manuală. Acelaşi proces a fost efectuat toate marcaje, respectiv CD 34, CD 68, CD 20, CD 8. Pentru a ne referi la aceste măsurători am utilizat termenul de relative stained area, respectiv aria relativă marcată (RSA) şi s-a calculat după formula enunţată în Extracţia datelor cantitative, RSA aria marcată/ aria analizată x 100. REZULTATE Rezultatele marcării vascularizaţiei CD 34 Analiza marcajelor a putut fi efectuata pe toată suprafaţa tisulară etalată pe lamă la toate cazurile, în condiţiile în care nu am avut distorsiuni de revelare asociate efectului de margine. Nu am avut incidente care să necesite reglaje speciale pentru achiziţia imaginilor în format electronic şi toate lamele virtuale au putut fi analizate în paralel de către 2 morfopatologi cu posibilitate de zoom in pentru validare. Stroma asociată tumorii (TAS) a fost definită ca micromediul înconjurător sau din interiorul tumorii. Reacţia desmoplazică din interiorul stromei este importantă în subclasificarea stromei de tip imatur, matur şi intermediar. Astfel, stroma matură a fost considerată cea compusă din fibre de colagen, subţiri, elongate cu straturi multiple de fibrocite; stroma intermediară etalarea de benzi late de colagen keloid-like întrerupte de fibre mature de collagen; şi stroma fibrotică imatură formată din pachete de colagen orientate întâmplător şi înconjurate de stromă mixoidă abundentă. (Figura 39) 10

20 Figura 39: Selectarea unei regiuni de interes de tip stroma asociată tumorii (TAS) marcată cu anti CD34, identificată printr-un cerc de culoare verde Fereastra din dreapta oferă o imagine de tip zoom-in, în timp în stânga ecranului aflăm poziţia acestui ROI (region of interest) raportat la toată secţiunea. Zona tumorală (T) (încercuită în albastru) a fost identificată ca având un pattern neregulat, stelat, incluzând celule epiteliale tumorale ce descriau ducte, cuiburi sau corzi. (Figura 40) Figura 40: ROI de tip tumoral 11

21 Alegerea unei ROI de tip tumoral (cerc albastru, pentru o identificare endotelială facilă), în dreapta focus in pentru surprinderea detaliilor morfologice, iar în stânga jos secţiunea per ansamblu, cu identificarea poziţiei actuale. Frontul invaziv (IF) perceput ca interfaţa de remaniere active dintre periferia tumorală şi ţesutul adiacent sănătos, a fost descris sub formă infiltrativă sau care disecă ţesutul normal pe arii largi, cu pierderea limitei de demarcaţie dintre ţesutul sănătos şi tumoră, sau, un aspect particular identificat la magnificaţii mari, dezvoltarea de agregate tumorale mici şi discontinui sau chiar celule tumorale izolate, classic cunoscute sub denumirea de muguri tumorali. (Figura 41) Figura 41: Compartiment intratumoral de front invaziv (cerc roşu), elementele identificate în zoom-in în fereatra din dreapta Aceasta reprezintă un instantaneu în cadrul programului de analiză automată. După ce medicul a ales zona de interes, în acest caz frontu de invazie, programul va calcula automat suprafaţa elementelor pozitive. În imagine, permanent se află un ecran în stânga jos care ne oferă coordonatele raportate la întreaga secţiune virtuală. În ecranul din dreapta vedem o zonă de zoom-in pentru a surprinde detalii legate de celularitate. 12

22 Procentul suprafeţei vasculare cuantificate pentru domeniul stromă atunci când vorbim de analiză globală, la toţi pacienţii, a fost de 0,91% (raportat la aria ROI delimitate de circumferinţa roşie, cu diametru de 2 mm). Vascularizaţia relativă în compartimentul tumoră (delimitat prin consens de catre morfopatologi) a fost de 1,95%, iar vascularizaţia frontului invaziv a fost calculată ca fiind 4,2% raportat la aria măsurată. Aceste valori le găsim exprimate în Figura 42 şi incluse în Tabel V. Tabel V: Area realtivă marcată (REA) pe compartimente (TAS, T, IF) pentru toţi pacienţii, dar şi pentru subgrupul reprezentat de pacientele fără afectare gangionară (N 0), cât şi pentru pacientele cu metastaze ganglionare (N>N 0) Aria endotelială relativă marcată (REA) pe compartiment Lotul studiat de 50 cazuri Subgrupul pacientelor fără metastaze ganglionare (N 0 ) 13 cazuri Subgrupul pacientelor cu afectare ganglionară (N>N 0 ) 37 cazuri TAS % 0.91% 0.91% 0.92% T % 1.95% 2.72% 1.67% IF % 4.2% 4.99% 3.92 % Rezultatele marcarii macrofagelor - CD 68 Figura 50: Zona de stromă asociată tumorii (TAS) 13

23 Print screen cu o zonă de stromă asociată tumorii marcată pentru macrofag (CD 68 ), iar în dreapta observăm fereastra de zoom-in pentru o mai bună apreciere a detaliilor celulare. Permanent, în stânga jos aflam coordonatele zonei alese, în raport cu tot slide-ul. Figura 51: Zona de tumoră propriu-zisă (T) Zonă de tumoră propriu-zisă, cu celule neoplazice, dar şi macrofage, detalii obiectivate în fereastra din dreapta, dar şi imaginea de ansamblu în ecranul din stânga-jos. Figura 52: Zona de front invaziv (IF) Zonă de compartiment intratumoral de front invaziv, după criterii anatomo-patologice, cu celule neoplazice în insule, ce invadează ţesutul adipos sănătos. Se observă marcajul macrofagelor, bine 14

24 executat tehnic, identificarea automată corectă şi raportarea la secţiunea în ansamblul ei, în fereastra din stânga jos. Aplicând acelaşi principii ca şi la măsurarea ariei endoteliale, s-a efectuat cuantificarea ariei marcate a macrofagelor. Datele sunt sumarizate în Tabel VI şi Figura 53. Tabel VI: Marcajele macrofagice în cadrul subgrupurilor de pacienţi Grup pacienţi Aria relativă marcată (CD 68 /RSA) TAS T IF N0 (fără afectare ganglionară) paciente N (cu metastaze ganglionare) paciente Toţi pacienţii (50) În toate cele trei loturi analizate N 0, N şi total pacienţi, se observă o exprimare mai mică a macrofagelor din zona de stromă asociată tumorii (TAS) şi mai pronunţată în zona frontului invaziv (IF), în timp ce în zona de tumoră propriu-zisă, macrofagele sunt cele mai dense, indiferent de absenţa sau prezenţa metastazelor limfatice. Rezultatele marcarii limfocitelor B CD 20 Figura 58: Detalii al imunomarcajului CD20+ 15

25 Imunomarcajul membranar CD20+ defineşte subsetul limfocitelor B în aceste imagini. Se remarcă distribuţia folicular-nodulară. Figura 59: Focus asupra marcării limfocitelor B Detaliu ce surprinde convergenţa populaţiei limfocitare B prezente la nivelul carcinomului infiltrativ de glandă mamară. În stânga jos se observă toată secţiunea, dar şi zona pe care am ales-o pentru zoom-in. Analiza statistică preliminară Tabel VIII: Aria relativă marcată CD20 Grup paciente Aria relativa marcata (CD20) TAS_RSA T_RSA IF_RSA N N All Remarcăm tendinţa de localizare a limfocitelor B CD 20 mai mare în aria tumorală versus stromă. Această relaţie pare să fie o 16

26 extensie a pattern-ului de localizare fiziologică a limfocitelor B în proximitatea ţestului epitelial normal. Rezultatele marcarii limfocitelor Tcitotoxic CD8+ Figura 72: Detalii al imunomarcajului CD8+ Imagine de focus-in din tumora reprezentată, ce surprinde o arie bogată în limfocite CD 8 +. Acest print screen oferă detalii legate de intensitatea culorilor, dar şi de pragul de validare, respectiv threshold. Simultan observăm imaginea de ansamblu cu identificarea zonei în care s-a efectuat focusul (imagine stânga jos). Acest printscreen pune la dispoziţie un instantaneu din timpul analizei digitale. Programul utilizat poate rula pe două monitoare LCD oferind o calitate remarcabilă şi facilitând vizualizarea de către medic. În partea stângă observăm parametrii setaţi (şi care pot fi astfel validaţi sau înlocuiţi) pentru detecţia automată. Aceşti parametrii se referă la intensităţile culorilor analizate maro şi albastră, dar şi la pragul de detecţie considerată corectă, acest prag de detecţie pentru zgomotul de fond face ca 17

27 elementele care sunt în afara intervalului de culori acceptate să fie excluse din analiza digitală. Un principiu mai clar exprimat în limba engleză garbage in, garbage out şi explicat pe larg în sensul că introducerea unor date eronate iniţial va genera rezultate false şi lipsite de credibilitate în final, este axiomatic pentru analiza digitală automatizată. Deşi ochiul uman are o capacitate discriminatorie fără programare suplimentară, totuşi rezultatele finale pot fi doar aproximate, astfel analiza computerizată, care oferă date cantitative şi reproductibile rămâne varianta de preferat. Analiză statistică preliminară Tabel IX: Aria relativă marcată - CD8 Grup paciente Aria relativa marcata (CD8) TAS_RSA T_RSA IF_RSA N N All Valorile numerice, cantitative au fost exploatate în sensul de raportare a acestor suprafeţe marcate la suprafaţa analizată care a fost constantă, respectiv un cerc cu raza de 1 mm, rezultând rapoarte denumite de noi RSA (aria relativă marcată). După cum se observă există o diferenţă dramatică în ceea ce priveşte prezenţa limfocitelor CD + 8 în frontul invaziv unde regăsim o celularitate bogată comparitv cu zonele tumorale sau de stromă asociată tumorii. Din acest punct de vedere, lotul de paciente prezintă aceleaşi caracteristici, indiferent de metastazarea ganglionară. STATISTICĂ Procesarea statistică a datelor s-a adresat secţiunii descriptive cât şi aceleia analitice centrate pe atingerea obiectivelor noastre majore. Mediul de lucru statistic a fost asigurat atât de 18

28 pachetul SPSS 17.0, fiind urmărite comparaţii între seturi de valori parametrice descriind marcajele adresate unor populaţii celulare stromale relevante în localizări intratumorale distincte şi în raport cu clase de diagnostic (histopatologic) diverse. Prelucrarea statistică a datelor descriptive pentru lotul studiat Supravieţuirea medie pentru cele 50 de cazuri reprezentând lotul de paciente complet documentat a fost de 3 ani şi 6 luni. Distribuţia valorilor de supravieţuire este neomogenă şi include cel puţin 3 categorii (Figura 77). A B C Figura 77: Media de supravieţuire (Prelucare din Output-ul SPSS) Structural, diagrama de supravieţuire apare heterogenă, incluzând extreme rapid evolutive şi relativ lent evolutive. A: Un prim subgroup de 14 persoane reprezintă cazurile cu evoluţie rapida post-diagnostic (deces sub 1 an şi 6 luni). B: Un al doilea subgroup, 33 cazuri, pare a etala timpii reprezentând supravieţuirea post-diagnostic în cadrul unei distributii de tip Gaussian (normal), cu media de supravieţuire de 4 ani. 19

29 C: Relativ puţine cazuri (3) se pot grupa într-o categorie de evoluţie relativ lentă (supravieţuire de 7 10 ani post-diagnostic). Toate cazurile fost, din punct de vedere lezional, carcinoame invazive. S-au efectuat curbe Kaplan Meier de analiză a supravieţuire în funcţie de T, N, M, G clasificare moleculară. Figura 81: Graficul supravieţuirii în funcţie de gradul histologic (Preluare din Output-ul SPSS) Graficul Kaplan Meier este concordant cu informaţia din literatură, conform căreia un grad histologic mai mic denotă o tumoră mai puţin agresivă şi paciente cu o supravieţuire mai bună. (Figura 81) Analiza supravieţuirii comparată prin prisma profilului molecular al tumorilor mamare studiate, confirmă supravieţuirea mai mare a pacientelor cu carcinom infiltrativ de glandă mamară til Luminal A, confirmată prin valorile mediei şi medianei şi prin metoda Kaplan Meier. Prelucrarea statistică a datelor pentru vasele CD 34 + Vascularizaţia ne-a apărut în evaluările optice ca fiind foarte heterogenă ca pattern în leziunile analizate. Am identificat subiectiv prezenţa variabilă a unor plaje de vascularizaţie CD34+ compactă la nivelul structurilor analizate. 20

30 Analiza statistică a fost efectuată pe întregul grup de pacienţi şi pe fiecare marker. În ceea ce priveşte marcajul cu anti CD 34 în mod particular am dorit să identificăm existenţa unei corelaţii între amploarea vascularizaţiei şi tipul compartimentului tumoral. S-au analizat zonele de interes TAS REA, T REA şi IF REA. Corelaţiile Pearson împreună cu diferenţele statistice sunt exprimate în Tabel XIII, pentru intreaga cohortă. S-au obiectivat corelaţii slabe, dar semnificative statistic între compartimentul stromă şi tumoră (r = 0,418; p = 0,003) şi între stromă şi frontul invaziv (r = 0,432; p = 0,02). Acest fapt obiectivând respectarea unor caracteristici de tip tendinţă. Tabel XIII: Corelaţii între vascularizaţia din diferitele compartimente intratumorale ale lotului studiat Compartimente intratumorale Nr pacienţi Pearson correlation statistical analizate r significance 2 tailed p TAS-T p<0.01 TAS-IF p<0.01 T-IF p<0.001 Statistic difference Sig (2 tailed) p p< p< p<0.001 Corelaţiile T-test two tailed dintre domeniul tumoral şi frontul invaziv au arătat un r = 0,655 şi p<0,001. Această corelaţie directă, medie şi semnificativă statistic, dintre tumoră şi frontul invaziv, arată faptul că frontul invaziv parcurge acelaşi trend ca şi tumora în ceea ce priveşte vascularizaţia, reprezentări importante ale ariilor endoteliale în compartimentul tumoral sunt însoţite de valori similare ale angiogenezei la nivelul periferiei tumorale. Efectul fiind asupra magnitudinii vascularizaţiei în compartimentu tumoră versus front de invazie al variilor factori determinanţi este la fel de pronunţat. Corelaţiile efectuate pentru cele două subgrupuri (N 0 şi N>N 0 ), pentru zona de vascularizaţie tumorală au arătat un r = 0,851 (p<0,001) corelaţie directă, puternică şi semnificativă statistic şi un r 21

31 = 0,565 (p<0,001) corelaţie directă, medie şi semnificativă statistic a vascularizaţiei în Frontul invaziv pentru N 0 şi N>N 0. Atunci când s-au realizat statistic comparaţii ale angiogenezei în cele 4 subgrupuri morfopatologice s-au observat corelaţii pozitive şi semnificative statistic doar între anumite compartimente, respectiv S T şi T Fi pentru subtipul luminal A, T Fi pentru luminal B, S T pentru bazal like şi T Fi pentur Her2. (Tabel XIV) Tabel XIVI: Corelaţii statistice de vascularizaţiei din compartimentele analizate, în funcţie de clasificarea moleculară a neoplasmului mamar. Subtipuri moleculare ale neoplasmului mamar Nr pacienţi luminal A 25 luminal B 9 basal-like 5 HER2 11 Perechi de compartimente analizate Corelaţii (r) Statistical significance 2 tailed p TAS-T p= p<0.05 TAS-IF p=0.169 p>0.05 T-IF p<0.05 TAS-T p=0.410 p>0.05 TAS-IF p=0.086 p>0.05 T-IF p=0.003 p<0.01 TAS-T p=0.007 p<0.01 TAS-IF p=0.475 p>0.05 T-IF p=0.244 p>0.05 TAS-T p=0.258 p>0.05 TAS-IF p=0.434 p>0.05 T-IF p= p<

32 Faptul că există corelaţii între diversele compartimente analizate validează metoda noastră de analiză partajată spaţial a celularităţii stromale ca fiind una de succes, iar în ceea ce priveşte absenţa unei relaţii de tip liniar între aceste entităţi, credem că motivul principal este legat de implicarea în fiecare categorie biologică a unor seturi diferite de variabile determinante (incluzând factori de tip diferenţiere funcţională distinctă celulară). Remarcăm asocierea constantă între amploarea dezvoltării vascularizaţiei în compartimentul tumoral şi frontul de invazie pentru toate subtipurile moleculare. Prelucrarea statistică a datelor pentru macrofage CD68+ Macrofagele sunt extrem de heterogene ca tipuri de atribuţii şi comportamente reactive propriu-zise. Ne aşteptăm ca macrofagele din domeniul tumoral să fie complet diferite de acelea din stromă. Literatura sugerează faptul că macrofagele intratumorale ar fi M 2 şi că aceste celule ar proveni preferenţial prin import vascular de monocite. În constrast, macrofagele din stromă ar fi de tip rezident (constitutiv), neactivate. (capitolul DISCUŢII) În acestă analiză statistică noi am evaluat diferenţele doar de pondere numerică a macrofagelor în aceste compartimente şi nu diferenţele eventuale ale funcţiilor sau ale căilor de apariţie locală a acestor celule. În ceea ce priveşte analiza statistică a marcajelor de macrofag s-a constat o corelaţie pozitivă, slabă r = 0,677 corelaţie directă, medie şi semnificativă statistic, p<0.001 între valoarea marcajelor stromă şi tumoră. Nu s-au obiectivat corelaţii importante între celelalte domenii intratumorale analizate. Această realitate poate sugera faptul că macrofagele din stromă pot fi funcţional similare cu cele din tumoră, în timp ce macrofagele din frontul invaziv exprimă alt comportament biologic, urmare a altui tip de diferenţiere funcţională reactivă. (Tabel XV) 23

33 Tabel XV: Analiza statistică a compartimentelor intratumorale în funcţia de expresia macrofagelor pentru tot lotul de paciente Compartimente analizate Nr. paciente Correlations Pearson correlation (r) Sig. (2- tailed) TAS T (p<0.001) TAS IF (p<0.01) T IF (p<0.001) Paired Differences Sig. (2- tailed) (p<0.05) (p>0.05) (p>0.05) Corelaţiile Pearson pentru lotul pacientelor fără interesare ganglionară le găsim în Tabel XVI. Tabel XVIII: Analiza statistică comparată a macrofagelor în diferite compartimente intratumorale în grupul pacientelor fără afectare ganglionară (N 0) TAS T Nr. paciente Pearson correlation (r) Correlations Sig. (2-tailed) TAS T (p<0.001) TAS IF (p<0.001) T IF (p<0.05) Paired Differences Sig. (2-tailed) (p>0.05) (p>0.05) (p>0.05) Corelaţii pozitive puternice au fost obiectivate între toate perechile analizate: Pereche S T r = 0,908 (corelaţie directă, foarte puternică şi semnificativă statistic, p<0,05). Deci, prezenţa 24

34 macrofagelor la nivelul stromei este corelată ca amplitudine cu prezenţa acestora în tumoră. Pereche S Fi r = 0,922 (corelaţie directă, foarte puternică şi semnificativă statistic, p<0,05). Similar, prezenţa macrofagelor în stromă indică expresia acestora şi în fontul de invazie. Pereche T Fi r = 0,749 (corelaţie directă, puternică şi semnificativă statistic, p<0,05) Aceste constatări denotă o creştere a ponderilor imunomarcajelor pentru populaţia macrofagică într-un ritm similar pentru toate compartimentele analizate. Deşi numărul pacientelor este redus, 13, corelaţiile puternice şi semnificative statistc pot reprezenta repere în iniţierea unor ipoteze medicale. În ceea ce priveşte pacientele cu interesarea ganglionilor axilari, comparaţiile inter-domenii au arătat corelaţii slabe doar între S şi T, dar cu o valoare a p<0,001, Tabel XVII. Tabel XVII: Analiza statistică comparată a macrofagelor în diferite compartimente intratumorale în grupul pacientelor cu metastaze ganglionare (N) Compartiment e analizate Nr. pacie nte Pearson correlation (r) TAS T TAS IF T IF Correlations Sig. (2-tailed) (p<0.001) (p>0.05) (p=0.001) Paired Differences Sig. (2-tailed) (p>0.05) (p>0.05) (p>0.05) Deşi aici numărul pacientelor a fost mai mare, corelaţii s-au păstrat doar între ponderea macrofagelor din stromă în relaţia cu compartimentul tumoral, sugerând astfel funcţii diferite ale macrofagelor din frontul de invazie. 25