DETERMINAREA PRIN METODA HPLC A D-PANTENOLULUI SI A ACIDULUI GLICIRETINIC DINTR-UN SUPLIMENT ANTIHERPETIC PE BAZA DE PLANTE

Transcription

1 DETERMINAREA PRIN METODA HPLC A D-PANTENOLULUI SI A ACIDULUI GLICIRETINIC DINTR-UN SUPLIMENT ANTIHERPETIC PE BAZA DE PLANTE DETERMINATION BY HPLC METHOD OF D-PANTHENOL AND GLYCYRRHETINIC ACID IN A ANTIHERPES HERBAL SUPPLEMENT Elena Gabriela Oltean, G. Oltean, C. Chiurciu Romvac Company SA, Bucharest Cuvinte cheie: pantenol, acid gliciretinic, UV-VIS cromatografie de lichide de performanță ridicată de fază inversă, Glycyrrhiza glabra, virus herpetic. Key words: panthenol, glycyrrhetinic acid, UV - VIS RP-HPLC reversed phase high performance liquid chromatography, Glycyrrhiza glabra, herpes virus. Rezumat Metoda HPLC a fost utilizata pentru determinarea cantitativa a pantenol si a acidului gliciretinic dintr-un supliment antiherpes pe baza de plante, constituit din pantenol (provitamina B5) si un extract alcoolic de Glycyrrhiza glabra (lemn dulce). Pentru determinarea pantenolului separarea s-a realizat pe o coloana KROMASIL 60D HILIC C18, 250x4.6 mm, 5 µ, utilizand ca si faza mobila un amestec format din metanol si o solutie tampon de fosfat dipotasic, 20 mm, ph 6, in raport volumetric de 10/90. Lungimea de unda a fost setata la 210 nm. Fluxul a fost de 1 ml/min, iar temperatura coloanei a fost mentinuta la (30+5) C. Pentru acidul gliciretinic a fost folosita elutia izocratica pe o coloana HYPERSIL C18 BDS, 250x4.6 mm, 5 µ, cu un amestec acetonitril solutie apoasa de acid fosforic 0.1%, in raport volumetric de 75/25. Lungimea de unda a fost stabilita la 250 nm. Fluxul a fost de 1 ml/min, iar temperatura coloanei a fost mentinuta la (30+5) C. Abstract HPLC was used for the quantitative determination of panthenol and glycyrrhetinic acid in an antiherpes herbal supplement based on panthenol (B5 provitamin) and alcoholic extract of Glycyrrhiza glabra. For the determination of panthenol, the separation was carried out on a Kromasil 60-S HILIC D C18 column (250x4.6 mm, 5 µm), with methanol 20 mm potassium phosphate dibasic, ph 6 (10:90, volume ratio) as the mobile phase. The detection wavelength was set at 210 nm. Flow was 1 ml min -1 and the column temperature was maintained at (30±0.5) C. For glycyrrhetinic acid, a Hypersil C18 BDS column (250x4.6 mm, 5 µm) with acetonitril 0.1% phosphoric acid in water (75:25, volume ratio) isocratic elution. The detection wavelength was set at 250 nm. Flow was 1 ml min -1 and the column temperature was maintained at (30±0.5) C. Introducere Lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra) este o planta ierbacee perena, leguminoasa, care creste in sudul Europei si in anumite parti ale Asiei (India). De la plantă se foloseste radacina, bogata in acid gliciretinic (glicirizina). Acidul gliciretinic este folosit si in scop de indulcitor, fiind de de ori mai dulce decat zaharul. Au fost demonstrate efectele antivirale, antimicrobiene, anti-inflamatorii si de crestere a presiunii sangelui ale glicirizinei, atat in vitro cat si in vivo. Injectarea intravenoasa, cat si administrarea orala a glicirizinei duce la incetinirea progresiei hepatitei virale si a celei autoimmune. Aplicată topic, s-a demonstrat actiunea asupra dermatitei atopice. 59

2 Până acum a fost demonstrată activitatea anti-hiperlipidemică, eficiența în terapia hiperpigmentarii pielii indusă de inflamații, precum și în prevenirea problemelor neurodegenerative si a cariilor dentare. De asemenea, au fost investigate deja proprietățile specifice antiulceroase, laxative, antidiabetice, antiinflamatorii, imunomodulatoare, antitumorale si expectorante ale acidului gliciretinic. Pantenolul (provitamina B5) este un analog alcoolic al acidului pantotenic (vitamina B5). Este folosit în industria farmaceutica, în prepararea cosmeticelor și a produselor de ingrijire personala ca și hidratant si umectant, in unguente, lotiuni, sampoane, spray-uri nazale, colire și solutii de curățare pentru lentilele de contact. Este utilizat în unguente pentru tratarea arsurilor solare, arsurilor usoare, în rănile minore ale pielii, in concentratii de 2-5 %; imbunatateste hidratarea, reduce pruritul și inflamația pielii, îmbunatățind elasticitatea și accelerând rata de vindecare a ranilor de la nivelul epidermiei. 1. Materiale și Metode Reactivii Pantenol CRS (Sigma) - utilizat ca standard intern. Acid gliciretinic CRS (Sigma) - utilizat ca standard intern. Toți ceilalți reactivi utilizați au fost de grad HPLC, furnizați de către Merck (Germania). Apa pentru soluții a fost obținută in-house cu un sistem Milli-Q (Millipore, USA). Toate soluțiile au fost preparate zilnic. Metoda HPLC A fost realizată pe un LC Surveyor (Thermo Electron Corporation, USA) echipat cu pompă cuaternară, autosampler, buclă de 25 µl şi detector UV-VIS diode array (Thermo Electron Corporation, USA). Integrarea picurilor cromatografice a fost realizată cu softul ChromQuest (Thermo Electron). Condițiile cromatografice sunt prezentate in Tabelul 1. Tabel 1 Parametri de separare cromatografică aplicate în cazul pantenolului si acidului gliciretinic Pantenol Faza stationara Kromasil 60d Hilic C18 250x4.6 mm, 5µ Faza mobila Metanol K2HPO4 20 mm ph 6 10/90 raport volumetric Acid gliciretinic Faza stationara Hypersil BDS C18 250x4.6 mm, 5µ Faza mobila Acetonitril solutie apoasa acid fosforic 0.1% - 75/25 raport volumetric UV VIS 210 nm Temperatura 30 C Temperatura 30 C Flux 1 ml/min Flux 1 ml/min Prepararea soluțiilor standard de referință Soluția standard de lucru acid gliciretinic: a avut o concentrație finală de 0.02 mg/ ml, preparată în apă, pornind de la o soluție stoc de acid gliciretinic de 1 mg/ ml preparată apa. Solutia standard de lucru pantenol a avut o concentratie finala de 0.1 mg/ml preparata in alcool, pornind de la o solutie stoc de pantenol cu concentratia 1 mg/ml in alcool. Prepararea soluțiilor de probe Pentru determinarea acidului gliciretinic: se injecteaza in sistemul cromatografic 5 µl produs integral. Pentru determinarea pantenolului din produsul final: se realizeaza o dilutie de 250 ori a acestuia in apa si se injecteaza in volum de 5 µl. 60

3 2. Rezultate și Discuții Pentru determinarea cantitativa a pantenolului si acidului gliciretinic din produsul final a fost propusă o metoda HPLC de faza inversă, fiind selectate conditiile optime de separare cromatografica. Parametri cromatografici aleşi ca definitorii în cazul acestui studiu au fost: timpul de retenție, aria cromatogramei, rezoluția (selectivitatea metodei), numărul de talere teoretice (eficiența separării). Din analiza cromatogramelor solutiilor standard de referinta si a solutiilor de proba se constata ca nu exista diferente intre compusii de interes analizati si restul matricei produsului finit (figurile 1 si 2). Pentru dezvoltarea metodei HPLC de analiza a celor doi compusi activi prezenti in suplimentul pe baza de plante, cu actiune antiherpetica, a fost folosit si un produs similar, existent pe piata; rezultatele au fost similare, demonstrand reproductibilitatea metodei. De asemenea, au fost analizate cromatografic mai multe serii de produs finit, rezultatele fiind comparabile (figura 3). Figura 1. Comparatie intre Solutia antiherpetica si substanta de referinta D-Pantenol 61

4 Figura 2. Comparatie intre Solutia antiherpetica si substanta de referinta Acid gliciretinic Figura 3. Reproductibilitatea seriilor de produs finit 62

5 3. Concluzii A fost pusa la punct o metoda HPLC pentru determinarea pantenolului si acidului gliciretinic dintr-un supliment natural antiherpes. Din studiul cromatogramelor substantelor de referinta si a celor corespunzatoare produsului finit, s-a demonstrat specificitatea metodei de analiza propusa. De asemenea, analiza HPLC a seriilor successive de produs finit a constituit un instrument de analiza sigur pentru reproductibilitatea procesului de fabricatie. Metoda HPLC de analiza a pantenol si acid gliciretinic a fost aplicata cu success si pe un produs similar, aflat pe piata. switching. Journal of Liquid Chromatography, 7(4), Bibliografie 1. Andrisano V, Bonazzi D, Cavrini V (1995). HPLC analysis of triterpenoides - applications to thequality control of pharmaceuticals. Journal of pharmaceutical and Biomedical Analysis, 13, Sabbioni C, Ferranti A, Bugamelli F, Forti GC, Raggi MA (2006). Simultaneous analysis, with isocratic elution, of glycyrrhizin and glycyrrethinic acid in liquorice roots and confectionary products. Phytochem. Anal., 17(1), Zhang Y, Cao J, Xiao S. (2013). Simultaneous determination of glycyrrhizin and 15 flavonoids in liquorice and blood by high performance liquid chromatography with ultraviolet detector. Analytical Chemstry, Spinks EA, Fenwick GR (1990). The determination of glycyrrhizin in selected UK liquorice products. Food additives and Contaminants, 7(6), Mao X, Hu X, Pan W (2010). Simultaneous determination of panthotenic acid and D panthenol in cosmetics by high performance liquid chromatography. SePu, 28(11), Franks TJ, Stodola JD (1984). A reverse phase HPLC assay for the determination of calcium panthotenate utilizing column 63