Proiect Doc-Postdoc- POSDRU/159/1.5/S/ Cercetarea doctorală şi postdoctorală prioritate a învaţamântului superior românesc (Doc-Postdoc)

Transcription

1 Proiect Doc-Postdoc- POSDRU/159/1.5/S/ Cercetarea doctorală şi postdoctorală prioritate a învaţamântului superior românesc (Doc-Postdoc) UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI Facultatea Chimie Aplicată şi Ştiinţa Materialelor Departamentul Inginerie Chimică şi Biochimică Nr. Decizie Senat din TEZĂ DE DOCTORAT Contribuţii la analiza radiofarmaceuticelor pentru diagnosticare prin tomografie cu emisie de pozitroni utilizând metode complexe chimice si radiochimice Contributions to the analysis of radiopharmaceuticals for diagnosis by positron emission tomography, using complex chemical and radiochemical methods Autor: Mirela Claudia Popescu (Mihon) Conducator de doctorat: prof. dr. ing. Vasile Lavric COMISIA DE DOCTORAT Preşedinte Prof. dr. ing. Ioan Calinescu de la Universitatea POLITEHNICA Bucureşti Conducator de doctorat Prof. dr. ing. Vasile Lavric de la Universitatea POLITEHNICA Bucureşti Referent de la Universitatea de Medicină şi Farmacie Prof. univ.dr. Doina Drăgănescu CAROL DAVILA Bucureşti Referent Prof. dr. ing. Alina-Catrinel Ion de la Universitatea POLITEHNICA Bucureşti Referent C.S.II dr. ing. Cristian Postolache de la Institutul de Fizica şi Inginerie Nucleară - HORIA HULUBEI Bucureşti 1

2 2

3 Cuprins Obiectivele tezei 6 Capitolul 1 Radiofarmaceutice pentru PET Productia de radiofarmaceutice marcate cu 18 F Productia de radiofarmaceutice marcate cu 68 Ga Tomografia cu emisie de pozitroni 9 Capitolul 2 Metode analitice de control Introducere Tehnici de separare in determinarea puritatii chimice si radiochimice Cromatografia de lichide de inalta performanta Cromatografia in strat subtire Cromatografia in faza gazoasa pentru analiza de solventi reziduali 10 Capitolul 3 Metode de validare Validarea metodelor analitice Calitatea prin Proiectare a metodelor analitice 11 Capitolul 4 Imbunatatirea metodei pentru determinarea puritatii chimice si radiochimice in 18 F-FDG 4.1. Parametrii metodei optimizate HPAEC/PAD Studiu de validare 13 Capitolul 5 Imbunatatirea metodei pentru determinarea puritatii chimice si radiochimice in 18 F-NaF 5.1. Validarea testului pentru determinarea identitatii si puritatii radiochimice in 18 F-NaF 5.2. Studii de stabilitate 17 Capitolul 6 Metoda rapida pentru determinarea solventilor reziduali Injectare directa Injectarea tip headspace 20 Capitolul 7 Imbunatatirea metodelor radioanalitice pentru controlul de calitate a peptidelor marcate cu 68 Ga 7.1. Sinteza si studiu de stabilitate a peptidelor marcate cu 68 Ga Metode radioanalitice pentru determinarea puritatii radiochimice 24 Capitolul 8 Imbunatatirea metodei pentru determinarea identitatii si puritatii chimice 26 a [ 18 F]FLT utilizand DoE Concluzii finale 29 Bibliografie selectata 32 Lista abrevieri, simboluri si acronime

4 Cuvinte cheie: radiofarmaceutice, Tomografia cu emisie de pozitroni (PET), radio-hplc, GC, radio-tlc, impuritati chimice, QbD, DoE Teza este organizata in opt capitole si concluzii, dupa cum urmeaza : Capitolul 1 prezinta dezvoltarea radiochimiei pentru PET: sinteza si aplicarea clinica a radiofarmaceuticelor studiate. Capitolul 2 consta intr-o trecere in revista a metodelor analitice.cele mai utilizate metode analitice in determinarea si cuantificarea impuritatilor din radiofarmaceutice sunt: radio- HPLC, radio-tlc si GC. Sunt cateva criterii specifice pe care radiofarmaceuticele trebuie sa le indeplineasca pentru a fi eliberate si utilizate: puritatea chimica si radiochimica, puritatea radionuclidica, pirogenitatea, ph, aspect, osmolaritatea si sterilitatea. Metodele analitice trebuie sa fie rapide, dar in acelasi timp foarte precise respectand standardele de calitate ale farmaceuticelor uzuale. Metodele trebuie sa fie rapide datorita timpul de viata scurt al radiofarmaceuticelor, dozei radioactive primita de operator in timpul lucrului (conditii speciale pentru manuirea substantelor radioactive si radioprotectia operatorului) si a cantitatii foarte mici de compus chimic. Un timp lung de analiza inseamna pierderea activitatii radiofarmaceuticului, datorita timpului de injumatatire scurt. Capitolul 3 este dedicat validarii metodelor analitice; este introdus conceptul modern de Calitate prin Proiectare (Quality by Design). Capitolul 4 se ocupa cu primul obiectiv al tezei si anume sinteza 18 F-FDG si validarea metodologiei pentru evaluare puritatii chimice si radiochimice. Impuritatile radiochimice pot influenta studiile de imagistica medicala, datorita acumularii nespecifice a acestor impuritati. Impuritatile chimice pot influenta, pe de alta parte, mecanismul de substitutie nucleofila. Mentinerea impuritatilor la o concentratie cat mai mica este cheia pentru o sinteza reusita. De aceea, determinarea celor doua tipuri de impuritati in scurt timp este un pas essential in caracterizarea fiecarui lot, datorita timpului de injumatatire scurt (110 min). Metodele cromatografice trebuie sa separe efectiv aceste specii. Unul din cele mai importante aspecte cand lucrezi cu radiofarmaceutice marcate cu 18 F este timpul scurt in analiza controlului de calitate. Cercetarile din acest capitol au fost prezentate la 2nd International Conference on Chemical Engineering (ICCE 2014, 5-8 November 2014). Acest capitol a fost publicat în Mihon et al., (2015a). Parti din datele experimentale au fost prezentate la 3rd International Conference on Radiation and Application in Various Field (Mihon et.al, 2015b). Capitolul 5 prezinta o metoda rapida de determinarea a impuritatilor chimice si radiochimice din radiofarmaceuticul 18 F-NaF si studiul stabilitatii. Cercetarile din acest capitol au fost publicata ca lucrari stiintifice Mihon et al., (2015c) and Mihon et al., (2016a). 4

5 Capitolul 6 prezinta doua noi metode de analiza a solventilor reziduali din radiofarmaceuticele studiate utilizand tehnica headspace si injectarea directa. Solventii reziduali sunt impuritati critice in produsele radiofarmaceutice, datorita efectelor biologice secundare ce pot afecta marcarea si proprietatile fizico-chimice ale farmaceuticului. Cantitatea de solvent in radiofarmaceutice trebuie sa fie scazuta, si in anumite conditii sunt considerati in siguranta din punct de vedere toxicologic. Injectarea tip Headspace este adesea utilizata in determinarea solventilor reziduali din produsele farmaceutice deoarece cantitatea de compusi nevolatili introdusa in GC este scazuta. Aceasta tehnica asigura o un mediu necontaminat si o durata mai mare de viata a coloanei. Parti din cercetarile din acest capitol au fost prezentate la International Conference on Instrumental Methods of Analysis, Modern Trends and Applications (Mihon et. al., 2015d) si publicate Mihon et al. (2017). Capitolul 7 are ca scop optimizarea metodelor pentru determinarea puritatii radiochimice a peptidelor marcate cu 68 Ga si studii de stabilitate pentru acesti compusi, utilizand cromatografia de lichide de inalta performanta si cromatografia in strat subtire. Compusii pe baza de peptide sunt molecule care tintesc cu mare specificitate si care distribuie radioizotopul in tesutul vizat. Dar substantele stabile chimic se descompun incet sub influenta radiatiei, si acest proces, denumit radioliza, este influentat de multi factori ca natura substantei si activitatea specifica a probei, natura si energia radiatiei, timp de injumatatire, prezenta impuritatilor si conditiile de depozitare. In formularea radiofarmaceuticelor este necesara adaugarea de agenti protectori la radioliza. Cateva peptide (neurotensina, crgd, octreotida) impreuna cu chelatori macrociclici (DOTA, NODAGA) au fost marcate cu radioizotopul 68 Ga. Parti din cercetarile din acest capitol au fost prezentate la 19th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering (Mihon et al., 2015e). Alte parti au fost prezentate la 1st International Conference on Radioanalytical and Nuclear Chemistry (Mihon et al, 2016b). Capitolul 8 evidentiaza avantajele aplicarii DoE (Proiectarea experimentelor) in dezvoltarea metodelor cromatografice. Dezvoltarea metodei HPLC pentru analiza [ 18 F]FLT s-a facut cu ajutorul Calitatii prin Proiectare (QbD) din care DoE face parte. Marele avantaj in utilizarea DoE este evitarea revalidarii la schimbarea parametrilor metodei analitice. Parti din cercetarile experimentale din acest capitol au fost prezentate la 4th International Conference on Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences (Mihon et al.,2016c) si vor fi publicate ca si capitol de carte in Biophysics for Biomedical and Environmental Sciences, Transilvania University Press, Niculae et al.,2016. O cerinta esentiala pentru a dovedi ca metoda dezvoltata de analiza si control este adecvata este validarea. Pentru toate metodele cromatografice dezvoltate in aceasta teza au 5

6 fost effectuate studii de validare. Validarea este esentiala pentru tranferul metodelor analitice de la cercetare catre laboratorul de control de calitate al productiei de serie. In capitolul final sunt prezentate contributiile la dezvoltarea metodelor prezentate in aceasta teza si activitatea de cercetare viitoare. INTRODUCERE Aceasta lucrare originala este concentrata pe caracterizarea completa si optimizarea metodelor radioanalitice, bazata pe date din literatura si a descoperirilor originale proprii. Cunoscand impactul deosebit al proprietatilor fizico-chimice si analitice asupra farmacodinamicii radiofarmaceuticelor si a specificitatii mecanismului de actiune, in partea experimentala a tezei mi-am propus completarea profilului radioanalitic a radiofarmecuticelor utilizate in PET: 18 F-FDG, 18 F-NaF, 68 Ga-DOTA-c(RGD) 2, 18 F-FLT. Cercetarea originala prezenta in aceasta teza este concentrata, pe de o parte, pe stabilirea de noi metode cromatografice, simple si selective, in determinarea atat a impuritatilor chimice si radiochimice ce pot aparea in timpul sintezei, cat si pe optimizarea parametrilor de operare pentru micsorarea timpului de analiza, cu mentinerea si respectarea constrangerilor farmaceutice. Radiofarmaceutice sunt preparate radioactive utilizate in medicina nucleara ca trasori in imagistica de diagnostic si in tratamentul anumitor boli. Aplicatii practice ale tehnicilor nucleare sunt prezente in activitatea IFIN-HH, care are o istorie de peste 30 de ani in cercetarea si productia de radiofarmaceutice. Este de remarcat faptul ca cercetarile mele beneficiaza de o noua infrastructura, Centrul de Cercetare Radiofarmaceutice (CCR), o instalatie care cuprinde un ciclotron pentru producerea de radioizotopi si echipamente dedicate radiochimiei si laboratoarelor de control. 1. RADIOFARMACEUTICE PENTRU PET 1.1 PRODUCTIA DE RADIOFARMACEUTICE MARCATE CU 18 F 18 F este cel mai folosit radioizotop pentru sinteza radiofarmaceuticelor pentru PET datorita proprietatilor fizico-chimice pe care le are: o perioada de injumatatire lunga (pentru studii de imagistica PET, care implica procese biochimice lente), o buna calitate a imagisticii PET care reflecta energia scazuta a pozitronilor emisi MeV si 2.2 mm parcurs (Saha, 2004, Coenen et al, 2010). Productia radionuclidului [ 18 F]F - este realizata urmand reactia nucleara 18 O(p,n) 18 F (Schlyer, 2009): (1.1) Materialul tinta este apa imbogatita in [ 18 O] cu grad de imbogatire de cel putin 95%. Procesul este automat; operatorul trebuie sa introduca durata si curentul de iradiere. 6

7 Parametrii iradierii sunt determinati din masurarea activitatii cerute si randamentul reactiei nucleare (Coenen et al, 2010). Sunt doua metode pentru marcarea cu 18 F: substitutie electrofila sau nucleofila (Coenen et al, 2010). Cea mai utilizata metoda pentru productia de fluorura [ 18 F]F - este fluorurararea nucleofila. Fluorura- 18 F este produsa la IFIN-HH in Centrul de Cercetare Radiofarmaceutice (Ursu et al., 2013), in ciclotronul TR19 (ACSI). Ionul de 18 F-fluorura este produs intr-un ciclotron de 19 MeV prin bombardarea apei imbogatite cu protoni accelerati (reactia nucleara 18 O (p/n) 18 F). Cartusele utilizate in proces sunt de unica folosinta, sterile ambalate. Radioizotopul 18 F in apa provenit din tinta se transfera pe cartusul schimbator de anioni. Cartusul a fost apoi eluat cu solutie 1M Na 2 CO 3. Sinteza a fost realizata in modul sinteza Synthra RN (Germania). Produsul final se filtreaza pe un filtru 0,22 µm si apoi este portionat in flacoane din sticla cu ajutorul unui sistem automatizat pentru distribuirea radiofarmaceuticelor-theodorico (Comecer-Italia). [ 18 F] fluorura de sodiu ([ 18 F]NaF) este un radiofarmaceutic produs ca solutie sterila pentru administrare intravenoasa, care trebuie sa contina nu mai mult de 4.25mg NaF/V, V este volumul dozei totale de injectare, la momentul expirarii (EDQM, 2014). 18 F-FDG este un analog al glucozei, in care gruparea hidroxil de la al doilea atom de carbon este substituit cu 18 F, radiofarmaceutic folosit ca un indicator al captarii glucozei si a viabilitatii celulare. Sinteza 18 F-FDG s-a efectuat prin mecanismul de substitutie nucleofila (Hamacher et al., 1986) urmat de hidroliza bazica (Fig. 1.6), in modulul de sinteza FASTlab (GE Healthcare, USA). Fig 1.6. Mecanism de substitutie nucleofila utilizat in sinteza 18 F-FDG (Yu, 2006) 7

8 Analiza PET a 18 F-3-fluor-3-dezoxitimidina ( 18 F-FLT) permite evaluarea proliferarii celulara prin masurarea absorbtiei sale crescuta in celula (Salskov et al., 2007). Timidina radiomarcata este un trasor PET, care este util pentru imagistica tumorilor, pentru vizualizarea replicarea ADN-ului in organismul uman. 18 F-FLT este incorporat in ADN in timpul fazei de sinteza a celulei si, prin urmare, este un indicator util al proliferarii celulare. Sinteza 18 F-FLT implica o procedura in trei etape bazata pe precursorul nosilat protejat, 3-N- Boc-5`-O-dimetoxitritil-3`-O-nosil timidina, dizolvat in acetonitril (Shields et al., 1998, Suehiro et al., 2007). Reactia de fluorurare implica inlocuirea grupei 3-O-nosil cu [ 18 F]Frezultand un produs intermediar care dupa hidroliza acida si neutralizare, se obtine 18 F-FLT (Marchand et al., 2016). Productia de 18 F-FLT include o etapa de purificare, care este, in general, realizata prin HPLC. 1.2 PRODUCTIA DE RADIOFARMACEUTICE MARCATE CU 68 Ga Generatoarele de radioizotopi furnizeaza emitatori pozitronici pentru PET cu durata scurta de viata, fara a fi nevoie de ciclotron. Printre acestea, radionuclidul metalic 68 Ga este de mare interes datorita proprietatilor sale fizice: t ½ = 67,6 min, β + = 89%, EC = 11%; E β + max = 1,19 MeV. 68 Ga se dezintegreaza 89% prin emisie de pozitroni si 11% prin captura de electroni la 68 Zn stabil. 68 Ga este un radionuclid care ofera chimie excelenta coordinativa cu o gama larga de agenti chelatori bifunctionali si prevede radiomarcare rapida in diferite intervale de ph. Peptidele radiomarcate cu 68 Ga sunt folosite pentru diagnosticul si terapia tumorilor. Timpul de injumatatire de 68 min. a 68 Ga se potriveste cu farmacocinetica multor peptide si alte molecule mici, datorita difuziei rapide, localizare tintita si eliminarea rapida din sange. Marcarea s-a efectuat in modul de sinteza automatizat (Galigand, model GAL102, Veenstra) cu reactivi suprapuri, cu control al activitatii si purificarea anionica. Peptidele DOTA-(20 nmol) au fost marcate cu solutie 68 Ga 3+ la ph prin incalzire la 95 C timp de 5 minute. NOTA si NODAGA -peptide au fost marcate cu 68 Ga 3+ prin incalzire la 40 C. ph-ul a fost ajustat cu acetat de amoniu tampon (1M). Dupa racire, purificarea a fost realizata utilizand cartuse SPE (C18 Sep-Pak), eluate cu 1ml apa ultrapura. Adsorbtia peptidei marcate a fost monitorizata pe un detector radiochimic. Desorbtia produsului din cartus cu faza inversa a fost realizata prin eluare cu etanol, colectat intr-un al doilea reactor de sticla. Prin incalzire, etanolul se evapora la maxim 3 minute si produsul a fost dizolvat in solutie salina 0,9%, sterilizata prin filtrare (filtru membrana de 0,2µm, Millipore) si colectate intr-un flacon steril. Eluarea, purificarea prin concentrare, marcarea si purificare finala a durat 25 de minute (Boschi et al., 2013, Patrascu et al., 2011). 8

9 1.3 TOMOGRAFIA CU EMISIE DE POZITRONI Tomografie cu emisie de pozitroni este o tehnica pentru diagnostic imagistic utilizat in cardiologie, neurologie si cancer. PET poate fi aplicat pentru identificarea unei tumori maligne, poate masura raspunsul tumorii la chimioterapie si radioterapie, evaluarea activitatii metabolice, proliferarea celulara, expresia de legare a receptorului si a genei, proiectarea de noi medicamente si studiul farmacodinamic si farmacocinetic. PET este capabil sa tintesca procesele metabolice specifice si sa masoare viteza cu care aceste procese au loc (Ghambir, 2002, Vallabjosula et al., 2011). In analiza PET este introdus in organism (prin injectare sau prin inhalare) o mica cantitate dintr-un compus chimic biologic activ (un radiofarmaceutic) marcat cu un radioizotop care emite pozitroni (de obicei, 18 F, 14 C, 13 N, 15 O, 68 Ga). Acest compus se acumuleaza in pacient si permite estimarea distributiei radioizotopului in diferite tesuturi, organe sau sisteme de organe (Saha, 2004, Khalil, 2011, Scott si colab., 2009). 2. METODE ANALITICE DE CONTROL 2.1 INTRODUCERE Compusii radiofarmaceutici se supun controlului analitic (RCP, PC) si puritate radionuclidica (RNP), deoarece acestia se dezintegreaza in timp. Analiza puritatii radiochimice trebuie sa fie rapida, precisa si reproductibila, datorita duratei de viata scurta, protectiei impotriva radiatiilor a operatorului (conditii speciale pentru manipularea substantelor radioactive) si o cantitate foarte mica de compus chimic. Limita de detectie a metodelor de analiza ar trebui sa fie la nivelul ppm (Theobald, 2010). Puritatea radiochimica (RCP) reprezinta raportul, exprimat in procente, dintre radioactivitatea izotopului de interes in forma chimica specificata raportata la radioactivitatea totala a acelui radioizotop in preparatul radiofarmaceutic (Saha, 2004). Cromatografia este o tehnica utilizata pentru separarea unui amestec in componente individuale, care permite determinarea cantitativa a compusului dorit si a impuritatilor. Metodele cromatografice utilizate in determinarea puritatii chimice si radiochimice sunt, in principal cromatografia lichida de inalta performanta (HPLC) si cromatografia in strat subtire (TLC). Instrumentele care sunt utilizate pentru a detecta radiaţia in masurarea puritatii radiochimice sunt calibratoarele de doza, detectori cu scintilaţie şi scanere cromatografice (Wieland et al, 1986, Kellner et al., 2004). O sinteza reusita consta in mentinerea impuritatilor chimice si radiochimice la concentratii cat mai mici. Datorita dezintegrarii radioizotopilor pozitronici este esentiala determinarea celor doua tipuri de impuritati in scurt timp pentru fiecare lot (Hung G.C, 2002). 9

10 2.2 TEHNICI DE SEPARARE IN DETERMINAREA PURITATII CHIMICE SI RADIOCHIMICE 2.2.1Cromatografia de lichide de inalta performanta Accentul se va pune pe mecanismele citate in literatura de specialitate care pot explica separarea chimica si radiochimica ale impuritatilor din radiofarmaceutice, utilizate in studiile experimentale detaliate in capitolele originale ale acestei teze: cromatografia cu faza inversa si cromatografia de schimb ionic. HPLC este o tehnica utila deoarece permite separarea impuritatilor si a produsilor de degradare si permite evaluarea stabilitatii; radioliza poate fi cuantificata prin HPLC. In cromatografia de distributie sau cromatografia cu faza inversa (RP-HPLC), faza stationara nepolara este obtinuta prin legarea chimica a gruparilor functionale hidrofobe pe suprafata de silice. Faza mobila consta in solventi polari. Mecanismul principal de retentie este distributia intre cele doua faze. Mecanismul de distributie se bazeaza pe fortele de dispersie care au loc intre molecule care nu au dipoli, permanente sau induse. Aceasta distributie depinde de raportul de hidrofobie si solubilitate (David si Medvedovici, 2008). Cromatografia cu schimb de ioni (IEX), se bazeaza pe diferitele afinitati ale analitilor in forma ionica pentru centre ionice opuse din rasina sau adsorbitia contraionilor in faza stationara hidrofoba (Kazakevich si Lobrutto, 2007, Bhattacaryya, 2012). IEX implica separarea analitilor ionici si polari. Faza stationara este o faza solida incarcata ionic si eluentul este in mod tipic o solutie apoasa tampon. O coloana schimbatoare de anioni este derivatizata cu grupari functionale incarcate pozitiv Cromatografia in strat subtire TLC este o metoda larg utilizata, din cauza vitezei, costul sau scazut si simplitate. HPLC nu detecteaza contaminanti coloidali si de aceea acestia trebuie sa fie determinati utilizand metode TLC (Theobald, 2010). Standardele si probele pot fi prelucrate in paralel. In aceasta tehnica, faza stationara este reprezentata de o suprafata de sticla, plastic sau folie de aluminiu, care este acoperita cu un strat subtire de material absorbant, de obicei, silice, alumina, sau celuloza. La baza acestei placi este pipetata o proba, si placa este plasata intr-un solvent sau amestec de solventi - care este faza mobila pentru separarea compusilor din proba. Principiile acestei metode de analiza sunt adsorbtie (forte electrostatice), partitie (solubilitate) si schimbul de ioni (incarcare) (Leonardi si colab., 2012, Koziorowski, 2010) Cromatografia in faza gazoasa (GC) pentru analiza de solventi reziduali Analiza solventilor reziduali prin GC a fost studiata in ceea ce priveste tehnicile de injectare, coloane si variatii de temperatura. Metode de analiza pentru determinarea solventului rezidual din produse farmaceutice se bazeaza pe cromatografia de gaze: prin 10

11 injectare tip headspace static (Fliszar et al, 2004, Qin si colab., 2004), injectie tip purge and trap (Lakatos, 2008), prin injectare cu programare de temperatura si cromatografia in faza gazoasa/spectrometrie de masa (Perez Pavon si colab., 2007). 3. METODE DE VALIDARE 3.1. VALIDAREA METODELOR ANALITICE Studiile de validare analitice sunt efectuate pentru a asigurarea ca metoda este reproductibila, fiabila, precisa si stabila in utilizarea de rutina. Inainte de a valida metoda de analiza, este necesar ca sistemul cromatografic sa fie proiectat in mod corespunzator, intretinut, calibrat si testat (Chan et al., 2004, ghidul EURACHEM, 2002, Huber, 2007). Cerintele pentru validarea metodelor analitice au fost abordate de catre Conferinta Internationala de Armonizare ( In controlul calitatii produsului radiofarmaceutic trebuie sa fie respectate metodele de analiza descrise in monografiile din Farmacopeea Europeana si ghidurile ICH (EDQM, 2014). Metodele de validare trebuie efectuate in comercializarea produselor radiofarmaceutice PET. Oricare dintre acestea este metoda de analiza adoptata (HPLC, TLC sau GC), acesta trebuie sa fie validata in raport cu urmatorii parametri: liniaritate, precizie, acuratete, specificitate, limita de detectie (LOD), limita de cuantificare (LOQ) si robustetea metodei (Riley si Rosanske, 2010). 3.2 CALITATEA PRIN PROIECTARE A METODELOR ANALITICE (Quality by Design) In dezvoltarea unor metode de analiza, poate fi aplicat principiul calitatii prin proiectare (QbD). ICH Q8 descrie bune practici pentru dezvoltarea de produse farmaceutice si introduce conceptele de spatiu de proiectare si de management al riscului de calitate. Lloyd si Bergum (2014) a introdus aplicarea QbD la dezvoltarea si validarea metodelor analitice. Un avantaj al QbD este acela ca dupa definirea spatiului de proiectare, metoda este validata in interiorul spatiului de proiectare. Metodele de determinare a spatiului de proiectare au inclus: proiectarea statistica a experimentelor (DOE) si abordari de modelare. DoE ofera o estimare a efectelor factorilor (variabile independente) ce sunt alesi pentru experiment (Tankiewicz et al., 2016, Tol et al., 2016). Metodologia Box-Behnken (BB) este una dintre metodele cele mai utilizate in DoE. BB cauta relatia dintre atributiile critice de proces si atributele critice de calitate. Metoda permite acest lucru pentru a verifica caracterul adecvat al conditiilor optime selectate (Kellner, 2004). 11

12 Avantajele aplicarii QbD in laboratorul de control al calitatii sunt: o mai buna intelegere a procesului si un control mai eficient si eficace la schimbarile aparute. Dezvoltarea metodelor prin QbD ofera oportunitatea unor abordari de reglementare mai flexibile (GMP, 2015). In cazul in care parametrii de analiza sunt schimbati in spatiul de proiectare aprobat nu este necesara revalidarea. 4. IMBUNATATIREA METODEI PENTRU DETERMINAREA PURITATII CHIMICE SI RADIOCHIMICE IN 18 F-FDG 4.1 PARAMETRII METODEI OPTIMIZATE HPAEC/PAD Metodele HPAEC au fost elaborate pe baza separarii cromatografice a standardelor FDG si ClDG tinand cont de timpul de retentie cel mai scurt (analiza mai rapida) si separare mai buna (rezolutie Rs>1). Pentru a determina raspunsul optim al detectorului, potentialul de detectie a fost schimbat in mod sistematic de la 0,1V la 0,2V pentru toate coloanele studiate. In dezvoltarea metodei am variat mai multi parametri in sistemul HPAEC: temperatura coloanei, debitul fazei mobile si concentratia fazei mobile. Prin aplicarea procedurii de mai sus, s-au gasit parametrii metodei optimizate (Tabelul 4.1), iar detaliile sunt prezentate in cele ce urmeaza. Table 4.1. Parametrii cromatografici pentru metoda optimizata HPAEC/PAD Parametri cromatografici Metoda Farmacopee Europeana Setari Procedura Optimizata Parametri Optimizati Debit (ml/min) 1 Izocratic Coloana strongly basic anion exchange resin PA1, PA1 si precoloana PA1; PA10 PA10 Temperatura, 0 C Volumul de injectare, µl Faza mobila 0.1M Hidroxid de sodiu (NaOH) 0.1 M 0.2 M 0.1M Detector detector potrivit pentru carbohidrati PAD Potential de lucru 0.1V 0.2V vs. Ag/AgCl electrod de referinta 0.15 Curent, µa Separarea pe CarboPac PA1 a fost efectuata la variatia debitului fazei mobile in intervalul 0,5 1,1 ml/min, potential de detectie intre 0,1 V si 0,2 V si variind temperatura 12

13 (25 C 55ºC). Separarea pe CarboPac PA10 a fost efectuata in aceleasi conditii. Variatia concentratiei de hidroxid de sodiu nu a influentat separarea. Sensibilitateaa detectarii a scazut odata cu cresterea concentratiei acestuia. Prin urmare, concentratia de NaOH 0.1M a fost considerata adecvata. Cele mai bune rezultate au fost obtinute folosind o coloana CarboPac PA10, la o temperatura de 40 C si un debit de 0,8 ml/min. Concentratia de hidroxid de sodiu a fazei mobile a fost mentinuta constanta la 0,1M. Timpul total al analizei a fost de 15 minute (Fig. 4.6). Fig Cromatogram obtinuta cu metoda optimizata (coloana CarboPac PA10) 4.2. STUDIU DE VALIDARE Pentru validarea ulterioara a metodei a fost selectat coloana CarboPac PA10, debitul fazei mobile 0,8 ml/min si temperatura coloanei 40 C. Validarea metodelor de analiza a fost efectuata in conformitate cu ghidurile ICH descrise in capitolul 3. Parametrii de validare au fost: conformitatea sistemului, specificitate, precizie, acuratete si liniaritate, limita de detectie (LOD) si limita de cuantificare (LOQ). Liniaritatea FDG si ClDG a fost investigata in intervalul de concentratie de 5-100µg/ml (FDG) si 4-100µg/ /ml (ClDG). Fiecare concentratie a solutiei de liniaritate a fost injectata in triplicat. Prin construirea curbelor de calibrare s-au determinat coeficientii de corelatie (R 2 > 0,99) pentru aria picurilor si inaltimea acestora (Fig. 4.8). Rezultatele indica o buna corelatie intre raspuns (aria picului) si concentratie. Fig Curbe de calibrare pentru standarde FDG and ClDG 13

14 Rezultatele obtinute la validarea metodei sunt cuprinse in Tabelul 4.5; parametrii de validare au fost evaluati conform ghidului ICH. A fost dezvoltata si validata o metoda HPAEC/PAD utila si rapida pentru controlul calitatii a radiofarmaceuticului 18 F-FDG. Impuritatile chimice pot fi separate prin cromatografie de schimb anionic cu faza mobila alcalina si determinate prin detectie in puls amperometric. Timpul de analiza este scurt, doar 15 minute. Valorile optime ale celor trei potentiale pentru detectarea impuritatilor au fost: E1 = 0.15V, E2 = -1.5V si E3 = 0.65V. Cele mai bune rezultate au fost obtinute folosind o coloana CarboPac PA10, la temperatura de 40 C si debit faza mobila 0,8 ml/min. Metoda cromatografica propusa pentru determinarea puritatii chimice si radiochimice a 18 F-FDG a fost validata in conformitate cu standardele ICH. Tabel 4.5. Parametrii de validare ai metodei dezvoltate Parametru validare Linearitate: Coeficient de corelatie (R 2 ) > 0.99 FDG ClDG Ecuatia de regresie y = x y = x Coeficient corelatie (R 2 ) Interval liniaritate (µg/ml) Precizie: %RSD < 5% Repetabilitate Precizie intermediara 80% % % LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) Acuratete: %Recuperare (80-120%) Concentratie (%) Recuperare (%)

15 5. IMBUNATATIREA METODEI PENTRU DETERMINAREA PURITATII CHIMICE SI RADIOCHIMICE IN 18 F-NaF 5.1. VALIDAREA TESTULUI PENTRU DETERMINAREA IDENTITATII SI PURITATII RADIOCHIMICE IN 18 F-NaF Identitatea si puritatea radiochimica poate fi confirmata prin HPLC echipat cu un detector (conductivitate sau ion cromatografic) sau prin cromatografie in strat subtire (TLC). Identitatea si puritatea radiochimica a fost determinata, in acest studiu, utilizand cromatografia lichida de inalta performanta (HPLC) echipat in serie cu spectrofotometru si detector radioactive. Comparativ cu metoda descrisa Ph.Eur. a fost dezvoltata o tehnica mai rapida pentru a determina impuritatile chimice care pot fi gasite in [ 18 F]NaF. Identificarea [ 18 F]NaF se realizeaza prin compararea valorii timpului de retentie (t R ) masurat pe detector radiochimic (Gaby Star) si timpul de retentie al materialului de referinta NaF masurat pe detector UV. Timpii de retentie nu sunt identici, deoarece distanta de la injector la detector radioactiv si detector UV este diferita. Prin urmare, este necesar sa se determine diferenta de timp dintre detectori si corectarea timpului de retentie a [ 18 F]NaF obtinut pe detectorul radioactiv. In acest sens, determinarea timpului de retentie a [ 18 F]NaF a fost efectuata pe cinci loturi consecutive. Pentru fiecare lot, au fost calculate diferentele dintre timpul de retentie a [ 18 F]NaF si timpul de retentie al NaF exprimata in minute si abaterea procentuala din valoarea corectata a [ 18 F]NaF in raport cu standardul NaF. Rezultatele validarii metodei HPLC pentru determinarea identitatii sunt prezentate in Tabelul 5.3. Timpul de retentie a [ 18 F]NaF ar trebui sa fie aceeasi (± 10%), cu timpul de retentie observat pentru standardul de referinta. Abaterea timpului de retentie al NaF si [ 18 F]NaF a fost de maxim 0,55%. Tabel 5.3 Validarea testului de identificare a [ 18 F]NaF Abatere Abaterea t t R [ 18 R corectat cu F]NaF, Abatere, t R NaF, (min) t R, medie abaterea min % min t R, min medie, min

16 In domeniul de liniaritate, standardele cu concentratii diferite sunt determinate prin determinarea dezintegrarii radiochimice, respectiv cu calcularea concentratiei radioactive la momentul injectarii (Tabelul 5.4). Table 5.4 Linearitatea testului de puritate radioachimica Timp (hh:mm) 09:40 10:10 10:50 11:50 12:30 13:40 14:30 Aria [ 18 F]NaF (mau min) Concentratia radioactive [ 18 F]NaF (MBq/mL) S-a reprezentat grafic concentratia radioactiva si aria picurilor (Fig. 5.2) si s-a determinat coeficientul de corelatie (R2). Fig Curba de calibrare pentru determinarea puritatii radiochimice Precizia metodei cromatografice a fost determinata prin cinci analize a probei de [ 18 F]NaF. Din evaluarea cromatogramelor obtinute s-a determinat puritatea radioactiva a [ 18 F]NaF (puritate radiochimica 99,5%) si apoi s-a calculat deviatia standard a valorilor obtinute (RSD = 0,36%). Timpul de retentie a fost inregistrat 4.13 min pentru standard si 4.33 min pentru radiofarmaceuticul [ 18 F]NaF (fig. 5.3). 16

17 Fig.5.3. Cromatograme: solutie standard detector UV (stanga) si [ 18 F]NaF-detector radioactiv (dreapta) S-a dezvoltat si validat o metoda cromatografica (HPLC) a standardului de referinta si sistemul testat a aratat un semnal bun zgomot de fond. Aceasta metoda este utila pentru controlul procesului de sinteza si determinarea impuritatilor NaF in radiofarmaceutic. Abaterea timpilor de retentie de NaF si [ 18 F]NaF este in intervalul 0-0,55%. Liniaritatea pe radiochimic detectorului R 2 este STUDII DE STABILITATE Radiofarmaceuticul [ 18 F]NaF indeplineste criteriile specificate in Ph.Eur pentru evaluarea calitatii la 8 ore dupa terminarea sintezei. Au fost testate stabilitatea fizico-chimica si microbiologica pe durata a 8 ore. 6. METODA RAPIDA PENTRU DETERMINAREA SOLVENTILOR REZIDUALI Solventii reziduali sunt impuritati critice in produsul radiofarmaceutic datorita efectele biologice adverse, pot afecta eficacitatea marcarii si influenteaza proprietatile fizicochimice ale medicamentului. Cantitatea de solvent din radiofarmaceutice trebuie sa fie scazuta pentru a fi considerata sigura din punct de vedere toxicologic. Solventii din Clasa 1 sunt cunoscuti agenti cancerigeni sau periculosi pentru mediu. Solventii din Clasa 2 (acetonitril si metanol) sunt suspectati de toxicitate, sub anumite limite. Ghidul ICH Q3C enumera acetona si etanolul din Clasa 3 de solventi iar prezenta lor in radiofarmaceutice poate fi considerata ca fiind cu risc scazut pentru sanatatea umana (EDQM, 2014, ICH Q3C). 6.1 INJECTARE DIRECTA Aceasta cercetare prezentata in acest capitol este dedicata dezvoltarii si validarii unei metode de analiza optimizata pentru a cuantifica solventii reziduali metanol, acetonitril, acetona, etanol si 2-propanol din preparate radiofarmaceutice, cum ar fi 18 F FDG, 18 F FMISO, 18 F FLT si 18 F FES. Metoda cromatografica in faza gazoasa a fost dezvoltata avand ca obiectiv separarea solventilor reziduali avand cel mai scurt timp de retentie (analiza rapida) si separarea mai buna (rezolutie mai mare decat 2). Metoda a fost caracterizata prin: precizie, liniaritate, acuratete, limita de detectie, limita de cuantificare si robustete (ICHQ2 (R1), 2005). Metoda propusa are modificari semnificative in comparatie cu metodele actuale cum 17

18 ar fi: gradient de temperatura, debitul fazei gazoase si raport de splitare (Channing, 2001, Klick, 2004, Klok, 2006). Rampa de temperatura a fost optimizat pentru C. Pentru a determina cantitativ solventii reziduali am efectuat probe la diferite rapoarte de splitare (10:1; 15:1; 20:1; 25:1). Raportul optim a fost de 15:1, deoarece la aceasta valoare, s-a gasit cel mai bun rezultat pentru aria picurilor. Parametrii metodei GC optimizate prin injectare directa sunt prezentati in Tabelul 6.1. Timpul de analiza GC a fost optimizat la ora 7 min. Tabel 6.1 Parametri cromatografici optimi Parametru GC Temperatura pe inlet (admisie gaz purtator ) 180 o C Debitul fazei mobile (He) 48 ml/min Presiune kpa Raport de splitare 15:1 Gradient de temperatura cuptor / 40 o C (2 min) 90 o C (0 min) Rampa 15 o C / min Temperatura FID 250 o C Debit gaze detector (Aer si Hidrogen) 30 ml/min. Fig. 6.1 Cromatograma solventi reziduali obtinuta prin metoda injectare directa Metoda s-a dovedit a fi liniara prin reprezentarea grafica aminimum 6 puncte in intervalul ppm pentru acetona si 2-propanol, ppm pentru metanol si ppm pentru acetonitril. Intervalul de liniaritate a fost determinata intre ppm pentru etanol. Liniaritate buna a fost realizata pentru toti solventii. Curbele de calibrare sunt prezentate in Fig Metoda dezvoltata este liniara, cu coeficienti de corelatie (R 2 ) mai mari decat 0.99 pentru toti analitii investigati. 18

19 a) b) Fig.6.2. Curbe calibrare: a. Acetona, Metanol, 2-Propanol; b. Etanol; c. Acetonitril Precizia acestei metode a fost exprimata in % RSD si i a fost realizata prin injectarea a 6 solutii standard. Deviatia standard (SD) si deviatia standard relativa (RSD) au fost calculate pentru fiecare solvent. RSD s-a dovedit a fi mai mica de 2%. Toate valorile sunt prezentate in Tabelul 6.3. In comparatie cu rezultatele Klok si Windhorst (2006), rezultatele prezentate in aceasta lucrare au si un scop analitic, deoarece limitele de detectie si de cuantificare a solventilor s-au determinat cu liniaritate ridicata. Numar determinari Metanol Valoarea medie Deviatia standard 8.81 % RSD 0.72 Tabel 6.3. Precizia metodei Area Etanol Acetona 2-Propanol Acetonitril c)

20 Ambele limite de detectie (LOD) si de cuantificare (LOQ) s-au calculat asa cum s-a descris in capitolul 3 (formulele 3.3 si 3.4). Rezultatele sunt prezentate in Tabelul 6.4. Solvent Tabel 6.4. Valori LOD si LOQ pentru solventi reziduali Limita de detectie Limita de cuantificare [mg/ml] [mg/ml] Metanol Etanol Acetona Propanol Acetonitril Metoda cromatografica propusa a fost aplicata cu succes pentru diferite radiofarmaceutice si a fost validat in conformitate cu standardele internationale ICH. Aceasta metoda este adecvata pentru evaluarea puritatii chimice a radiofarmaceuticelor marcate cu 18 F in laboratorul de control. Avantajul acestei abordari asupra altora descrise anterior (metoda Eur.Ph) este cel mai scurt timp de analiza (7 minute) pentru fiecare proba in comparatie cu 30 de minute. Cromatografia in faza gazoasa prin injectare directa este o metoda specifica adecvata pentru scopul nostru, mai ales pentru un procent de etanol de pana la 10%. Din cauza timpului scurt de analiza, aceasta metoda poate fi utilizata pentru radiofarmaceutice marcate cu 11 C (timp de injumatatire de 20 de minute). 6.2 INJECTARE HEADSPACE Scopul acestei lucrari experimentale este dezvoltarea si validarea unor metode mai rapide comparativ cu cele recomandate de Eur.Ph., pentru a determina solventii reziduali din peptide radiomarcate cu 68 Ga si care pot fi validate si utilizate in controlul calitatii. Este prezentata o metoda cromatografica in faza gazoasa prin injecare tip Headspace (HS/GC) pentru determinarea solventilor reziduali (metanol, etanol, acetona, 2- propanol si acetonitril), in produsele radiofarmaceutice. Metoda propusa are modificari semnificative in comparatie cu metoda descrisa in Eur.Ph. Un numar de parametri din sistemul HS au fost variate, si anume: temperatura (cuptor, linia de transfer si bucla), timpul (echilibrare flacon si injectare) si presiunea. Temperatura de echilibrare a fost crescuta de la 90 C pana la 105 C. Timpul de echilibrare in modulul headspace a fost scazut de la 15 la 2 minute. Ciclul GC a fost optimizat la 10 min. Un numar de parametri GC au fost evaluati la elaborarea acestei metode: gradient de temperatura, raport splitare, debitul fazei mobile. Temperatura a fost optimizata la C. Toate solutiile (standarde si probe) au fost diluate cu apa ultrapura. Parametrii metodei optimizate HS-GC sunt prezentate in Tabelul

21 Tabel 6.8 Parametrii metodei optimizate HS-GC Parametri Headspace Setari Temperatura de echilibrare 105 C Temperatura liniei de transfer 110 C Temperatura buclei 110 C Timp echilibrare flacon 2 min Timp de injectare 0.2 min GC Ciclu 10 min Volumul de injectare 1 µl Parametri GC Temperatura pe Inlet (admisia gaz purtator) 150 C Debit fazamobila (He) 82.1 ml/min Presiune 3.65 psi Raport de splitare 15:1 Gradient de temperature cuptor 35 C 85 C Rampa 10 C / min. Temperatura FID 250 C Debit gaz detector (Hidrogen siaer) 30 ml/min. Cromatograma obtinuta la injectarea standardelor este prezentata in Fig Fig Cromatograma standarde solventi reziduali Studiul liniaritate este realizata cu solutia de linearitate continand solventi reziduali in 7 concentratii (10%-120% din concentratia limita). Fiecare concentratie a solutiei de liniaritate a fost injectata in triplicat. Curbele de calibrare sunt reprezentate grafic in Fig

22 a) b) c) Fig Curbe etalonare: a) ethanol; acetone; 2-propanol b) methanol c) acetonitrile Rezultatele (R 2 mai mare decat 0.999) indica o buna corelatie intre raspunsul si concentratia. Iar aceste rezultate optime ale liniaritatii se observa din cromatograme care se suprapun. Cromatogramele suprapuse pentru fiecare concentratie sunt prezentate in Fig Fig. 6.5 Cromatograme studiul liniaritatii O metoda imbunatatita si rapida HS-GC pentru controlul calitatii 18 F-FDG a fost elaborata si validata indeplinind toate criteriilor de aceptare in ceea ce priveste liniaritatea, specificitatea, precizia, acuratetea, precum si LOD si LOQ. Metoda HS-GC se caracterizeaza prin coeficientii de corelatie mari si timpul scurt de analiza (10 min.), comparativ cu 30 min. obtinuta cu metoda din Farmacopeea Europeana. Aceasta metoda a fost aplicata cu rezultate 22

23 bune pentru determinarea solventilor reziduali de la [ 18 F]FDG, [ 18 F]NaF si 68 Ga-DOTA-c (RGD) IMBUNATATIREA METODELOR RADIOANALITICE PENTRU CONTROLUL DE CALITATE A PEPTIDELOR MARCATE CU 68 Ga Scopul acestui studiu a fost acela de a optimiza metodele de determinare a puritatii radiochimice a peptidelor marcate cu 68 Ga si efectuarea de studii de stabilitate pentru acest compus, utilizand cromatografia lichida de inalta performanta si cromatografia in strat subtire. Mai multe tipuri de peptide (neurotensina, crgd, octreotida) conjugat cu chelatori macrociclice (DOTA, NODAGA) au fost marcate cu 68 Ga. 7.1 SINTEZA SI STUDIU DE STABILITATE A PEPTIDELOR MARCATE CU 68 Ga Galiu-68 este un izotop radioactiv care emite pozitroni, produs in generatorul de 68 Ge/ 68 Ga. 1,4,7,10-Tetraazacyclodecane-1,4,7,10-acid tetraacetic (DOTA) este utilizat ca un chelator pentru marcarea arginina (R)-glicina (G)-acid aspartic (D) pentru a forma 68 Ga- DOTA-c(RGD) 2 pentru imagistica PET a receptorilor α v β 3 (tesut ischemic). Primele peptide radiomarcate studiate in aceasta cercetare ( 68 Ga-DOTA-c(RGD) 2 ) au mai multe avantaje: legare selectiva, o mai buna absorbtie celulara si sintetiza relativ usoara. Deoarece numai peptidele radiomarcate intacte au o afinitate mai mare la receptorul lor, este important sa se protejeze peptidele radiomarcate la radioliza si sa se injecteze doar radiofarmaceutice cu puritate radiochimica ridicata. Scopul acestei cercetari este testarea stabilitatii la intervale de timp diferite ale radiofarmaceuticului pastrat la temperatura camerei. Sunt incluse date de control al calitatii complete pentru trei loturi de 68 GA-DOTA-c(RGD) 2. Produsele radiofarmaceutice PET trebuie sa ramana stabile tot timpul in care sunt depozitate (Vallabhajosula, 2009). Studiile de stabilitate trebuie efectuate pentru a determina modul de depozitare si transport, precum si timpul de expirare, pentru a elucida tipul de impuritati care se formeaza in timpul depozitarii. Parametrii de stabilitate sunt: RCP, aspect, ph-ul. Parametrii de control al calitatii au fost investigate pentru a determina puritatea si stabilitatea 68 Ga-DOTA-c(RGD) 2. Compusul radiofarmaceutic a fost stabil pana la 4 ore, asa cum s-a dovedit prin ambele metode HPLC si TLC. RCP a 68 Ga-DOTA-c(RGD) 2. in 0,9% solutie salina ramas mai mare de 95% in imtervalul de 4 ore (Fig. 7.3). Pentru toate loturile RCP a fost mai mare de 95%. 23

24 uv uv min min Fig. 7.3 Cromatograme HPLC studiul stabilitatii 4h 68 Ga-DOTA c(rgd) 2 Evaluarea preliminara a radiofarmaceuticului indica potentialul acestuia pentru a putea fi utilizat in imagistica angiogenezei prin PET. 7.2 METODE RADIOANALITICE PENTRU DETERMINAREA PURITATII RADIOCHIMICE Caracterizarea chimica inainte de aplicarea in continuare a peptidelor 68 Garadiomarcate este necesara pentru a asigura identitatea si puritatea lor. Analiza trebuie sa fie efectuata intr-un timp scurt pentru a minimiza pierderea de radioactivitate. Adaugarea de inhibitori pentru a reduce efectul radiolizei a fost studiata, dar validarea metodei de determinare RCP nu este descrisa (masurarea cu exactitate a RCP). Pentru peptidele radiomarcate, controlul calitatii include metodele radio-hplc si radio-tlc (Breeman si colab., 2011). RCP a produselor finale, asa cum este determinat la sfarsitul sintezei (EOS) a fost evaluata pe o perioada de 3 luni si pentru toate radiofarmaceuticele am repetat analiza (n) de zece ori. Toate radiofarmaceutic investigate prin sistem HPLC A au aratat o puritate radiochimica ridicata (Fig. 7.4, 7.5, 7.6). Sistemul A (metoda optimizata): sistem Agilent Bio-inert 1260, pompa cuaternara, injectare manuala multiport cu bucla de injectie 20µL, coloana Nucleosil C18 Supelco, 5µm, 250x4,6 mm; Detector de radioactivitate Gaby Raytest; A = H20 0,1% TFA, B = ACN 0,1% TFA; gradient de la 0 min 100% A, 23 min, 90% B, min 90% B, min 100% A; Debit faza mobila 1 ml/min. 24

25 a) Fig. 7.4 a) 68 Ga-DOTA-cRGD Sistem A (n=10) b) b) 68 Ga-NODAGA-cRGD Sistem A (n=10) a) Fig. 7.5 a) 68 Ga-NODAGA-NOC Sistem A (n=10) b) 68 Ga-DOTA-NOC Sistem A (n=10) b) 25

26 Fig GA-DOTA-NT Sistem A (n=10) Cu ajutorul metodei optimizate (sistem A), am redus timpul de analiza pentru controlul calitatii la 26 minute. Pentru a evita rezultate fals pozitive de control al calitatii datorita formarii coloizilor, determinarea PRC se face si pe radio-tlc. Pentru aceasta analiza au fost studiate doua sisteme cromatografice diferite. Analizele ITLC au fost realizate folosind placi din fibra de sticla impregnata de silicagel ca faza stationara. In sistemul ITLC A, o solutie de 0,1 M tampon de citrat de sodiu (ph 5) a fost utilizat ca faza mobila. Valori R f au fost pentru 68 Ga-BFC-peptide si 0,7-1 pentru speciile de 68 Ga nelegate. RP-ITLC Sistem B apa/acetonitril amestec de solventi a fost utilizat ca faza mobila, care a fost preparata cu 25:75 amestec de apa cu acetonitril. Valorile R f au fost 0,7-1,0 pentru 68 Ga-BFC-peptide si pentru speciile de 68 Ga libere. O metoda utila si rapida (sistem A) pentru controlul calitatii peptidelor radiomarcate 68 Ga a fost elaborata si validata urmarind toate criteriile de aceptare in termeni de liniaritate, precizie si specificitate. Metoda optimizata a fost dovedit a fi active precise, exacte si specifice recomandand utilizarea sa pentru determinarea puritatii radiochimice a radiofarmaceuticelor marcate cu 68 Ga. Metodele HPLC si TLC se caracterizeaza prin coeficientii de corelatie mari si timpul scurt de analiza (26 min). 8. IMBUNATATIREA METODEI PENTRU DETERMINAREA IDENTITATII SI PURITATII CHIMICE A [ 18 F]FLT UTILIZAND DoE Acest capitol prezinta dezvoltarea unei metode HPLC pentru analiza [ 18 F]FLT urmand abordarea calitatea prin proiectare (QbD). QbD include, dar nu se limiteaza la proiectarea experimentelor (DOE), un set de metodologii menite sa extraga cele mai multe informatii dintr-un experiment, folosind numarul minim de experiente, fata de abordarea clasica, potrivit careia optimul este cautata fie prin modificarea separata a unuia dintre parametrii considerati importanti, sau, folosind un experiment factorial complet. Fosta abordare nu garanteaza faptul ca s-a gasit optimul adevarat, in timp ce acesta din urma presupune o multime de lucrari experimentale, chiar si pentru combinatiile de parametri, care sunt departe de optimalitate, crescand astfel costurile aferente. 26

27 Scopul acestui studiu a fost acela de a identifica cea mai potrivita metoda pentru determinarea identitatii si puritatea chimica a [ 18 F]FLT utilizand cromatografia lichida de inalta performanta cu faza inversa (RP-HPLC). Urmatorul pas a fost optimizarea, folosind ca parametri de functionare setari cromatografice, cum ar fi compozitia (continutul de etanol in faza mobila), rata a fazei mobile, iar temperatura coloanei de curgere. Deoarece timpul este un parametru critic in determinarea identitatii si puritatea chimica a [ 18 F]FLT, reducerea acesteia a fost ales ca obiectivul abordarii QbD. Pentru determinarea puritatii chimice, sistemul ales a fost un AgilentBio inert 1260, echipat cu UV si detector radioactiv. Separarea a fost realizata cu o coloana analitica cu faza inversa (Zorbax SB-C18, 150mm x 2,1 mm, 3.5µm). Precizia metodei (repetabilitate si precizia intermediara) a fost foarte buna. Liniaritatea metodei a fost demonstrata folosind cinci nivele de concentratie. Metoda s-a dovedit a fi precisa, exacta si specifica; mai mult, reproductibilitatea este foarte buna, deviatia standard relativa a ariei picului a fost mai mica de 2%. Toate acestea recomanda utilizarea sa pentru determinarea identitatii si puritatea chimica a [ 18 F]FLT. Domeniul experimental este prezentat in Tabelul 8.1. Tabel 8.1. Factorii de process si nivele de variatie Parametru/ Nivel de variatie Concentratia de etanol (%v) Debit (ml/min) Temperatura ( 0 C) Valorile optime ale parametrilor sunt prezentate in tabelul 8.5, pentru fiecare model, impreuna cu valorile functiilor obiective. Analizand timpul optim de retentie prezis de fiecare model, o discrepanta intre timpii de retentie date de modelele generate cu Box-Behnken si experimente combinate, care sunt foarte apropiate, iar cel obtinut folosind experimentul-d optimal exista, acesta din urma se apropie de timpul de retentie al fayei mobile. Tabel 8.5 Parametrii experimentali optimi Model Concentratia de Etanol Debit Temperatura Timp de retentie (%v) (ml/min) ( 0 C) prezis (min) BB D-optimal Combinat Variatia timpului de retentie cu o combinare ai parametrilor de proces (debitul si concentratia de etanol), este prezentata in Fig. 8.8 pentru cele trei modele, pe masura ce 27