UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA FACULTATEA DE MEDICINĂ

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA FACULTATEA DE MEDICINĂ TEZĂ DE DOCTORAT CONTRIBUŢII LA STUDIUL HISTOLOGIC AL PTERIGIONULUI REZUMAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC, Prof. Dr. ŞTEFANIA CRĂIŢOIU DOCTORAND Dr. CIPRIAN LIVEZEANU CRAIOVA

2 INTRODUCERE Pterigionul este o leziune a suprafeţei oculare care se poate dezvolta fie într-un ochi, fie bilateral. Se prezintă sub forma unei benzi triunghiulare de ţesut fibrovascular pe suprafaţa epibulbară a conjunctivei, în zona fantei palpebrale, cu baza nazal şi vârful spre cornee, putând progresa până în centrul acesteia. Are o evoluţie variabilă: lentă, de oprire spontană sau de invazie rapidă a corneei pînă în centrul ei. Uneori, capul pterigionului poate suferi o metaplazie malignă epiteliomatoasă. Incidenţă este crescută în anumite regiuni ale globului, în zonele tropicale şi subtropicale, între 0 şi 30 0 latitudine nordică şi sudică. Poate să recidiveze, recidiva depăşind adesea pterigionul iniţial (Tan DT, Chee SP, Dear KB, Lim AS, 1997). Pterigionul nu este un simplu proces degenerativ al conjunctivei, aşa cum este el încadrat alături de pingueculă în tratatele de specialitate. Datele recente sugerează că este o tulburare de creştere, fiind un proces activ, invaziv, inflamator, asociat cu proliferare celulară, remodelare a ţesutului conjunctiv şi angiogeneză (Coroneo MT, Di Girolamo N, Wakefield D, 1999; Kwok LS, Coroneo, MT, 1994). Patogenia pterigionului primar caută să explice rolul factorilor extrinseci, în special a radiaţiilor ultraviolete şi localizarea sa nazală. Formarea pterigionului este legată de microtraumatismele corneene şi conjunctivale, alături de expunerea la radiaţiile ultraviolete (Threlfall TJ, English DR, 1999). Factorii de risc ai pterigionului au fost evaluaţi în diferite părţi ale globului (Rojas JR, Malaga H, 1986; Khoo J, Saw SM, Banerjee K, Chia SE, TanD 1998; Norn MS 1982). Motivaţia alegerii acestei teme este multiplă: frecvenţa relativ crescută a pterigionului, recidivele înregistrate după ablaţia chirurgicală, aspectele clinice pe care le poate îmbrăca, de la local invaziv până la uşoară displazie şi chiar carcinom in situ în pofida faptului că este considerat un proces relativ benign, faptul că uneori, membrana fibrovasculară dezvoltată pe suprafaţa epibulbară a conjunctivei şi cu extindere pe suprafaţa corneei, poate determina scăderea vederii prin astigmatismul neregulat indus, prin lezarea stromei corneene şi prin acoperirea axului vizual ceea ce afectează calitatea imaginii retiniene care depinde de transparenţa şi puterea refractivă a corneei, primul dioptru ocular care deţine un rol fundamental în transmisia, refracţia şi reflexia luminii. Scopul acestui studiu este de a contribui la elucidarea unor aspecte legate de etiopatogenia afecţiunii care, în ciuda multor teorii avansate, a analizelor statistice, geografice, etiologice, microscopice şi histochimice, este insuficient explicată, în posibilitatea explicării unor aspecte legate de recidivele apărute după ablaţia chirurgicală cât şi contribuţia la dezvoltarea unei strategii terapeutice nechirurgicale care să reducă recurenţa, severitatea inflamaţiei, invazia ţesutului, proliferarea şi angiogeneza. În partea generală a tezei, primele două capitole, am realizat o aducere la zi a materialului teoretic aferent temei, din literatura de specialitate. Partea personală a tezei de doctorat se direcţionează pe linia realizării unui studiu clinic, a unui studiu histologic, cât şi a unui studiu imunohistochimic, fiecare dintre acestea propunându-şi mai multe obiective: 1. Studiul clinic al pacienţilor: 2. Studiul histologic: 3. Studiul imunohistochimic al secţiunilor, centrat pe investigarea principalelor teorii etiopatogenice implicate în geneza pterigionului: Investigarea clinică şi trierea cazuisticii s-a efectuat în Ambulatoriul şi Clinica de Oftalmologie a Spitalului Clinic de Urgenţă Craiova în intervalul , iar studiile de histologie şi imunohistochimie s- au efectuat la disciplina de Histologie a Facultăţii de Medicină şi în Centrul de cercetare al UMF Craiova: "Centrul pentru studii de morfologie microscopică şi imunologie". Scopul acetei teze l-a reprezentat studierea caracteristicilor histologice şi imunohistochimice ale secţiunilor de pterigion primar şi recidivat şi corelarea lor cu aspectele clinice ale cazuisticii luate în studiu, urmărind astfel să testăm posibilitatea predictibilităţii evoluţiei şi recurenţei acestei afecţiuni pe baza criteriilor morfologice. 2

3 CAPITOLUL 1 DEZVOLTAREA EMBRIOLOGICĂ ŞI HISTOFIZIOLOGIA TUNICII EXTERNE A GLOBULUI OCULAR 1.1. DEZVOLTAREA TUNICII EXTERNE A GLOBULUI OCULAR La dezvoltarea globului ocular şi a anexelor participă două foiţe embrionare: ectodermul şi mezodermul. Schiţa oculară pentru a ajunge la maturitate parcurge trei etape de dezvoltare : 1. Embriogeneza ce constă în simpla segmentare a zigotului şi se desfăşoară până în săptămâna a 3-a a dezvoltării intrauterine; 2. Organogeneza ce determină elaborarea diferitelor structuri oculare din săptămâna a 4-a până în săptămâna a 8-a intrauterină; 3. Diferenţierea ţesuturilor oculare şi a anexelor din săptămâna a 9-a până în luna a IX-a a vieţii intrauterine DEZVOLTAREA CONJUNCTIVEI Dezvoltarea embriologică a conjunctivei începe la embrionul de şase săptămâni şi este strâns legată de cea a pleoapelor. În luna a III-a de viaţă intrauterină, fanta palpebrală se închide începând de la unghiuri spre centru şi obturează cavitatea în care se va dezvolta conjunctiva DEZVOLTAREA SCLEROTICII Sclera are baze ontologice comune cu corneea şi coroida. Sclerotica se dezvoltă din mezodermul care înveleşte cupa optică, prin condensarea straturilor mezenchimale externe. Sclera se schiţează la polul anterior al globului din mezodermul care prelungeşte periferic endoteliul posterior al corneei. La exteriorul acestei condensări sclerale anterioare, ţesutul conjunctival rămâne mai lax. În acest moment al ontogenezei, sclerotica se schiţează la polul anterior al globului şi nimic nu delimitează coroida, sclerotica şi mezenchimul orbitar la nivelul ecuatorului şi înapoia lui. Mezodermul pătrunde între cele două lame corneene primitive, se condensează într-un inel pericorneean dând naştere rădăcinii irisului şi corpului ciliar DEZVOLTAREA CORNEEI Formarea corneei este dependentă de individualizarea cristalinului. Originea embriologică a corneei este dublă: ectodermică pentru epiteliu şi mezodermică pentru stromă şi endoteliu. Ectodermul din vecinătatea cupei optice se îngroaşă şi în săptămâna a 3-a evoluează spre vezicula cristaliniană. Începând din săptămâna a 6-a, vezicula cristaliniană se separă de ectoderm, iar în spaţiul subectodermic se pot evidenţia fibre precolagenice, alungite, care ocupă cavitatea cupei optice, fibre ce sunt elaborate de mezenchimul pericupular. Aceste fibre precolagenice au tendinţa de a se dispune în fascicule paralele la suprafaţă. Până în săptămâna a 6-a, segmentul anterior este reprezentat de o cornee rudimentară, primitivă. În a 38-a zi de gestaţie, la om, corneea primitivă este constituită dintr-un epiteliu (ectoblast de acoperire) format din două straturi de celule (periderm şi ectoderm propriu-zis), aşezate pe o bandă subţire de ţesut conjunctiv acelular, mezostroma. Această stromă primară, elaborată de celulele epiteliului corneean, este constituită dintr-o matrice extracelulară amorfă ce conţine câteva fibrile fine şi contrastează cu mezostroma corneei embrionului de găină (pui) care în stadiu echivalent prezintă o organizare remarcabilă de fibre de colagen. Urmează apoi un fenomen de maturaţie ce conduce la elaborarea unui epiteliu aşa zis normal HISTOLOGIA TUNICII EXTERNE A GLOBULUI OCULAR Globul ocular, partea cea mai importantă a aparatului vizual, este alcătuit dintr-un perete şi un conţinut. Peretele este format din trei tunici concentrice: O tunică externă fibroasă, formată din scleră şi cornee; O tunică mijlocie musculo-vasculară numită uvee în alcătuirea căreia intră următoarele structuri: iris, corp ciliar şi coroidă; O tunică internă nervoasă, retina. Conţinutul este reprezentat de mediile transparente ale ochiului: cristalin aşezat în spatele irisului, umoare apoasă aflată în spaţiul dintre cristalin şi cornee, corpul vitros situat în spatele cristalinului. 3

4 1.2.1 CONJUNCTIVA Conjunctiva este o mucoasă care tapetează faţa posterioară a celor două pleoape şi faţa anterioară a scleroticii. Topografic şi clinic există următoarele zone: conjunctiva palpebrală, conjunctiva fundului de sac şi conjunctiva bulbară. Conjunctiva este formată din epiteliu, şi corion (lama propria) care conţine glande, vase sanguine, limfatice şi nervi. Ea este aşezată pe un strat de ţesut conjunctiv lax, ţesutul subconjunctival, care permite alunecarea mucoasei conjunctivale pe straturile subjacente. Epiteliul conjunctivei palpebrale care este în raport cu tarsul este bistratificat, cilindric. Conjunctiva bulbară are un epiteliu de tip pavimentos necheratinizat. Corionul sau lamina propria este aşezat sub epiteliu, fiind format dintr-un strat superficial şi unul profund SCLERA Sclera, componentă a tunicii externe a globului ocular, constituie elementul de menţinere cel mai solid al acestuia şi este un mijloc de protecţie al mediilor oculare, fiind rezistentă şi puţin extensibilă. Structura microscopică Sclera este un ţesut fibros bogat în fibre colagene, cu o dispoziţie mai puţin ordonată decât a celor corneene. Conţine şi fine fibre elastice. Între fibrele conjunctive se află componenta celulară, fibrocitele şi cromatoforele localizate în număr mic, mai ales în jurul orificiilor vasculare. Sclera este puţin vascularizată. Aportul nutritiv se face prin intermediul structurilor tisulare adiacente. În structura sclerei sunt prezente filete nervoase, dovadă a inervaţei sale proprii CORNEEA Corneea, primul dioptru ocular, datorită transparenţei şi puterii sale refractive deţine un rol fundamental în transmisia, refracţia şi reflexia luminii, determinând astfel calitatea imaginii retiniene. Structura microscopică Histologic, corneea este un ţesut heterogen, constituit din: Epiteliu anterior, acoperit de un fin strat de lichid, filmul lacrimal sau precorneean; Membrana Bowman, separată de epiteliul anterior printr-o membrană bazală; Stroma corneeană sau ţesutul propriu corneean; Membrana Descemet; Epiteliul posterior. Epiteliul corneean anterior Este un epiteliu stratificat pavimentos de tip malpighian necheratinizat, format din 5-7 rânduri de celule. Celulele epiteliale sunt dispuse pe trei straturi: stratul bazal, stratul intermediar, stratul superficial Membrana Bowman Separă stroma de epiteliul anterior şi se mai numeşte şi limitanta anterioară. Ea nu se regenerează şi nu este elastică. Este formată dintr-un strat de fibre colagene cu grosimea de 8-10µm, uşor PAS pozitivă şi acelulară. Stroma corneeană Histologic, ţesutul propriu corneean este format din lamele suprapuse de fibre colagene, dispuse paralel cu suprafaţa corneeană, întinse de la un limb la altul, separate între ele prin celule turtite, corneocite. În interiorul fiecărei lamele, fibrilele sunt paralele între ele, dar sunt perpendiculare faţă de fibrilele din lamelele adiacente. Membrana Descemet Este o membrană bazală transparentă, interpusă între stromă şi epiteliul posterior. Se mai numeşte şi limitanta posterioară. Spre deosebire de membrana Bowman, membrana Descemet se regenerează dacă este distrusă. Epiteliul corneean posterior este un strat celular continuu, situat pe faţa posterioară a corneei, în contact cu umoarea apoasă. La circumferinţa corneei, celulele acestui strat se continuă fără demarcaţie cu epiteliul care acoperă faţa anterioară a irisului. Aceste celule nu au capacitate de regenerare, ceea ce face ca numărul lor să se reducă în urma traumatismelor chirurgicale şi cu vârsta. Inervaţia corneei Epiteliul corneean, este structura tisulară cu cea mai densă inervaţie din organism. Prezintă atât o inervaţie senzitivă cât şi una vegetativă. Nervii corneeni îi asigură troficitatea. Nutriţia corneei Corneea se caracterizează prin absenţa totală a vascularizaţiei, ceea ce realizează transparenţa ei. Nutriţia se realizează pe cale limbică, transepitelială şi transendotelială, prin mecanisme pasive şi active. Limbul sclero-corneean. Este o zonă cu o structură particulară, prin care corneea, sclera şi membrana musculo-vasculară se unesc la periferia corneei prezentând o triplă importanţă: 1. Fiziologică, în circulaţia lichidelor endoculare, prin canalul Schlemm care este localizat la acest nivel, în grosimea sclerei, de jur împrejurul corneei; 2. În patologie, aici având punctul de plecare numeroase afecţiuni traumatice, inflamatorii şi tumorale; 3. Chirurgicală, limbul sclero-corneean reprezintă calea cea mai frecventă de abordare a globului ocular, în majoritatea intervenţiilor. 4

5 1.3. HISTOFIZIOLOGIA TUNICII EXTERNE A GLOBULUI OCULAR HISTOFIZIOLOGIA CONJUNCTIVEI Conjunctiva îndeplineşte multiple funcţii prin cele două elemente structurale de bază, epiteliul şi ţesutul conjunctiv. Funcţia de protecţie, rezidă în realizarea unei bariere mecanice impermeabile la invazia microorganismelor, realizată datorită aderenţei celulelor epiteliale prin intermediul complexelor joncţionale. Funcţia de apărare, prin prezenţa celulelor Langerhans care prezintă pe suprafaţa lor antigene de histocompatibilitate de clasa a II-a şi pot prezenta antigenele sistemului imunitar. Ele sunt capabile să asigure primul stadiu al hipersensibilităţii de contact. Funcţia de retenţie şi stabilitate a filmului lacrimal, prin micropliurile mucoasei care formează un labirint de creste şi şanţuri ce reţine lacrimile HISTOFIZIOLOGIA SCLEREI Sclera este o structură cu un metabolism redus, dar care conferă consistenţă globului ocular. Principalele funcţii deţinute de scleră sunt: Menţinerea formei globului ocular. Rol protector împotriva şocurilor şi radiaţiilor luminoase. Rol de aponevroză pentru inserţia musculaturii oculare extrinseci şi intrinseci. Rol tensional prin rigiditatea sa faţă de presiunea lichidelor endoculare. Rol de drenaj al umorii apoase. Deşi calea principală de drenare este cea limbică, există şi calea uveo-sclerală, prin spaţiul supracoroidian. Pe această cale se elimină până la 25% din fluxul total de umoare apoasă. Ea este independentă de presiunea intraoculară HISTOFIZIOLOGIA CORNEEI Corneea îndeplineşte mai multe funcţii deosebit de importante pentru integritatea structurală şi funcţională a ochiului: optică, de barieră, reflexă, imunologică şi metabolică. 5

6 CAPITOLUL 2 ASPECTE ETIOPATOGENICE ALE DEZVOLTĂRII ŞI EVOLIŢIEI PTERIGIONULUI Patogeneza pterigionului este încă controversată şi pentru explicarea formării sale s-au emis mai multe teorii Rolul radiaţiilor ultraviolete Radiaţiile ultraviolete sunt radiaţii electromagnetice cu lungimea de undă de nm. Conform legii lui Draper, numai o fracţiune din energia absorbită de ţesuturi poate fi utilizată sau poate produce leziuni. Cantitatea cea mai mare de energie necesară inducerii efectelor biologice este denumită doză prag. Sursele de radiaţii ultraviolete la care o persoană poate să fie expusă zilnic sunt multiple: lămpi incandescente şi fluorescente, laseri, arcuri voltaice, lumina solară, care reprezintă principala sursă. S-a constatat că persoanele care lucrează mai mult în interior recepţionează aproximativ 3% din nivelul total ambiental al radiaţiilor ultraviolete, comparativ cu persoanele care îşi desfăşoară activitatea mai mult în aer liber şi care recepţionează mai mult de 10% din radiaţiile ultraviolete ale mediului înconjurător (Marc B, 2004). În acest sens, rata de dezvoltare a pterigionului este de cinci ori mai mare la persoanele care locuiesc în mediul rural comparative cu cele care locuiesc la oraş (Moran DJ, Hollows FC, 1984). Studiile epidemiologice au stabilit că radiaţiile ultraviolete reprezintă un agent etiologic pentru pterigion, de fapt lumina ultravioletă reprezintă impactul major în patogeneza acestei afecţiuni (Moran DJ, Hollows FC, 1984; Coroneo MT, 1993; Kwok LS, Coroneo MT, 1994; Di Girolamo N, Minas TC, Wakefield D, 2003). Expunerea la lumina soarelui în timpul copilăriei cât şi pe parcursul vieţii au fost implicate în dezvoltarea ulterioară a pterigionului ceea ce seamănă cu schimbările degenerative actinice observate la pielea expusă cronic la radiaţiile ultraviolete Rolul apoptozei Ţesuturile epiteliale îşi menţin homeostazia printr-o reglare strânsă între proliferarea celulară şi apoptoza celulară, apoptoza reprezentând moartea celulară normală, programată a celulei care a ajuns la finalul ciclului său de viaţă (Donald TH Tan, Wen Ying Tang, Yan Ping Liu, Hak-Su Goh, Duncan R Smith, 2000). Unele studii au arătat că rata proliferării celulare la mostrele de pterigion este similară cu cele găsite pe suprafaţa conjunctivei normale. Aceasta sugerează că pterigionul nu este o tulburare în exces a proliferării celulare ci este posibil să fie rezultatul lipsei unei apoptoze celulare potrivite Rolul metaloproteinazelor şi al inhibitorilor lor tisulari S-a demonstrat importanţa celulelor epiteliale ale pterigionului în dezvoltarea sa, deoarece ele exprimă un nivel mare de matrix proteinaze (MMPS). De asemenea, s-a observat o creştere a MMPS în fibroblastele din pterigion comparativ cu fibroblastele din conjunctiva normală (Lee SB, Li DQ, Gunja Smith Z, 1999). În plus, citokinele şi factorii de creştere au fost localizaţi în celulele din pterigion. De aici se poate presupune că ambele tipuri de celule ar putea acţiona împreună pentru degradarea membranei bazale şi a altor componente structurale ale ţesutului conjunctiv (Mackenzie FD, Hirst LW, Battistutta D, Green A, 1992). MMPs sunt reglate la multiple nivele, incluzând transcrierea, secreţia, activarea şi inhibarea. Ultimul nivel se realizează prin proteine care apar natural, numite inhibitori tisulari ai MMPs (TIMPs) şi care se leagă cu enzima latentă sau activă. Menţinerea echilibrului între MMPs şi TIMPs este esenţial şi orice modificare a acestuia este determinantă în declanşarea proteolizei şi invadarea tisulară (Di Girolamo N, Minas TC, Wakefield D, 2001). Supraexprimarea MMPs şi TIMPs de către celulele epiteliale din pterigion în regiunile fără membrană bazală sugerează că acestea ar putea contribui la remodelarea matricei şi la distrugerea membranei bazale. Absenţa membranei bazale coincide cu prezenţa fibroblastelor din ţesutul conjunctiv care exprimă MMPs şi TIMPs. Intensitatea exprimării MMPs şi TIMPs este mai mare în celulele epiteliale comparativ cu fibroblastele ceea ce sugerează că celula epitelială este implicată mai mult în distrugerea membranei bazale (Aimes RT, Quigley JP, 1955) Rolul factorilor angiogenetici S-a sugerat că pot exista factori angiogenici implicaţi în patogeneza pterigionului care se dezvoltă în urma iritaţiilor repetate de la nivelul limbului sclerocorneean: TNF-α (factorul de necroză tumorală alfa), b- TGF (factorul de creştere fibroblastic bazic), PDGF (factorul de creştere derivat din plachete), TGF-β (factorul de creştere şi transformare β). Este posibil ca expunerea prelungită la radiaţiile ultraviolete să cauzeze 6

7 modificările biologice de la nivelul membranei Bowman şi ca proteinele alterate să acţioneze ca un factor angiogenic sau pterigiogenic (Eliason JA Elliott JP, 1987). Supraexprimarea factorilor angiogenici concomitent cu expresia scăzută a factorilor inhibitori ai angiogenezei, furnizează probabil o cale pentru mecanismul patogenic al pterigionului, precum şi posibilitatea intervenţiei terapeutice, în scopul prevenirii recurenţelor pterigionului Rolul factorilor imunologici S-a semnalat prezenţa depozitelor de IgE şi IgG de la nivelul stromei pterigionului. În aceleaşi zone cu depozitele de imunoglobuline au fost identificate plasmocite şi infiltrat limfocitar, limfocitele reprezentând celulele pivot ale reacţiilor imune care în prezenţa antigenelor se diferenţiază în vederea declanşării unui răspuns specific, umoral sau celular. Cu ajutorul imunohistochimiei se poate aprecia tipul de imunitate declanşat şi intensitatea răspunsului imun. Răspunsul imun eficient presupune o cooperare celulară. Totuşi, este neclar dacă inflamaţia cronică este o cauză a pterigionului sau un efect secundar. În mod sigur, conjunctivita cronică apare predominant asociată, lucru indicat de studiile inţiale făcute. Unii autori speculează implicarea complexelor de IgE in iniţierea eliberarii mediatorilor farmacologici activi de la nivelul mastocitelor, care la rândul lor eliberează factori stimulatori care conduc la formarea pterigionului (Pinkerton OP, Yoshitsugi H, Shigemura LA, 1984; Džunić B, Jovanović P, Veselinović D, Petrović A, Stefanović I, Kovačević I, 2010) Rolul eredităţii S-a luat în considerare implicarea factorului ereditar deoarece un mare număr de pacienţi cu pterigion au o istorie familială pentru această afecţiune. Nu s-a putut verifica dacă pterigionul în sine este moştenit, ca o trăsătură independentă sau dacă indivizii afectaţi au în comun o susceptibilitate crescută faţă de efectele oculodermice ale luminii solare Rolul filmului lacrimal Filmul lacrimal este esenţial pentru o suprafaţă oculară transparentă şi calitativă din punct de vedere optic. Anormalităţile filmului lacrimal au fost propuse ca factor etiologic pentru că s-a observat creşterea pterigionului prin avansarea capului acestuia în situaţiile de uscăciune oculară (Taylor HR, 1980; Holly FJ, 1985; Liotet S, Van Bijsterveld OP, Blétry O, 1987). S-a sugerat că evaporarea filmului lacrimal de către vânt, devitalizează ţesuturile din treimea medie a fantei palpebrale, iar radiaţiile actinice afectează conjunctiva, epiteliul corneean şi membrana Bowmann (Coroneo, 1993). Filmul lacrimal este esenţial pentru o suprafaţă oculară transparentă şi calitativă din punct de vedere optic. Relaţia intimă, existentă între pătura lacrimală precorneo-conjunctivală, filmul lacrimal şi structurile anatomice subiacente: conjunctivă şi cornee, explică manifestările patologice intricate: leziunile uneia din componentele acestui complex antrenează modificări ale celei de-a doua componente. Acestea arată implicarea calităţii filmului lacrimal în patogeneza pterigionului (Holly FJ, 1985; Degrassi M, Piantanida A, Nucci P, 1993) Model ipotetic al modalităţii de formare a pterigionului Coroborând rezultatele multor studii de specialitate efectuate de diverşi cercetători, am dezvoltat un model ipotetic de modalitate de formare a pterigionului. Lumina ultavioletă ar putea fi declanşatorul iniţial care determină o scădere a celulelor stem limbice ceea ce induce o insuficienţă limbică şi activează celulele epiteliale la sau în apropierea limbului pentru a produce citokine (de tipul IL-6 şi IL-8) şi factori de creştere precum FGF, Le Platelet-Derived Grow Factor, Le Transforming Growth Factor, Factorul de necroză tumorală α (Nolan TM, Di Girolamo N, Minas TC, Wakefield D, 2004; Džunić B, Jovanović P, Veselinović D, Petrović A, Stefanović I, Kovačević I, 2010). Aceste proteine multifuncţionale: - declanşează o cascadă de evenimente care includ inflamaţia, proliferarea, angiogeneza şi antiapoptoza (Anand Apte B, Pepper MS, Voest E, 1997). - citokinele sunt capabile să inducă exprimarea MMPs şi a inhibitorilor lor din ţesuturi (TIMPs), făcând posibil ca acestea să inducă remodelarea tisulară (membrana bazală Bowmann, stroma) cât şi invazia pterigionului (Fariss RN, Apte SS, Olsen BR, 1997). Radiaţiile ultraviolete reprezintă cauza esenţială a microtraumatismelor responsabile de leziunile inflamatorii corneo-conjunctivale. De asemenea, genele supresoare tumorale (p53) sunt sensibile la aceste radiaţii şi modificările induse de aceste radiaţii joacă un rol în patogeneza pterigionului (Onur C, Orhan D, Orhan M, Sak SD, Tulunay O et al, 1998; Dushku N, John MK, Schultz GS, Reid TW, 2000). Ceilalţi factori (praf, vânt, căldură, uscăciune) au un rol secundar. 7

8 CAPITOLUL 3 STUDIUL HISTOLOGIC AL PTERIGIONULUI MATERIAL ŞI METODE Materialul cercetat în teza de doctorat este reprezentat de: Fragmente de pterigion primar şi recidivat recoltate de la un număr de 125 pacienţi la care s-a practicat ablaţia chirurgicală a pterigionului, pacienţi internaţi în Clinica de Oftalmologie a Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova în intervalul Membrană conjunctivală normală (37 fragmente) obţinută din conjunctiva bulbară superioară, recoltată de la o parte din pacienţii la care s-a practicat îndepărtarea chirurgicală a pterigionului. Recoltarea s-a făcut de la pacienţi care nu au prezentat altă patologie oculară (conjunctivite alergice şi atopice, alte afecţiuni conjunctivale, intervenţii chirurgicale oculare de dată recentă) şi fără afecţiuni sistemice din categoria bolilor de colagen. Fixarea fragmentelor s-a făcut în soluţie de formol 40% timp de ore la temperatura camerei, iar prelucrarea s-a făcut la Centrul de Cercetare "Centrul pentru studii de morfologie microscopică şi imunologie" al UMF Craiova. Metode utilizate Fragmentele de pterigion şi de mucoasă conjunctivală au fost prelucrate prin tehnica histologică de includere la parafină, obţinându-se secţiuni groase de 3-5µ care s-au examinat la microscopul de cercetare Nikon 55I dotat cu cameră digitală de 5Mpi şi programul de expunere şi preluare automată a imaginilor microscopice NISS Elements. Secţiunile au fost colorate în coloraţiile uzuale cu hematoxilină-eozină, tricromicul pe bază de verde de lumină după metoda Goldner-Szekelly, tricromicul Masson cu albastru de anilină şi coloraţia PAShematoxilină REZULTATE Pterigionul este o membrană fibrovasculară asociată unei hiperplazii epiteliale, cu punct de plecare joncţiunea corneeo-conjunctivală. Este o afecţiune relativ frecvent întâlnită şi care prezintă numeroase recidive după ablaţia chirurgicală. Cel mai frecvent este localizat nazal, foarte rar temporal şi uneori poate să fie dublu. Are un aspect triunghiular cu baza spre unghiul intern al ochiului şi vârful la nivelul corneei, putând ajunge până la mijlocul acesteia. Poate să fie şi bilateral. În intervalul au fost recoltate în Clinica de Oftalmologie a Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova, prin excizie chirurgicală, fragmente de pterigion de la un număr de 125 pacienţi atât de sex feminin cât şi de sex masculin, după prealabila lor examinare clinică (Fig. 1). În majoritatea cazurilor, pterigionul operat a fost în stadiul avansat, atunci când acesta a determinat prezentarea pacienţilor datorită discomfortului vizual creat de acoperirea axului optic. Din cele 125 de cazuri de pterigion operate, 32 au fost de pterigion recidivat. În majoritatea cazurilor (95%) pterigionul a fost localizat în unghiul intern al orbitei, comparativ cu cel localizat în unghiul extern. Din totalul de 125 de fragmente examinate, 80 (64%) au provenit de la femei şi 45 (36%) au provenit de la bărbaţi (Fig. 2). Spre deosebire de literatura de specialitate care semnalează o incidenţă mai mare a pterigionului la sexul masculin, în cazuistica noastră, sexul feminin a predominat Fig. 1 Provenienţa pe ani a fragmentelor de pterigion. F B 8 F B 45; 36% 80; 64% Fig. 2 Repartiţia în funcţie de sex a cazurilor

9 În funcţie de mediul de provenienţă, există o predominenţă a pacienţilor proveniţi din mediul rural, 102 (81,6%), comparativ cu mediul urban unde îşi au domiciliul 23 (18,4%) din totalul pacienţilor (Fig. 3). Fragmentele de pterigion au provenit de la pacienţi cu vârsta cuprinsă între 28 şi 73 ani. Incidenţa cea mai mare a fost la grupa de vârstă ani, iar incidenţa cea mai mică s-a remarcat la pacienţii din decada ani (Fig. 4). RURAL URBAN 23; 18% 80; 64% ani ani ani ani ani ani Fig. 3 Repartiţia în funcţie de mediul de provenienţă. Fig. 4 Repartiţia pe grupe de vârstă a pacienţilor. Pacienţii, atât cei cu pterigion primar cât şi cei cu pterigion recidivat au fost examinaţi clinic în scopul identificării zonelor de progresie (insulele Fuchs) şi a aspectului clinic care poate să pledeze pentru un pterigion evolutiv sau unul staţionar (foarte cărnos, bine vascularizat, precedat de o zonă infiltrativă). Am examinat la microscop fragmente de pterigion primar şi recidivat de la pacienţii la care s-a practicat ablaţia chirurgicală, consemnând modificări atât la nivelul epiteliului cât şi în stroma subepitelială. Am constatat aspecte morfologice diferite de la un caz la altul şi chiar pe secţiunile provenite de la acelaşi caz s-au observat diferenţe zonale. Totodată, aceste modificări au fost legate de etapa evolutivă a afecţiunii. Un număr foarte mic de secţiuni de pterigion au prezentat o organizare structurală, atât la nivelul epiteliului cât şi la nivelul stromei, similară cu cea a conjunctivei bulbare. Epiteliul secţiunilor de pterigion examinate este stratificat pavimentos necheratinizat, format din trei straturi celulare (Fig. 5). Am observat că epiteliul este uneori, neuniform ca grosime, zone mai groase alternând cu zone mai subţiri, datorită numărului variabil de straturi celulare pe care epiteliul pterigionului îl prezintă de la un segment la altul (Fig. 6). Fig. 5 Pterigion - aspect general. Fig. 6 Epiteliu cu zone inegale ca grosime. Col HE X 100 Col. PAS - hematoxilină X 100 Pe unele secţiuni, hiperplazia epitelială determină o îngroşare a stratului intermediar (Fig. 7). Pe un număr extrem de mic de secţiuni s-a observat că ea a fost însoţită de o tendinţă de cheratinizare, prin încărcarea cu granule de cheratohialină a celulelor epiteliale superficiale. Epiteliul poate să fie de aspect normal, dar am întâlnit şi zone de epiteliu displazic sau zone de erozie epitelială (Fig. 8). Aceste aspecte se datorează probabil agresivităţii mai mari a factorilor etiologici care au depăşit capacitatea de apărare celulară locală. Printre celulele epiteliale sunt prezente celule secretoare de mucus, celulele caliciforme, pe care le-am observat că sunt dispuse fie izolat fie grupat (Fig. 9). În zonele în care epiteliul se invaginează adânc la nivelul 9

10 stromei, formând adevărate cripte, numărul celulelor caliciforme este mult mai mare comparativ cu epiteliul de suprafaţă realizând un aspect pseudoglandular (Fig. 10). Invaginarea epiteliului şi aspectul pseudoglandular sunt determinate de multiplicarea accelerată a celulelor din stratul bazal ceea ce determină creşterea numărului de celule poliedrice, cilindrice şi caliciforme, rezultând imposibilitatea epiteliului de a le integra, ducând la direcţionarea lor spre conjunctivul subepitelial. Am remarcat că membrana bazală în anumite zone fie este mai subţire, fie este fragmentată, fie chiar lipseşte. Aceste aspecte ale membranei bazale indică punctele de minimă rezistenţă care au permis epiteliului să se invagineze la nivelul laminei propria. Fig. 7 Hiperplazie epitelială. Fig. 8 Zonă de erozie epitelială. Col. PAS - hematoxilină X 200 Col. HE X 100 Fig. 9 Tendinţa de invaginare a epiteliului cu Fig. 10 Aspect pseudoglandular determinat de celule caliciforme isolate sau grupate. invaginarea epiteliului în care predomină celulele Col. PAS - hematoxilină X 200 Col. PAS-hematoxilină X 200 La nivelul laminei propria, coexistă zone de aspect cvasinormal, cu zone care prezintă modificări de grade diferite. Sunt identificate zone de infiltrat celular inflamator, alături de o componentă vasculară bine reprezentată. Pe aceste secţiuni se poate vorbi de un adevărat polimorfism lezional (Fig. 11). Multe dintre cazurile examinate au prezentat semne de inflamaţie cronică: infiltrat cu limfocite, plasmocite, mastocite şi macrofage. Prezenţa acestor celule indică faptul că la nivelul stomei se desfăşoară un proces de apărare, atât de tip macrofagic, cît şi de tip imun. Procesul inflamator este prezent la nivelul corionului pe secţiunile provenite de la majoritatea cazurilor. Diferă însă, de la un caz la altul, modalitatea de dispunere, putând să fie difuz (Fig. 12) sau localizat, sub formă de insule de dimensiuni diferite. Zonele cu infiltrat inflamator le-am observat pe unele secţiuni ca fiind izolate localizate în special perivascular şi periglandular (Fig. 13). Au existat şi secţiuni care nu au prezentat infiltrat inflamator. Distribuţia şi modalitatea de dispunere a fibrelor am întâlnit-o sub diferite aspecte, de cele mai multe ori nu prezintă o anumită orientare sau tendinţa de formare a fasciculelor. Fibrocitele pot realiza însă un proces de fibrilogeneză colagenă deosebit de intens, astfel încât, pe unele secţiuni microscopice examinate, fibrele colagene sunt abundente realizând adevărate zone întinse de fibroză (Fig. 14). 10

11 Fig. 11 Polimorfism lezional stromal Fig. 12 Proces inflamator difuz, de intensitae redusă. Col. HE X 100 Col. tricr. GS X 100 Fig. 13 Discret proces inflamator perivascular. Fig. 14 Fibre colagene cu dispoziţie fasciculară. Col. tricr. GS X 200 Col. tricr. GS X 100 Numărul, calibrul şi tipul vaselor de sânge a fost extrem de diferit pe secţiunile examinate. Numeroase capilare sunt localizate în apropierea membranei bazale, în strânsă vecinătate cu epiteliul activ, ele asigurând aportul de substanţe necesar celulelor epiteliale aflate în activitate mitotică intensă. Un număr mare de vase am întâlnit în jurul şi în interiorul zonelor cu concentrare mare a celulelor inflamatorii care beneficiază astfel de aportul sanguin necesar multiplicării şi funcţionării lor. Unele vase au tendinţa la trombozare, altele sunt trombozate, iar altele au un perete fragil, dovadă existenţa în unele zone a unui extravazat hematic (Fig. 15). Pe lângă capilarele tipice, am întâlnit frecvent capilare cu lumen lărgit care prezintă numeroase anastomoze, cu aspect de vase de neoformaţie, răspândite în tot corionul. (Fig. 16). Fig. 15 Numeroase vase, unele trombozate. Fig. 16 Reţea de neovase în secţiune transversală. Col. HE X 200 Col. HE X

12 Aspectele histopatologice diferă în funcţie de etapa evolutivă, faza de progresie sau staţionară, cât şi după cum pterigionul este primar sau recidivat. Din cele 125 de secţiuni microscopice de pterigion examinate, 53 (42,4%) s-au încadrat în tipul angiomatos, 41 (32,8) au corespuns aspectului fibros şi 31 cazuri (24,8%) au fost de tip mixt. Procentele celor trei tipuri histopatologice decelate de noi la cazuistica luată în studiu au fost apropiate de cele citate de literatura de specialitate (Fig. 17). Angiomatos Fibros Mixt Am făcut analiza aspectelor histopatologice întâlnite, pentru ca pe baza acestei analize să putem stabilii parametrii morfologici care caracterizează pterigionul primar, formele sale recidivate cât şi stadiul evolutiv. Intensitatea modificărilor întâlnite pentru fiecare dintre aceste elemente de structură am cuantificat-o pe o scară de la 0 la 3 (Tabel nr. 1). Tabelul nr. 1 Intensitatea modificărilor histopatologice ELEMENTUL DE GRUPE STRUCTURĂ INTENSITATEA INFLAMAŢIEI GRADUL DE VASCULAROZAŢIE MODIFICĂRILE COMPONENTEI FIBRILARE Fig. 17 Tipurile histopatologice de pterigion examinate. 0: Fără infiltrat inflamator. 1: Infiltrat inflamator sporadic localizat perivascular. 2: Infiltrat inflamator cronic multifocal. 3: Infiltrat inflamator cronic difuz. 0: Vascularizaţie asemănătoare conjunctivei normale. 1: Arteriole în zona centrală a pterigionului. 2: Capilare localizate subepitelial şi în zone mai întinse. 3: Arteriolelor subepitelial şi în zone mai întinse. 0: Fără modificări. 1: Modificări rare, focale, perivasculare. 2: Un număr mare de modificări focale, perivasculare. 3: Un număr mare de modificări focale şi subepiteliale. Pe majoritatea secţiunilor examinate, intensitatea inflamaţiei a fost sporadică, perivasculară (grupul 1), gradul vascularizaţiei s-a încadrat în grupul 1, iar modificările fibrinoide s-au încadrat în grupul 2. Pe secţiunile de pterigion primar provenite de la pacienţii cu pete Fuchs am constatat un proces inflamator mai intens şi o vascularizaţie mai accentuată comparativ cu pacienţii care nu au prezentat clinic pete Fuchs. În schimb, componenta fibrilară a fost mai bine reprezentată la pacienţii care nu au prezentat pete Fuchs. Rezultă că petele Fuchs reprezintă indicatorul clinic al activităţii pterigionului, al progresiei sale, în timp ce absenţa petelor Fuchs se poate corela cu existenţa unui proces staţionar (Fig. 18) % 80% % 40% 20% Absenta petelor Fuchs Prezenta petelor Fuchs 0% Pterigion primar Pterigion recidivat Fig. 18 Analiza comparativă a recidivei pterigionului şi prezenţei petei Fuchs 12

13 3.3. DISCUŢII Pterigionul este una dintre cele mai comune afecţiuni oftalmologice, a cărei patogeneză este încă neclară, rar întâlnită înainte de vârsta de 12 ani, evoluând încet pe parcursul anilor (10-20 ani), crescând dinspre limb spre centrul corneei. Pterigionul este o proliferare fibrovasculară a ţesutului conjunctiv care se dezvoltă de la conjunctiva bulbară spre cornee. Activitatea proliferativă de la nivelul pterigionului variază în perioada sa de dezvoltare. Clinic, semnul de evolutivitate al pterigionului este dat de zona progresivă Fuchs sau insula (pata) Fuchs (Džunić B, Jovanović P, Veselinović D, Petrović A, Stefanović I, Kovačević I, 2010). Capul pterigionului este înconjurat în perioada de invazie de o zonă gelatinoasă avasculară, uşor proeminentă la suprafaţa corneei (Baidan N, Munteanu Ghe, Olteanu, 1989). În 1997, Tan DT, Chee SP, Dear KB, Lim AS au clasificat morfologic pterigionul în trei categorii: atrofic, hipertrofic, intermediar şi au propus ca morfologia să reprezinte un factor de risc pentru recidivă. Conform altei clasificări, există trei forme histopatologice de pterigion: angiomatos, în care stroma conţine un număr semnificativ de vase cu edem intervascular, fibros, cu numeroase fibre şi puţine elemente vasculare şi mixt, cu ambele elemente (García Carmona KP, Romero Guadarrama MB, Rodríguez Florido MA, Tenorio G, 2006). Şi noi am clasificat aspectele întâlnite pe secţiunile microscopic provenite de la cazuistica luată în studiu conform acestor criterii care fac referire la componenta vasculară şi la cea fibrilară. Tipul morfologic cel mai comun de pterigion întâlnit de noi a fost cel angiomatos (42,4%), ceea ce corespunde datelor din literatură care citează pentru această formă un procent de 40%. Şi pentru celelalte două forme, rezultatele noastere au fost apropiate de cele ale altor autori: tipul fibros a reprezentat în cazuistica noastră un procent de 32,8%, comparative cu 31,5%, iar cel mixt, 24,8%, în comparaţie cu 28,5%. Ritmul accelerat de multiplicare a celulelor din zona epitelială germinativă determină creşterea numărului de celule poliedrice, cilindrice, caliciforme, componente ale epiteliului. Hiperplazia epitelială care rezultă trebuie privită ca fiind un proces de adaptare al celulelor la stresul local reprezentat de factorii iritativi. Adaptarea se poate face fie în mod progresiv (hiperplazia), fie în mod regresiv (atrofia). Epiteliul pterigionului progresiv prezintă o hiperplazie semnificativ mai mare şi o activitate germinativă mai crescută în stratul bazal, comparativ cu pterigionul staţionar. Toţi autori sunt de acord asupra faptului că ţesutul conjunctiv prezintă modificări în cursul evoluţiei pterigionului. Şi noi am găsit la cazurile examinate modificări ale conjunctivului, diferenţiate în funcţie de etapa evolutivă şi de caracterul primar sau recidivat al afecţiunii. Aceste modificări au interesat toate componentele structurale ale stromei (componenta celulară, componenta fibrilară, substanţa fundamentală). Alţi autori (Karukonda SR, Thompson HW, Beuermann RW, Lam DS, Wilson R et al, 1995) nu găsesc diferenţe ale proliferării celulare între pterigion şi conjunctiva normală şi sugerează că pterigionul nu este o expresie a dezordinii proliferării celulare. De asemenea, arată că nu există diferenţe semnificative în ceea ce priveşte proliferarea celulară de la nivelul pterigionuli primar şi recurent. Studiile lui Tai MC, Chen CH, Yieh FS, Chang CJ, 2003 confirmă însă că fibroblastele din pterigion prezintă abilităţi de adezivitate şi cinetică de creştere mare, superioare fibroblastelor din conjunctiva normală. Aceasta explică posibilităţile de creştere ale pterigionului. Numărul, calibrul şi tipul vaselor prezintă o mare variabilitate. O reţea vasculară abundentă cu numeroase capilare în zona superioară a laminei propria, cu o modificare fibrinoidă focală însoţită de epiteliu zonal activ, caracterizează formele de pterigion lent evolutiv. Dezvoltarea acestor leziuni pe zone mai întinse arată însă o evoluţie progresivă. Asocierea inflamaţiei reprezintă un semn de activitate şi este mai accentuată la pacienţii cu recidive (Cilova-Atanasova B, 1974). Pterigionul prezintă multe semne histopatologice de inflamaţie cronică: infiltrat limfocitar predominent cu limfocite T, plasmocite şi mastocite. Mastocitele joacă un rol important în inflamaţia cronică acompaniată de angiogeneză şi fibroză. Vasele de neoformaţie, creşterea numărului de fibroblaste, gruparea fibrelor de colagen degenerate şi prezenţa fibrelor elastice anormale, confirmă prezenţa inflamaţiei cronice (Džunić B, Jovanović P, Veselinović D, Petrović A, Stefanović I, Kovačević I (Džunić B, Jovanović P, Veselinović D, Petrović A, Stefanović I, Kovačević I, 2010). Creşterea infiltratului limfocitar sugerează implicarea unui mecanism imunologic în patogeneza pterigionului (Perra MT, Maxia C, Zucca I Piras F, Sirigu P, 2002). Acest aspect şi noi l-am remarcat în cazuistica studiată. În plus, apariţia limfocitelor şi plasmocitelor sugerează că formarea pterigionului implică o inflamaţie cronică asociată cu infiltrat mononuclear stromal. Prezenţa infiltratului inflamator limfo-plasmocitar şi macrofagic demonstrează că la nivelul laminei propria se desfăşoară un proces de apărare atît de tip macrofagic cât şi de tip imun. Există o cooperare celulară atât între macrofag (celula pivot a apărării nespecifice) şi limfocit (celula cheie a apărării specifice, imune), între diferitele subpopulaţii limfocitare cât şi între macrofag şi granulocitul neutrofil (microfag), în scopul realizării unui răspuns imun cât mai eficient ca intenitate, adecvat stimulului antigenic. 13

14 CAPITOLUL 4 STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC AL PTERIGIONULUI 4.1. MATERIAL ŞI METODE Studiul a fost centrat pe investigarea principalelor teorii etiopatogenice implicate în geneza pterigionului: Angiogeneza de la nivelul pterigionului a fost investigată cu markerii: o CD31, ce permite identificarea endoteliilor vasculare şi implicit stabilirea microdensităţii vasculare; o VEGF ce a permis identificarea principalelor surse de factori proangiogeni de la nivelul pterigionului; Implicarea factorilor de creştere în patogenia pterigionului investigată cu markerii: o EGF, EGFR şi TGFb, implicaţi în proliferările tisulare intense din pterigion, fapt ce a determinat considerarea acestei entităţii patologice drept o pseudotumoră; Remodelarea matrixului extracelular investigată cu ajutorul markerilor: o MMP1, MMP9, şi TIMP1, ce permit evidenţierea activităţilor colagenolitice şi gelatinolitice din cursul remodelării materialului extracelular şi din procesele degenerative ce au loc la nivelul pterigionului, ce fac din această boală o formă particulară de colagenoză; Implicarea genelor supresoare tumorale investigată prin markerul: o p53 care ar fi responsabilă de proliferarea necontrolată a de la nivelul pterigionului REZULTATE IMPLICAŢIILE ANGIOGENZEI ÎN PATOGENIA PTERIGIONULUI. Morfologia, distribuţia şi microdensitatea vaselor de sânge Cea mai intensă reactivitate la acest marker la nivelul pterigionului a fost evidenţiată îndeosebi la nivelul ariei subepiteliale. Această particularitate de distribuţie a vaselor de sânge se explică prin necesitatea asigurării unui aport crescut nutritiv pentru epiteliul pterigionului în proliferare. Am mai consemnat la nivelul conjunctivului prezenţa îndeosebi a vaselor de calibru mic, colabate (Fig. 19). De asemenea am mai remarcat prezenţa de vase alungite, tortuoase şi ramificate (Fig. 20). Morfologia acestor vase este concludentă pentru existenţa unui activ proces de angiogeneză la nivelul conjunctivului subepitelial al pterigionului. Fig. 19 Vase de sânge CD31+ de calibru mic, Fig. 20 Vas de sânge CD31+ alungit, tortuos, colabate X 200 ramificat X 400 Valorile medii ale MVD, măsurate la un obiectiv cu magnitudine X 400 au fost de 19,58±6,7 la nivelul pterigionului comparativ cu conjunctiva normală, în care valoarea medie a fost de 7,6±4,5 (Tabelul nr. 2) Tabelul nr. 2 Valorile medii ale MVD la nivelul pterigionului şi conjunctivei normale. MVD Pterigion 19,58±6,7 Conjunctiva normală 7,6±4,5 14

15 Implicarea factorului de creştere a endoteliului vascular (VEGF) în angiogeneza şi respectiv patogenia pterigiunului. Imunoreactivitatea pentru VEGF a fost prezentă în toate cazurile şi a fost superioară celei din conjunctivă. Calitativ, imunoreacţia a fost una heterogenă (Fig. 21) intensitatea reacţiei variind de la caz la caz (Tabelul nr. 3). La nivelul pterigionului am consemnat o intensă reacţie la VEGF pentru: celulele epiteliale, cu excepţia celulelor mucoase, celulele endoteliale vasculare, fibroblaştii şi celule inflamatorii stromale (Fig. 22). Fig. 21 VEGF+ la nivelul epiteliului X 400 Fig. 22 VEGF+ în celulele endoteliale X 400 Tabelul nr. 3: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-vegf Nr de cazuri de pterigion Scorul evaluării calitative al immunomarcajului anti-vegf 0 ± IMPLICAREA FACTORILOR DE CREŞTERE ÎN PATOGENIA PTERIGIONULUI Implicarea factorului de creştere epidermal (EGF) şi a receptorului său (EGFR) în patogenia pterigionului. Imunomarcajul celulelor epiteliale ale pterigionului la EGF a fost prezent în toate eşantioanele de pterigion investigate (Tabelul nr. 4). Intensitatea imunomarcajului a fost una predominant intensă (Fig. 23), dar reacţia a fost şi slabă (Fig. 24). Imunoreacţia la acest marker din partea conjunctivei normale a fost una slabă şi chiar absentă. Tabelul nr. 4: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-egf Nr de cazuri de pterigion Scorul evaluări calitative al immunomarcajului anti-egf 0 ± Fig. 23 Reacţie intensă la EGF (+++) X 400 Fig. 24 Reacţie slabă la EGFR (+) X

16 Reactivitatea pentru EGF a fost evidentă şi la nivelul celulelor endoteliale. (Fig. 25). Imunoreacţia la acest marker din partea conjunctivei normale a fost una slabă şi chiar absentă. EGFR a fost exprimat în 13 din cele 21 de cazuri investigate. Intensitatea imunomarcajului a fost în general intensă (Tabelul nr. 5) fiind comparabilă cu nivelul expresiei acestui receptor la nivelul celulelor endoteliale ale conjunctivului pterigionului (Fig. 26). Fig. 25 Reacţie pozitivă la EGF a celulelor Fig. 26 Reacţie pozitivă la EGFR a celulelor endoteliale X 400 endoteliale şi a celulelor inflamatorii stromale X 400 Tabelul nr. 5: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-egfr Nr de cazuri de pterigion Scorul evaluări calitative al immunomarcajului anti-egfr 0 ± Implicarea factorului beta de transformare a creşterii epidermal (TGFb) în patogenia pterigionului Toate cazurile investigate au fost pozitive pentru TGFb. Intensitatea imunomarcajului a variat de la moderat la intens (Tabelul nr. 6). Tabel nr. 6: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-tgfb Nr de cazuri de pterigion Scorul evaluări calitative al immunomarcajului anti-tgfb 0 ± Imunoreactivitatea la TGF-b a fost mai evidentă în epiteliul pterigionului având un pattern citoplasmatic (Fig. 27). Faţă de conjunctiva normală, imunoreacţia la nivelul pterigionului a fost mult mai intensă. Am mai consemnat o reactivitate la TGF-b în citoplasma celulelor endoteliale, membrana bazală a vaselor şi a epiteliului, fibroblaştilor şi celulelor infiltratului inflamator (Fig. 28). Fig. 27 Reacţie intensă la TGFb (+++) a Fig. 28 Reacţie pozitivă la TGFb a endoteliului celulelor epiteliale X 400 vascular şi fibroblaştilor X

17 IMPLICAREA MATRIX METALOPROTEINAZELOR ŞI A INHIBITORILOR LOR SPECIFICI ÎN PATOGENIA PTERIGIONULUI. Implicarea matrix metoloproteinazei 1 (MMP1) în patogenia pterigionului MMP1 a fost evidenţiată în toate cazurile de pterigion investigate. Patternul imunoreacţiei a fost unul difuz citoplasmatic, iar din punct de vedere calitativ imunomarcajul a fost unul preponderent moderat-intens (Tabelul nr. 7). Tabelul nr. 7: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-mmp1 Nr de cazuri de pterigion Scorul evaluări calitative al immunomarcajului anti-mmp1 0 ± Reacţia a fost mai evidentă la nivelul vaselor de sânge ale pterigionului (Fig. 29). Cu o intensitate variabilă, imunoreacţia a fost prezentă şi la nivelul întregului epiteliu al pterigionului, precum şi în fibroblaştii conjunctivului (Fig. 30). Fig. 29 Reacţie pozitivă la MMP1 a endoteliului Fig. 30 Reacţie pozitivă la MMP1 heterogenă vascular şi fibroblaştilor X 400 în grosimea epiteliului X 400 Implicarea inhibitorului matrix metoloproteinazei 1 (TIMP1) în patogenia pterigionului Imunoreactivitate la TIMP1 a fost evidenţiată în toate cazurile investigate iar calitativ, marea majoritate au prezentat o reacţie intensă (Tabelul nr. 8). Totuşi, per ansamblu imunoreactivitatea pentru TIMP1 la nivelul pterigionului a fost aproape similară celei pentru MMP1. Tabelul nr. 8: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-timp1 Nr de cazuri de pterigium Scorul evaluări calitative al immunomarcajului anti-timp1 0 ± Imunoreacţie pozitivă la TIMP1 a fost evidenţiată în întreaga grosime a epiteliului (Fig. 31). O reacţie pozitivă la acest marker a fost evidenţiată şi la nivelul fibroblaştilor şi a fasciculelor de colagen din corpul pterigionului (Fig. 32). Fig. 31,32 Reacţie intens pozitivăla TIMP1 în grosimea epiteliului, fibroblaştilor şi vaselor X

18 Implicarea matrix metoloproteinazei 9 (MMP9) în patogenia pterigionului Imunoreactivitatea la MMP9 a fost evidenţiată în toate cazurile investigate, iar calitativ, marea majoritate au prezentat o reacţie intensă (Tabelul nr. 9). Tabelul nr. 9: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-mmp9 Nr de cazuri de pterigion Scorul evaluări calitative al immunomarcajului anti-mmp9 0 ± Pentru MMP-9 am consemnat o reducere a expresiei în epiteliul pterigionului (Fig. 33). Endoteliul vascular, fibroblaştii şi celulele inflamatorii din pterigion au fost imunoreactive la MMP-9 (Fig. 34). Intens citoplasmatic pozitive la MMP9 au fost neutrofilele, atât extravazate cât şi cele din lumenele vasculare. Fig. 33 Reacţie intens pozitivă (+++) la MMP9 Fig. 34 Reacţie pozitivă la MMP9 la nivelul în grosimea epiteliului X 400 fibroblaştilor şi a vaselor de sânge X IMPLICAREA GENELOR SUPRESOARE TUMORALE ÎN PATOGENIA PTERIGIONULUI. Implicarea oncoproteinei p53 în patogenia pterigionului Pozitivitatea la p53 a fost prezentă în 14 din cele 21 de cazuri investigate (Tabelul nr. 10). Nu am detectat imunoreactivitate pe conjunctiva normală în grupurile de control examinate. Tabelul nr. 10: Evaluarea calitativă a immunomarcajului cu anticorpul anti-p53 Nr de cazuri de pterigium Scorul evaluări calitative al immunomarcajului anti-p53 0 ± La nivelul epiteliului pterigionului, imunoreacţia a fost mai evidentă în stratul bazal (Fig. 35). Ocazional, am consemnat prezenţa reacţiei nuclear şi în straturile superioare (Fig. 36). Fig. 35, 36 Reacţie pozitivă la p53 la nivelul nucleilor celulelor din grosimea epiteliului X