NOI METODE DE ANALIZĂ A ANTIHISTAMINICELOR DIN A DOUA GENERAŢIE (LORATADINA)

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GR. T. POPA IAŞI FACULTATEA DE FARMACIE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT NOI METODE DE ANALIZĂ A ANTIHISTAMINICELOR DIN A DOUA GENERAŢIE (LORATADINA) Conducător ştiinţific, PROF. UNIV. DR. VASILE DORNEANU Doctorand, ASIST. UNIV. GEORGETA PAVALACHE Iaşi 21

2 CUPRINS (se păstrează numerotarea capitolelor din teză) INTRODUCERE 3 PARTEA GENERALĂ...4 CAPITOLUL 1 CARACTERIZAREA GENERALĂ A ANTIHISTAMINICELOR...4 CAPITOLUL 2 LORATADINA...4 CAPITOLUL 3 DATE PRIVIND METODOLOGIA DE LUCRU...4 PARTEA EXPERIMENTALĂ...5 CAPITOLUL 4. METODĂ TURBIDIMETRICĂ PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Determinarea turbidimetrică a loratadinei folosind reactivul tetraiodomercuriat de potasiu Aplicaţii ale metodei turbidimetrice de determinare a loratadinei din forme farmaceutice Concluziile capitolului...1 CAPITOLUL 5. METODE HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI METODA I HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI APLICAŢII ALE METODEI I HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Aplicaţii ale Metodei I HPLC de dozare a loratadinei din forme farmaceutice Aplicaţii ale Metodei I HPLC de dozare a loratadinei din diferite medii biologice Concluziile Metodei I HPLC pentru separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei METODA a II-a HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI APLICAŢII ALE METODEI a II-a HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Aplicaţii ale Metodei a II-a HPLC de dozare a loratadinei din forme farmaceutice Aplicaţii ale Metodei a II-a HPLC de dozare a loratadinei din diferite medii biologice Concluziile Metodei a II-a HPLC pentru separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei STUDIU COMPARATIV AL APLICAŢIILOR METODEI I HPLC ŞI METODEI a II-a HPLC Concluziile studiului comparativ...3 CONCLUZII GENERALE...31 PERSPECTIVE DE CERCETARE...35 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ...35 LISTA LUCRĂRILOR DIN TEZA DE DOCTORAT PUBLICATE SAU ÎN CURS DE PUBLICARE CURRICULUM VITAE

3 INTRODUCERE Antihistaminicele sunt antagonişti competitivi ai histaminei. Nu împiedică eliberarea histaminei, nu inactivează histaminaza, ci blochează receptorii histaminergici, datorită asemănării structurale cu histamina, împiedicând fixarea acesteia pe receptori. Corespunzător celor două tipuri de receptori histaminergici există două grupe de antihistaminice H 1 şi H 2. În manifestările alergice sunt importante mai ales efectele histaminei obţinute prin activarea receptorilor H 1. Aceste efecte pot fi combătute cu ajutorul antagoniştilor receptorilor H 1. Industria farmaceutică are reglementări stricte cu privire la activitatea laboratoarelor analitice de dezvoltare şi control. Astfel, se acordă o atenţie deosebită optimizării şi utilizării metodelor de analiză şi control a materiilor prime, a produşilor intermediari şi produselor finite. [17, 18, 19, 126, 127] Scopul acestei lucrări este de a realiza o serie de metode spectrofotometrice şi cromatografice pentru separarea şi determinarea cantitativă a unui antihistaminic din a doua generaţie şi anume loratadina, cu aplicaţii atât pe produse farmaceutice cât şi din medii biologice. Obiectivele lucrării sunt: prezentarea datelor privind unele antihistaminice de ultimă generaţie (loratadina, desloratadina), sinteza, proprietaţile fizico-chimice şi farmacologice, metodele utilizate în analiza şi controlul antihistaminicelor studiate; instituirea de noi metode de separare şi determinare cantitativă prin spectrofotometrie, respectiv cromatografie de lichide de înaltă performanţă pentru substanţa luată în studiu; validarea acestor metode în conformitate cu prevederile ghidurilor internaţionale pentru produse farmaceutice, în încercarea de a face un pas înainte în cercetarea şi optimizarea activităţii de control a calităţii în cazul acestui grup important de medicamente; folosirea metodelor pentru separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei din produse farmaceutice; folosirea metodelor pentru separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei din unele medii biologice. 3

4 PARTEA GENERALĂ Stadiul actual al cunoaşterii este structurat astfel: CAPITOLUL 1 CARACTERIZAREA GENERALĂ A ANTIHISTAMINICELOR În acest capitol sunt prezentate cele mai impotrante date privind alergia: istoric, evoluţia cercetărilor în domeniu, tipuri de alergie (Tipul I, denumit şi hipersensibilizare imediată este iniţiat de alergeni (antigen) şi este dependent de IgE; Tipul II, reacţia citotoxică sau citolitică; Tipul III, se prezintă sub formă de leziuni tisulare care se dezvoltă datorită depunerii complexelor antigen-anticorp circulante capabile să acţioneze complementul în peretele vaselor şi ţesuturile perivasculare şi Tipul IV, reacţia de hipersensibilizare mediată celular sau întârziată apare tardiv după acţiunea agresorului şi induce un flux mare celular de limfocite sensibilizate ce eliberează limfokine). S-a prezentat detaliat tratamentul tulburărilor alergice. Histamina, mediatorul chimic major în procesul alergic, este descrisă din punct de vedere chimic, biochimic şi farmacologic. Sunt prezentaţi receptorii de tip H 1, receptori de care se leagă histamina în timpul procesului alergic. De asemenea sunt prezentate antihistaminicele H 1 (antagonişti de receptori H 1 ): scurt istoric, structură chimică, clasificare, farmacocinetică, farmacodinamie, farmacoterapie, farmacotoxicologie, contraindicaţii. CAPITOLUL 2 LORATADINA Loratadina, antagonist al receptorilor H 1 din generaţia a doua, este descrisă în acest capitol, menţionându-se: denumirea ştiinţifică, formula chimică şi moleculară, masa moleculară, sinteza loratadinei, proprietăţile fizice, metodele de identificare conform European Pharmacopoeia şi United States Pharmacopeia [25, 35], substanţele cu structuri asemănătoare ce ar putea inpurifica loratadina, farmacologie clinică, farmacocinetică, precauţii la administrare, metabolizarea loratadinei, interacţiuni cu alte medicamente, reacţii adverse, forme farmaceutice cu loratadină (forma farmaceutică, conţinut, denumiri comerciale, ambalare şi păstrare, identificare [35], excipienţi). CAPITOLUL 3 DATE PRIVIND METODOLOGIA DE LUCRU În ceea ce priveşte bazele teoretice ale analizei substanţelor medicamentoase prin spectrometria de absorbţie UV-VIS, se prezintă informaţii privind: părţile componente ale spectrofotometrului de absorbţie, Legea lui Lambert-Beer, spectrele de absorbţie, analiza chimică, turbidimetria. Întrucât în Partea experimentală sunt propuse şi metode lichidcromatografice, capitolul 3 mai cuprinde descrierea cromatografiei de lichide de înaltă performanţă, părţile componente ale unui dispozitiv HPLC, pompe pentru 4

5 HPLC, coloane în LC, faza staţionară, faza mobilă, tipuri de detectori, principalii parametri cromatografici (factorul de întârziere selectivă, timpul mort, timpul de retenţie, coeficientul de distribuţie, factorul de capacitate, timpul de retenţie ajustat, volumul de retenţie, volumul mort, volumul de retenţie ajustat, factorul de asimetrie, abaterea standard, înălţimea echivalentă a talerului teoretic, coeficientul de separare, rezoluţia, numărul de talere teoretice). Validarea analitică este un subcapitol important al capitolului 3 în care se regăseşte descrierea parametrilor de validare (liniaritatea, acurateţea, precizia, limita de detecţie, limita de cuantificare, specificitatea/selectivitatea, domeniul de lucru, rigiditatea, robusteţea/stabilitatea). PARTEA EXPERIMENTALĂ (CONTRIBUŢII PERSONALE) CAPITOLUL 4. METODĂ TURBIDIMETRICĂ PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI 4.1 Determinarea turbidimetrică a loratadinei folosind reactivul tetraiodomercuriat de potasiu Scop: Ne-am propus elaborarea şi validarea unei metode de separare şi determinare a loratadinei ca atare sau din amestec prin turbidimetrie. Principiul metodei Metoda de analiză dezvoltată în această lucrare are în vedere determinarea loratadinei prin turbidimetrie folosind ca reactiv tetraiodomercuriatul de potasiu [9] Loratadina (Etil 4 -(8 cloro -5, 6 dihidro -11H benzo [5, 6] ciclohepta [1, 2 -b] piridin -11 -ilidin) -1 -piperidincarboxilat), în soluţie metanolică, formează cu ionul complex tetraiodomercuriat [HgI 4 ] 2-, în prezenţă de acid clorhidric, un compus ce prezintă absorbanţă maximă la 362 nm, proportională cu concentraţia în loratadină. Reacţia care are loc este urmatoarea: + N NH+ 2 + K2[HgI 4] + HCl - 2 KCl [HgI 4]2- N O N O Cl LORATADINA O Cl O 2 Figura nr. 37 Reacţia de formare a compusului voluminos, greu solubil 5

6 S-au stabilit condiţiile optime de lucru (mediul de reacţie, cantităţile optime de reactiv, timpul după care se efectuează citirea, etc). Metoda a fost validată, stabilindu-se următorii parametri: liniaritatea funcţiei de răspuns, liniaritatea rezultatelor, limitele de detecţie şi de cuantificare, precizia (precizia sistemului, precizia metodei, precizia intermediară), exactitatea. Rezultate S-a stabilit lungimea de undă de detecţie prin înregistrarea spectrului de absorbţie faţă de un martor, a unei probe de loratadină de concentraţie 4 μg/ml (1 ml probă) la care s-a adăugat 1 ml reactiv tetraiodomercuriat de potasiu (soluţie stoc) şi 1 ml HCl,5N şi s-a completat la 5 ml cu apă bidistilată (Figura nr. 38). Rezultatul s-a comparat cu spectrul de absorbţie a unei probe de loratadină în metanol 1 μg/ml (Figura nr.39) 4 2 Abs Figura nr.38 - Spectrul de absorbţie al compusului loratadină-[hgi 4 ] Wavelength [nm] - Figura nr Spectrul de absorbţie al loratadinei în metanol 1 μg/ml; λ max =288nm Se observă că la 362 nm absorbţia specifică a produsului de reacţie este de peste 3 ori mai mare decât absorbţia specifică a loratadinei în metanol la 288 nm, aşadar lungimea de undă de 362 nm a fost utilizată în toate determinările. Concentraţia optimă a soluţiei de tetraiodomercuriat de potasiu s-a stabilit prin analizarea a două probe de loratadină de concentraţii 2 μg/ml şi 8 μg/ml (câte 1 ml probă). Pentru fiecare probă s-a adăugat 1 ml soluţie tetraiodomercuriat de potasiu în concentraţii diferite şi s-au comparat absorbanţele obţinute. (Figura nr.4 şi Figura nr. 41). Absorbanţ a,2,15,1,5 Soluţie loratadină 2 μg/ml,1,2,3,4 Concentraţia m olară a soluţiei de tetraiodomercuriat de potasiu Figura nr.4 - Absorbanţa funcţie de concentraţia molară a soluţiei de tetraiodomercuriat de potasiu pentru soluţia de loratadină 2 μg/ml 6

7 Absorbanţ a,8,6,4,2 Soluţie loratadină 8 μg/ml Figura nr.41 - Absorbanţa funcţie de concentraţia molară a soluţiei de tetraiodomercuriat de potasiu pentru soluţia de loratadină 8 μg/ml,1,2,3,4 Concentraţia m olară a soluţiei de tetraiodomercuriat de potasiu Concentraţia optimă de tetraiodomercuriat de potasiu pentru optimizarea metodei este 2 x 1-3 M, această concentraţie fiind folosită în toate analizele ulterioare. Pentru alegerea acidităţii reacţiei s-a procedat în mod similar (citirea absorbanţei la λ = 362 nm a unor probe de loratadină de concentraţii 2 μg/ml şi 8 μg/ml la care s-au adăugat diferite concentraţii molare de HCl în volum de 1 ml) şi s-a constatat că de la concentraţia acidului clorhidric de,5m absorbanţa este practic constantă, deci aciditatea necesară reacţiei se realizează prin adăugarea unui volum de 1 ml soluţie HCl,5 M. S-a urmărit apoi stabilitatea produsului de reacţie prin analizarea spectrofotometrică a probelor la momente diferite (între 5 şi 9 minute) de la preparare şi s-a constatat că absorbanţa poate fi citită după 1 minute de la adăugarea reactivilor, iar produsul de reacţie este stabil încă 1 minute. După acest interval particulele de precipitat aflate în suspensiese aglomerează şi se depun. Metoda a fost validată în domeniul de concentraţie 1 1 μg/ml. Pentru studiul liniarităţii s-au luat în lucru 1 concentraţii diferite din domeniul studiat. S-au preparat 4 seturi de soluţii de lucru şi s-a reprezentat grafic variaţia absorbantei medii în funcţie de concentraţie. În Figura nr.46 se prezintă curba de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de determinare a loratadinei folosind ca reactiv tetraiodomercuriatul de potasiu. Absorbanţa,8,7,6,5,4,3,2,1 y =,76x -,113 R 2 =, Concentraţia (μg/ml) Figura nr.46 Dreapta de calibrare în studiul liniarităţii metodei Ecuaţia dreptei de calibrare, calculată prin regresie matematică, este: Absorbanţa =,76 x Concentraţia,113; coeficientul de corelaţie r =,99984, eroarea standard a dreptei de regresie SE =,427. Pentru a evalua precizia sistemului s-au efectuat un numar de 1 determinări pentru aceeaşi concentraţie de probă (8 μg/ml loratadină), în 7

8 aceleaşi condiţii experimentale, măsurându-se valorile absorbanţelor. S-au calculat apoi valoarea medie, deviaţia standard şi deviaţia standard relativă. Având în vedere valoarea deviaţiei standard relative obţinute, RSD =,287%, se poate afirma că la determinarea turbidimetrică a loratadinei, folosind metoda descrisă, sistemul este precis. Pentru determinarea preciziei metodei prezentate s-a ales varianta de lucru cu un minim de 9 determinări acoperind domeniul specific de concentraţie: 3 determinări la 3 valori ale concentraţiei. Conform datelor experimentale obţinute, deviaţia standard relativă (RSD = 1,4354) are o valoare mai mică de 5%, ceea ce demonstrează că metoda de analiză propusă este precisă. Precizia intermediară s-a stabilit prin efectuarea întregului experiment a doua zi, cu reactivi nou preparaţi, procedeul fiind identic ca şi în cazul determinării repetabilităţii metodei. Deviaţia standard relativă obţinută în acest caz este RSD = 1,238%. Exactitea metodei de analiză a loratadinei s-a stabilit prin metoda adaosului: într-o soluţie ce conţine o cantitate cunoscută de standard, se introduc volume de soluţie de loratadină astfel încât să se obţină concentraţii de 75, 1 şi 125% din concentraţia soluţiei ce va fi testată (6 μg/ml). Procedeul s-a repetat de trei ori utilizând soluţii etalon preparate separat. Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile absorbanţelor corespunzătoare loratadinei s-a calculat concentraţia (μg/ml) pentru fiecare probă în parte. S-a determinat apoi regăsirea, calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice, regăsirea medie, precum şi domeniul în care variază regăsirea. Biasul în studiul exactităţii metodei de determinare a loratadinei prin metoda turbidimetrică are valoarea 11,21% de pe intervalul 99,87 12,35%. Pentru determinarea limitei de detecţie (LD) şi a limitei de cuantificare (LC) am utilizat metoda de calcul în funcţie de eroarea standard şi panta dreptei de regresie şi am obţinut următoarele rezultate: LD = 3xSE panta = 1,7 μg/ml 1 xse LC = panta = 5,6 μg/ml 4.2 Aplicaţii ale metodei turbidimetrice de determinare a loratadinei din forme farmaceutice Metoda de dozare instituită pentru determinarea loratadinei sub forma asocierii ionice loratadină [HgI 4 ] 2- a fost aplicată pe diferite forme farmaceutice (comprimate cu 1 mg loratadină, comprimate cu eliberare modificată 5 mg/12 mg: loratadină/sulfat de pseudoefedrină şi sirop 1 mg/ml). La analiza comprimatelor cu 1 mg loratadină, concentraţia probelor analizate a fost calculată utilizând ecuaţia dreptei de calibrare, iar rezultatele, reprezentate în Figura nr. 48, au fost exprimate în μg/ml şi ca procent din valoarea concentraţiei teoretice. 8

9 concentraţia (μg/ml) numărul probei concentraţia regăsită concentraţia calculată Figura nr. 48 Variaţia concentraţiei regăsite faţă de concentraţia calculată în analiza comprimatelor cu loratadină Pentru determinarea loratadinei din comprimate 1 mg, regăsirea medie este de 97,98 cu intervalul de încredere μ = 97,98 ± 3,38. Rezultatele prezentate au confirmat faptul că regăsirea este conform normelor, iar metoda este validă şi poate fi folosită în controlul calităţii şi evaluarea comprimatelor cu loratadină. Comprimatele cu eliberare modificată au fost analizate în mod similar comprimatelor cu 1 mg loratadină, iar concentraţia regăsită şi concentraţia calculată au fost comparate în Figura nr concentraţia (μg/ml) numărul probei concentraţia regăsită concentraţia calculată Figura nr. 49 Variaţia concentraţiei regăsite faţă de concentraţia calculată în analiza comprimatelor cu compoziţie mixtă Regăsirea medie obţinută a fost de 1,7122, cu intervalul de încredere μ= 1,7122 ± 2,57, aşadar metoda poate fi aplicată în controlul calităţii şi dozarea loratadinei din forme farmaceutice orale cu compoziţie mixtă. O altă aplicaţie a constat în dozarea loratadinei din sirop 1 mg/ml. Prepararea probelor, procedeul şi prelucrarea rezultatelor s-au efectuat similar celorlalte forme farmaceutice. 9

10 concentraţia (μg/ml) numărul probei concentraţia regăsită concentraţia calculată Figura nr. 5 Variaţia concentraţiei regăsite faţă de concentraţia calculată în analiza siropului cu loratadină Rezultatele prezentate au confirmat faptul că regăsirea este conform normelor, iar metoda se pretează şi la controlul calităţii şi dozarea loratadinei din soluţii orale. 4.3 Concluziile capitolului A fost pusă la punct o metodă de determinare turbidimetrică a loratadinei prin cuplare cu tetraiodomercuriatul de potasiu în mediu acid, compus ce prezintă un maxim de absorbţie la 362 nm, comparativ cu loratadina în metanol care prezintă maxim de absorbţie la 288 nm. Au fost stabiliţi parametrii optimi ai metodei: lungimea de undă de detecţie λ = 362 nm când absorbanţa este maximă, concentraţia optimă de tetraiodomercuriat de potasiu, 2 x 1-3 M, aciditatea necesară reacţiei (se adaugă 1 ml HCl,5M la 5 ml probă de analizat), precum şi stabilitatea probelor (absorbanţa poate fi citită după 1 minute de la adăugarea reactivilor, iar produsul de reacţie este stabil încă 1 minute). După cum reiese din rezultatele prezentate, toate criteriile de admisibiliate setate pentru validarea metodei analitice de determinare a loratadinei prin turbidimetrie au fost îndeplinite: liniaritate pe domeniul studiat (1 1 μg/ml), coeficientrul de corelaţie fiind r =.99984, precizie (RSD = 1,4354% are o valoare mai mică de 5%, limita de detecţie (LD = 1,7 μg/ml) şi limita de cuantificare (LC = 5,6 μg/ml). Prin urmare, validarea se consideră corespunzătoare, iar metoda de testare adecvată pentru scopul propus, adică pentru determinarea concentraţiilor scăzute de loratadină în cadrul analizelor de Controlul medicamentului pentru diverse preparate farmaceutice. Pentru dozarea loratadinei din comprimate cu 1 mg loratadină s-a obţinut o regăsire medie de 97,98, cu intervalul de încredere 97,98 ± 3,38, pentru determinarea din comprimate cu eliberare modificată, s-a obţinut regăsirea medie 1,712, cu intervalul de încredere 1,712 ± 2,57, iar pentru determinarea din sirop s-a obţinut o regăsire medie de 1,481, cu intervalul de încredere 1,481 ± 2,37. Metoda este facilă, simplu de aplicat, nu necesită aparatură complicată, iar timpul de citire spectrofotometrică este redus, ceea ce permite efectuarea unui număr mare de analize într-un timp relativ scurt. 1

11 CAPITOLUL 5. METODE HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Scop: ne-am propus elaborarea şi validarea unor metode sensibile şi rapide de separare şi determinare cantitativă a loratadinei ca atare sau din amestec prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă. 5.3 METODA I HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Principiul metodei: separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei, dintr-o soluţie metanolică, prin metoda cromatografiei de lichide de înaltă performanţă, în condiţii isocratice, şi detectarea acesteia în domeniul UV, la 264 nm. Condiţii cromatografice: HPLC Agilent 12, cu pompă cuaternară, DAD, termostat, sistem de degazare, autosampler. coloană cromatografică tip C18 (25 x 4,6) 5µm XDB - C18 Agilent (Zorbax Eclipse XDB-18) ; mărime pori 8Å; suprafaţa 18m 2 /g; t limită = 6, ph = 2 9; capete dublu legate; carbon legat 1%; debit: 1 ml/min; temperatura coloanei: 27 C; volum de injectare: 1 µl; faza mobilă: soluţie de trietilamină,1% ajustată la ph = 2,75 cu acid ortofosforic / acetonitril (46/54, v/v)] isopropanol (9/1, v/v). detecţie: UV λ = 264 nm; Rezultate Pentru stabilirea condiţiilor optime de lucru s-au avut în vedere urmatoarele aspecte: stabilirea lungimii de undă de detecţie, domeniul optim de concentraţie a soluţiei de loratadină şi influenţa ph-ului fazei mobile. Stabilirea lungimii de undă de detecţie s-a realizat prin analizarea spectrofotometrică a unei probe de soluţie de loratadină în faza mobilă, de concentraţie,4 mg/ml (2 ml probă). După 1 minute de la preparare, s-a înregistrat spectrul de absorbţie faţă de martor (faza mobilă), în cuvă de 1 cm (Figura nr.51) şi s-a constat că acesta prezintă un maxim la lungimea de undă 264 nm, unde nu interferă cu absorbtia componentelor fazei mobile. Această lungime de undă a fost utilizată la determinările ulterioare. 11

12 nm 2 Abs 1 28 nm Wavelength [nm] Figura nr Spectrul de absorbţie al loratadinei, soluţie în fază mobilă,1mg/ml; λ max =264 nm S-a verificat liniaritatea pe domeniul,5 15, µg/ml şi s-a constatat că ea este respectată pe intervalul ales (Figura nr. 52). Aria picului (mau*sec.) Concentraţia (μg/ml) Figura nr.52 Stabilirea domeniului de concentraţie a soluţiei de loratadină Metoda a fost validată în domeniul,5 µg/ml 1, µg/ml. A fost urmărit efectul ph-ului fazei mobile asupra retenţiei, prin analiza unei soluţii standard de loratadină (6, µg/ml), injectată de trei ori. Considerand funcţia bazică a loratadinei şi pentru menţinerea acesteia în formă protonată, ph-ul fazei mobile a fost ajustat potentiometric la 2,6 3,1. Se constată că o creştere a ph-ului componentei apoase a fazei mobile determină creşterea timpului de retenţie (Figurile nr. 53, 54, 55). mau 2 DAD1 A, Sig=264,4 Ref=36,1 (LORATADINA \1-11.D) min Figura nr.53 Cromatogramă a soluţiei de loratadină la un volum de injectie de 1 µl, la ph-ul fazei mobile de 2,6 mau loratadina min Figura nr.54 Cromatogramă a soluţiei de loratadină la un volum de injectie de 1 µl, la ph-ul fazei mobile de 2,75 12

13 mau min Figura nr.55 Cromatogramă a soluţiei de loratadină la un volum de injectie de 1 µl, la ph-ul fazei mobile de 3,1 Modificarea valorii ph-ului determină modificarea valorilor factorului de capacitate şi a timpului de analiză cât şi aria picului. ph-ul de 2,75 pentru care s-a obţinut o arie maximă a picului şi un timp de retenţie pentru loratadină de aproximativ 3,6-3,9 minute este potrivit pentru metoda propusă. Pentru validarea Metodei I HPLC s-a verificat liniaritatea pe domeniul,5 µg/ml 1, µg/ml preparându-se 1 soluţii cu concentraţii diferite (între,5 şi 1 μg/ml). S-au efectuat 3 serii de determinări, s-au înregistrat cromatogramele aferente şi s-a calculat aria picului pentru fiecare determinare. S-a reprezentat grafic aria picului corespunzător loratadinei în funcţie de concentraţia în loratadină a soluţiilor. (Figura nr. 6) 14 Seria 1, y = 198,6x + 936,87 12 R 2 =, Seria2, y = 179,2x + 978,94 6 R 2 =, Seria 3, y = 195,7x + 944,54 2 R 2 =, Series1 Series2 Series3 Figura nr. 6 Curbele corespunzătoare fiecărei serii de determinări Ecuaţia dreptei de calibrare calculată prin regresie matematică este: Aria = 191,2 x Concentraţia + 953,45 iar coeficientul de regresie r 2 =,9978, deci liniaritatea este bună pe domeniul de concentraţie studiat. Precizia sistemului a fost demonstrată prin injectarea de şase ori a soluţiei de referinţă în volum de injecţie de 1 μl şi determinarea ariilor picurilor corespunzătoare loratadinei. Datele obţinute au fost prelucrate statistic şi s-au obţinut următoarele rezultate: deviaţia standard SD =,943, deviaţia standard relativă RSD (%) =,369, aşadar sistemul este precis. Selectivitatea metodei a fost determinată prin injectarea următoarelor soluţii: soluţie-martor (metanol, solventul utilizat la prepararea soluţiilor probă) şi soluţie de referinţă (conţine 6, µg loratadină/ml metanol). Cromatogramele solventului (Figura nr. 63) nu prezintă răspunsuri care ar putea interfera cu determinarea loratadinei în soluţia de referinţă (Figura nr. 64), în concluzie metoda este selectivă. 13

14 mau loratadina Figura nr. 63 Cromatograma solventului min Figura nr Cromatograma soluţiei standard Pentru a determina procentul de regăsire s-au realizat şase probe de control cu concentraţia loratadinei de 6, µg/ml. Probele s-au prelucrat în mod identic şi s-au efectuat injecţii de 1 μl. Utilizând valorile ariilor picurilor corespunzătoare loratadinei, s-a calculat procentul de regăsire a metodei analitice. Datele obţinute au fost prelucrate statistic şi s-a constatat că metoda se încadrează în exigenţele normelor de validare, întrucât factorul de regăsire este 1,614. La stabilirea exactităţii metodei de analiză a loratadinei, s-a lucrat prin metoda adaosului: într-o soluţie ce conţine o cantitate cunoscută de standard, se introduc volume de soluţie de loratadină astfel încât să se obţină concentraţii de 5, 1 şi 15% din concentraţia soluţiei ce va fi testată (6, μg/ml). Procedeul s-a repetat de trei ori utilizând soluţii etalon preparate separat. Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile ariilor picurilor corespunzătoare loratadinei, s-a calculat concentraţia (μg/ml) pentru fiecare probă în parte. S-a determinat regăsirea (calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice), regăsirea medie, precum şi domeniul în care variază regasirea şi s-a constatat că, bias-ul în studiul exactităţii Metodei I de determinare a loratadinei prin HPLC, are valoarea 1,83%, iar domeniul în care variază regăsirea se încadrează în intervalul 95 15%, ceea ce dovedeşte că metoda este exactă. S-au calculat limita de detecţie (LD =,1 μg/ml) şi limita de cuantificare (LC =,33 μg/ml) prin metoda de calcul în funcţie de eroarea standard şi panta dreptei de regresie APLICAŢII ALE METODEI I HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Aplicaţii ale Metodei I HPLC de dozare a loratadinei din forme farmaceutice Au fost analizate aceleaşi forme farmaceutice ca şi în cazul metodei turbidimetrice (vezi 4.2) şi anume: comprimate cu 1 mg loratadină, 14

15 comprimate cu eliberare modificată 5 mg/12 mg: loratadină/sulfat de pseudoefedrină şi sirop 1 mg/ml. Pentru analiza comprimatelor cu 1 mg loratadină s-a determinat masa medie,126 g prin cântărirea la balanţa analitică a 2 comprimate. Comprimatele cântărite s-au adus într-un mojar şi s-au triturat până la obţinerea unei pulberi fine, omogene. S-a cântărit o cantitate de pulbere echivalentă cu 1 mg loratadină. Pulberea cântărită şi 2 ml cloroform s-au adus într-un balon de 1 ml. După agitare energică timp de 1 minute s-a completat la semn cu acelaşi solvent. Suspensia obţinută s-a filtrat prin hârtie de filtru cantitativă, iar filtratul s-a adus în vaporizator până la eliminarea completă a solventului. Substanţa astfel separată s-a adus într-un balon cotat de 1 ml, s-a dizolvat în 2 ml metanol şi s-a completat la semn cu acelaşi solvent. Un volum de,5 ml din această soluţie s-a adus într-un balon de 1 ml şi s-a completat la semn cu metanol. S-a obţinut o concentraţie teoretică de,5 μg/ml. Au fost preparate un număr de 6 astfel de soluţii. Utilizând procedeul de lucru descris la capitolul 5.3.7, după echilibrarea coloanei cromatografice cu faza mobilă timp de 6 de minute, s-au injectat 1 µl din fiecare probă şi s- au înregistrat cromatogramele cu detecţie în ultraviolet, la 264 nm. (Figura nr. 65) mau loratadina min Figura nr. 65 Cromatogramă a probei de loratadină din comprimat Din cromatogramă se evidenţiază selectivitatea metodei: picul loratadinei este bine evidenţiat, iar eventualele urme de excipienţi nu interferă cu substanţa analizată. S-a determinat conţinutul în substanţă pe comprimat conform prevederilor FRX. [27] Faţă de conţinutul declarat în substanţă activă pe comprimat, s-a detectat o abatere de 1,48%, valoare ce se încadrează în abaterea admisă de ± 1%. La dozarea loratadinei din comprimate cu eliberare modificară şi compoziţie mixtă s-a determinat masa medie,9365 g prin cântărirea la balanţa analitică a 2 comprimate. Comprimatele cântărite s-au adus într-un mojar şi s-au triturat până la obţinerea unei pulberi fine, omogene. S-a cântărit o cantitate de pulbere echivalentă cu 5 mg loratadină (concentraţia pentru un comprimat). Pulberea cântărită s-a prelucrat similar probelor din comprimate orale. S-a obţinut o soluţie cu concentraţia teoretică de,5 μg/ml. 15

16 mau Area: min Figura nr. 66 Cromatogramă a probei de loratadină din comprimat cu eliberare modificată După cum se poate vedea în figura nr. 66, în cromatograma obţinută după injectarea soluţiei probă, la 3,66 minute (timp de retenţie la care eluează picul de loratadină) nu apar interferenţe ale altor compuşi. S-a determinat conţinutul în substanţă pe comprimat conform prevederilor FRX. [27] Faţă de conţinutul declarat în substanţă activă pe comprimat, s-a detectat o abatere de 7,28%. La dozarea loratadinei din sirop, un volum corespunzător cu 5 mg loratadină (5 ml sirop, doza uzuală pentru 24 ore, pentru copii cu vârste între 2 şi 12 ani) şi 1 ml cloroform s-au adus într-o pâlnie de extracţie. După agitare energică timp de 1 minute şi repaus până la separarea completă a celor două faze, componenta cloroformică s-a colectat într-un vas cu dop. Operaţia s-a repetat de 4 5 ori. Soluţia de loratadină în cloroform s-a adus în vaporizator pentru eliminarea completă a solventului. Substanţa astfel separată s-a transferat într-un balon cotat de 1 ml, s-a dizolvat în 2 ml metanol, s-a completat la semn cu acelaşi solvent şi s-a omogenizat. 1 ml din această soluţie s-a adus într-un balon de 1 ml şi s-a completat la semn cu metanol. S-a obţinut o soluţie cu concentraţia teoretică de,5 μg/ml. mau loratadina Figura nr. 67 Cromatogramă a probei de loratadină din sirop min După cum se poate vedea în Figura nr. 67, în cromatograma obţinută după injectarea soluţiei probă, nu a fost identificat nici un pic parazit la 3,535 minute, timp de retenţie la care eluează picul de loratadină. S-a determinat conţinutul în substanţă activă şi s-a comparat cu valoarea declarată, conform prevederilor FRX. [27] S-a detectat o abatere de 2,49%, valoare ce se încadrează în abaterea admisă de ± 5%. În concluzie, metoda s-a dovedit a fi validă şi uşor de aplicat în controlul calităţii şi evaluarea formelor farmaceutice cu loratadină. 16

17 Aplicaţii ale Metodei I HPLC de dozare a loratadinei din diferite medii biologice Au fost luate în lucru probe de ser uman, urină şi lapte matern. Pentru studiul probelor de ser uman s-a prelevat sânge de la 6 voluntari sănătoşi cărora li s-a administrat loratadină pe cale orală în doze de 1 mg o singură dată pe zi, la aceeaşi oră (9: AM). Voluntarii sunt adulţi, de sex masculin, care nu au prezentat niciodată alergie la produsul analizat. Probele de sânge au fost prelevate la 1 oră, 2 ore, 5 ore, 12 ore şi 24 ore după administrare. După prelevare, probele de sânge au fost centrifugate în tuburi de centrifugă la 3 rotaţii/minut, timp de 1 minute. 1, ml ser a fost tratat cu 1, ml alcool isoamilic, în scopul precipitării proteinelor serice. După 2 minute de repaus, amestecul a fost supus centrifugării la 4 rotaţii/minut timp de 1 minute. S-a luat în lucru supernatantul. [91, 92] Loratadina este bine absorbită oral şi prezintă un pic plasmatic după aproximativ 2 ore de la ingestie. Este metabolizată în mare parte la metabolitul său activ, descarboetoxiloratadină. Concentraţia loratadinei nemetabolizate în sânge a fost detectată prin Metoda I HPLC, iar modificarea valorilor acesteia s-a evidenţiat grafic (Figura nr. 72): concentraţia în loratadină (μg/ml),16,14,12,1,8,6,4, tim pul de recoltare (ore) Figura nr. 72 Modificarea în timp a concentraţiei loratadinei (μg/ml) din probele de sânge Prin analiza probelor recoltate de la cei 6 voluntari s-a observat o uşoară creştere a concentraţiei loratadinei nemetabolizate în primul interval de timp (1-12 ore de la administrare), după care o scădere datorată metabolizarii şi eliminării pe cale renală a acesteia. Conform literaturii de specialitate, loratadina nemetabolizată se elimină pe cale renală.[1, 3, 6]. Pentru acest studiu s-au prelevat probe de urină de la 6 voluntari sănătoşi cărora li s-a administrat loratadină pe cale orală în doze de 1 mg o singură dată pe zi, la aceeaşi oră (9: AM). Voluntarii sunt adulţi, de sex masculin, care nu au prezentat niciodată alergie la produsul analizat. Probele de urină au fost prelevate la 1 oră, 2 ore, 12 ore şi 24 ore după administrare. După prelevare, probele de urină au fost tratate cu alcool isoamilic, în scopul precipitării proteinelor (1 ml alcool isoamilic la 1 ml urină). După mixare 1 minute, şi 2 minute de repaus, amestecul a fost supus centrifugării la 4 rotaţii/minut timp de 1 minute. S-a luat în lucru supernatantul. 17

18 Modificarea valorilor concentraţiilor urmelor de loratadină în urină se observă în Figura nr. 77: concentraţia în loratadină (μg/ml),2,15,1, timpul de recoltare (ore) Figura nr. 77 Modificarea în timp a concentraţiei loratadinei (μg/ml) din probele de urină Metoda s-a dovedit a fi validă şi uşor de aplicat în dozarea urmelor de loratadină nemetabolizată eliminate prin urină. Loratadina se excretă în laptele matern, realizând concentraţii egale cu cele plasmatice [1, 3, 6]. Studiul a fost efectuat pe probe de lapte matern prelevat de la o persoană diagnosticată cu urticarie, la 2 luni după ce a născut. Probele de lapte au fost prelevate la ore, 1 oră, 2 ore, 3 ore, 6 ore şi 8 ore după administrarea tratamentului antihistaminic (1 mg loratadină). După prelevare, 4 ml lapte matern a fost mixat cu 1 ml acid tricloracetic 1%. Amestecul a fost lăsat în repaus 2 de minute, iar apoi s-a centrifugat la 55 rotaţii/minut, timp de 15 minute. O probă de 6 μl supernatant s-a amestecat cu 1 μl soluţie metanolică de cianaldehidă 1% şi s-a lăsat în repaus 5 minute. Probele pregătite după procedeul descris mai sus s-au analizat prin Metoda I HPLC, după echilibrarea coloanei cromatografice cu faza mobilă timp de 3 de minute. S-au injectat 1 µl din fiecare probă şi s-au înregistrat cromatogramele cu detecţie în ultraviolet, la 264 nm. În Figura nr. 8 sunt redate concentraţiile loratadinei determinate în lapte, pe întreaga perioadă de analiză: concentraţia de loratadină (μg/ml),7,6,5,4,3,2, timpul de recoltare (ore) Figura nr. 8 Modificarea concentraţiei în loratadină (μg/ml) din laptele matern după administrarea medicamentului 18

19 Concentraţia în loratadină din laptele matern creşte cu timpul scurs de la administrare până la aproximativ 6 ore, apoi începe să scadă. Metoda I HPLC este sensibilă şi poate detecta urmele de loratadină din laptele matern întrucât, picul acesteia nu interferă cu picurile celorlalte componente din probă Concluziile Metodei I HPLC pentru separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei Metoda de analiză propusă a fost optimizată pe domeniul,5 1, μg/ml. S-a stabilit lungimea de undă de detecţie (264 nm), compoziţia fazei mobile ([trietilamină,1% / acetonitril (46/54, v/v)] isopropanol (9/1, v/v)), precum şi ph-ul fazei mobile (2,75). Validarea acestei metode a dus la concluzia că metoda de analiză propusă este liniară, precisă şi exactă. S-au realizat aplicaţii ale metodei pe diferite probe (forme farmaceutice, medii biologice). În analiza formelor farmaceutice s-au luat în lucru: comprimate orale cu loratadină, comprimate cu eliberare modificată cu loratadină şi sulfat de pseudoefedrină, şi sirop cu loratadină. Regăsirea medie (%) a concentraţiilor calculate pentru fiecare formă farmaceutică se află în intervalul 92,71 12,49, ceea ce dovedeşte că metoda este validă şi poate fi folosită în controlul calităţii şi la evaluarea produselor farmaceutice cu loratadină. S-au analizat probe biologice (ser, urină şi lapte matern) după administrarea orală a 1 mg loratadină în 24 ore. Metoda utilizată pentru efectuarea acestor determinări s-a dovedit a fi simplă, selectivă, exactă, precisă şi reproductibilă pentru dozarea loratadinei. 5.4 METODA a II-a HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Principiul metodei: Separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei, folosind o coloană XDB-C8 şi faza mobilă, amestec tampon fosfat ph = 2,9 cu acetonitril în raport 15:11 (v/v), cu detecţie la 28 nm. Condiţii cromatografice: HPLC Agilent 12, cu pompă cuaternară, DAD, termostat, sistem de degazare, autosampler. coloană cromatografică tip C8 (Zorbax, Eclipse XDB-C8, capete dublu legate, 4.6 mm x 15 mm, cu mărimea particulelor de 5 μm, t limită = 6, ph = 2 9); debit: 1,5 ml/min; temperatura coloanei: 27 C; volum de injectare: 1 µl; 19

20 faza mobilă: acetonitril / (soluţie apoasă de NH 4 H 2 PO 4 1 g/l în care s- au adăugat 5 ml H 3 PO 4 ) : 11/15 (v/v) detecţie: 28 nm; Rezultate S-au stabilit condiţiile optime de lucru avându-se în vedere următoarele aspecte: lungimea de undă de detecţie, domeniul de concentraţie a soluţiei de loratadină, efectul compoziţiei fazei mobile, influenţa ph-ului fazei mobile şi influenţa temperaturii coloanei cromatografice. Pentru a stabili lungimea de undă de detecţie s-a luat în lucru o probă de soluţie standard de loratadină. După echilibrarea coloanei cromatografice cu fază mobilă timp de 6 de minute s-au efectuat injecţii de 1 μl la diferite lungimi de undă atât din domeniul UV cât şi din domeniul vizibil şi s-a constat că la lungimea de undă λ = 28 nm, loratadina prezintă înălţimea şi aria picului optime pentru analizele propuse. Domeniul de concentraţie s-a ales prin analiza a 1 diluţii ale soluţiei standard de loratadină cu concentraţii între,5 şi 12 µg/ml (Figura nr. 83). 12, 1, 8, 6, 4, 2,,, 2, 4, 6, 8, 1, 12, 14, Figura nr. 83 Stabilirea domeniului de concentraţie a soluţiei de loratadină S-a verificat liniaritatea şi s-a constatat că ea este respectată până la concentraţia de 9, µg/ml, deci metoda a fost validată în domeniul,5 µg/ml 9, µg/ml. A fost studiat efectul compoziţiei fazei mobile prin înregistrarea cromatogramelor unor soluţii standard de loratadină, utilizând ca fază mobilă un amestec de solvent A (soluţie apoasă de fosfat monobazic de amoniu 1 mg/ml cu ph-ul ajustat la 2,9 cu acid fosforic) şi solvent B (acetonitril) în diferite rapoarte. S-a reprezintă grafic variaţia timpului de retenţie (Figura nr. 85) şi variaţia factorului de capacitate (Figura nr. 86) în funcţie de procentul de solvent B din compoziţia fazei mobile. 2

21 Timpul de retenţie (minute) Procentul de solvent B Figura nr. 85 Reprezentarea grafică a timpului de retenţie în funcţie de procentul de acetonitril din compoziţia fazei mobile Factorul de capacitate, k' 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1, Procentul de solvent B Figura nr. 86 Reprezentarea grafică a factorului de capacitate în funcţie de procentul de acetonitril din compoziţia fazei mobile Se observă că modificarea cantităţii de acetonitril din compoziţia fazei mobile are o influenţă semnificativă asupra retenţiei loratadinei. Raportul de amestecare solvent A / solvent B, ales pentru determinările ulterioare este de 15/11 (v/v) întrucât astfel se obţine un factor de capacitate optim şi un timp de retenţie al loratadinei de aproximativ 4 minute care asigură evitarea interferenţei unor excipienţi prezenţi în produsele farmaceutice sau în probele biologice analizate. A fost urmărit efectul ph-ului fazei mobile asupra retenţiei, prin analiza unei solutii standard de loratadina (6 µg/ml), injectată de trei ori. S-au efectuat trei serii de determinări. Pentru fiecare serie s-a preparat câte o fază mobilă conform indicaţiilor de la capitolul 5.4.5, modificându-se ph-ul soluţiei apoase între 2, şi 3,5. Modificarea valorii ph-ului a determinat modificarea valorilor factorului de capacitate, a ariei picului loratadinei şi a timpului de analiză. ph-ul de 2,9 pentru care s-a obţinut aria maxima si un timp de retenţie pentru loratadină de aproximativ 4 minute este potrivit pentru metoda aleasă. Temperatura de lucru a fost aleasă prin înregistrarea unei serii de cromatograme pentru o soluţie standard de loratadină, utilizând ca fază mobilă, amestecul: acetonitril / (soluţie apoasă de NH 4 H 2 PO 4 1 g/l în care s-au adăugat 5 ml H 3 PO 4 ): 11/15 (v/v). Temperatura coloanei a fost variată între C. (Figura nr. 89) 21

22 mau loratadina (temp. coloana = 27 grade celsius) 3.86 mau loratadina (temp. coloana = 35 grade celsius) min mau loratadina (temp coloana = 45 grade celsius) min Figura nr Cromatogramă comparativă a soluţiei standard de loratadină la diferite temperaturi min Pentru analiza loratadinei prin HPLC, s-a ales temperatura de lucru de 27 C, când loratadina prezintă un timp de retenţie de aproximativ 4 minute, iar picul său este simetric. Metoda a II-a HPLC a fost validată. S-a verificat liniaritatea pe domeniul,12 µg/ml,6 µg/ml. S-au înregistrat cromatogramele aferente şi s-a calculat aria picului pentru fiecare determinare. S-a reprezintat grafic variaţia ariei medii în funcţie de concentraţie şi s-a determină domeniul pentru care această variaţie este liniară.(figura nr. 96) 1 8 Linear Regression with 95% Mean Prediction Interval and 95% Individual Prediction Interval aria medie aria = 956,68*conc. - 59,427 R-Square =, concentraţia Figura nr. 96 Curba de etalonare pentru determinarea loratadinei prin HPLC Metoda este liniară în domeniul de concentraţie ales (,5 9, μg/ml). Ecuaţia dreptei este: Aria = 956,68 x Concentraţia 59,428. Pe acest interval, coeficientul de regăsire are valoarea r =,9992 iar eroarea standard a curbei de regresie are valoarea SE= 95,668. Precizia sistemului a fost demonstrată prin injectarea de şase ori a soluţiei de referinţă în volum de injecţie de 1 μl şi determinarea ariilor 22

23 picurilor corespunzătoare loratadinei. Datele obţinute au fost prelucrate statistic şi s-au obţinut următoarele rezultate: deviaţia standard SD = 4,72229 şi deviaţia standard relativă RSD(%) = 1, Selectivitatea metodei a fost determinată prin injectarea următoarelor soluţii: soluţie-martor (metanol, solventul utilizat la prepararea soluţiilor probă) şi soluţie de referinţă (conţine 6, µg loratadină/ml metanol). Cromatograma solventului (Figura nr. 98) nu prezintă răspunsuri care ar putea interfera cu determinarea loratadinei în soluţia de referinţă (Figura nr. 99), deci metoda este selectivă. mau loratadina Figura nr. 98 Cromatograma solventului min Figura nr Cromatograma soluţiei standard de loratadină 6 μg/ml Pentru a determina procentul de regăsire în cazul Metodei a II-a HPLC, s-au realizat şase probe de control cu concentraţia loratadinei de 6, µg/ml. Probele s-au prelucrat în mod identic şi s-au efectuat injecţii de 1 μl. Utilizând valorile ariilor picurilor corespunzătoare loratadinei, s-a calculat factorul de regăsire a metodei analitice. Metoda se încadrează în exigenţele normelor de validare, întrucât Factorul de regăsire este,9977. Pentru determinarea exactităţii Metodei a II-a de analiză a loratadinei, s-a lucrat prin metoda adaosului. Utilizând ecuaţia dreptei de calibrare şi valorile ariilor picurilor corespunzătoare loratadinei, s-a calculat concentraţia (μg/ml) pentru fiecare probă în parte. S-a reprezentat grafic concentraţia regăsită în funcţie de concentraţia teoretică (Figura nr. 1). concentraţia(μg/ml) nr. probă concentraţia teoretică concentraţia calculată Figura nr. 1 Graficul concentraţiilor pentru determinarea exactităţii metodei 23

24 S-a determinat regăsirea (calculată ca procent din valoarea concentraţiei teoretice), regăsirea medie, precum şi domeniul în care variază regasirea şi s-a constatat că bias-ul are valoarea 1,2%, iar domeniul în care variază regăsirea se încadrează în intervalul 95 15%, ceea ce dovedeşte că metoda este exactă. S-au calculat limita de detecţie (LD =,3 μg/ml) şi limita de cuantificare (LC = 1, μg/ml). În concluzie, metoda se poate extinde la concentraţii mai mici de loratadină decât cele din domeniul studiat APLICAŢII ALE METODEI a II-a HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI Aplicaţii ale Metodei a II-a HPLC de dozare a loratadinei din forme farmaceutice Aşa cum am procedat la Metoda I HPLC, şi în acest caz au fost analizate următoarele forme farmaceutice: comprimate cu 1 mg loratadină, comprimate cu eliberare modificată 5 mg/12 mg: loratadină/sulfat de pseudoefedrină şi sirop 1 mg/ml. Toate probele obţinute din forme farmaceutice au fost prelucrate în mod identic ca la Metoda I HPLC, dar citite în condiţiile cromatografice ale metodei de faţă. Au fost preparate un număr de 6 probe din comprimate cu 1 mg loratadină. Utilizând procedeul de lucru descris la capitolul 5.4.7, după echilibrarea coloanei cromatografice cu faza mobilă timp de 6 de minute, s-au injectat 1 µl din fiecare probă şi s-au înregistrat cromatogramele cu detecţie în ultraviolet, la 28 nm. (Figura nr. 11) mau loratadina Figura nr. 11 Cromatogramă a probei de loratadină din comprimat min Din cromatogramă se evidenţiază selectivitatea metodei: picul loratadinei este bine evidenţiat, iar eventualele urme de excipienţi nu interferă cu substanţa analizată. S-a determinat conţinutul în substanţă pe comprimat conform prevederilor FRX. [27] Faţă de conţinutul declarat în substanţă activă 24

25 pe comprimat, s-a detectat o abatere de,49%, valoare ce se încadrează în abaterea admisă de ± 1%. La analiza comprimatelor cu compoziţie mixtă, după injectarea soluţiei probă, nu a fost identificat nici un pic la 3,841 minute, timp de retenţie la care eluează loratadina. Faţă de conţinutul declarat în substanţă activă pe comprimat, s-a detectat o abatere de 3,8%. Probele obţinute din soluţia orală s-a detectat o abatere de 1,74%, valoare ce se încadrează în abaterea admisă de ± 5%. În concluzie, Metoda a II-a HPLC s-a dovedit a fi validă şi uşor de aplicat în controlul calităţii şi evaluarea formelor farmaceutice cu loratadină Aplicaţii ale Metodei a II-a HPLC de dozare a loratadinei din diferite medii biologice Au fost luate în lucru probe de ser uman, urină şi lapte matern. Prelevarea lichidului biologic, momentul prelevării precum şi voluntarii de la care s-au efectuat recoltările coincid cu cei de la Metoda I HPLC. Prelucrarea probelor (deproteinizarea, separarea loratadinei din lichid, prepararea soluţiilor de analizat) este de asemenea identică cu cea de la prima metodă cromatografică. S-au înregistrat cromatogramele corespunzătoare probelor obţinute din ser uman şi s-au calculat ariile picurilor loratadinei observându-se o creştere mai rapidă a concentraţiei loratadinei nemetabolizate în primul interval de timp (1-2 ore de la administrare), o creştere mai lentă a acesteia în a doua parte (2 12 ore), după care o scădere datorată metabolizarii şi eliminării pe cale renală a substanţei active. (Figura nr. 18) concentraţia în loratadină (μg/ml),16,14,12,1,8,6,4, timpul de recoltare (ore) Figura nr. 18 Modificarea concentraţiei loratadinei (μg/ml) din probele de sânge recoltate în timp de la 1 la 24 ore La aplicarea Metodei a II-a HPLC pe probele de urină au fost înregistrate cromatogramele corespunzătoare probelor, s-au calculat ariile picurilor loratadinei şi s-a observat că picurile celorlalte componente din probă nu interferă cu picul loratadinei, ceea ce face ca metoda să fie sensibilă pentru loratadină în mediul analizat. Evoluţia concentraţiei de loratadină în urină a fost reprezentată grafic (Figura nr. 113) 25

26 concentraţia în loratadină (μg/ml),2,15,1, timpul de recoltare (ore) Figura nr. 113 Modificarea concentraţiei loratadinei (μg/ml) în urină, în funcţie de timp de la 1 la 24 ore Loratadina este excretată în laptele matern după aproximativ 1,5 2 ore de la administrare. În Figura nr. 117 sunt consemnate concentraţiile loratadinei determinate în lapte, pe întreaga perioadă de analiză: concentraţia de loratadină (μg/ml),7,6,5,4,3,2, timpul de recoltare (ore) Figura nr. 117 Modificarea în timp a concentraţiei loratadinei (μg/ml) din laptele matern după administrarea medicamentului Concentraţia în loratadină din laptele matern creşte cu timpul scurs de la administrare (până la 6 ore) apoi începe să scadă. Metoda a II-a HPLC este sensibilă şi poate detecta urmele de loratadină întrucât, picul acesteia nu interferă cu picurile celorlalte componente din probă Concluziile Metodei a II-a HPLC pentru separarea şi determinarea cantitativă a loratadinei S-a descris şi validat o nouă metodă HPLC pentru identificarea şi determinarea cantitativă a loratadinei în condiţii isocratice prin detectarea acesteia în domeniul ultraviolet, la 28 nm. Metoda de analiză a fost optimizată pe domeniul,5 9, μg/ml. S-a stabilit lungimea de undă de detecţie (28 nm), compoziţia fazei mobile acetonitril / (soluţie apoasă de NH 4 H 2 PO 4 1 g/l în care s-au adăugat 5 ml H 3 PO 4 ): 11/15 (v/v), temperatura de lucru (27 C), precum şi ph-ul fazei mobile (2,9). Metoda este liniară pe domeniul studiat întrucât este respectat criteriul de admisibilitate R 2,995 (în cazul metodei de faţă, R 2 =,9985); ecuaţia 26

27 dreptei de regresie este: Aria = 956,68 x concentraţie 59,428; eroarea standard a curbei de regresie este SE = 95,668. Sistemul este precis pentru că RSD (n = 6) = 1,92%, adică mai mic decât 5%. Cromatograma solventului sau a soluţiei martor nu prezintă răspunsuri care ar putea interfera cu determinarea loratadinei în soluţia de referinţă, aşadar metoda este selectivă. S-a analizat exactitatea metodei şi s-a calculat bias-ul 1,2%, care se încadrează în intervalul 95 15%, deci metoda este exactă. S-au calculat limita de detecţie (LD =,3 μg/ml) şi limita de cuantificare (LC = 1, μg/ml). În concluzie, metoda de analiză propusă este liniară, precisă, selectivă şi exactă. Verificarea acestor parametri s-a efectuat prin aplicarea metodei pe diferite probe (forme farmaceutice, medii biologice). Ca şi în cazul Metodei I HPLC, în analiza formelor farmaceutice s-au luat în lucru: comprimate orale cu loratadină, comprimate cu eliberare modificată cu loratadină şi sulfat de pseudoefedrină, şi sirop cu loratadină. Regăsirea medie (%) pentru fiecare formă farmaceutică analizată s-a regăsit în intervalul 96,91 11,74 %, aşadar metoda este validă şi poate fi folosită în controlul calităţii şi la evaluarea produselor farmaceutice cu loratadină. S-au analizat probe biologice (ser, urină şi lapte matern) după administrarea orală a 1 mg loratadină în 24 ore. Metoda stabilită s-a dovedit a fi sensibilă, cu o bună acurateţe şi simplă pentru determinarea nivelului de loratadină din diferite probe (de sinteză sau biologice), în concluzie este potrivită pentru studii farmacocinetice şi de biodisponibilitate ale loratadinei. 5.5 STUDIU COMPARATIV AL APLICAŢIILOR METODEI I HPLC ŞI METODEI a II-a HPLC S-a realizat o analiză comparativă a rezultatelor obţinute la dozarea loratadinei din forme farmaceutice şi medii biologice prin metoda descrisă la capitolul 5.3 METODA I HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI, cu rezultatele obţinute la dozarea loratadinei prin metoda descrisă la capitolul 5.4 METODA a II-a HPLC PENTRU SEPARAREA ŞI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A LORATADINEI şi s-au obţinut următoarele rezultate: La determinarea loratadinei din comprimate orale, diferenţa dintre media obţinută prin Metoda I (98,51) şi cea obţinută prin cea de-a doua metodă (99,5) este nesemnificativă. Valorile SD şi RSD în ambele cazuri sunt comparabile. (Figura nr. 118 şi Tabelul nr. 94) 27