CONTRIBUŢII LA CERCETAREA CHIMICO-TOXICOLOGICĂ A ALCOOLULUI METILIC

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GR. T. POPA FACULTATEA DE FARMACIE CONTRIBUŢII LA CERCETAREA CHIMICO-TOXICOLOGICĂ A ALCOOLULUI METILIC Rezumatul tezei de doctorat CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC, PROF. DR. FARM. ELENA BUTNARU DOCTORAND BIOLOG PRINCIPAL DOINA (BEJAN) MOALEŞ IAŞI, 2011

2 CUPRINS 1. Introducere Motivarea alegerii temei Obiectivele tezei de doctorat 2 A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 2. Metanolul. Istoric Obţinerea metanolului Obţinerea metanolului prin distilarea lemnului Obţinerea metanolului din gazul de sinteză 3. Structură. Proprietăţi fizico-chimice Structură Proprietăţi fizice Proprietăţi chimice 5 5 Pag. 4. CONSIDERAŢII ASUPRA RISCULUI LA METANOL Ecotoxicitatea metanolului Surse naturale Surse antropice Circuitul metanolului în apă Circuitul metanolului în atmosferă Circuitul metanolului în condiţii anaerobe Securitatea şi gestionarea metanolului Prevederi referitoare la deşeurile de metanol Metode de eliminare din mediu Toxicitatea metanolului Etiologia intoxicaţiilor Toxicocinetică Pătrundere. Absorbţie. Distribuţie Biotransformarea metanolului. eliminare Oxidarea metanolului la aldehidă formică Oxidarea aldehidei formice la acid formic prin intermediul formaldehid dehidrogenazei Biotransformarea acidului formic la dioxid de carbon şi apă prin intermediul folaţilor Toxicodinamie Factori care influenţează toxicitatea alcoolului metilic Factori genetici Factorii fiziologici Ritmul circadian Interacţiuni cu alte substanţe 27 2

3 Existenţa efectului cumulativ Factori dependenţi de mediu Simptomatologia în intoxicaţia cu metanol Simptomatologia în intoxicaţia acută Simptomatologia în intoxicaţia cronică Aspecte ale intoxicaţiei metanolice în sarcină Leziuni anatomo-patologice Tratamentul intoxicaţiei metanolice Etapele tratamentului Antidoturi specifice Prezenţa metanolului şi a altor congeneri volatili cu potenţial toxic în băuturile alcoolice Toxicitatea principalilor congeneri volatili ce se regăsesc în distilatele alcoolice Toxicitatea alcoolului etilic Toxicitatea aldehidei acetice Toxicitatea altor congeneri volatili Toxicitatea acetatului de etil Toxicitatea acidului acetic Toxicitatea alcoolilor amilici Metode de analiză a alcoolului metilic Metode calitative Determinarea calitativă a metanolului din băuturile alcoolice Metode de determinare cantitative Dozarea metanolului din probe biologice Determinarea cantitativă a metanolului din distilatele alcoolice prin metoda colorimetrică Dozarea metanolului din aer Determinarea metanolului prin gaz-cromatografie (GC) Metode de determinare a metanolului din sânge prin gazcromatografie (GC) Determinarea metanolului din băuturi alcoolice spirtoase prin GC B. CONTRIBUŢII PERSONALE 9. Dezvoltarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului prin gaz-cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS) Protocol de lucru Dezvoltarea metodei Validarea metodei Liniaritatea Limita de detecţie Limita de cuantificare (LQ) Intervalul (domeniul de lucru) Precizia Repetabilitatea Precizia intermediară

4 Reproductibilitatea Acurateţea (Exactitatea) Concluzii referitoare la determinarea metanolului prin GC-MS Aplicabilitatea metodei de determinare a metanolului prin GC-MS Obiectivele studiului Protocol de lucru Rezultate şi discuţii Determinarea metanolului din distilatele alcoolice naturale Determinarea concentraţiei etanolice din distilatele alcoolice natural Determinarea concentraţiei metanolului faţă de concentraţie etanolului Determinarea prin gaz-cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă a altor toxici volatili prezenţi în distilatele alcoolice Concluzii Dezvoltarea şi validarea unei metode de determinare cantitativă a metanolului din probe biologice prin GC-MS Obiectivele studiului Dezvoltarea metodei Validarea metodei Liniaritatea Limita de detecţie Limita de cuantificare (LQ) Intervalul (domeniul de lucru) Precizia Repetabilitatea Precizia intermediară Acurateţea (Exactitatea) Concluzii referitoare la determinarea metanolului din sânge prin GC-MS Aplicarea metodei GC-MS la determinarea cantitativă a metanolului din probe biologice provenite de la animale de experienţă Obiectivele studiului Material şi metodă Aparatura şi condiţiile de lucru Protocol de lucru Animalele de laborator Particularităţi anatomo-fiziologice Comportamentul animalelor de experienţă Organizarea laboratorului de cercetare Factori habituali Alimentaţia animalelor de laborator Stabilirea dozelor şi calea de administrare a metanolului la animalele de laborator Recoltarea probelor de sânge Rezultate şi discuţii Simptomatologia observată la iepurii din rasa Olandez cenuşiu Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge şi probe biologice la iepuri din rasa Olandez cenuşiu (DL 50 ). Observarea simptomatologiei 148 4

5 Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge Stabilirea şi administrarea dozei de metanol DL 100 la iepurii din rasa Olandez cenuşiu Recoltarea probelor biologice Rezultate şi discuţii Simptomatologia intoxicaţiei metanolice acute cu doză de metanol (DL 100 ) la iepurii din rasa Olandez cenuşiu Determinarea concentraţiei de metanol prin GC-MS din organe şi ţesuturi la iepuri din rasa Olandez cenuşiu Protocolul de lucru Rezultate şi discuţii Concluzii Determinarea concentraţiei de metanol în cazul intoxicaţiilor letale. Prezentare de caz Prezentarea cazului nr Prezentarea cazului nr Concluzii Incidenţa intoxicaţiilor letale cu alcool metilic din unele judeţe din România ( ) Studiu statistic al intoxicaţiilor letale pentru toate judeţele Studiu statistic al intoxicaţiilor letale pentru fiecare judeţ în parte Concluzii CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE BIBLIOGRAFIE 198 ANEXA 1 STADIUL CUNOAŞTERII 1. INTRODUCERE 1.2. OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT În contextual actual generat de importanţa elucidării mecanismului de acţiune a metanolului asupra organismului uman, cât si de importanţa testelor toxicologice în cazul intoxicaţiilor metanolice, prezenta teză de doctorat îşi propune următoarele obiective: Validarea unei metode GC-MS de determinare şi cuantificare a metanolului din 5

6 distilatele alcoolice. Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale prin metoda GC-MS. Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice naturale. Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentraţiei metanolice din probe biologice, respective sânge şi ţesuturi. Aplicarea metodei de determinare a metanolului din probe biologice într-un studiu pe animale de laborator, respective pe iepuri, care cuprinde: Evaluarea dinamicii intoxicaţiei metanolice analizând prin GC-MS probele de sânge recoltat de la iepuri la interval prestabilite, în cazul administrării unei doze DL50 de metanol. Evaluarea stării de sănătate şi dinamica intoxicaţiei metanolice prin analiza GC-MS a probelor de sânge în cazul administrării animalelor de metanol DL100. Studierea variaţiei concentraţiei metanolice din ţesuturile animalelor de experienţă, concentraţie determinată prin GC-MS. Aplicarea metodei de determinare a concentraţiei de metanol din probe biologice GC-MS, pe subiecţi umani (prezentări de caz). Evaluarea statistică a numărului de cazuri de intoxicaţii letale din unele judeţe din România. 6

7 CONTRIBUŢII PERSONALE 9. DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINARE A METANOLULUI PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ Obiective: Validarea unei metode GC-MS de determinare şi cuantificare a metanolului din distilatele alcoolice. Progresele realizate în stabilirea compoziţiei unor amestecuri complexe au fost posibile datorită perfecţionării în ultimele decenii a tehnicilor cromatografice şi în special a cromatografiei de gaze. Datorită variabilităţii mari a substanţelor care compun un distilat din produse naturale apare evidentă necesitatea utilizării unor detectori universali care să ofere un semnal analitic pentru oricare din compuşii separaţi. Sensibilitatea, precizia şi adaptabilitatea la coloanele capilare, au făcut ca spectrometrul de masă sa devenea cel mai utilizat tip de detector în analiza probelor necunoscute multicomponenţiale separate prin cromatografie de gaze iar spectrele de masă obţinute sa constituie un punct de plecare foarte important în elucidarea structurilor chimice deci şi a proprietăţilor fizico chimice şi farmacologice DEZVOLTAREA METODEI Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecţie. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un debit de 1 ml/minut. Astfel, au fost efectuate determinări iniţial pe o coloană nepolară (DB 5 MS, cu următoarele dimensiuni: 30 m lungime x 0,25 mm diametru intern şi 0,25 µm grosimea filmului depus pe pereţii interni ai coloanei). În urma analizei unei probe etalon ce conţine metanol şi etanol se observă faptul că timpii de retenţie corespunzători celor doi compuşi sunt relativ apropiaţi 1,539 minute pentru metanol şi 1,615 minute pentru etanol. Fig Separarea metanolului de etanol pe coloană HP 5 MS 7

8 Acest fapt nu este foarte important în situaţia în care cei doi alcooli se află în cantitate mică în proba analizată, în schimb, dacă etanolul se află în concentraţie mare, există riscul ca picul corespunzător etanolului să mascheze picul metanolului. Din acest motiv, în urma consultării literaturii de specialitate (U.S. Pharmacopeia Cromatographic Columns )şi a datelor tehnice privind coloanele utilizate în cromatografia de gaze ne-am oprit în cele din urmă la o coloană cromatografică Zebron Phenomenex, de tip YB-WAXplus (cu următoarele dimensiuni: 60 m lungime x 0,25 mm diametru intern şi 0,25 µm grosimea filmului depus pe pereţii interni ai coloanei). Fig Separarea metanolului de etanol pe coloană ZB-WAXplus Analizând cromatograma obţinută se observă că timpul de retenţie pentru metanol este de 6,650 iar pentru etanol este de 7,712. Dacă se ia în considerare şi lăţimea la bază a celor două picuri (0,049 pentru metanol şi 0,117 pentru etanol) s-a calculat rezoluţia între aceste două picuri, de 12,795, deci metoda este selectivă. Am efectuat analize pentru mai multe rapoarte de splitare, anume 1/10, 1/50, 1/100 şi 1/1000. Analizând datele experimentale obţinute am considerat că raportul optim de splitare este de 1/50. În continuare, pentru picul cu valoarea timpului de retenţie 6,697 se înregistrează spectrul de masă şi acesta se compară cu spectrele din biblioteca de spectre. Aşa cum se observă din figura 9.7, pentru picul cu timpul de retenţie 6,697, după compararea spectrală se obţine identitatea compusului corespunzător, în cazul de faţă metanolul. 8

9 Fig Compararea spectrului de masă al compusului din probă cu cele din baza de date (biblioteca de spectre de masă Wiley) Un alt aspect avut în vedere îl constituie verificarea purităţii picului. Acest lucru este opţional în analiza cromatografică. Puritatea picului poate fi definită ca fiind un factor de prag, sub care se pot pune întrebări cu privire la precizia rezultatelor. În urma tuturor acestor experimente am stabilit condiţiile experimentale optime de lucru: cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; injector automat tip Agilent Technologies 7683 B Series; detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană cromatografică Zebron Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm); faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 ml/minut; volum injecţie de 0,1 µl; raport splitare 1 / 50; temperatura injectorului: 250 C; gradient temperatură în compartimentul coloanei: 50 C, 20 minute, apoi temperatura creşte cu 10 C/min până la 250 C unde este menţinută constantă încă 5 minute; temperatura sursei MSD: 230 C; temperatura cvadrupolului MSD: 150 C; modul de achiziţie a spectrelor: SCAN (urmărirea tuturor liniilor din spectrul de masă); domeniul de masă urmărit: unităţi atomice de masă; interpretarea rezultatelor obţinute: Agilent Technologies ChemStation software VALIDAREA METODEI Liniaritatea Reactivi utilizaţi în studiul liniarităţii: etanol de puritate cromatografică (Merck); metanol de puritate cromatografică (Merck); apă bidistilată. soluţiile standard: la un volum de 0,5 ml metanol se adaugă 5 ml etanol şi 4,5 ml apă. Concentraţia în metanol s-a calculat ţinând cont de densitatea acestuia, conform relaţiei în care: d - densitatea metanolului (0,791 g/ml); v volumul de metanol luat în lucru (0,5 ml) V volumul final (10 ml) d v 0,791 0,5 metanol în g / ml 0, (5) V 10 solvent amestec de etanol şi apă în raport volumic de 1 / 1. Din soluţia standard (39550 g/ml) s-au preparat soluţii de lucru prin diluare cu solvent. Pornind din aceeaşi soluţie stoc, s-au preparat un număr de 3 seturi de soluţii de lucru pentru studiul linearităţii pe intervalul de concentraţie 4, g/ml. Fiecare din aceste probe au fost analizate în condiţiile menţionate şi, din cromatogramele obţinute, s-a determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului. În figura 9.9 se prezintă dreapta de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de determinare a metanolului. 9

10 Arie pic Fig. 9.9 Dreapta de calibrare la determinarea metanolului prin GC-MS Tabelul 9.3 Calculul statistic al dreptei de regresie Coeficient de corelaţie ( r) 0,9982 Coeficient de regresie ( r 2 ) 0,9963 Eroare standard a dreptei de regresie (SE) ,271 Intercept ,174 Pantă 4877,4 S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în funcţie de concentraţia injectată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4, g/ml). Ecuaţia dreptei de regresie obţinute s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate: Arie = 4877,4 x Concentraţia ( g/ml) ,174 Analizând datele experimentale obţinute se observă că există două domenii de liniaritate diferite, pe domeniul 4,9 2768,5 g/ml şi respectiv 2768, g/ml Arie pic = 6500,4 x Concentraţia R 2 = 0, Arie pic = 4685,8 x Concentraţia ,7 R 2 = 0, Concentraţie (ug/ml) Fig Domenii de liniaritate la determinarea metanolului prin GC-MS Tabelul 9.5. Calculul statistic al regresiei Domeniu de concentraţie ( g/ml) 4,9 2768,5 2768, Coeficient de corelaţie ( r) 0,9991 0,9990 Coeficient de regresie ( r 2 ) 0,9982 0,

11 Eroare standard a dreptei de regresie (SE) , ,6 Intercept , ,7 Pantă 6500,4 4685,8 Concentraţia ( g/ml) = Arie 11679,5 6500,4 Arie ,7 4685,8 Pe domeniul 4,9 2768,5 g/ml ecuaţia curbei de calibrare este: Arie pic = 6500,4 x Concentraţia 11679,5 Pe domeniul 2768, g/ml ecuaţia curbei de calibrare este: Arie pic = 4685,8 x Concentraţia , Limita de detecţie (LD) LD = 146,4 g/ml pe intervalul 4,9 2768,5 g/ml, respectiv LD = 875,8 g/ml pe intervalul 2768, g/ml Limita de cuantificare (LQ) LQ = 443,5 g/ml pe intervalul 4,9 2768,5 g/ml, respectiv LQ = 2653,9 g/ml pe intervalul 2768, g/ml Intervalul (domeniul de lucru) Având în vederea aceasta faptul că distilatele prezintă valori ale concentraţiei în etanol foarte diverse, am considerat oportun să alegem ca interval de lucru: 3559,5 9887,5 g/ml; Precizia metodei Repetabilitatea analizei. Precizia sistemului Tabelul Repetabilitatea injecţiei (Precizia sistemului) Nr. Determinării Arie pic Media SD ,9 RSD 1,0621 % Având în vedere valoarea deviaţiei standard relative obţinute (RSD = 1,0621%), se poate afirma că la determinarea prin cromatografie de gaze a metanolului, sistemul este precis. Repetabilitatea analizei (precizia metodei) Tabelul 9.9. Precizia metodei de determinare a metanolului prin GC-MS Nr.det. Concentraţie teoretică Arie pic Concentraţie calculată % 11

12 ( g / ml) ( g / ml) ,9 98, , ,1 98, ,0 98, ,4 92, , ,3 94, ,8 93, ,2 98, , ,0 98, ,4 98,7 Media 96,7 Date statistice SD 2,5735 RSD 2,6601 Deviaţia standard relativă are o valoare mai mică de 5%, respectiv, (RSD) este de 2,6601 % pe domeniul 2768, g/ml; Precizia intermediară Tabelul Precizia intermediară de determinare a metanolului prin GC-MS Nr.det. Concentraţie teoretică Concentraţie calculată Arie pic ( g / ml) ( g / ml) % ,3 98, , ,6 99, ,7 98, ,5 92, , ,2 94, ,8 94, ,9 97, , ,7 96, ,0 96,9 Media 96,5 Date statistice SD 2,2511 RSD 2,3336 Deviaţia standard relativă obţinută are o valoare mai mică de 5%, (RSD) este de 2,3336 % pe domeniul 2768, g/ml Reproductibilitatea Normele elaborate de ICH (International Conference of Harmonization) definesc reproductibilitatea ca o precizie interlaboratoare în studii de colaborare. Deoarece nu am avut posibilitatea de a aplica metoda şi în alte laboratoare, reproductibilitatea nu a fost studiată Acurateţea (Exactitatea) Tabelul Exactitatea metodei de determinare a metanolului prin GC-MS Concentraţie teoretică Concentraţie calculată Nr.det. Arie pic Regăsire % ( g / ml) ( g / ml) ,0 97,9 3559, ,6 97,9 12

13 ,5 97, ,5 92, , ,8 92, ,7 93, ,0 97, , ,5 97, ,2 97,6 Regăsire medie 95,9 Date statistice Minim 92,4 Maxim 97,9 Regăsirea medie în studiul exactităţii metodei de determinare a metanolului prin cromatografie gaze cuplată cu spectrometrie de masă are valoarea de 95,9% pe intervalul 92,4 97,9%. Având în vedere faptul că, pentrui metodele cromatografice se acceptă un interval de ± 10%, rezultă că metoda este exactă CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA METANOLULUI PRIN GC-MS Cromatograf de gaze tip Agilent Tehnologes 7890 A, detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană Zebron Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm), fază mobilă heliu cu un debit de 1 ml/min. gradient de temperatură în compartimentul coloanei: 50 C timp de 20 minute, apoi temperatura creşte cu 10 C/min până la 250 C unde este menţinută constantă încă 5 minute; volumul de soluţie injectată este de 0,1 L şi un raport de splitare de 1 / 50 în portul de intrare al injectorului ce are temperatura de 250 C; temperatura sursei MSD de 230 C şi cea a cvadrupolului MSD de 150 C; identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală faţă de biblioteca de spectre Wiley. S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în funcţie de concentraţia injectată). Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4, g/ml). Pe domeniul 4,9 2768,5 g/ml ecuaţia curbei de calibrare este: Arie pic = 6500,4 x Concentraţia 11679,5 Pe domeniul 2768, g/ml ecuaţia curbei de calibrare este: Arie pic = 4685,8 x Concentraţia ,7. Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 146,4 g/ml pe intervalul 4,9 2768,5 g/ml, respectiv LD = 875,8 g/ml pe intervalul 2768, g/ml) şi limita de cuantificare (LQ = 443,5 g/ml pe intervalul 4,9 2768,5 g/ml, respectiv LQ = 2653,9 g/ml pe intervalul 2768, g/ml). A fost stabilit intervalul de lucru: 3559,5 9887,5 g/ml; Pentru estimarea preciziei s-au determinat: repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) - RSD - 1,0621 %; repetabilitatea analizei (precizia metodei) RSD - 2,6601 % precizia intermediară RSD - 2,3336 % Exactitate - regăsire medie de 95,9% pe intervalul 92,4 97,9% pe domeniul 2768, g/ml. 13

14 10. APLICABILITATEA METODEI DE DETERMINARE A METANOLULUI PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ Obiective: Determinarea concentraţiei de metanol din distilatele alcoolice naturale prin metoda GC-MS. Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice naturale PROTOCOL DE LUCRU S-au analizeazat un numar de 98 de probe de distilate alcoolice naturale, care constitue produse rezultate in urma distilarii amestecurilor de macerate de fructe (mere, pere, prune, struguri ), macerate simple de prune sau struguri (tescovină). Aceste produse de distilare denumite ţuică sau rachiu se regăsesc în toată ţara. Reţetele după care se prepară nu au o specificitate aparte, acestea ţinând de reteta personală a celor care prepara aceste produse, având astfel un caracter artizanal. Probele au fost analizate conform metodei de determinare a metanolului din distilatele alcoolice prin GC-MS utilizand acelaşi aparat şi aceiaşi parametri de lucru REZULTATE ŞI DISCUŢII Determinarea metanolului din distilatele alcoolice naturale Probele au fost prelevate din zona Moldovei în perioada Majoritatea probelor provin din judeţul Bacău respectiv 82 de probe celelelte 16 probe provin din alte şapte judeţe. Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidenţă două probe ca fiind sub limita de determinare şi una sub limita de cuantificare. Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului ( g/ml distilat ) cuprinse între 499,5-8316,0 g/ml distilat. Vaoarea medie cea mai mare regăseşte în distilatele din prune, respectiv 3320,46 g/ml distilat. Media cea mai scăzută a concentraţiei metanolului în g/ml distilat se observă în probele de distilat alcoolic prelucrate din tescovină. Fig Variaţia valorii medii a concentraţiei metanolului ( g/ml distilat) funcţie de natura distilatelor 14

15 Regulamentul CEE 1014/90 şi STP prevede că valoarea concentraţiei de metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 ml alcool etilic anhidru. Pentru raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 ml etanol anhidru s-a determinat conţinutul în etanol pentru fiecare probă de distilat în parte, cu o metoda, conform legislatiei in vigoare Determinarea concentraţiei metanolului faţă de concentraţia de etanol Raportând concentraţia de metanol g/ml distilat la concentrţia de etanol din probele analizate, s-au obţinut valori între 0,12 2,3 g/ 100 ml etanol anhidru, dintre care: 19 probe au valori ale concentrţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100 ml alcool etilic anhidru), din care: 6 probe cu valori ale concentraţiei in metanol peste limită, distilate din tescovina, reprezentand 6,12% din totalul probelor analizate. 7 probe cu valori ale concentraţiei alcoolului metilic peste limita admisă, provenite din amestec de fructe, îsemnând 7, 14% din totalul probelor de distilat analizate. 6 probe cu valori ale concentraţiei metanolului peste limitele admise reprezintă 6,12% din totalul probelor de distilate. Din calculul concentraţiei medii a metanolului din probele de distilat analizate în funcţie de materialul din care au fost prelucrate se observă : Concentraţiamedie a metanolului la 100 ml etanol anhidru Amestec fructe Altele Prune Tescovina Toate Fig Variaţia valorii medii a concentraţiei metanolului ( g/100 ml etanol anhidru) funcţie de natura distilatelor Concentraţia medie a metanolului la 100 ml etanol anhidru Comanesti (BC) Blăgeşti (BC) Straoani (BC) Panciu (VN) Altele Fig Concentraţia medie pentru localităţile de provenienţă a distilatelor analizate care au valori ale metanolului (la 100 ml etanol anhidru) peste limitele admise de STAS-urile în vigoare 15

16 În funcţie de provenienţa probelor cu valori ale concentraţiei metanolice peste limita admisă se constată că distilatele din Localitatea Străoani Jud. Bacău (figura 10.9.) prezintă cea mai mare medie a concentraţiei de metanol la 100 ml etanol anhidru, respective 1,92 g/100 ml etanol anhidru. Valoarea aceasta este urmată de valoarea concentraţiei medii a metanolului din distilatele provenite din Localitatea Blăgeşti Jud. Bacău cu 1,85 g/100 ml etanol anhidru Determinarea prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă a altor toxici volatili prezenţi în distilatele alcoolice În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de distilate naturale s-au identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri (Jung A., 2010). Aceştia au fost identificaţi prin metoda SCAN comparându-se timpii de retenţie cu datele din bibliotecile spectrale. Concentraţia acestora se calculează raportând aria picului ce corespunde fiecărui compus detectat şi identificat, faţă de aria totală a picurilor detectate. Concentraţia în ml/total congeneri a compuşilor volatili detectaţi si identificaţi s-a calculat raportându-se procentul de arie al fiecăruia la concentraţia în volume a etanolului, concentraţie ce a fost obţinută anterior. În urma centralizării acestor date, s-a constatat că o parte din compuşii identificati se regăsesc mult mai des în probele de distilate faţa de alţii. Astfel s-a efectuat un calcul statistic privind frecvenţa detectării acestor compuşi, calcul care este prezentat în tabelul Acest tabel prezintă compuşii care au fost detectaţi în mai mult de 50 de determinări, valoarea maximă, medie şi minimă a ariei procentuale din total compuşi volatili, a volumului (ml / ml distilat) cât şi numărul de probe în care s-au detectat. Tabelul Compuşi detectaţi care au mai mult de 50 determinări Compus detectat Area % ml/100 ml distilat Maxima 0,67 0,31 1,4,7,10,13,16-Hexaoxacyclooctadec Media 0,20 0,08 Minima 0,03 0,01 Maxima 0,64 0,31 12-Crown-4 / 12-Crown-5 Media 0,21 0,09 Minima 0,21 0,09 Maxima 2,56 1,07 Acetat de etil Media 1,04 0,45 Minima 0,23 0,09 Maxima 2,49 0,88 Acetic acid Media 0,84 0,34 Minima 0,05 0,02 Maxima 1,56 0,87 Alcool izoamilic Media 0,78 0,34 Minima 0,03 0,01 Maxima 99,01 69,80 Ethanol Media 95,88 41,61 Minima 92,48 10,90 Maxima 0,47 0,23 Ethanol, 2-(1-methylethoxy)- Media 0,17 0,07 Minima 0,47 0,23 Methanol Maxima 1,60 0,77 Media 0,73 0,30 Nr. 57,00 55,00 71,00 73,00 96,00 98,00 61,00 98,00 16

17 Minima 0,16 0,05 1% 3% Etanol Metanol Congeneri 96% Fig Ponderea etanolului şi metanolului faţă de congeneri (% valori medii) Din totalul compuşilor volatili detectaţi 96% reprezintă etanol, 3% alţi compuşi volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul reprezintă 1,04% CONCLUZII În vederea determinării concentraţiei de alcool metilic şi a prezenţei compuşilor volatili în distilatele alcoolice naturale, s-au analizat un număr de 98 de probe de distilate alcoolice naturale care provin din zona Moldovei. Determinarea concentraţiei metanolului şi a compuşilor volatili din distilatele alcoolice naturale s-a efectuat prin GC - MS, conform metodei. Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidenţă două probe ca fiind sub limita de determinare şi una sub limita de cuantificare. Cele 95 de probe prezintă concentraţii ale metanolului ( g/ml distilat) cuprinse între 499,5 g/ml distilat şi 8316,0 g/ml distilat. Regulamentul CEE 1014/90 şi STP prevede că valoarea concentraţiei de metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 ml alcool etilic anhidru. Pentru raportarea concentraţiei metanolului faţă de 100 ml etanol anhidru s-a determinat conţinutul în etanol. Raportând concentraţia de metanol g/ml distilat la concentrţia de etanol din probele analizate, s-au obţinut valori între 0,12 2,3 g/ 100 ml etanol anhidru, dintre care: - 19 probe au valori ale concentraţiei metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100 ml alcool etilic anhidru), din care în funcţie de materialul din care s-au distilat sunt: Tescovină - 6 probe amestec de fructe - 7 probe prune - 6 probe Din calculul concentraţiei medii a metanolului din probele de distilat analizate care au concentraţia metanolică peste limita admisă în funcţie de materialul din care au fost prelucrate se observă : valoarea medie cea mai mare a concentraţiei metanolice se regăseşte în probele de distilate provenite din macerarea şi distilarea prunelor, respectiv 1,67 g/100 ml etanol anhidru; valoarea medie cea mai scăzută o întâlnim la probele provenite din distilarea amestecurilor de fructe de 1.38 g/100 ml etanol anhidru. valoarea medie generală pe cele 19 probe de distilat cu concentraţii metanolice peste limita admisă este de 1,51 g/100 ml etanol anhidru. În funcţie de provenienţa probelor cu valori ale concentraţiei metanolice peste 17

18 limita admisă se constată că cele mai multe provin din Comăneşti Jud. Bacău respectiv 7 probe, reprezentând 36% din totalul probelor, cele mai putine probe provenind din Panciu Jud. Vrancea şi Străoani Jud. Bacău cu câte 2 probe şi un procent de 11%. În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de distilate naturale s-au identificat o serie de compuşi volatili denumiţi congeneri. Din totalul compuşilor volatili detectaţi 96% reprezintă etanol, 3% alţi compuşi volatili şi 1 % alcool metilic. Faţă de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul reprezintă 1,04%. 11. DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINAREA CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ Obiective: Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentraţiei metanolice din probe biologice, respective sânge şi ţesuturi. Intoxicaţiile metanolice de diferite etiologii, dar cu precădere cu etiologie alcoolică, constituie cauza multor urgenţe medicale, dar şi a multor decese (Şorodoc L., 2009). Important în acest sens este ca diagnosticul cu privire la natura toxicului la care a fost expus pacientul să fie pus cât mai prompt pentru administrarea unei scheme de tratament adecvate. În acest sens s-a încercat elaborarea şi validarea unei metode de determinare a metanolului din produsele biologice într-un timp scurt şi eficient. Prin această metodă s-a avut în vedere analizarea din punct de vedere calitativ şi cantitativ a metanolului din sânge, dar şi din organe, în cazul examenului toxicologic pe cadavru DEZVOLTAREA METODEI Pentru a realiza separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a metanolului din probe biologice prin cromatografie de gaze, cuplată cu spectrometrie de masă, au fost efectuate iniţial o serie de teste, obligatorii de altfel, pentru a stabili condiţiile experimentale optime de analiză (Dorneanu V., 2003, Lazăr D., 2000). Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecţie. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un debit de 1 ml/minut. În ceea ce priveşte alegerea coloanei staţionare folosite s-a avut în vedere determinarea metanolului din distilate alcoolice astfel, ca fază staţionară a fost utilizată o coloană polară Zebron Phenomenex, de tip YB-WAXplus (60 m x 0,25 mm; 0,25 µm). Portul de intrare al injectorului se află la o temperatură de 250 C. Cantitatea de probă injectată este de 1 L cu un raport de splitare de 1/50. Faza mobilă - heliu (debit 1 ml/min). Programul de temperatură porneşte de la 50 C (temperatură menţinută constantă timp de 16 minute) şi creşte la 250 C cu o viteză de 25 C. În ceea ce priveşte sistemul de detecţie, parametrii de lucru sunt următorii: temperatura sursei MS: 230 C; temperatura quadrupolului: 150 C; mod de achiziţie (SIM Single Ion Monitoring) - mod de lucru: SIM, ionii înregistraţi fiind cei cu raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32; detecţie oprită între minutul 12 şi 15 (interval de timp necesar pentru eliminarea apei din probă). 18

19 Fig Cromatograma unei soluţii ce conţine metanol (provenienţă intestin) Fig Spectrul de masă al picului cu timpul de retenţie 6,755 Fig Compararea spectrului de masă al compusului din probă 19

20 În ceea ce priveşte modul de preparare a probelor pentru izolarea alcoolului metilic, acestea au fost prelucrate prin distilare conform metodei Cordebard VALIDAREA METODEI Liniaritatea Pentru evaluarea liniarităţii s-a avut în vedere un necesar de minim 5 valori ale concentraţiei pentru cel puţin trei serii de soluţii de substanţe standard de diferite concentraţii (de regulă concentraţia de interes ± 20 până la 50% pentru valorile extreme de concentraţie ( Yowomo M., 2005, Roman L., 1998). Reactivi necesari: metanol de puritate cromatografică (Merck); apă bidistilată; soluţiile standard. În ceea ce priveşte pregătirea standardelor de lucru s-a procedat astfel: Pentru calculul concentraţiei în metanol se are în vedere densitatea metanolului (d) în mg/ml (0,791), volumul de metanol şi volumul final al probei. Astfel, pentru prepararea standardelor de lucru s-a lucrat în modul următor: un volum (v) de 0,5 ml metanol a fost amestecat cu un volum de 9,5 ml sânge obţinându-se un volum total (V) de 10 ml soluţie stoc (ST 1) a cărei concentraţie se calculează folosind formula următoare: d v 0, 791 0,5 0,03955 g/ml=39550 g/ml V 10 Din soluţia astfel obţinută au fost preparate prin diluare cu sânge soluţii de diferite concentraţii. Aceste soluţii au fost supuse distilării conform modului descris. Pornind din aceeaşi soluţie stoc, s-au preparat un număr de 3 seturi de soluţii de lucru pentru studiul linearităţii pe intervalul de concentraţie 4, ,00 g/ml. Fiecare din aceste probe au fost analizate în condiţiile menţionate şi, din cromatogramele obţinute, s-a determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului. Se reprezintă grafic variaţia ariei medii în funcţie de concentraţie şi se determină intervalul de concentraţie pentru care această variaţie este liniară. Se trasează dreapta de regresie pentru acest interval şi se determină coeficientul de corelaţie (r), deviaţia standard a pantei dreptei de regresie (s) şi ecuaţia dreptei ce redă modificarea ariei picului în funcţie de concentraţie: Arie pic = a x Concentraţia + b a = panta, b = intercept În figura se prezintă dreapta de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de determinare a metanolului. 20

21 Arie pic Arie pic = 7041,6 x Concentraţia ,3 R 2 = 0, Concentraţie (ug / ml) Fig Dreapta de calibrare la determinarea metanolului prin GC-MS-SIM Tabelul Calculul statistic al dreptei de regresie Coeficient de corelaţie ( r) 0,9997 Coeficient de regresie ( r 2 ) 0,9994 Eroare standard a dreptei de regresie (SE) ,35 Intercept 6137,3 Pantă 7041,6 Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4, g/ml sânge sau 1, ,67 g / ml distilat) Limita de detecţie Utilizând datele obţinute la studiul liniarităţii se obţine: LD = 139,3 μg/ml Limita de cuantificare (LQ) Estimarea LQ s-a realizat pe baza erorii standard a dreptei de regresie şi a pantei dreptei de regresie Intervalul (domeniul de lucru) LQ = 422,1 μg/ml A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 6591,67 g/ml distilat respectiv 417, ,01 g/ml sânge Precizia Pentru estimarea preciziei s-au determinat: repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări, valoarea deviaţiei standard relative (RSD) fiind de 0,8748 %; repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluţii independente la trei nivele de concentraţie diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de 4,6811 % pe domeniul 263,67 527,33 g/ml distilat; precizia intermediară pentru trei soluţii independente la trei nivele de concentraţie diferite pentru care valoarea deviaţiei standard relative (RSD) este de de 4,1078 % pe 21

22 domeniul 263,67 527,33 g/ml distilat; Acurateţea (Exactitatea) Pentru estimarea exactităţii s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe la trei nivele de concentraţie diferite obţinându-se o regăsire medie de 98,0% pe intervalul 93,2 102,8% CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN GC-MS.» cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană cromatografică Zebron Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm şi o grosime a filmului de 0,25 µm); injector automat tip Agilent Technologies 7683 B Series;» faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 ml/minut;» volum injecţie de 1 µl; raport de splitare 1 / 50;» temperatura injectorului: 250 C;» gradient temperatură în compartimentul coloanei: 50 C (temperatură menţinută constantă timp de 16 minute) şi creşte la 250 C cu o viteză de 25 C.» temperatura sursei MSD: 230 C; temperatura cvadrupolului MSD: 150 C;» modul de achiziţie a spectrelor: SIM (urmărirea liniilor din spectrul de masă cu raportul M/Z = 15, 29, 31 şi 32);» interpretarea rezultatelor obţinute: Agilent Technologies ChemStation software. S-a studiat liniaritatea funcţiei de răspuns. Funcţia de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4, g/ml sânge sau 1, ,67 g/ml distilat). Ecuaţia dreptei de regresie obţinută (în cazul exprimării concentraţiei pe ml distilat) s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate. Au fost calculate limitele de detecţie (LD = 139,3 g/ml) şi limita de cuantificare (LQ = 422,1 g/ml). A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 6591,67 g/ml distilat respectiv 417, ,01 g/ml sânge; Pentru estimarea preciziei s-au determinat: repetabilitatea injecţiei (precizia sistemului) RSD - 0,8748 %; repetabilitatea analizei (precizia metodei) RSD - 4,6811 % precizia intermediară RSD - 4,1078 % Pentru estimarea exactităţii - regăsire medie 98,0 % pe intervalul 93,2 102,8 %. 12. APLICABILITATEA METODEI GC-MS LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PROVENITE DE LA ANIMALE DE EXPERIENŢĂ Obiective : 1. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge în cazul injectării de metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa Olandez cenuşiu şi observarea simptomatologiei intoxicaţiei. 2. Determinarea variaţiei concentraţiilor de metanol în sânge şi organe în cazul injectării de metanol cu doza de DL100 la iepuri din rasa Olandez cenuşiu şi observarea simptomatologiei intoxicaţiei. Pentru studierea absorbţiei, acumulării toxicului, s-a optat pentru testarea toxicităţii metanolului pe organismul animal, în conformitate cu legislaţia în vigoare. Acest studiu s-a 22

23 efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Animală din cadrul Universităţii V. Alecsandri Bacău, Facultatea de Biologie, pe un lot de iepuri. Rasa utilizată în vederea cercetării a fost Iepurele cenuşiu olandez. Studiile pe animale sunt supuse legislaţiei în vigoare respectiv OG. 37/2002 cu privire la protecţia animalelor folosite în scopuri ştiinţifice sau în scopuri experimentale aprobată cu L 471 / MATERIAL ŞI METODĂ Metoda a fost testată pe mai multe tipuri de probe biologice (sânge, ţesut), efectuate pe acelaşi aparat şi aceiaşi parametri utilizaţi la validarea metodei. Pentru ca probele de sânge şi ţesuturi să poată fi analizate prin GC-MS, au fost prelucrate prin distilare (metoda Cordebard). DETERMINAREA VARIAŢIEI CONCENTRAŢIILOR DE METANOL ÎN SÂNGE ÎN CAZUL INJECTĂRII DE METANOL CU DOZA DE DL 50 LA IEPURI DIN RASA OLANDEZ CENUŞIU ŞI OBSERVAREA SIMPTOMATOLOGIEI INTOXICAŢIEI Stabilirea dozelor şi modul de administrare a metanolului la animalele de experienţă Lotul experimental a fost compus din cinci femele de iepuri aparţinând rasei Olandez cenuşiu. Acestea prezintă o masă corporal cuprinsă între 2000 şi 2400 g. Din punct de vedere anatomo fiziologic, sunt mature având vârsta de şase luni. Dozele de alcool metilic care s-au administrat în vederea inducerii intoxicaţiei metanolice au fost stabilite faţă de literatura de specialitate (Roe O., 1982, Silverman J., 2002, Ciudin E., 2004). Administrarea dozei s-a efectuat intraperitoneal. S-a optat pentru acest gen de administrare deoarece doza de administrat este mai mică, iar posibilitatea de administrare orală a toxicului era destul de scăzută ţinând cont de comportamentul sensibil al iepurelui. Administrarea intravenoasă a metanolului ar fi indus necroza endovenoasă, ceea ce ar fi periclitat atât sănătatea animalului pe durata experimentului cât si deprecierea locurilor de elecţie în vederea recoltării sângelui pentru analiză. Pentru fiecare exemplar s-a calculat doza de administrare în funcţie de masa corporală. Tabelul Doza de metanol DL 50 calculată pentru lotul experimental de iepuri, conform masei corporale Nr. Masă corporală g Doză administrată DL ,8 ml ,5 ml ,3 ml ,1 ml ,8 ml Recoltarea probelor în urma administrării metanolului în doză DL 50 la iepurii din rasa Olandez cenuşiu Probele de sânge s-au recoltat din vena femurală, la următoarele intervale: I 75 minute, II 195 minute, III 375 minute Rezultate şi discuţii 23

24 Din rezultatele obţinute în urma analizei sângelui recoltat la intervale prestabilite, se constată ca cea mai scăzută concentraţie la prima serie de recoltări, respectiv la 75 de minute s-a înregistrat la iepurele numărul 1, cu o valoare de 0,69 mg/ml şi cea mai crescută la iepurele numărul 3 cu 0,95 mg / ml. La a doua serie de recoltări, la 195 de minute, valoarea cea mai mică s-a înregistrat la iepurele nr. 5 ( 0,75 mg /ml), valoarea cea mai mare înregistrându-se la iepurele nr. 3 cu 1,02 mg/ml. Seria a treia de recoltări se evidenţiază cu 0,68 mg/ml reprezentând valoarea cea mai mică şi 0,89 mg/ml, reprezentând valoarea cea mai crescută. Fig Reprezentarea grafică a valorilor concentraţiei metanolice din probele de sânge recoltate în prima etapă Conform acestor valori este evident că în minutul 75 metanolul nu era complet în circuitul metabolic, vârful concentraţiei regăsindu-se în minutul 195, ţinând cont că în minutul 375 concentraţiile erau deja în descreştere. În prima parte a metabolismului creşte concentraţia cu 0,012 mg/ml pe minut, de la minutul 75 până la minutul 195 e înregistrează o creştere extreme de lentă de 0,0002 mg/ml pe minut ca panta descendentă sa se exprime cu o descreştere de 0,0004 mg/ml. Se poate spune că dacă absorbţia este foarte rapidă metabolismul este extrem de lent SIMPTOMATOLOGIA ÎNTOXICAŢIEI METANOLICE ÎN URMA ADMINISTRĂRII DE METHANOL ÎN DOZĂ DL50 LA IEPURII DIN RASA OLANDEZ CENUŞIU Pe parcursul derulării experimentului s-au urmărit o serie de parametri fiziologici şi s- au făcut observaţii referitoare la simptomatologia intoxicaţiei metanolice La primul interval de recoltare la 75 de minute sensibilitatea la metanol a fost minimă. Simptomatologia intoxicaţiei metanolice s-a concretizat la toţi subiecţii practic la cel de-al doilea interval de recoltare, respectiv la 195 de minute de la injectare. La a treia recoltare la intervalul de 375 de minute toţi subiecţii prezentau aceiaşi simptomatologie, respective somnolenţă, dezechilibru motor, dificultăţi de deplasare, manifestată cu precădere la membrele inferioare posterioare prin imposibilitatea de coordonare şi mişcare, stare general de relaxare. 24

25 Pulsuri/minut Minute Fig Variaţia în timp a pulsului mediu ca simptomatologie observată după administrarea DL 50 Evoluţia valorilor pulsului este diferită de la individ la individ, în medie valoarea cea mai crescută raportându-se la minutul 75 de la administrarea metanolului, având o evoluţie descendentă în raport cu evoluţia concentraţiei metanolice regăsită în probele de sânge recoltate pe intervalele prestabilite. Această evoluţie atât a concentraţiei metanolice determinată din sânge cât şi a simptomatologiei denotă faptul că toxicitatea metanolului are un caracter individualizat în funcţie de fiecare subiect DOZAREA METANOLULUI PRIN GC-MS DIN SÂNGE ŞI PROBE BIOLOGICE LA RASA DE IEPURI OLANDEZ CENUŞIU (DL 100 ). Observarea simptomatologiei intoxicaţiei Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge a A doua etapă a experimentului s-a desfăşurat la un interval de 72 de ore de la încheierea primei etape pe aceiaşi subiecţi. S-a optat pentru un astfel de interval între cele două serii de experimente pentru ca organismul subiecţilor să elimine complet metanolul şi produşii de metabolism ai acestuia şi starea de sănătate să revină la normal pentru a nu denature simptomatologia intoxicaţiei metanolice. În acest interval iepurii au fost hrăniţi şi hidrataţi corespunzător normelor de hrană şi îngrijire, urmârindu-se îndeaproape comportamentul pentru a depista eventualele deficienţe sau afecţiuni. După 72 de ore iepurii prezentau o stare de sănătate bună şi un comportament normal Stabilirea şi administrarea dozei de metanol DL 100 la iepurii din rasa Olandez cenuşiu A doua doză administrată a constituit o doză letală DL100, doză calculată în funcţie de masa corporală a fiecărui subiect. Tabelul Cantitatea de metanol DL 100 administrat la iepurii din rasa Olandez cenuşiu în funcţie de masa corporală Nr. Masă corporală g Doză administrată DL ,6 ml ,0 ml ,6 ml ,2 ml 25

26 ,6 ml Recoltarea probelor biologice Recoltarea probelor de sânge în vederea determinării metanolului s-a efectuat în două serii, a câte 5 ml, prima serie la 75 de minute, a doua serie în momentul decesului subiectului testat. seria 1 la 75 minute de la expunere, seria 2 în momentul decesului subiectului testat Rezultate şi discuţii Rezultatele privind concentraţia de methanol din sângele recoltat în cea de-a doua etapă a experimentului sunt exprimate în tabelul , intervalul de timp la care s-a făcut recoltarea respective, prima probă la 75 de minute şi a a doua probă la momentul decesului, cât şi valorile concentraţiei metanolice obţinute prin analiza GC-MS. Tabelul Valorile concentraţiei metanolului determinat în sânge la iepuri în cazul intoxicaţiei acute cu DL100 (4,8 ml/kg corp) Greutate corporală (g) Subiecţii Doza DL100 metanol (ml) 75 minute Metanol determinat în sânge (mg/ml) în momentul decesului ,6 1,08 1, ,76 1, ,6 1,77 1, ,2 1,39 1, ,6 1,29 1,23 Din datele etalate în tabelul se observa că la 75 de minute de la administrarea dozei de metanol DL 100, valorile concentraţiei metanolului în sânge sunt variabile, cea mai mică valoare fiind înregistrată la subiectul nr. 1, cu 1,08 mg/ml faţă de cea mai mare valoare înregistrată la subiectul 3 cu o valoare de 1,77 mg/ml. Fig Variaţia concentraţiei de metanol din probele de sânge înainte şi după exitus 26

27 În cazul valorilor concentraţiilor metanolice determinate din sânge în momentul decesului subiecţilor, se constată de asemeni o mare fluctuaţie de valori, care ţin de factorii individuali şi de intervalul de timp la care s-a produs decesul. Faţă de perioada de supravieţuire de la administrarea metanolului până la deces, cel mai mult a supravieţuit subiectul nr. 2 cu 200 de minute, cel mai puţin supravieţuind subiectul nr. 3 cu 105 minute. Variaţia cea mai mare dintre valoarea concentraţiei metanolice în viu şi valoarea concentraţiei metanolice la deces a fost înregistrată la subiectul nr. 1 care la 75 de minute de la injectarea cu metanol avea o concentraţie metanolică de 1,08 mg/ml şi în momentul decesului de 1,55 mg / ml, diferenţa dintre cele două valori acumulându-se în 85 de minute. Calculându-se o rată de acumulare pentru cei cinci iepuri, din momentul injectării până la minutul 75, metanolul a avut o rată de acumulare cuprinsă între 0,014-0,023 mg/ml/minut Simptomatologia întoxicaţiei metanolice acute cu doză de methanol DL100 la iepurii din rasa Olandez cenuşiu Concomitent cu recoltarea probelor de sânge s-au făcut observaţii privind simptomatologia intoxicaţiei acute provocate de metanolul injectat intraperitoneal la iepurii de experienţă pentru DL 100 (4,8 ml/kg corp). După 75 de minute de la injectarea a metanolului DL 100 se observă apariţia somnolenţei, dezechilibrului motor, a stării de relaxare, a urechilor lăsate, ochi exoftalmici, puls filiform, la toţi subiecţii testaţi. Dacă la doza de metanol DL 50 simptomatologia intoxicaţiei la 75 de minute de la administrarea metanolului era prezentă cu simptome uşoare la 60 % dintre subiecţi, la o administrare a unei doze de DL 100, simptomatologia intoxicaţiei este prezentă la 100% din subiecţi. În funcţie de rezistenţa fiecărui organism şi mai ales în funcţie de particularităţile metabolice ale fiecărui subiect, aceştia au supravieţuit mai mult sau mai puţin. Insuficienţa cardio respiratorie, au determinat decesul subiecţilor după minute de la administrarea DL Determinarea concentraţiilor de metanol prin GC-MS din organe şi ţesuturi la iepuri din rasa Olandez cenuşiu Protocol de lucru După exitus toţi subiecţii testaţi prin administrare intraperitoneală a unei doze DL 100 cu metanol, au fost autopsiaţi. Conform protocolului de prelevare de probe biologice s-au prelevat de la fiecare subiect fragmente de organe în vederea examenului toxicologic. Astfel s- au recoltat fragmente de creier, ochi, fragmente de cord, plămân, ficat şi rinichi. Probele s-au condiţionat separate pentru fiecare tip de ţesut, în flacoane sterile, prevăzute cu capac etanş şi etichetate. Fiecare etichetă a fost inscripţionată cu : numărul iepurelui, conţinut, data şi ora prelevării. Pentru examenul toxicologic al ţesuturilor în vederea determinării concentraţiei de metanol s-au prelevat câte 5 g ţesut din fiecare organ. Pentru acurateţea rezultatelor, probele au fost cântărite cu o balanţă analitică ANH. 27

28 Rezultate şi discuţii Tabelul Valorile medii ale metanolului (în mg/g probă) în diferite ţesuturi în cazul intoxicaţiei cu DL100 la iepure (4,8 ml metanol/kg corp) Proba din organe g / ml distilat g/15 ml distilat g/5 g probă g/ g probă mg/g probă Proba 1 - creier , , , ,83 1,56 Proba 2 - creier , , , ,58 1,52 Proba 3 - creier , , , ,31 1,88 Proba 4 - creier , , , ,01 1,51 Proba 5 - creier , , , ,60 1,62 Media creier 1,62 Proba 1 - Ochi , , , ,40 1,32 Proba 2 - Ochi , , , ,08 1,50 Proba 3 - Ochi , , , ,61 1,70 Proba 4 - Ochi , , , ,20 1,26 Proba 5 - Ochi , , , ,93 1,21 Media ochi 1,40 Proba 1 - Cord , , , ,15 1,16 Proba 2 - Cord , , , ,66 1,54 Proba 3 - Cord , , , ,72 2,26 Proba 4 - Cord , , , ,71 1,54 Proba 5 - Cord , , , ,69 1,65 Media cord 1,63 Proba 1 - Pulmon , , , ,46 1,52 Proba 2 - Pulmon , , , ,63 1,95 Proba 3 - Pulmon , , , ,45 1,83 Proba 4 - Pulmon , , , ,91 2,08 Proba 5 - Pulmon , , , ,28 1,40 Media pulmon 1,76 Proba 1 - Ficat 504, , , ,54 1,51 Proba 2 - Ficat , , , ,33 1,65 Proba 3 - Ficat , , , ,92 3,81 Proba 4 - Ficat , , , ,60 1,62 Proba 5 - Ficat , , , ,99 2,23 Media ficat 2,16 28

29 Proba 1 - Rinichi , , , ,78 1,32 Proba 2 - Rinichi , , , ,20 1,45 Proba 3 - Rinichi , , , ,32 2,22 Proba 4 - Rinichi , , , ,38 1,44 Proba 5 - Rinichi , , , ,55 1,89 Media rinichi 1,66 Media generală organe Minima 1,16 Maxima 3,81 Faţă de rezultatele obţinute cea mai mare concentraţie s-a obţinut în proba de ficat recoltată de la subiectul nr. 3 cu o valoare de 3,81 mg/ml. Cea mai scăzută valoare s-a regăsit în fragmentul de cord recoltat de la subiectul nr. 1, respectiv 1,16 mg/ml. Media valorilor concentraţiilor metanolice pe tipurile de organe prelucrate a fost de 1,70 mg/ml, din care media concentraţiilor metanolice obţinute din creier reprezintă 1,62 mg/ml, cord 1,63 mg/ml, plămân 1,76 mg/ml, rinichi 1,66 mg/ml şi cea mai mare valoare în ficat cu 2,16 mg/ml. 1,70 Fig Variaţia valorilor medii ale concentraţiei metanolului determinat în organe faţă de valoarea medie generală în organe, determinată în cazul intoxicaţiei provocate de DL 100 la iepure. ( 4,8 ml /kg ) În figura este prezentată fluctuaţia concentraţiei de metanol în organele analizate. Astfel, sunt prezentate valorile medii ale concentraţiei metanolice obţinute din analiza GC-MS a probelor prelevate de la cei cinci iepuri, probe din creier, ochi, cord, plămân, ficat şi rinichi. Acestea sunt prezentate comparativ cu valoarea mediei generale. Din sinteza datelor rezultă că valoarea medie cea mai mare s-a determinat în ficat, respectiv 2,16 mg / ml, iar valoarea cea mai scăzută s-a înregistrat în ochi, de 1,40 mg/ml. Concentraţia din pămâni, de 1,76 mg/ ml este mai mare datorită afinităţii crescute a metanolului pentru celula alveolară pulmonară cât şi funcţiei respiratorii care stimulează circulaţia la nivel pulmonar. Concentraţia metanolică scăzută de la nivelul ochilor se explică prin faptul că globii oculari prezintă o mare cantitate de lichid provenit din lichid lacrimal şi umoare apoasă. Valoarea medie generală a concentraţiei metanolice s-a calculat la 1,70 mg/ml, valoare reprezentativă faţa de valorile obţinute pe organele analizate. Figura exprimă reprezentarea grafică a mediilor concentraţiilor de metanol 29

30 determinate la cei cinci subiecţi prin GC-MS din sânge, creier, ochi, cord, plămân, ficat şi rinichi, după administrarea de metanol în doză DL100 (4,8 ml/kg) faţa de timpul de supravieţuire. Din reprezentarea grafică reiese că subiectul nr. 3 a acumulat cea mai mare cantitate de metanol respective 2,2 mg/ml, acesta de altfel a avut perioada cea mai scurtă de supravieţuire (105 min). Următoarea valoare a concentraţiei metanolice este cea a subiectului nr. 2 cu 1,63 mg/ml, acest a decedat ultimul la 200 de minute. Subiectul nr. 5 cu o concentraţie metanolică de 1,60 mg/ml decedează la 180 de minute de la injectare la fel ca subiectul nr. 4 cu 1,53 mg/ml. Subiectul cu valoarea concentraţiei metanolice cea mai scăzută este iepurele nr. 1 cu 1,42 mg/ml, care a supravieţuit 155 de minute. Conform timpului de supravieţuire faţă de valoarea mediei concentraţiei pentru fiecare din cei cinci iepuri analizaţi, se constată că valoarea medie a concentraţiei metanolice nu este relevant în procesul de supravieţuire, metabolismul individual având un rol hotărâtor, fapt expus în figura Fig Valoarea medie a concentraţiei metanolice la cei cinci subiecţi testaţi cu metanol DL100 (4,8 ml/kg) faţă de timpul de supravieţuire din momentul injectării Datele obţinute privind concentraţia metanolică ce se regăseşte în sângele şi organele iepurilor testaţi la metanol în doză DL100 (4,8 ml/ Kg), corelate cu masa corporală faţă de intervalul de supravieţuire evidenţiază faptul că în cazul în care expunerea la metanol se face conform masei corporale, aceasta nu prezintă importanţă majoră în procesul de supravieţuire Determinarea concentraţiei de metanol în cazul intoxicaţiilor letale. Prezentare de caz Marea majoritate a intoxicţiilor metanolice se produc pe fondul consumului de băuturi alcoolice în exces şi care prezintă o concentraţie metanolică peste limita admisă. Acest gen de intoxicaţii conduc de cele mai multe ori la un final nefast, deoarece intoxicaţia cu alcool etilic maschează simptomatologia intoxicaţiei metanolice înârziind astfel aplicarea medicaţiei antidot specifice. Tarele de sănătate, cât şi starea de confuzie, obnubilare sau chiar coma pacienţilor sunt factori importanţi în diagnosticarea precoce a intoxicaţiilor metanolice. De o importanţă majoră în aplicarea diagnosticului sunt examenele complementare şi in mod 30

31 special examenele biochimice şi nu în ultimul rând examenul toxicologic al sângelui. În cele ce urmează se prezintă două cazuri de intoxicaţii metanolice care s-au prezentat la Spitalul Judeţian Bacău şi au decedat la câteva ore de la internare Prezentarea cazului nr. 1 O pacientă de 32 de ani este internată în secţia Urgente a Spitalului Judeţean Bacău în data de cu diagnosticul Coma gradul III, şoc toxic în observaţie. La examenul clinic general, pacienta prezenta tegumente reci marmorate, secreţii albicioase abundente la nivelul căilor respiratorii, TA nu se poate măsura, AV-68/minut, pupile midriatice bilateral, ROT absente, raluri bronşice bilateral. Examenele complementare respectiv, examenul biochimic al sângelui relevă: amilază -117 U/L, GGT 113 U/L, TGO 331 U/L şi TGP 147 U/L. Din datele de anchetă rezultă că femeia era o consumatoare cronică de băuturi alcoolice. Starea gravă a pacientei cât şi a lipsei de informaţii privind toxicul care a fost ingerat pe fondul consumului de băuturi alcoolice, a condus la o diagnosticare dificilă. Evoluţia a fost gravă cu deprimare respiratorie, pacienta moare prin stop cardio-respirator după 9 ore de la internare. În urma examenului toxicologic s-a constatat că in momentul decesului pacienta prezenta o alcoolemie de 1,90g. Analiza concentraţiei metanolice din sange şi organe s-a efectuat prin GC-MS, conform metodei, valorile fiind prezentate în tabelul Tabelul Valorile concentraţiei metanolice din sânge şi organe determinate prin GC/MS Concentraţia metanolului Nr. Distilat µg/ml sânge, sau g ţesut mg/ml sânge, sau g ţesut g/1000 ml sânge/g ţesut 1 Sânge 1720,342 1,720 1,72 2 Ficat 795,506 0,795 0,79 3 Bilă 2661,306 2,661 2,66 4 Stomac 2287,104 2,287 2,28 5 Intestin 1639,867 1,639 1,63 6 Rinichi 1590,389 1,590 1,59 Valoare medie 1,78 Datele obţinute pun în evidentă valorile crescute ale concentraţiilor metanolice atât în sânge cât şi în organele cercetate. Astfel, în sânge concentraţia metanolului este de 1,720 g, în ficat de 0,795 g, în bilă de 2,661 g, în stomac 2,287 g, în intestin de 1,639 g iar în rinichi de 1,590 g. Fig Variaţia concentraţiei de metanol în sânge şi organe 31

32 Datorită coeficientului bun de lipo hidrosolubilitatate, metanolul se distribuie în majoritatea organelor, cu precădere în organele cu concentraţii mari de apă. În cazul de faţă, în bilă concentraţia metanolica este de trei ori mai mare faţă de concentraţia metanolică din ficat, unde s-a înregistrat cea mai scăzută valoare. Variaţia mare a valorilor concentraţiilor metanolice este explicată în primul rând de examenul anatomo-patologic. În cazul de faţă steatoza hepatică cu degenerescenţă grasă, explică pe de o parte distribuţia neuniformă a toxicului, cât şi accentuarea scăderii ratei metabolice a metanolului, cu potenţarea efectului de acumulare. Valorile mari ale concentraţiei metanolice din stomac şi intestin pun în evidenţă faptul că expunerea la metanol s-a făcut prin ingestie. Astfel, consumul excesiv de băuturi alcoolice coroborat cu tarele de sănătate (leziuni bacilare vechi, steatoză hepatică, alcoolism cronic) şi nu în ultimul rând concentrţia mult peste limită a metanolului din băuturile alcoolice consumate au dus în cazul de faţă la deces. Valoarea concentraţiei metanolice determinată în sânge şi organe fiind fatală chiar şi în cazul unui organism sănătos Prezentarea cazului nr. 2 În luna februarie 2011, un bărbat de 65 de ani este internat în secţia Urgenţe a S.J.U. Bacău, la ora 14, 50 cu diagnosticul de : Comă profundă. Şoc toxic. În momentul internării, tegumente reci, marmorate, hipotermie 34 C, pupile midriatice bilateral, areactive la lumină, ROT absente, RCA abolite, TA 80/50, AV 60/ minut, GCS-6, examenul Compiuter Tomograf nu s-a putut efectua. Examenele complementare, respectiv analizele biochimice pun în evidenţă următoarele valori : Creatinină - 1,35, TGP- 45, GOT- 65, GGT- 171, CO 2-8, K- 6,39, Na - 156,4, Gluc.- 143, ph 6,8. Cu toate eforturile de susţinere a vieţii, la ora 06,50 decedează în urma stopului cardio-respirator. Din analiza toxicologică reiese că acesta a consumat băuturi alcoolice cu o concentraţie metanolică mult peste limită (1 g/100 ml etanol anhidru), constatându-se o concentraţie etanolică de 0,90 g la 16 ore de la internare. În urma analizei GC-MS a probelor biologice, s-au obţinut următoarele rezultate, prezentate în tabelul Tabelul Valorile concentraţiei metanolice din sânge şi organe determinate prin GC-MS Concentraţia metanolului Nr. Distilat µg/ml sânge, sau g ţesut mg/ml sânge, sau g ţesut g/1000 ml sânge/g ţesut 1 sânge 526,6 0,526 0,52 2 creier 677,8 0,677 0,67 3 pulmon 946,1 0,946 0,94 4 cord 621,1 0,621 0,62 5 ficat 771,0 0,771 0,77 6 bila 1056,7 1,056 1,05 7 pancreas 924,2 0,924 0,92 8 stomac 1235,9 1,235 1,23 9 intestin 1345,2 1,345 1,34 10 rinichi 1483,5 1,483 1,48 Valoare medie 1,35 Datele prezentate în tabelul 12.15, pun în evidenţă valorile mari ale concentraţiei metanolice obţinute stomac, intestin, rinichi, valori de 1,23 g, 1,34 g, 1,48 g. Valori 32

33 apropiate s-au obţinut în pulmon cu 0,94 g şi pancreas cu 0,92 g. În bilă s-a determinat 1,05 g. Valori mai mici s-au determinat în sânge şi anume 0,52 g, în creier 0,67 g şi în ficat 0,77 g, date exprimate şi în figura Fig Variaţia concentraţiei de metanol în sânge şi organe Din analiza toxicologică prin GC-MS a sângelui şi a organelor în cazul de faţă se constată o fluctuaţie a valorilor cu pondere mare pe rinichi, intestin şi stomac şi mai scăzută pe creier, cord şi ficat. Valoarea concentraţiei metanolice din sânge a fost cea mai scăzută valoare determinată la caz, ceea ce denotă că metabolismul metanolului era în dinamică Concluzii faţă de cazuistică Cele două cazuri prezentate constituie practic două exemple de intoxicaţie metanolică letală. În ambele cazuri pacienţii au fost internaţi în stare comatoasă, astfel încât epicriza foilor de observaţie nu a putut fi completată cu date care ar fi putut avea o reală importanţă în stabilirea diagnosticului. Ancheta cazurilor stabilea cu certitudine că ambii pacienţi au consumat băuturi alcoolice în exces, prezentând în mod evident simptomatologia intoxicaţiei etanolice. Faţă de datele din literatură, valorile concentraţiei metanolice obţinute în urma analizei probelor biologice prin GC-MS, se încadrează în intervalele valorice obţinute şi în alte cazuri de intoxicaţii letale cu metanol, respectiv intervalul 0,52 2,66 g metanol (Ashley L., 1992, Vaida H., 1997, Watson WA., 2003). Comparaţia valorile privind ponderea concentraţiei de metanol obţinute la cazul nr.1 faţă de ponderea concentraţiei metanolice la cazul nr. 2, pe aceleaşi organe conform valorilor expuse în tabelele nr şi se prezintă în figura nr Fig Valori comparative între ponderea concentraţiei metanolice obţinută din sânge şi organe la cazul nr. 1 şi cazul nr. 2 33