UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GRIGORE T.POPA FACULTATEA DE FARMACIE DOCTORAND,

Transcription

1 UIVERITATEA DE MEDICIĂ ŞI FARMACIE GRIGRE T.PPA FACULTATEA DE FARMACIE DCTRAD, BGDA PALADE REZUMAT TEZA DE DCTRAT CRDATR ŞTIIŢIFIC, PRF.UIV.DR. MIHAI IA LAZĂR Iaşi, 2010

2 CUPRI TADIUL CUAŞTERII TUDII PRIVID TABILITATEA UR CEFALPRIE, MATERII PRIME PETRU BŢIEREA DE FRME FARMACEUTICE CAPITLUL 1 DATE PRIVID TRUCTURA ŞI CLAIFICAREA CEFALPRIELR tructura cefalosporinelor...1 Cefalosporine si cefamicine obtinute prin biosinteza Proprietatile fizico-chimice ale cefalosporinelor Proprietati fizice Proprietati chimice...5 a. Desfacerea legăturii C- din ciclul beta-lactamic...6 b. Gruparea 7-acilamino...6 c. Reacţiile legăturii duble 3-cefem...6 d. Derivaţi de 3-cefem...7 e. Gruparea 4 - carboxil din cefalosporine...7 f.reacţiile atomului de sulf...8 g. Înlocuirea atomului de hidrogen de la C Clasificarea cefalosporinelor...9 Cefalosporine din prima generaţie...9 Cefalosporine din generaţia a doua Cefalosporine din generaţia a treia Cefalosporine din generaţia a patra Cefalosporine din generaţia a cincea CAPITLUL 2 ACŢIUEA FARMACLGICÃ A CEFALPRIELR Actiunea antibacteriana Condiţii structurale fundamentale pentru activitatea antibacteriană Relatia structura-activitate Cefalosporine Influenţa substituentului de la C 3 asupra activităţii antibacteriene a cefalosporinelor Atomul de sulf şi acţiunea antibacteriană a cefalosporinelor tructura 7-α-metoxi-cefalosporinelor (cefamicine) şi activitatea lor antibacteriană CAPITLUL 3 METDE AALITICE DE TUDIU AL TABILITATII CEFALPRIELR tabilitatea substantelor medicamentoase Metode analitice de urmãrire a stabilităţii cefalosporinelor Metode cromatografice de analiză a cefalosporinelor Cromatografia pe strat subţire Cromatografia de lichide de înalta performanta Metode spectrale de analiza a cefalosporinelor Metode spectrale in UV-VI Metode fluorimetrice Metode spectrale in IR

3 Metode RM Metode electrochimice Metode electroforetice Aplicatiile electroforezei capilare in analiza stabilitatii Cefalosporinelor... Metode voltametrice CTRIBUTII PRPRII CAPITLUL DATE AALITICE PRIVID CEFTAZIDIMA I CEFIXIMA 4.1. Justificarea şi scopul cercetării tructura şi proprietãţile fizico-chimice ale ceftazidimei şi cefiximei Prevederi ale farmacopeei europene, editia 6-a privind Cefalosporinele luate in studiu Ceftazidima tructura Impuritati Cefixima tructura Impurităţi Identificarea ceftazidimei si cefiximei Identificarea cromatografica pe strat subtire Identificarea spectrala in UV Identificarea spectrala in IR Identificarea HPLC Determinarea HPLC a impurităţilor ceftazidimei CAPITLUL 5 IDETIFICAREA I VALIDAREA UEI METDE CUATIFICARE A CEFTAZIDIMEI PETAHIDRAT I A UBTATELR IRUDITE CP PRTCL DE VALIDARE Principiul metodei Definirea parametrilor de performanţă. Criterii de admisibilitate Identificarea picurilor pecificitatea/selectivitatea Eligibilitatea sistemului Liniaritatea şi domeniul de liniaritate Acurateţea (exactitatea)/regăsirea medie Fidelitatea/precizia sistemului Limita de detecţie Limita de cuantificare Descrierea metodei Aparatura utilizată Reactivi necesari Prepararea soluţiilor istemul cromatografic Rezultate si discuţii Identificarea picurilor Eligibilitatea sistemului pecificitatea metodei Liniaritatea şi domeniul de liniaritate al metodei pentru Ceftazidimă Liniaritatea şi domeniul de liniaritate pentru impuritatea F Exactitatea / acurateţea metodei Precizia sistemului Limita de detecţie şi limita de cuantificare Concluzii CAPITLUL 6 IDETIFICAREA I VALIDAREA UEI METDE DE AALIZA A CEFIXIMEI I A UBTATELR IRUDITE CP PRTCL DE VALIDARE Principiul metodei Definirea parametrilor de performanţă. Criterii de admisibilitate Identificarea picurilor pecificitatea/selectivitatea Eligibilitatea sistemului Liniaritatea şi domeniul de liniaritate Acurateţea (exactitatea)/regăsirea medie Limita de detecţie Limita de cuantificare tabilitatea substanţei active. Impurităţi şi produşi de degradare Descrierea metodei Aparatura utilizată Reactivi necesari Prepararea soluţiilor istemul cromatografic Efectuarea determinării Rezultate si discuţii Identificarea picurilor Eligibilitatea sistemului pecificitatea metodei Liniaritatea şi domeniul de liniaritate al metodei Exactitatea/acurateţea metodei Limita de detecţie şi limita de cuantificare tudiu de degradare a cefiximei trihidrat Concluzii CAPITLUL 7 ELABRAREA UR METDE DE AALIZA PETRU CEFTAZIDIMA I CEFIXIMA Analiza cromatografica pe strat subtire Metode spectrometrice de determinare a ceftazidimei si cefiximei 133 Metode spectrometrice de determinare a ceftazidimei

4 1. Determinarea cantitativa a ceftazidimei prin derivatizare cu acidul p-cloranilic Validarea metodei Determinarea stoechiometriei reactiei chimice de formare a complexului radicalic ionic pentru ceftazidimă Determinarea cantitativă a ceftazidimei prin derivatizare cu metilbenzotiazolin-2-on hidrazona (MBTH) Validarea metodei Determinarea cantitativă a ceftazidimei prin derivatizare cu Clorhidrat de n-(1-aftil)etilendiamină (EDA) Cinetica formării complexului CFZM - EDA Validarea metodei Metode spectrometrice de determinare a cefiximei Determinarea cantitativa a cefiximei prin derivatizare cu acidul p-cloranilic Validarea metodei Determinarea stoechiometriei reactiei chimice de formare a complexului radicalic ionic pentru cefiximă Determinarea cantitativă a cefiximei prin derivatizare cu MBTH Validarea metodei Determinarea cantitativă a cefiximei prin derivatizare cu n-(1-naftil) etilendiamină (EDA) Cinetica formării complexului CFXM - EDA Validarea metodei Analiza HPLC a ceftazidimei si cefiximei Analiza HPLC a ceftazidimei Validarea metodei Analiza HPLC a cefiximei Validarea metodei CAPITLUL 8 CERCETAREA TABILITATII CEFTAZIDIMEI I CEFIXIMEI MATERIE PRIMA PETRU BTIEREA DE FRME FARMACEUTICE TABILITATEA CEFTAZIDIMEI MATERIE PRIMA EVALUAREA CATITATIVĂ A TABILITĂŢII CEFTAZIDIMEI Cercetarea stabilităţii ceftazidimei în condiţii normale şi de stres Urmărirea stabilităţii ceftazidimei în condiţii de temperaturi cuprinse Între 21 şi 37 o C Urmărirea stabilităţii ceftazidimei în condiţii stres Degradare în mediu acid Degradare în mediu alcalin Degradare în mediu oxidant tabilitatea cefiximei materie prima Evaluarea cantitativă a stabilităţii cefiximei Cercetarea stabilităţii cefiximei în condiţii normale şi de stres Urmărirea stabilităţii ceftazidimei în condiţii de temperaturi cuprinse Între 21 şi 37 o C Urmărirea stabilităţii cefiximei în condiţii stres Degradare în mediu acid Degradare în mediu alcalin Degradare în mediu oxidant CAPITLUL 9 TUDIUL TABILITAŢII CEFTAZIDIMEI I CEFIXIMEI I FRME FARMACEUTICE DZATE Modalităţi de studiere a stabilităţii substanţelor şi formelor FARMACEUTICE 1. Testarea in timp real Testarea în condiţii accelerate Testarea în condiţii de stres (degradare forţată) FRME FARMACEUTICE DZATE uspensii Emulsii oluţii Comprimate Capsule gelatinoase Unguentele FRMELE FARMACEUTICE BŢIUTE CU CEFTAZIDIMĂ ŞI CEFIXIMĂ CEFTAZIDIMĂ, PULBERE PETRU LUTIE IJECTABILA Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 0,25 g ceftazidimă Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 0,50g ceftazidimă Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 1,0 g ceftazidimă Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 2, g ceftazidimă CEFTAZIDIMĂ PULBERE PETRU ADMIITRARE ITRAVEAĂ Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 0,200 g ceftazidimă CEFIXIMĂ, CAPULE Analiza stabilităţii cefiximei în capsulele cu 0,200 g cefixima CCLUZII GEERALE BIBLIGRAFIA CULTATA

5 CTRIBUŢII PRPRII CAPITLUL 4 DATE AALITICE PRIVID CEFTAZIDIMA I CEFIXIMA TRUCTURA ŞI PRPRIETÃŢILE FIZIC-CHIMICE ALE CEFTAZIDIMEI ŞI CEFIXIMEI CEFTAZIDIMA tructura H 2 H 3 C CH 3 H H IDETIFICARE Identificare spectrală constă în compararea spectrului de absorbţie al substanţei cercetate cu spectrul de absorbţie al substanţei de referinţă (CR). Referitor la substanţe A. Examinare pe strat subţire utilizând plăci cu ilicagel F 254 B. Examinare prin cromatografie de lichide Procedeul cromatografic necesită: - coloană cromatografică 0, 25 m cu diametru interior de 4,6 mm umplută cu octadeciclsilil silicagel pentru cromatografie (5 m), - o fază mobilă ce curge cu o viteză de 1,3 ml/min formată din acetonitril, amoniu dihidrogen fosfat( soluţie 22,6 g/l) în proporţie de 7:93. Faza mobilă se adduce la ph 3,9 cu soluţie 10% de acid fosforic. - detecţie UV 255 nm - temperatura coloanei 35 o C. IMPURITATI Posibilele impurităţi se determină lichid-cromatografic faţa de substanţe de referinţă. e cercetează prezenţa impurităţilor A, B, C şi F. Impuritatea D se determină prin cromatografiere pe strat subţire. H + TRUCTURA IMPURITĂŢILR A. (2R,6R,7R)-7-[[(Z)-2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-[(1-carboxy-1- methylethoxy)imino]acetyl]amino]-8-oxo-3-[(1-pyridinio)methyl]-5-thia-1- azabicyclo[4.2.0]oct-3-ene-2-carboxylate (Δ-2-ceftazidime) H 2 şi epimerii de la C* H 3 C CH H 3 C H C - * H H H B. (6R,7R)-7-[[(E)-2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-[(1-carboxy-1- methylethoxy)imino]acetyl]amino]-8-oxo-3-[(1-pyridinio)methyl]-5-thia-1- azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate H 2 HC CH 3 + CH C - 3 H + H H H C. (6R,7R)-2-carboxy-8-oxo-3-(pyridiniomethyl)-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en- 7-aminium dichloride + H3 H H CH D. (6R,7R)-7-[[(Z)-2-[[2-(1,1-dimethylethoxy)-1,1-dimethyl-2-oxoethoxy]imino]-2- [2-(triphenylmethyl)amino]thiazol-4-yl]acetyl]amino]-8-oxo-3-(pyridiniomethyl)- 5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxâylate + 2Cl - 2 3

6 H 3 C CH 3 CH 3 H 3 C H C - 3 C + H H H H E. (6R,7R)-7-[[(Z)-2-(2-ammoniothiazol-4-yl)-2-[[2-(1,1-dimethylethoxy)-1,1- dimethyl-2-oxoethoxy]imino]acetyl]amino]-8-oxo-3-(pyridiniomethyl)-5-thia-1- azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate chloride IDETIFICAREA CEFTAZIDIMEI I CEFIXIMEI 1. IDETIFICAREA CRMATGRAFICA PE TRAT UBTIRE uport: - plăci cromatografice cu ilicagel GF 254 (Merck) istem developare: - butanol - tampon acetat de sodiu, ph 4,5 - acetat de butil - acid acetic glacial (6:26:32:32) H 3 C CH 3 F. Piridina CEFIXIMA tructura + H3 CH 3 H 3 C H 3 C H H H H C - + Cl - 1 = ceftazidima proba 3= cefixima probă 2 = ceftazidima etalon 4 = cefixima etalon Cromatograma pe strat subţire a ceftazidimei şi cefiximei 2. IDETIFICAREA PECTRALA I UV Aparat: spectrofotometru Jasco V-530 oluţii etalon: 1-10 g/ml ceftazidimă şi cefiximă în alcool metilic oluţii probe: 2-4 g/ml ceftazidimă, 4 6 g/ml cefiximă în alcool metilic pectrele obţinute sunt redate în figurile urmatoare: H H 2 CH 2 H pectrul de absorbţie al ceftazidimei 4 5

7 pectrul de absorţie al cefiximei 3. IDETIFICAREA PECTRALA I IR Analizele IR au fost efectuate în următoarele condiţii: pectrofotometru FT-IR Bruker ptics de tip Tensor 27 pectrul IR al ceftazidimei pectrul IR al cefiximei Concluzii Prin compararea spectrelor cefalosporinelor materii prime cu cele obţinute cu ceftazidina şi cefixima etalon putem afirma că ele corespund din acest punct de vedere al identificării. 6 CAPITLUL 5 IDETIFICAREA I VALIDARE UEI METDE CUATIFICARE A CEFTAZIDIMEI PETAHIDRAT I A UBTATELR IRUDITE CAPITLUL 6 IDETIFICAREA I VALIDAREA UEI METDE DE AALIZA A CEFIXIMEI I A UBTATELR IRUDITE CAPITLUL 7 ELABRAREA UR METDE DE AALIZA PETRU CEFTAZIDIMA I CEFIXIMA 1. AALIZA CRMATGRAFICA PE TRAT UBTIRE Am apelat la tehnicile cromatografice indicate de Fardous A. Mohamed, pe care le-am modificat pe baza unor indicaţii bibliografice (Eric-Jovanovic, Tuzimski T. şi Bhushan Ravi). Adsorbant: ilicagel GF 24 isteme solvenţi: 1. acid propionic-2-propanol-apă (6:2:3) 2. 2-propanol-apă-acetat de etil (5:3:3) 3. n-butanol-apă-acid acetic (5:4:2) 4. acetat de etil-acetonă-metanol-apă (5:2,5:2,5:1.5) Reactivi de developare: 1. UV 254 nm 2. Reactiv Dragendorff Modul de efectuare al unor asemenea determinări a fost expus în capitolul 4 al acestei lucrări. In tabel sunt înscrise valorile Rf obţinute prin analiză pe strat subţire de silicagel GF 254 în cele 4 sisteme de developare propuse. Valorile Rf determinate pentru cefalosporinele materii prime Cefalosporina Valoarea Rf Ceftazidima 0,70 0,56 0,49 0,66 Cefixima 0,49 0,44 0,67 0,55 2. METDE PECTRMETRICE DE DETERMIARE A CEFTAZIDIMEI I CEFIXIMEI -au elaborat trei metode spectrometrice în VI pentru determinarea cantitativă a celor două cefalosporine. Metodele au la bază formarea unor complexe colorate cu: - Acid p-cloranilic - MBTH (3-metillbenzotiazolin-2-on hidrazona) - EDA [-(1-naftil) etilenediamina] 7

8 Condiţiile determinărilor: pectrofotometru Agilent 8453, monocanal Detecţie: Diode Array Detector, detectie de la 630 nm canare în domeniul nm, cu frecvenţa de 1 Hz oluţii: oluţia stoc: 26,5 g probă echivalente cu 25 mg ceftazidima pentahidrat se dispersează cu 10 ml soluţie apă prin agitare la ultasunete şi se aduce cantitativ la 25 ml cu acelaşi solvent rezultând o soluţie cu o concentraţie de 1 mg/ml oluţii etalon(1): 25 mg substanţa etalon se dispersează cu 10 ml soluţie prin agitare la ultasunete şi se aduce cantitativ la 25 ml cu faza mobilă, rezultând o soluţie cu o concentraţie de 1 mg/ml. olutie derivatizare (1) - D1: 0,48 g clorură ferică (III)/ 1L solutie olutie derivatizare(2) - D2: 2,00 g 3-metilbenzotiazolin-2-onă hidrazonă clorhidrat se dizolvă în 1000 ml apă. oluţie derivatizare(3) - D3: soluţie 0,01 mol/l acid clorhidric. oluţie de analizat: 0,1ml solutie stoc + 1,5 ml D1 + 1 ml D2. e lasă în repaus 15 minute. e adaugă 1 ml D3 si se completează la 10 ml cu apă. oluţie de referinţă: 0,1ml solutie etalon + 1,5 ml D1 + 1 ml D2. e lasă în repaus 15 minute. e adaugă 1 ml D3 si se completează la 10 ml cu apă. CH 3 CH CH 3 H H 2 C - + CH 3 CH CH 3 H + H Cl H 2 C - complex n- H Cl + Cl H Cl H METDE PECTRMETRICE DE DETERMIARE A CEFTAZIDIMEI A. DETERMIAREA CATITATIVA A CEFTAZIDIMEI PRI DERIVATIZARE CU ACIDUL p-clrailic Principiul metodei Metoda se bazează pe reacţia de cuplare oxidativă prin transfer de sarcină dintre cefalosporină (donor n) şi acidul para-cloranilic (p-ca acceptor π), rezultând un radical anionic. Reacţia are loc în solvenţi polari (acetonitril sau metanol). Transferul complet de electroni de la donor la accepor are loc cu formarea unor radicali ionici intens coloraţi. În metanol, complexul CFZM-pCA format are culoarea roşu-purpuriu şi prezintă absorbanţă maximă în UV-VI la 530 nm.acidul p-cloranilic formează cu ceftazidima un complex în raport molar 1:1. Acest lucru a fost demonstrat prin metoda Job (77) de Rahman (116) şi aleh (123). Formarea complecşilor are loc după reacţiile: Mecanismul formării complexului cu acidul cloranilic Compusul colorat se datorează ionului HA - al acidului cloranilic: D + A D A D + A complex ioni radicali H 2 A H + HA - + (purpuriu) B + H + H + + HA - (incolor) Tehnica de lucru: pectrofotometru Agilent 8453, monofascicul Detecţie: Diode Array Detector, detectie de la 530 nm canare în domeniul nm, cu frecvenţa de 1 Hz. VALIDAREA METDEI tudiul liniarităţii şi domeniului de liniaritate tudiile de liniaritate au fost determinate pe 9 soluţii cu un conţinut în ceftazidimă cuprins între 0,9 şi 0,3 mg/ml, ceea ce reprezintă domeniul 100% - 25% raportat la concentraţia ţintă pentru determinarea cantitativă (0,2 mg/ml). In figura sunt prezentate spectrele UV-VI înregistrate pentru soluţiile de referinţă de concentraţii crescătoare de cefixima.. 8 9

9 pectrele UV-VI înregistrate pentru soluţiile de CFZM pca incluse în curba de calibrare. În tabelul de mai jos sunt reprezentate absorbanţele medii pentru ceftazidima determinate, la concentraţiile propuse. Absorbanţele soluţiilor de referinţă C CFTZD AB (mg/ml) eria eria eria Media Corelograma (dreapta de calibrare), prezentată în figura urmatoare, evidenţiază o legătură liniară după o ecuaţie de gradul 2 între concentraţia probei şi absorbanţa soluţiei la 520 nm. Prin urmare estimarea absorbanţei complexului se va face cu ajutorul ecuaţiei de regresie liniară: Y = X tudiul specificităţii metodei Pentru verificarea acestui parametru, s-au înregistrat şi comparat spectrele UV-VI înregistrate pentru următoarele soluţii: oluţie probă reconstituită, cu conţinut diferit de ceftazidimă, şi posibil, carbonat de sodiu, diferit ca şi structură sau proprietăţi oluţia placebo oluţie de referinţă olutii corespunzătoare a două produse cu ceftazidim: Ceftamil şi Fortum Mai jos sunt prezentate spectrele UV VI obţinute: lungime de unda (mau) blanc crs ceftamil fortum cocentratie (mg/ml) Acurateţea metodei de dozare a cefiximei prin derivatizare cu acid p-ac pectrul soluţiei de probă reconstituită evidenţiază un maxim de absorbţie spectrală bine definit la 530 nm, spectru cu o puritate ridicată în raport cu spectrul soluţiei de referinţă (crs). oluţia placebo prezintă maxime de absorbţie la alte lungimi de undă, dar nu se semnalează nici un interferent la valoarea de 530 nm. Concluzie: Metoda propusă este selectivă în raport cu excipienţii de condiţionare. tudiul exactităţii Curba de calibrare pentru dozarea cefiximei folosind acid p-ca 10 Pentru determinarea acestui parametru s-au calculat randamentele de regăsire a substanţei active din probe reale Reprezentând limita teoretică a intervalului de admisibilitate, s-au considerat: - oluţie cu , , 0,077 mg/ml ceftazidimă din produsul Fortum şi respectiv , 0,11231, 0,09189 şi 0,0612 mg/ml ceftazidimă -produs comercial - CEFTAMIL pulbere pentru soluţii injectabile 11

10 Rezultatele verificării exactităţii pentru cefiximă pentahidrat sunt prezentate în cele ce urmeaza: Rezultatele experimentale testul de evaluare a exactităţii metodei de analiză FRTUM Cteoretic 0,17459 mg/ml 0,12324 mg/ml 0, mg/ml eria 1 eria 2 eria 3 Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % CEFTAMIL Cteoretic 0,15315 mg/ml 0,11231 mg/ml 0,09189 mg/ml 0,06126 mg/ml eria 1 eria 2 eria 3 Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Concluzii: Valoarea maximă a abaterilor procentuale este 3,4 pentru determinarea ceftazidimei din produsul farmaceutic Fortum şi respectiv 3,68 din Ceftamil, deci se respectă condiţia impusă ca abaterile procentuale ale regăsirii să fie mai mici decât 5. În plus, regăsirea procentuală medie este de 102,54 % pentru Ceftamil şi respectiv 102,41 pentru Fortum. Aceste diferente pot fi asociate cu variabilitatea continutului de carbonat de sodiu din cele două probe si respectiv cu natura diferita a altor excipienti prezenţi care influenţează formarea complexului. Deci metoda dezvoltată este exactă. În figura de mai jos sunt prezentate spectrele de absorbţie pentru probele preparate din produsul farmaceutic Ceftamil, Fortum, pentru blanc şi respectiv prentru standardul de lucru. tudiul preciziei Pentru verificarea preciziei s-au preparat 3 soluţii probe dintr-o proba omogena cu un conţinut de aproximativ 2, 1,5 şi respectiv 0,5mg Cefiximă conform metodologiei prezentate anterior. olutiile de concentraţii rezultate: 0,2, 0,15 şi respectiv 0,05 mg/ml ceftazidima au fost determinate pe o serie de 5 determinări, considerându-se variaţia faţă de media fiecărei serii (deviaţia standard absolută cât si deviaţia standard relativă) -au calculat valoarea medie a conţinutului în cefixima trihidrat, abaterea standard(s) şi deviaţia relativă (RD) pentru substanţa activă. 12 Precizia metodei de dozare PRBA 1 PRBA 2 PRBA 3 Cocentratie_proba 0,05 0,15 0,2 abs abs abs abs abs abs_medie TDEV E RD Concluzie: Determinările efectuate relevă, pentru fiecare soluţie o deviaţie standard relativă de maxim 0,46%, ceea ce echivalează cu o precizie foarte bună a metodei. e observă o corelare foarte bună cu datele obţinute pentru liniaritate, ceea ce conferă metodei o precizie intermediară foarte bună. tabilirea limitei de cuantificare şi de detecţie pentru ceftazidima Pentru determinarea acestor limite se iau în calcul parametrii pentru analiza statistică a seriilor de date a căror concentraţie este corelată cu variaţia absorbanţelor. Aceşti parametrii sunt prezentaţi în tabelul urmator. Analiza statistică Regression tatistics Media R multiplu coeficient de corelatie coeficient de corelatie ajustat -1.5 Eroare standard Panta erii 1 Considerând eroarea standard a curbei de calibrare şi implicit a pantei medii a acesteia s-au calculat pentru metoda actuală următoarele limite: Limita de cuantificare LQ = 0,011 mg/ml Limita de detecţie LD = 0,0034 mg/ml Determinarea stoechiometriei reacţiei chimice de formare a complexului radicalic ionic pentru ceftazidimă Principiul metodei Metoda variaţiei continue a fost aplicată în acest studiu pentru a determina stoechiometria reacţiei chimice. În aceste condiţii o serie de soluţii, fiecare conţinând acelaşi număr de moli de compuşi A şi B, dar într-un raport R, a 13

11 moleculelor B faţă de A, cantitatea maximă de produs este obţinută în condiţiile în care R = k (raport stoechiometric). Experimetal, pentru implementarea metodei Jobs, se prepară o serie de soluţii care conţin un număr exact de moli din compusul A şi respectiv un număr de moli din compusul B, dar pentru care raportul stoechiometric variază de la valori mari la valori mici, iar în acest fel se determină cantitatea de produs obţinut pentru fiecare soluţiei. În acest context cantitatea maximă de produs de reacţie ar trebui să se formeze în anumite condiţii; dacă R > k, atunci apare un exces de reactant B, iar în aceste condiţii A este reactivul de limitare. În condiţiile în care R descreşte sistematic spre k, cantitatea de produs de reacţie creşte cu cantitatea de agent de limitare, până când R devine egal cu k, în contrast, atunci când R este mai mic decât k, apare un exces de reactiv A, iar B este considerat agent de limitare. În concluzie, atunci când R este variat peste un domeniu cuprins între 0 şi valoarea maximă investigată, cantitea de produs creşte până până când R=k, şi apoi scade în condiţiile în care R devine mai mare decât k. Metoda experimentală -au preparat următoarele soluţii stoc (): : 24.5 mg substanţă echivalent la mg ceftazidima anhidră s-au dispersat în 10 ml metanol prin ultrasonare. Amestecul s-a centrifugat la 3000 rpm timp de 5 minute. R: 25 mg acid para-cloranilic s-a dizolvat în 5 ml metanol şi s-a diluat la 10 ml cu acelaşi solvent Pentru studiul stoechiometriei reacţiei de formare a complexului pcaceftazimdimă s-au constituit soluţii, pentru fiecare sistem studiat conform tabelului: Raportul dintre volumele de acid p-cloranilic si ceftazidimă Proba Volum P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 (ml) R În figura urmatoare sunt prezentate spectrele de absorbţie UV-VI obţinute la măsurarea celor 9 soluţii preparate conform tabelului de mai sus. tudiind această figură de la proba P9 (ce conţine cantitati ridicate de probă) până la P1 (ce conţine un exces major de agent de derivatizare) se observă o variaţie a maximelor de absorbţie de la 450 până la 530 nm, ceea ce indică dependenţa maximelor de absorbţie de cantitatea din cele două componente folosite în cadrul reacţiei. În tabel se vor introduce valorile maximelor de absorbţie de la lungimile de undă la care au fost determinate: pectrele de adsorbţie obţinute pentru soluţiile de CFZM pca preparate conform metodei JB Absorbanţele obţinute prin determinarea solutiilor de lucru Proba Volum (ml) 450 nm 530 nm P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P Maximele de absorbţie cele mai importante s-au obţinut în cazul probelor 4 si respectiv 5, ceea ce demonstrează că, concentraţia maximă se obţine în momentul în care raportul dintre cantitatea de substanţă de analizat şi cantitatea de agent de derivatizare (acid p-cloranilic) este de aproximativ 40% probă şi 60 % acid p-cloranilic, rezultat din raportul celor 2 reactanţi. Considerând, de asemenea, că, concentraţia de ceftazidimă anhidră este de 1,874 mg/ml în soluţia stoc, şi raportând la stoechiometria corelată cu concentraţia de acid p-cloranilic din soluţia stoc (), rezultă că de fapt raportul optim între cei doi componenţi, ceftazidima (anhidru) şi acid p-cloranilic este de 1:2. Totodată se observă că tot în această situaţie se obţine maximul de absorbţie caracteristic metodei, adică situat la 530 nm. Pentru confirmarea acestei situaţii s-au considerat două situaţii în care raportul dintre ceftazidima si respectiv acid p-cloranilic a fost de 1:1,5 şi respectiv 1:2. Concentraţia maximă în ceftazidimă fost de 0,2 mg/ml raportat la substanţa 14 15

12 anhidră, iar punctele din curbele de calibrare monitorizate au fost corespunzătoare următoarelor concentraţii: Concentraţiile soluţiilor de referinţă utilizeate in metoda Job Proba P1 P2 P3 P4 P5 P6 blanc În plus, excesul de agent p-cloranilic determină o inhibare a maximelor de absorbţie, fapt care deduce faptul că metoda respectă principiile metodei Job. Variaţia maximelor de absorbţie odată cu creşterea cantităţii de probă este prezentată în diagrama următoare: Raport 1:1,5 V(pCa) ml V (proba)ml V(MeH) ml Raport V(pCa) ml :2 V (proba)ml V(MeH) ml Corespunzător celor două sisteme s-au obţinut absorbanţele fiecărei soluţii în raport cu soluţia blanc corespunzătoare. Datele obţinute pentru absorbanţe sunt prezentate în tabel. Liniaritatea absorbanţelor este redată în figura urmatoare Absorbanţele soluţiilor de referinţă utilizate in metoda Job Proba Raport 1:1,5 Raport 1:2 Raport 1:1 Concentraţii mg/ml Absorbanta (mau) Absorbanta (mau) Absorbanta (mau) Coefficient de corelatie 0,9973 0,9995 0,9758 Variaţia absorbanţei maximelor de absorbţie a complexului format la 450 nm şi respectiv 530 nm Din diagramă se constată că la 450 nm, se produce o descreştere a maximelor de asborbţie ca urmare a formării produsului de reacţie, în timp ce la 530 nm se observă un palier crescător a cărui maxim corespunde probei nr. 4, după care conform princpiului metodei Job se observă o descreştere a maximului de asborbţie în condiţiile existenţei unui exces de probă. B. DETERMIAREA CATITATIVĂ A CEFTAZIDIMEI PRI DERIVATIZARE CU 3-METILBEZTIAZLI-2- HIDRAZA (MBTH) MBTH. 3-metilbenzotiazolin-2-on hidrazona (3-methylbenzothiazolin-2-one hydrazone-mbth) Metoda se bazează pe reacţia de cuplare oxidativă a cefalosporinei cu 3- metilbenzotiazolin-2-on hidrazona (MBTH) în prezenţa clorurii ferice şi a acidului clorhidric. Racţiile care au loc sunt redate mai jos : Variatia liniaritatii metodei in functie de raportul concentratiilor ceftazidima acid p-cloranilic Concluzie: tudiind evoluţia coeficienţilor de variatie în functie de raportul dintre acidul p-cloranilic si concentraţia de ceftazidima, este că raportul optim de 2:1 este corepunzător, considerând variaţia răpunsului în funcţie concentraţie (R 2 =0,9995)

13 H 2 H 2 CH 3 MBTH HC + + FeCl3-2e, -H+ H CH 3 CH 3 ceftazidima H H C H CH 3 CH 3 H sare de diazoniu Mecanismul de formare al complexului cu MBTH Modul de lucru Pentru obţinerea maximelor de absorbţie a soluţiilor colorate se vor lua în lucru: - ceftazidim soluţie standard: 100 g ml -1 - MBTH: 8,6 x 10-4 mol l -1 - FeCl 3 : 4,5 x 10-3 mol l -1 - HCl: 1 x 10-3 mol l -1 Parametri de lucru: pectrofotometru Agilent 8453, monocanal Detecţie: Diode Array Detector, detectie de la 628 nm. canare: nm, cu frecvenţa de 1 Hz. VALIDAREA METDEI Liniaritate tudiul liniarităţii funcţiei aria semnalului pentru ceftazidimă în funcţie de concentraţia ceftazidimei 628 nm Liniaritatea metodei de dozare constă în determinarea capacităţii metodei de a conduce în intervalul propus, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate. Liniaritatea exprimată, în acest caz ca o variaţie în jurul pantei dreptei de regresie calculate din rezultatele probelor de ceftazidima analizate la diverse concentraţii. Pentru a evidenţia dependenţa parametrilor studiaţi, absorbanţă spectrală şi respectiv concentraţie se va reprezenta grafic aria medie (y) în funcţie de concentraţia soluţiilor de lucru. Graficul de dependenţă între variabile este dat de coeficientul de corelare R. Pentru caracterizarea variaţiei se vor lua în calcul următorii parametri şi domeniile lor de variaţie: o Panta dreptei de regresie liniară, b o rdonata la origine a dreptei de regresie, a: o Coeficientul de corelaţie, R tudiul de liniaritate se verifică în acest caz pe tot domeniul de liniaritate, ce poate fi stabilit cu prezenta metodă. pecificitatea pecificitatea metodei de analiză măsoară gradul de interferenţă a altor substanţe prezente alături de substanţa activă care se dozează din matricea complexă a produsului. Metoda propusă este selectivă dacă permite dozarea substanţei active de analizat, fără ca matricea în care aceasta se găseşte să interacţioneze într-o măsură în care să afecteze exactitatea şi precizia metodei. Pentru verificarea specificităţii se vor compara cromatogramele unei probe reconstituite cu cea a unei soluţii de referinţă şi a unei soluţii placebo. Pentru admisibilitatea testului este necesar ca pe cromatograma soluţiei placebo să nu apară nici un maxim de asborbţie care să interfere. Exactitatea sau acurateţea Exactitatea metodei de dozare spectrofotometrică reprezintă concordanţa dintre valoarea reală şi rezultatul analitic obţinut în urma măsurătorii. Exactitatea oferă informaţii asupra erorilor sistematice. Pentru determinarea acestui parametru se va determina randamentul de regăsire a ceftazidimei pentahidrat din trei probe reconstituite cu valorile concentraţiilor la limita inferioară, teoretică şi superioară a intervalului de admisibilitate (reprezentând xx%, 100% şi xxx% faţă de conţinutul teoretic de ceftazidimă pentahidrat. Condiţiile de admisibilitate sunt îndeplinite în condiţiile în care gradul de regăsire mediu este cuprins între 95% şi 105%. Precizia (fidelitatea) Precizia metodei de dozare prin derivatizare cu MBTH este o măsură a repetabilităţii şi a reproductibilităţii rezultatelor analitice furnizate de o metodă de analiză. 19

14 Pentru controlul preciziei metodei de dozare a ceftazidimei pentanidrat se vor efectua 5 determinări pe 5 soluţii de aceeaşi concnetraţie în ceftazidimă. e va calcula deviaţia standard (s) pentru setul de 5 determinări şi abaterea relativă standard (RD) pentru substanţa activă. Limita de cuantificare şi limita de detecţie Limita de detecţie, în condiţiile metodei existente, reprezintă cantitatea minimă de ceftazidimă pentahidrat ce poate fi detectată. Limita de cuantificare este reprezentată de cea mai mică cantitate de substanţă dintr-o probă care poate fi determinată cu precizie şi exactitate acceptabilă în condiţiile experimentale propuse. Rezultate experimentale Liniaritatea tudiile de liniaritate au fost determinate pe 8 soluţii cu un conţinut în ceftazidimă cuprins între 0,0146 şi 0,0016 mg/ml, ceea ce reprezintă domeniul 180% - 20% raportat la concentraţia la care se realizează determinarea cantitativă. În tabelul urmator sunt reprezentate absorbanţele medii pentru ceftazidimă determinate, la concentraţiile propuse. Absorbanţele soluţiilor de referinţă AB Conc mg/ml 0, Media Media Reprezentare grafică (corelogramă) Corelograma (dreapta de calibrare) de mai sus evidenţiază o legătură liniară după o ecuaţie de gradul 2 între concentraţia probei şi aria picului. Prin urmare estimarea ariei picurilor se va face cu ajutorul ecuaţiei de regresie liniară: Y=87,29098 X + 0,02475 Aproximarea formei legăturii regresie liniară Ecuaţia de regresie: Y=α+βX+e unde: e reprezintă variabila aleatoare eroare. α reprezintă ordonata la origine β reprezintă panta dreptei Prezentăm absorbantele a 6 dintre soluţiile a căror concentraţii sunt incluse in curba de calibrare. Absorbantele soluţiilor incluse in curba de calibrare Concluzie: Coeficientul de corelaţie R obţinut este de 0,998 şi se încadrează în limitele prevăzute, in conditiile impuse de modalitatea de tratare a probelor luate în lucru pentru studiul acestui parametru. pecificitatea Pentru verificarea acestui parametru, s-au înregistrat şi comparat cromatogramele următoarelor soluţii: - oluţie probă reconstituită, cu conţinut diferit de ceftazidima, si posibil, carbonat de sodiu, diferit ca şi structura sau proprietăţi - oluţia placebo - oluţie de referinţă Mai jos sunt prezentate spectrele UV VI obţinute: Curba de calibrare pentru dozarea ceftazidimei folosind 3-metilbenzotiazolin-2-onă hidrazonă 20 21

15 Rezultatele verificării exactităţii pentru ceftazidimă pentahidrat sunt prezentate în tabel. Exactitatea metodei de dozare Exactitatea metodei de dozare CEFTAMIL FRTUM PRBA-X cantitate_proba (mg) absorbanta absorbanta absorbanta abs_medie TDEV RD cantitate_regasita regasire procentuala cantitate_teoretica regasire procentuala bservaţie: Regăsirea procentuală 1 reprezintă gradul de regăsire determinat din corelarea valorilor pentru absorbanţa medie si respectiv a pantei si a interceptului dreptei de calibrare. Regăsirea procentuală 2 derivă din parametrul anterior si este corelat cu cantitatea teoretică, calculată prin raportare la substanţa anhidră. Concluzie: Valorile randamentului de regăsire se încadrează în intervalul 95 % şi 105 % Precizia Pentru verificarea preciziei s-au preparat 3 soluţii probe dintr-o proba omogena cu un conţinut de aproximativ 10 mg ceftazidimă conform metodologiei prezentate anterior. -au calculat: valoarea medie a conţinutului în ceftazidima pentahidrat, abaterea standard(s) şi deviaţia relativă (RD) pentru substanţa activă. Precizia metodei de dozare Proba 1 Proba 2 Proba 3 cantitate_proba abs abs abs abs abs abs_medie TDEV RD Concluzie: Determinarile efectuate relevă, pentru fiecare soluţie o deviaţie standard relativă de maxim 2%. Limita de detecţie şi de cuantificare e iau în calcul parametrii pentru analiza statistica a seriilor de date a căror concentraţie este corelată cu variaţia absorbanţelor. Analiza statistică Regression tatistics R multiplu Coeficient de corelatie Coeficient de corelatie ajustat Eroare standard Panta erii 1 Considerând eroarea standard a curbei de calibrare si implicit a pantei medii a acesteia se vor considera pentru metoda actuală următoarele limite: Limita de cuantificare LQ = 0,0017 mg/ml Limita de detecţie LD=0,00051 mg/ml Robusteţea metodei Robusteţea metodei măsoară capacitatea acesteia de a rămâne neafectată de variaţii mici dar intenţionate a parametrilor metodei. -a efectuat determinarea timpului necesar pentru ca reacţia să se producă cu randament maxim, astfel încât complexul format să prezinte un maxim de absorbţie la 628 nm cu amplitudine constantă. -au constituit 2 probe de aceeasi concentraţie-0,01 mg-ml ceftazidima pentahidrat /10% carbonat de sodiu şi s-au preparat conform procedurii prezentate la capitolul de preparare a probei. Probele s-au determinat succesiv la diverşi timpi, conform datelor din tabelul urmatoare. tabilitatea soluţiilor determinate în timp Proba Conc. probei, mg/ml Interval de timp (min) Absorbanta P1 P2 0,1 2 0, ,1 2 0,324 0,1 3 0,348 0,1 4 0,413 0,1 5 0,456 0,1 5 0,471 0,1 6 0,5014 0,1 10 0,535 0,1 13 0,561 0,1 13 0,563 0,1 15 0,749 0,1 15 0,750 0,1 15 0,751 0,1 15 0,754 0,1 15 0,754 0,1 20 0,

16 In figura de mai jos se observă că maximul de intensitate nu este influenţat la concentraţii mai mari de 0,0086 M MBTH Evoluţia maximelor de absorbţie a soluţiilor determinate Figura urmatoare prezintă modul de evoluţie a maximelor de absorbţie în cazul determinărilor efectuate anterior Evoluţia maximelor de absorbţie a soluţiilor determinate Concluzie: Timpul necesar pentru ca reacţia de derivatizare a ceftazidimei să fie completă este de minim 15 minute, în condiţiile metodei propuse. Un alt context, în care se poate considera un studiu al robusteţei metode este determinat de variaţia concetraţiei de MBTH folosită în procesul de derivatizare astfel s-au considerat 4 soluţii conform schemei de mai jos. A1: 0,1ml solutie stoc + 1,5 ml D1 + 0,5 ml D2. repaus 15 minute + 1 ml D3 completare la 10 ml cu apă. A2: 0,1ml solutie stoc + 1,5 ml D1 + 0,75 ml D2. repaus 15 minut e+ 1 ml D3 completare la 10 ml cu apă. A3: 0,1ml solutie stoc + 1,5 ml D1 + 1,0 ml D2. repaus 15 minute + 1 ml D3 completare la 10 ml cu apă. A4: 0,1ml solutie stoc + 1,5 ml D1 + 1,25 ml D2. repaus 15 minute + 1 ml D3 completare la 10 ml cu apă. 24 Dependenţa maximelor de absorbţie în funcţie de concentraţia de MBTH Tabelul de mai jos certifica faptul că la valori mai mari de 0,00086M MBTH, maximul de absorbţie nu este puternic influenţat, deci în condiţiile metodei actuale se consideră ca fiind o concentraţia optimă pentru determinare. Valorile pentru maximele de absorbţie la 628 nm determinate pentru soluţiile de referinţă A1 A2 A3 A4 abs abs abs Concluzii: 1. Metoda de derivatizare cu 3-metilbenzotiazolin-2-onă hidrazonă (MBTH) prezintă un domeniu de liniaritate extins cuprins între 0,001 şi 0,018 mg/ml 2. Timpul necesar pentru tratarea probei este de 15 minute. 3. Limita de detecţie este de aproximativ 0,0008 mg/ml, iar limita de cuantificare este de 0,002 mg/ml. 4. Concentraţia de MBTH maximă este de 0,00086M pentru domeniul de concentraţii analizat. C. DETERMIAREA CATITATIVĂ A CEFTAZIDIMEI PRI DERIVATIZARE CU CLRHIDRAT DE -(1-AFTIL)ETILEDIAMIĂ (EDA) EDA: -(1-naftil) etilendiamina (-(1-naphthyl)ethylenediamine - EDA) - ceftazidim soluţie standard: 100 g ml -1 - EDA: 8 x 10-3 mol l -1 - HCl: 11 mol l -1 - a 2 : 0,145 mol l -1 - ulfamat de amoniu (H H 2 ): 8,8 x 10-2 mol l -1 25

17 H 2 Cl - + H 2 H HC CH 3 CH 3 H 2 C H H H HC CH 3 CH 3 H 2 C H C a2 - HCl H H C H HC CH 3 CH 3 compus colorat in purpuriu H H C 00 - H CH 2 CH 2 H 2 EDA Mecanismul formării complexului cu EDA Principiul metodei: Metoda EDA implică diazotizarea ceftazidimei cu formarea sării de diazoniu, care în momentul cuplării cu -(1-naftil)etilendiamină (EDA) formează un azo-colorant de culoare roşu purpuriu, ce prezintă maxim de absorbţie UV-VI la 510 nm. -a studiat: - cinetica formării complexului colorat. - stabilitatea complexului a fost studiată timp de 24 h la temperatura camerei. Tehnica de lucru: Instrument: pectrofotometru CITRA, dublu fascicol Detecţie:Diode Array Detector, detectie de la 510 nm. canare în domeniul nm, cu frecvenţa de 0,25s. Cinetica formării complexului CFZM - EDA Pentru a determina timpul de repaus necesar formării complexului roşupurpuriu CFZM EDA s-a măsurat absorbanţa soluţiei de analizat (A: C CFZM = 0,3 mg/ml) în mod automat, folosind un program special de scanare în timp. Absorbanţa soluţiei de analizat a fost măsurată la intervale de 5 minute, constatându-se că timpul necesar ca derivatizarea CFZM să fie completă este de minimum 30 minute. + In figura este reprezentată grafic formarea complexului de CFZM EDA în timp. Absorbanta (u.a.) Timp (min) Cinetica formării complexului CFZM EDA, de culoare roşu-purpuriu Înainte de prezentarea validării metodei de dozare, trebuie menţionat faptul că, pe parcursul desfăşurării procesului de validare s-au făcut ajustările necesare privind conţinutul în apă şi în carbonat de sodiu al probelor de ceftazidimă în formă pură sau de produs farmaceutic. În tabel sunt prezentate rezultatele obţinute în urma efectuării analizelor necesare pentru determinarea cantităţii de apă din fiecare probă utilizată pe parcursul acestei validări. Rezultate experimentale obţinute după uscarea probelor Proba CFZM substanţă FRTUM CEFTAMIL % pierderi prin uscare 17,30% 15,5% 15,2% VALIDAREA METDEI tudiul liniarităţii şi domeniului de liniaritate tudiile de liniaritate au fost determinate pe 7 soluţii cu un conţinut în ceftazidimă cuprins între 0,1385 şi 0,55407mg/ml, ceea ce reprezintă domeniul 40% - 160%, raportat la concentraţia ţintă pentru determinarea cantitativă (0,35 mg/ml), raportat la substanţa uscată. Prezentam spectrele UV-VI înregistrate pentru soluţiile de referinţă de concentraţii crescătoare de ceftazidimă

18 pectrele de absorbţie ale soluţiilor de CFZM-EDA de diferite concentraţii Rezultate experimentale obţinute la determinarea liniarităţii metodei 40% 60% 80% 100% 120% 140% 160% CCFZM (mg/ml) AB eria eria eria Media D E E E-05 RD Corelograma (dreapta de calibrare) din figura de mai jos evidenţiază o variaţie liniară a absorbanţei funcţie de concentraţia probei. Prin urmare, estimarea absorbanţei se va face cu ajutorul ecuaţiei de regresie liniară: Absorbanta = 3,01628 Concentraţia 0, y = x R² = Absorbanta (u.a.) 0.5 eria 1 eria 2 eria 3 0 Concentratia CFZM (mg/ml) Media Liniaritatea metodei de dozare a CFZM prin derivatizare cu EDA Concluzii: Coeficientul de corelaţie R = 0,99814 > 0,99, deci metoda are o liniaritate foarte bună Panta dreptei de regresie: b = 3, Domeniul de încredere al pantei dreptei: 2, ,19487 rdonata la origine: a = - 0,30165 Domeniul de încredere pentru a: - 0, , tudiul specificităţii metodei Pentru verificarea acestui parametru, s-au înregistrat şi comparat spectrele UV-VI înregistrate pentru următoarele soluţii: oluţie probă reconstituită, cu conţinut diferit de ceftazidimă, şi posibil, carbonat de sodiu, diferit ca şi structura sau proprietăţi oluţia placebo oluţie de referinţă In figura sunt prezentate spectrele UV VI obţinute: pecificitatea metodei de dozare a CFZM prin derivatizare cu EDA pectrul soluţiei de probă reconstituită evidenţiază un maxim de absorbţie spectrală bine definit la 510 nm, spectru cu o puritate ridicată în raport cu spectrul soluţiei de referinţă. oluţia placebo nu maxime de absorbţie aceeaşi lungime de undă Concluzie: Metoda propusă este selectivă în raport cu excipienţii de condiţionare. tudiul exactităţii Concentraţiile teoretice şi cele regăsite după aplicarea ecuaţiei dreptei de regresie, precum şi regăsirea procentuală şi abaterea procentuală sunt prezentate în tabelul urmator. Regăsirea procentuală exprimă oblicitatea experimentală maximă la concentraţiile studiate şi se calculează cu formula: X r R % 100 X 29 a

19 unde: R% = regăsirea procentuală; X r = concentraţia regăsită (μg/ml); X a = concentraţia teoretică (μg/ml) Rezultatele experimentale pentru testul de evaluare a exactităţii FRTUM Cteoretic 0,1655 mg/ml 0,2069 mg/ml 0,2717 mg/ml 0,3764 mg/ml 0,4612 mg/ml Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % eria ,37 1, ,48 0,483 0,269 99,15 0,846 0, ,53 1,53 0,455 98,62 1,38 eria ,55 1, ,47 0,526 0,269 99,04 0,958 0, ,46 1,46 0,458 99,32 0,68 eria ,95 1, ,82 1,178 0, ,63 0,627 0, ,44 1,44 0,457 99,08 0,92 CEFTAMIL Cteoretic 0,1696 mg/ml 0,2144 mg/ml 0,2892 mg/ml 0,3840 mg/ml 0,5188 mg/ml Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % Cregăsit R% Xd % eria 1 0, ,13 3,13 0,214 99,69 0,30 0,283 98,00 1,99 0,382 99,51 0,48 0, ,80 2,80 eria 2 0, ,67 2,67 0, ,64 0,64 0,282 97,59 2,41 0,382 99,50 0,50 0, ,62 2,62 eria 3 0, ,55 2,55 0, ,58 0,58 0,282 97,50 2,50 0, ,32 0,32 0, ,58 2,58 Concluzii: Valoarea maximă a abaterilor procentuale este 1,633 pentru determinarea CFZM din produsul farmaceutic FRTUM şi 3,133 pentru determinarea CFZM din produsul farmaceutic CEFTAMIL, deci se respectă condiţia impusă ca abaterile procentuale ale regăsirii sa fie mai mici decât 5. În plus, regăsirea procentuală medie este de 99,6606 % pentru FRTUM şi de 100,646 % pentru CEFTAMIL. Deci metoda dezvoltată este exactă. În figura sunt prezentate spectrele de absorbţie pentru probele preparate din produsul farmaceutic FRTUM, respectiv CEFTAMIL. Acurateţea metodei de dozare a CFZM prin derivatizare cu EDA din produse farmaceutice FRTUM, respectiv CEFTAMIL tudiul preciziei Pentru verificarea preciziei s-au preparat 3 soluţii probe dintr-o probă omogene cu un conţinut de aproximativ 200 mg Ceftazidimă conform metodologiei prezentate anterior. -au calculat valoarea medie a conţinutului în ceftazidimă, abaterea standard (s) şi deviaţia relativă (RD) pentru substanţa activă. În tabel sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute. Precizia metodei de dozare Proba 1 Proba 2 Proba 3 cantitate_proba abs abs abs abs abs abs_medie TDEV RD Concluzie: Determinările efectuate relevă, pentru fiecare soluţie o deviaţie standard relativă de maxim 0,95%, ceea ce echivalează cu o precizie foarte bună a metodei.tabilirea limitei de cuantificare şi de detecţie pentru CFZM Pentru determinarea acestor limite se iau în calcul parametrii pentru analiza statistică a seriilor de date a căror concentraţie este corelată cu variaţia 30 31

20 absorbanţelor. Aceşti parametri, obţinuţi în cazul dozării CFZM după derivatizare cu EDA sunt prezentaţi în tabel: Analiza statistică CFZM EDA Regression tatistics R multiplu coeficient de corelatie coeficient de corelatie ajustat -1.2 Eroare standard Panta erii 1 Considerând eroarea standard a curbei de calibrare şi implicit a pantei medii a acesteia s-au calculat pentru metoda actuală următoarele limite: Concluzii: Limita de cuantificare LQ = 0,0460 mg/ml Limita de detecţie LD = 0,1620 mg/ml tabilitatea complexului CFZM EDA Pentru determinarea acestui parametru absorbanţa aceleiaşi soluţii de concentraţie cunoscută în CFZM (0,3467 mg/ml, raportat la substanţa uscată) a fost măsurată la intervale de 60 minute timp de 4 h şi apoi după 24h, din momentul formării complete a complexului. oluţiile au fost păstrate în mediul ambiant. CAPITLUL 8 CERCETAREA TABILITATII CEFTAZIDIMEI I CEFIXIMEI MATERIE PRIMA PETRU BTIEREA DE FRME FARMACEUTICE tabilitatea celor două cefalosporine materii prime, păstrate în condiţii normale, pentru înglobarea în forme farmaceutice s-a urmărit timp de un an determinând aspectul, ph-ul şi conţinutul. Determinarea cantitativă efectuată dealungul celor 12 luni s-a efectuat cu ajutorul celor 4 metode elaborate de noi: spectrofotometric cu: - acid p-cloranilic (p-ac) - MBTH - EDA cromatografic: - HPLC TABILITATEA CEFTAZIDIMEI MATERIE PRIMA tabilitatea pulberii de ceftazidimă Ceftazidima, materie primă introdusă în flacoane incolore a fost urmărită din punct de vedere fizic (aspect, culoare) şi al ph-ului, timp de un an. Din datele obţinute rezultă că materia primă constituită din ceftazidimă corespunde din punct de vedere al aspectului şi al ph-ului cu cele înscrise în documentele companiei producătoare. tabilitatea complexului CFZM - EDA în timp Concluzie Complexul CFZM EDA este stabil maxim 3 h de la formare. De aceea se recomandă efectuarea analizelor de rutină pentru determinarea ceftazidimei din produse farmaceutice sau din probe de materie primă, la scurt timp după prepararea soluţiilor. Variaţia ph-lui ceftazidimei în timpul unui an de conservare EVALUAREA CATITATIVA A TABILITATII CEFTAZIDIMEI Ceftazidima materie primă a fost urmărită din punct de vedere cantitativ timp de 3 ani. Determinările au fost efectuate cu ajutorul celor trei metode spectrometrice şi metodei HPLC elaborate şi descrise în capitolul

21 CERCETAREA TABILITĂŢII CEFTAZIDIMEI Î CDIŢII RMALE ŞI DE TRE Luând în considerare o cercetare asupra ceftazidimei efectuată de ervais H., am cercetat stabilitatea ceftazidimei materie primă păstrată în condiţii normale de temperatură şi supusă unor condiţii de stres (mediu acid, alcalin, oxidant şi reducător). URMĂRIREA TABILITĂŢII CEFTAZIDIMEI Î CDIŢII DE TEMPERATURI CUPRIE ÎTRE 21 ŞI 37 C Graficul celor patru determinări cantitative Concluzie: Conţinutul în ceftazidimă scade uşor de-a lungul celor 12 luni de depozitare în condiţii normale. Cele patru metode arată valori apropiate, variind între 98,88 şi 98,55%. Determinările demonstrează acurateţea şi exactitatea metodelor elaborate pentru determinarea cantitativă. Evoluţia cantitativă a ceftazidimei de-a lungul celor trei ani Anul Acid CA MBTH EDA HPLC 1 98,88 98,87 98,85 98, ,33 96,35 96,77 96, ,51 95,35 95, 45 95,55 Graficul degradării ceftazidimei incubată la diverse temperaturi URMĂRIREA TABILITĂŢII CEFTAZIDIMEI Î CDIŢII TRE Am urmărit procesul de degradare sau de stabilitate al ceftazidimei în condiţii stres de mediu acid, alcalin, oxidant şi reducător. Graficul conţinutului în ceftazidimă la sfărşitul fiecărui an Concluzii: 1. Cele patru metode de evaluare cantitativă a ceftazidimei materie primă sunt în concordanţă şi reliefează faptul că substanţa îşi păstrează conţinutul admis de-a lungul celor trei ani de determinări. 2. Limita de 90% este cea minimă luată în considerare pentru a considera o substanţă medicamentoasă utilizabilă. 34 Graficul degradării în mediu acid a ceftazidimei 35

22 EVALUAREA CATITATIVĂ A TABILITĂŢII CEFIXIMEI Ca şi în cazul ceftazidimei, cefixima materie primă a fost urmărită din punct de vedere cantitativ acelaşi număr de ani. Determinările au fost efectuate cu ajutorul celor trei metode spectrometrice şi metodei HPLC. Graficul degradării în mediu alcalin a ceftazidimei Graficul celor patru determinări cantitative Evoluţia cantitativă a cefiximei de-a lungul celor trei ani Anul Acid p-ca MBTH EDA HPLC 1 102,1 102,1 102,1 102,1 2 98,88 98,83 98,81 98, ,11 96,07 96, 08 95,89 Graficul degradării în mediu oxidant a ceftazidim TABILITATEA CEFIXIMEI MATERIE PRIMA Graficul conţinutului în ceftazidimă la sfărşitul fiecărui an Variaţia ph-ului cefiximei în timpul unui an de conservare 36 Concluzii: Cele patru metode de evaluare cantitativă a cefiximei materie primă sunt în concordanţă şi reliefează faptul că substanţa îşi păstrează conţinutul în limitele admise de-a lungul celor trei ani de determinări. 37

23 CERCETAREA TABILITĂŢII CEFIXIMEI Î CDIŢII RMALE ŞI DE TRE Cefixima materie primă păstrată în condiţii normale de temperatură a fost supusă unor teste de stabilitate în condiţii de temperaturi moderate şi de stres (mediu acid, alcalin şi oxidant). Graficul degradării cefiximei în mediu alcalin Graficul degradării cefiximei incubată la diverse temperatura URMĂRIREA TABILITĂŢII CEFIXIMEI Î CDIŢII TRE Am urmărit procesul de degradare sau de stabilitate al cefiximei în condiţii stres amintite: mediu acid, alcalin şi oxidant. Graficul degradării cefiximei în mediu acid 38 Degradarea oxidativă a cefiximei CAPITLUL 9 TUDIUL TABILITAŢII CEFTAZIDIMEI I CEFIXIMEI I FRME FARMACEUTICE DZATE MDALITĂŢI DE TUDIERE A TABILITĂŢII UBTAŢELR ŞI FRMELR FARMACEUTICE 1. TETAREA I TIMP REAL Testarea în timp real reprezintă evaluarea stabilităţii caracteristicilor fizice, chimice, biologice si microbiologice ale unui produs medicamentos şi/sau ale unei substante medicamentoase pe întreaga perioadă de valabilitate si pe cea de retestare. 2. TETAREA Î CDIŢII ACCELERATE tudiile efectuate în condiţii accelerate sunt acele studii în cadrul cărora se creşte viteza degradării chimice sau a modificărilor fizice ale unei A sau ale unui produs medicamentos folosind condiţii de depozitare şi de păstrare extreme; aceste studii fac parte din programul definitiv şi oficial de depozitare. 39

24 3. TETAREA Î CDITII DE TRE (DEGRADARE FRŢATĂ) tudiile în condiţii de stres se efectueaza pentru a elucida caracteristicile intrinseci de stabilitate. Aceste studii fac parte din strategia de dezvoltare şi se efectuează de obicei în condiţii mult mai severe decât cele utilizate în testarea in conditii accelerate. FRMELE FARMACEUTICE BŢIUTE CU CEFTAZIDIMĂ ŞI CEFIXIMĂ Ceftazidima şi cefixima, materii prime obţinute din India au fost incluse în câteva forme farmaceutice dozate, care să fie testate cantitativ timp de un an. -au obţinut următoarele forme care au fost analizate în intervalul de timp amintit. 1. Ceftazidimă, pulbere pentru solutie injectabilă 0,25 g, 0,5 g, 1 g, 2 g 2. Ceftazidimă pulbere pentru administrare intravenoasă 500 mg ceftazidimă 3. Cefiximă - capsule 200 mg 1. CEFTAZIDIMĂ, PULBERE PETRU LUTIE IJECTABILA Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 0,25 g ceftazidimă Rezultatele obtinute sunt prezentate în tabelele şi în figurile urmatoare. Conţinutul în ceftazidimă în primul an de analiză al fiolelor cu 0,25 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % 40 g/fiolă 0 galben 102,10 0,250 4,54 3 galben 100,5 0,250 4,58 6 galben 99,66 0,247 4,65 9 galben 98,00 0,246 4,66 12 galben 98,20 0,240 4,63 Conţinutul în ceftazidimă în al doilea an de analiză al fiolelor cu 0,25 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 12 galben 98,20 0,240 4,64 15 galben 97,20 0,238 4,65 18 galben 96,50 0,237 4,68 21 galben ,236 4,69 24 galben 92,10 0,232 4,70 Conţinutul în ceftazidimă în al treilea an de analiză al fiolelor cu 0,25 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 24 galben 92,10 0,232 4,70 27 galben 91,50 0,230 4,58 30 galben 90,55 0,227 4,55 33 galben 89, 10 0,225 4,66 36 galben 88,20 0,220 4,63 Variaţia conţinutului în ceftazidimă de-alungul celor trei ani Anul ,10 98,20 92,10 100,50 97,20 91,50 99,66 96,50 90,55 98, , 10 98,20 92,10 88,20 Graficul variaţiei conţinutului în ceftazidimă Variaţia conţinutului în ceftazidimă/fiolă în cei trei ani de determinări Variaţia ph-ului ceftazidimei în cei trei ani de determinări 41

25 Concluzii 1. In cei trei ani de determinări conţinutul în cefalosporină scade pâna la 88,88% 2. ph-ul soluţiilor creşte, acesta luând valori între 4,54 şi 4,73 Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 0,50 g ceftazidimă Rezultatele obtinute sunt prezentate în tabelele şi în figura urmatoare: Conţinutul în ceftazidimă în primul an de analiză al fiolelor cu 0,50 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph 42 Conţinut % g/fiolă 0 galben 102,10 0,50 4,54 3 galben 100,5 0,47 4,58 6 galben 99,66 0,46 4,65 9 galben 98,00 0,43 4,66 12 galben 98,20 0,40 4,64 Conţinutul în ceftazidimă în al doilea an de analiză al fiolelor cu 0,50 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 12 galben 98,20 0,40 4,64 15 galben 97,20 0,39 4,65 18 galben 96,50 0,36 4,68 21 galben ,32 4,69 24 galben 92,10 0,30 4,70 Conţinutul în ceftazidimă în al treilea an de analiză al fiolelor cu 0,50 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 24 galben 92,10 0,30 4,70 27 galben 91,50 0,29 4,71 30 galben 90,55 0,28 4,75 33 galben 89,10 0,27 4,78 36 galben 88,20 0,25 4,79 Conţinutul % de ceftazidimă în cei trei ani de analică Anul ,10 98,20 92,10 100,5 97,20 91,50 99,66 96,50 90,55 98, ,10 98,20 92,10 88,20 Conţinutul de ceftazidimă pe fiola de 0,50 g Anul ,50 0,40 0,30 0,47 0,39 0,29 0,46 0,36 0,28 0,43 0,32 0,27 0,40 0,30 0,25 Variaţia conţinutului de ceftazidimă în cei trei ani de analiză Rezultatele determinarilor ph-ului ceftazidimei sunt redate in tabelul şi figura de mai jos: ph-ul fiolelor cu ceftazidim în cei trei ani de analiză Anul ,54 4,64 4,70 4,58 4,65 4,71 4,65 4,68 4,75 4,66 4,69 4,78 4,64 4,70 4,79 Variaţia phului ceftazidimei din fiolele cu 0,50 g Concluzii: 1. In cei trei ani de determinări conţinutul în cefalosporină scade pâna la 88,88% 2. ph-ul soluţiilor creşte, acesta luând valori între 4,54 şi 4,79 Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 1,0 g ceftazidimă Rezultatele obtinute sunt prezentate în tabelele şi în figurile de mai jos. Conţinutul în ceftazidimă în primul an de analiză al fiolelor cu 1 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph 43 Conţinut % g/fiolă 0 galben 102,10 1,00 4,54 3 galben 100,5 1,00 4,58 6 galben 99,66 0,99 4,65 9 galben 98,00 0,99 4,66 12 galben 97,60 0,98 4,67

26 Conţinutul în ceftazidimă în al doilea an de analiză al fiolelor cu 1g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 12 galben 97,60 0,98 4,67 16 galben 97,58 0,97 4,68 19 galben 97,55 0,97 4,68 21 galben 97,53 0,98 4,69 24 galben 97,50 0,97 4,70 Conţinutul în ceftazidimă în al treilea an de analiză al fiolelor cu 1 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 24 galben 97,50 0,97 4,70 27 galben 97,45 0,95 4,72 30 galben 97,42 0,93 4,75 33 galben 97,39 0,90 4,76 36 galben 97,30 0,88 4,79 Conţinutul de ceftazidimă pe fiola de 1,0 g Anul ,98 0,94 1 0,97 0,93 0,99 0,96 0,92 0,99 0,95 0,9 0,98 0,94 0,88 Variaţia conţinutului cefiximei pe parcursul celor trei ani Variaţia ceftazidimei în cei trei ani de analiză 44 Variaţia ph-ului în cei trei ani de analiză Anul ,54 4,66 4,69 4,58 4,67 4,71 4,65 4,68 4,75 4,66 4,69 4,78 Variaţia ph-ului ceftazidimei din fiolele cu 1,0 g Concluzii: 1. In cei trei ani de determinări conţinutul în cefalosporină scade de la 102,10 pâna la 97,30% 2. ph-ul soluţiilor creşte, acesta luând valori între 4,54 şi 4,73 Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 2, g ceftazidimă Conţinutul în ceftazidimă în primul an de analiză al fiolelor cu 2 g Conţinut în ceftazidimă Timp, luni Aspect Conţinut % g/fiolă 0 Galben 102,66 2,00 4,54 3 Galben 100,5 2,00 4,58 6 Galben 99,66 1,98 4,65 9 Galben 98,00 1,97 4,66 12 Galben 97,60 1,96 4,63 Conţinutul în ceftazidimă în al doilea an de analiză al fiolelor cu 2 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 12 galben 97,60 1,96 4,63 15 galben 97,58 1,95 4,65 18 galben 97,55 1,94 4,68 21 galben 97,53 1,94 4,69 24 galben 97,50 1,92 4,70 45 ph

27 Conţinutul în ceftazidimă în al treilea an de analiză al fiolelor cu 2 g Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 24 galben 97,50 1,92 4,70 27 galben 97,45 1,90 4,71 30 galben 97,42 1,89 4,72 33 galben 97,39 1,85 4,74 36 galben 97,27 1,82 4,76 Conţinutul de ceftazidimă pe fiola de 1,0 g Anul ,00 1,96 1,92 2,00 1,95 1,90 1,98 1,94 1,89 1,97 1,94 1,85 1,96 1,92 1,82 Variaţia ph-ului în cei trei ani de analiză Anul ,54 4,66 4,7 4,58 4,67 4,71 4,63 4,68 4,72 4,66 4,69 4,75 Concluzii: Variaţia ph-ului ceftazidimei din fiolele cu 1,0 Variaţia ceftazidimei în cei trei ani de analiză In cei trei ani de determinări conţinutul în cefalosporină scade de la 102,10 pâna la 97,27% 2. ph-ul soluţiilor creşte, acesta luând valori între 4,54 şi 4,75 2. CEFTAZIDIMĂ PULBERE PETRU ADMIITRARE ITRAVEAĂ Analiza stabilităţii ceftazidimei în fiolele cu 0,200 g ceftazidimă Rezultatele obtinute sunt prezentate in cele ce urmeaza: Conţinutul în ceftazidimă în primul an de analiză al fiolelor cu 200 mg Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 0 galben 102,1 0,200 4,54 3 galben 100,5 0,199 4,58 6 galben 99,66 0,196 4,65 9 galben 98,00 0,192 4,66 12 galben 97,60 0,190 4,63 Conţinutul în ceftazidimă în al doilea an de analiză al fiolelor cu 200 mg 47

28 Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă Conţinut % g/fiolă 12 galben 97,60 0,190 4,64 15 galben 97,58 0,188 4,65 18 galben 97,55 0,187 4,68 21 galben 97,53 0,185 4,69 24 galben 97,50 0,182 4,70 Conţinutul în ceftazidimă în al treilea an de analiză al fiolelor cu 200 mg Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 24 galben 97,50 0,182 4,70 27 galben 97,45 0,180 4,58 30 galben 97,42 0,177 4,55 33 galben 97,39 0,175 4,66 36 galben 97,33 0,172 4,63 Conţinutul de ceftazidimă pe fiola de 1,0 g Anul ,200 0,190 0,182 0,199 0,188 0,180 0,196 0,187 0,177 0,192 0,185 0,175 0,190 0,182 0,172 ph Variaţia ceftazidimei în cei trei ani de analiza Concluzii: 1. In cei trei ani de determinări conţinutul în cefalosporină scade de la 102,10 pâna la 97,33% 2. ph-ul soluţiilor creşte, acesta luând valori între 4,54 şi 4, 3. CEFIXIMĂ, 200 mg - CAPULE Analiza stabilităţii cefiximei în capsulele cu 0,200 g ceftazidimă Rezultatele obtinute sunt prezentate în tabelele şi în figurile urmatoare. Conţinutul în cefiximă în primul an de analiză al fiolelor cu 200 mg Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 0 galben 102,1 0,200 4,54 3 galben 100,5 0,196 4,58 6 galben 99,66 0,195 4,65 9 galben 98,00 0,192 4,66 12 galben 97,60 0,190 4,63 Conţinutul în cefiximă în al doilea an de analiză al fiolelor cu 200 mg Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 12 galben 97,60 0,190 4,64 15 galben 97,58 0,198 4,65 18 galben 97,55 0,197 4,68 21 galben 97,53 0,195 4,69 24 galben 97,50 0,192 4,

29 Conţinutul în cefiximă în al treilea an de analiză al fiolelor cu 200 mg Timp, luni Aspect Conţinut în ceftazidimă ph Conţinut % g/fiolă 24 galben 97,50 0,192 4,70 27 galben 97,45 0,190 4,58 30 galben 97,42 0,185 4,55 33 galben 97,39 0,182 4,66 36 galben 97,29 0,180 4,63 Conţinutul de cefiximăp e fiola de 0,200 g Anul ,200 0,190 0,192 0,196 0,198 0,190 0,195 0,197 0,185 0,192 0,195 0,182 0,190 0,192 0,180 Variaţia ph-ului în cei trei ani de analiză Anul ,54 4,66 4,70 4,58 4,67 4,71 4,65 4,68 4,75 4,66 4,69 4,79 Variaţia ph-ului cefiximei din fiolele cu 200 mg Concluzii: 1. In cei trei ani de determinări conţinutul în cefalosporină scade de la 102,10 pâna la 97,29% 2. ph-ul soluţiilor creşte, acesta luând valori între 4,54 şi 4,7 CCLUZII GEERALE Variaţia cefiximei în cei trei ani de analiză 50 Din întreaga lucrare se pot trage următoarele concluzii: Lucrarea cuprinde două părţi bine distincte: parte care se referă la problemele generale şi speciale legate de cunoaşterea din literatura de specialitate a celor două cefalosporine, a fost inclusă în tadiul cunoaşterii. Această parte cuprinde 3 capitole (1-3). Partea de cercetare este inclusă în Contribuţii proprii şi este inserată dea lungul a 6 capitole. Iata cateva dintre contributiile proprii pe care le-am adus in aceasta lucrare: 1. Am prezentat ceftazidima şi cefixima din punct de vedere structural, modalităţile de identificare, problemele complexe ale posibilelor impurităţi. 2. Am scos în evidenţă metodele de depistare a acestor impurităţi şi am insistat asupra analizelor lichid cromatografce. 51