UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE FACULTATEA DE MEDICINĂ TEZA DE DOCTORAT

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE FACULTATEA DE MEDICINĂ TEZA DE DOCTORAT CORELAŢII ÎNTRE ASPECTELE MICROSCOPICE ŞI MACROSCOPICE ALE MUCOASEI BUCALE ŞI FLORA MICROBIANĂ LA PACIENŢII CU PARODONTOPATII ŞI DIABET ZAHARAT - REZUMAT - CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ. dr. LAURENŢIU MOGOANTĂ DOCTORAND: Georgiana-Cristiana TOMA (CAMEN) CRAIOVA 2012

2 CUPRINS INTRODUCERE CONSIDERAŢII GENERALE Capitolul I Histologia cavităţii bucale. Capitolul I Aspecte microbiologice privind biocenoza cavităţii orale. Capitolul III Diabetul zaharat. Complicaţiile bolii. CONTRIBUŢII PERSONALE Capitolul IV Studiul microbiologic al florei microbiene la pacienţii cu parodontopatii şi diabet zaharat I. Introducere II. Material şi metodă III. Rezultatele studiului microbiologic IV. Discuţii Capitolul V studiul histologic al parodontopatiilor la pacienţii cu diabet zaharat I. Introducere II. Material şi metodă III. Rezultatele studiului histologic IV.Discutii Capitolul VI Studiul imunohistochimic al parodontopatiilor la pacienţii cu diabet zaharat I. Introducere II. Material şi metodă III. Rezultate IV. Discuţii Capitolul VII Concluzii Bibliografie 2

3 INTRODUCERE Problematica bolii parodontale este complexă şi pe larg descrisă în numeroase tratate, monografii şi lucrări. Boala parodontală, una dintre cele mai frecvente probleme de sănătate orală, reprezintă în ultimul timp una dintre principalele preocupări ale medicilor stomatologi. Suferinţele parodondale depind de boala specifică, factorii generali şi locali, dar şi de răspunsul individual. Studiile epidemiologice au scos în evidenţă faptul că afectarea parodontală este mai accentuată la pacienţii cu afecţiuni sistemice, care determină scăderea capacităţii organismului de apărare, dar în acelaşi timp favorizează şi evoluţia distrofiilor parodontale.la ora actuală printre factorii generali de risc pentru apariţia şi evoluţia bolii parodontale se numără: fumatul, vârsta înaintată, factorii genetici, dar şi boli sistemice ca diabetul, infecţia HIV. Descoperirile recente au scos la iveală relaţia de necontestat dintre diabet şi boala parodontală. Se ştie că, boala parodontala este responsabila de distrugerea ţesuturilor conjunctive care susţin dintele în alveolă, iar diabetul înseamnă utilizarea neadecvată a zaharurilor (determinând scăderea răspunsului imun la infecţii, creşterea vâscozităţii sanguine, hipoxie tisulară, etc.). Deşi boala parodontală şi diabetul au determinism diferit ele se agravează reciproc prin mecanisme imuno-biochimice. Lucrarea de faţă îşi propune să sublinieze necesitatea stabilirii unei conduite de colaborare interdisciplinară între medicii stomatologi pe de o parte şi medicii specialişti (diabetologi, internişti, endocrinologi, medici de laborator) pe de alta, în depistarea precoce a persoanelor posibil suferind de diabet. Având în vedere interrelaţia dintre diabet-sănătate orală-boală parodontală lucrarea şi-a concentrat atenţia spre prevenirea acestor maladii şi a complicaţiilor prin realizarea unui screening uşor de aplicat chiar la nivelul cabinetului medicului stomatolog. Boala parodontală reprezentând o afecţiune cu un impact mare în populaţie (mai ales adulţi şi vârstnici) este responsabilă de durere, dezechilibre dento-maxilare şi în final determină pierderea dinţilor. Creşterea speranţei la viaţă datorată evoluţiei societăţii a atras după sine şi expunerea pe termen mai mare la acţiunea nocivă a medicamentelor sau la agresiunea microbiană şi a factorilor de risc, precum şi la escaladarea unor boli cronice, generale cum ar fi diabetul. OMS raportează în 2000 aproape 117 milioane de diabetici în lume şi peste 1 milion în România (statisticile OMS prevăd pentru 2030 peste 370 milioane în lume şi aproximativ 1,8 milioane în România). 3

4 Observaţiile clinice şi epidemiologice au demonstrat că inflamaţiile şi sângerările gingivale sunt mai frecvente la pacienţii care au asociat diabetul, comparativ cu ne-diabeticii (la factori determinanţi sau favorizanţi similari). Diabetul zaharat este cea mai răspândită boală metabolică ce afectează deopotrivă metabolismul lipidic, proteic, carbohidraţilor, mineralelor. Dezechilibrul glicemiei determină afectarea tuturor organelor (rinichi, inimă vase sanguine, nervi, ochi, etc.). Aproximativ 50% din indivizi nu sunt conştienti de afectarea lor. Diabetul este o boală metabolică cu evoluţie cronică, transmisă genetic sau câştigată în cursul vieţii, caracterizată prin tulburarea metabolismului glucidic (hiperglicemie cu/fără glicozurie) însoţită pe plan secundar de perturbări ale metabolismului lipidic şi proteic. Aceste modificări metabolice se datoresc absenţei absolute sau relative de insulină, iar clinic bolnavul prezintă triada caracteristică: polidipsie, polifagie, poliurie. Este binecunoscut faptul că diabeticul poate fi considerat, atâta timp cât nu are complicaţii, un subiect sănătos căruia îi lipseşte insulina.bolnavii cu diabet zaharat au o susceptibilitate crescută la infecţii locale şi generale. S-a acceptat unamim ideea că la baza etiopatologiei diabetului se află factorii ereditari (prezenţa la pacienţii insulinodependenţi a antigenelor HLA-B8 si DW3 sau anticorpilor anticelule insulare) în corelaţie cu factorii din mediu. Studiile au evidenţiat perturbări ale proprietăţilor granulocitelor privind chemotactismul, aderenţa, diapedeza, funcţiei fagocitare mai ales bactericide, deprimarea profundă a transformării blastice a limfocitelor, dar şi defecte ale unor enzime din metabolismul purinelor (scădere a ectopurin-5-nucleotidazei). Complicaţiile cronice datorate deechilibrărilor metabolice din boala diabetică cele mai importante se datorează tulburărilor microangiopatice (retiniene, renale, neurologice), leziunea caracteristică fiind îngroşarea membranei bazale a epiteliului vascular. Glicoproteinele, constituenţi de bază ai membranelor bazale sunt responsabile alături de fibrinogenul crescut de mărirea vâscozităţii sanguine (element important în patogenia retinopatiei şi glomerulosclerozei diabetice) şi în acelaşi timp de scăderea fluxului sanguin în vase mici. Primele III capitole dedicate partii generale a tezei de doctorat nu se regasesc in rezumatul de fata considerand mai reprezentativa trecerea in revista a ultimelor IV capitole si anume capitolele de contributie personala. 4

5 STUDIUL MICROBIOLOGIC AL FLOREI MICROBIENE LA PACIENŢII CU PARODONTOPATII SI DIABET ZAHARAT I. INTRODUCERE Tegumentele şi parte din mucoasele care captuşesc cavităţile naturale ale organismului sunt constant populate cu microorganisme care alcătuiesc ceea ce numim flora normala rezidentă si flotantă. Orice microorganism poate ajunge pe invelişurile corpului, dar supravieţuiesc numai acelea care gasesc condiţii de dezvoltare şi care, neagresive sau mai puţin agresive, nu-şi desfiinţeaza gazda. Incă din primele 24 ore după naştere, speciile care populeză mucoasa bucală sunt streptococii viridans (facultativ anaerobi) care vor domina toată viaţa, urmaţi indeaproape de Bifidobacterium bifidium si Lactobacilus acidophilus (microaerofili), de bacili gram-negativi din familia Bacteroidaceae si spirochete (anaerobi). Intr-un studiu realizat de Pasteur preciza ipoteza ca flora normală este esenţială pentru viaţa, apoi câţiva ani mai târziu ipoteza lui a fost testată şi demonstrată ca este falsă de catre Reyniers şi colaboratorii la Laboratorul Labound, Universitatea Notre Dame, care au demontrat statusul germenilor liberi poate fi menţinut la succesive generaţii la animalele de laborator. [149] II.MATERIAL SI METODĂ Cercetarea s-a realizat pe un lot de 46 pacienţi (dintre care 38 pacienţi diabetici spitalizaţi în Clinica de Diabet si Boli de Nutriţie, Spitalul Universitar de Urgenţă, Craiova şi 8 pacienţi folosiţi ca lot martor din Clinica de Chirurgie Buco-Maxilo-Facială, Spitalul Universitar de Urgenţă, Craiova). Pentru identificarea florei anaerobe la pacienţii cu parodontopatii din diabet zaharat am folosit sistemul API 20A care ne dă posibiliatea identificării rapide, cu ajutorul a 21 teste biochimice. Diagnosticul de laborator al bacteriilor anaerobe constă din mai multe etape: 1. Recoltarea probelor 2. Izolarea bacteriilor 3. Identificarea examenul direct, izolarea in cultura pura necesară identificarii, identifiacarea bacteriilor anaerobe folosind trusa API 20A. Pentru utilizarea trusei API 20A trebuie efectuate şi alte teste, cum sunt morfologia culturală şi microscopica, rezultate obţinute folosind la confirmarea sau identificarea completă. II. REZULTATELE STUDIULUI MICROBIOLOGIC În urma cercetării celor 46 pacienţi (38 pacienţi diabetici si lotul martor având 8 pacienţi) am obţinut urmatoarele rezultate in funcţie de fiecare etapă a diagnosticului de laborator, am încadrat toate cele 38 de cazuri în trei forme clinice de bază: gingivită cronică (41% dintre pacienti), parodontită marginală cronică superficială (PMCS) 26% dintre pacienti şi parodontită marginală cronică profundă (PMCP) 33% pacienti. La o mare parte dintre bolnavi, boala diabetica duce in timp la aşa numitele complicaţii tardive. În timp ce unii diabetici nu ajung niciodată la astfel de complicaţii, alţii le dezvoltă devreme. În medie, 5

6 complicatiile tardive se manifestă la interval de de ani dupa apariţia hiperglicemiei manifeste. Unii pacienţi pot prezenta mai multe complicatii simultan. În studiul nostru cel mai mare procent de cazuri diabetice (57%) au fost cele de tip II. Bacterii identificate prin sistemul API 20 A Procentul pacienţior identificaţi din lotul patologic Streptocccus intermedius 26% ( 10 pacienţi ) Actinomyces istraelli 13% ( 5 pacienţi ) - bacil G+ Streptococcus constelatus 13% ( 5 pacienţi ) Gemella morbilorum 26% ( 10 pacienţi ) Prevotella melaninogenica 11% ( 4 pacienţi )- bacil G- Prevotella oralis 11% ( 4 pacienţi )- bacil G- În urma testării bacteriologice la întreg lotul de pacienţi luat în studiu, distribuţia cazurilor după bacteriile parodonto-patogene decelate la nivelul şantului gingival, a fost astfel: Asocierea diabetului zaharat şi a bolilor parodontale (cum ar fi gingivita si parodontoza), a primit cea mai mare atenţie în ultimii 20 de ani. În plus faţă de gingivita si parodontoza, Ship (2003) enumeră cariile dentare, disfuncţii salivare, boli ale mucoasei bucale, infecţii orale cum ar fi candidoza, tulburări ale gustului şi alte tulburări neurosenzoriale. [157] Pe de altă parte, studii prospective au arătat că PD la pacienţii cu diabet zaharat poate fi asociată cu un control metabolic mai prost al diabetului zaharat şi cu un număr de complicaţii cronice diabetice mai mare [178, 174]. A fost sugerat faptul că tratamentul adecvat al bolii parodontale la pacienţii cu diabet zaharat poate fi benefic în reducerea complicaţiilor diabetice [9, 107, 126]. Odată ce s-a recunoscut că boala parodontală este mai răspândită şi mai severă la persoanele cu diabet zaharat decât la persoanele fără diabet, cercetătorii au căutat mecanismele biologice specifice pentru a explica asocierea dintre cele două afecțiuni. Se consideră că diabetul favorizează apariția parodontopatiei printr-un răspuns inflamator exagerat la microflora parodontală. În general, microflora subgingivală la pacienţii cu parodontită care au diabet zaharat este echivalentă cu cea observată la pacienţii cu parodontită care nu au diabet [42, 90]. Noi considerăm că inflamaţia, indiferent de locul unde apare, este un răspuns local al gazdei la injuria tisulară, ca o reacţie la invazia materialului microbian, cât şi la stimuli chimici şi/sau fizici. Fără să se ţină cont de agentul agresor, inflamaţia este caracterizată, în forma ei acută, de semne clasice de roşeaţă, temperatură, transpiraţii şi durere. Aceste modificări tisulare vizibile şi la nivelul 6

7 parodonţiului, sunt rezultatul unor serii complexe de evenimente care pot fi detectate microscopic şi funcţional, şi includ: - vasodilataţie cu permeabilitate vasculară şi fux sangvin crescute; - exudat lichidian; - migrare leucocitară în spaţiile extravasculare. Răspândirea răspunsului inflamator într-o arie tisulară mai largă este propagată şi amplificată de un număr de mediatori chimici endogeni. Histamina, prostaglandinele (PG), leucotrienele şi citokinele se numără printre substanţele care mediază schimbările de flux sangvin, cresc aderenţa leucocitelor circulante la endoteliul vascular şi iniţiază migrarea leucocitelor în ţesuturi. La aceste elemente de risc în apariţia bolii parodontale se mai adaugă altele, dintre care placa bacteriană deţine un rol foarte mare. Studiile pe om şi animal arată că prima cauză în declanşarea parodontopatiilor o reprezintă placa bacteriană, care este aderentă de suprafaţa dinţilor şi care nu poate fi îndepărtată prin jet de apă sau simpla clătire. După localizare, există o placă supragingivală care aderă de suprafaţa dinţilor în imediata vecinătate a marginii gingivale libere şi placă subgingivală situată în şanţul gingival, până în zona joncţiunii gingivo-dentare. Nivelul ridicat al acceptării al acestei metode a identificat speciile de Streptococcus anginosus (83%), şi tot un nivel ridicat (76%) a fost realizat la identificarea Streptococcus constellatus şi Streptococcus intermedius. Senzitivitatea metodei realizată prin sistemul comercial comparand cu metoda genotipica a fost de 76 %, si de 57,5 % pentru Streptococcus intermedius. [96]. Bacterii identificate prin sistemul API 20 A Streptocccus intermedius Actinomyces istraelli Streptococcus constelatus Gemella morbilorum Prevotella melaninogenica Prevotella oralis Descriere Coci gram-pozitivi, facultativ anaerobi Bacil gram-pozitiv, anaerobi Coci gram-pozitivi, facultativ anaerobi Coci inruditi cu streptococcii Bacil gram-negativi, anaerobi Bacil gram-negativi, anaerobi 7

8 STUDIUL HISTOLOGIC AL PARODONTOPATIILOR LA PACIENȚII CU DIABET ZAHARAT I. INTRODUCERE Diabetul zaharat este una dintre cele mai răspândite boli cronice, netransmisibile și cea mai frecventă boală endocrină. Se caracterizează prin tulburări ale întregului metabolism, în special ale metabolismului glucidelor și prin complicații care afectează ochii, rinichii, nervii si vasele de sânge. Prin frecventa sa, diabetul zaharat intra în categoria așa-numitelor boli cronice ale civilizației. Pe cât de simplă pare astăzi determinarea nivelului glicemiei, pe atât de dificilă este totuși determinarea prevalentei diabetului zaharat la o anumită populație. Acest lucru se datorează în mare măsura faptului ca standardele de diagnosticare ale bolii nu sunt încă uniform aplicate. Se estimează că circa 2-6% din populația Europei Occidentale si a Americii de Nord suferă de această boală. Și mai alarmant este faptul că aproape o treime dintre acești oameni nu sunt conștienți de existenta bolii. Statisticile centralizate de Organizația Mondiala a Sănătății arătau că, în anul 2000, existau în Romania mai mult de un milion de diabetici și se estimează că până în 2030 numărul lor se va dubla. II. MATERIAL ŞI METODE Materialul histologic studiat în prezenta teză de doctorat a fost reprezentat de fragmente de parodonțiu recoltate de la un număr de 46 pacienți diagnosticaţi clinic şi paraclinic cu diabet zaharat și cu afecțiuni inflamatorii ale parodonțiului. Cu ocazia efectuării unor tratamente chirurgicale, am recoltat mici fragmente de parodonțiu, după informarea prealabilă a pacienților care au fost imediat supuse unor operații pregatitaore în vederea efectuării studiilor de microscopie. Astfel, materialul biologic recoltat a fost imediat pus în soluţie fixatoare de formol neutru 10% şi timp de 24 de ore și prelucrat în tehnica histologică clasică. B. Metodele de HISTOLOGIE utilizate Materialul biologic, respectiv fragmentele de parodonțiu, au fost prelucrate în continuare în tehnica histologică clasică pentru includerea la parafină, tehnică care ne-a permis efectuarea unor secţiuni seriate de 3-5µ grosime ce pot fi colorate şi studiate optim la microscopul optic. III. REZULTATELE STUDIULUI HISTOLOGIC Așa cum se cunoaște, periodonţiu de înveliş este o varietate a mucoasei orale fiind constituit dintr-un epiteliu pavimentos stratificat de tip malpighian fără keratinizare şi un corion papilar bogat în fibre de colagen, unite printr-o membrană bazală. La lotul de bolnavi investigat, s-au observat modificări histologice atât la nivelul epiteliului gingival cât și la nivelul corionului. Modificările histologice nu s-au corelat cu valorile glicemiei ci s- au corelat mai bine cu vechimea diabetului și cu starea de igienă a mucoasei orale. 8

9 Necroza epiteliului de acoperire a fost însoţită şi de distrugerea membranei bazale și a vaselor superficiale ceea ce a dus la apariția unor microhemoragii, astfel că ţesutul conjunctiv subiacent a venit în contact direct cu mediul oral. Necroza epiteliului de suprafață poate fi consecința exacerbării florei microbiene din cavitatea orală, deoarece este cunoscut faptul că la pacienții diabetici care răspund greu la tratament, excesul de glucoză permite dezvoltarea exagerată a florei microbiene. La nivelul corionului am semnalat modificări profunde, de amploare mult mai mare decât la nivelul epiteliului, prezente la toți pacienții cu diabet zaharat. Țesutul conjunctiv periodontal a fost sediul unui proces inflamator cronic, de intensitate variabilă de la un caz la altul şi chiar de la o zonă la alta la acelaşi caz. Considerăm că procesul inflamator parodontal a fost declanşat de pătrunderea florei microbiene din cavitatea orală la nivelul parodonţiului ca urmare a condiţiilor particulare create de excesul de glucoză sau de metaboliții rezultați din metabolizarea incompletă a acesteia. Dintre celulele aparţinând sistemului imunitar, cele mai numeroase au fost limfocite. Aceste celule au fost identificate după caracterele celulare. Sunt celule de formă sferică, lipsite de granulaţii specifice în citoplasmă. Nucleul este voluminos, ovalar, hipercrom şi nesegmentat, ocupând cea mai mare parte a celulei, intens bazofil, relativ omogen colorat (ca o pată de cerneală) datorită conţinutului mare de heterocromatină. În nucleu se poate observa uneori prezenţa unui nucleol. Citoplasma este intens bazofilă, redusă cantitativ, dispusă sub forma unui inel sau a unei semilune la periferia nucleului. Procesul inflamator cronic de la nivelul parodonţiului, deşi are rol de a restaura integritatea structurală şi funcţională locală, de a păstra homeostazia aparatului dentomaxilar, prin intensitatea sa şi prin unii mediatori ai inflamaţiei eliberaţi local, în special metaloproteinaze, poate deveni un proces agravant al leziunii parodontale. IV. DISCUŢII La persoanele cu diabet zaharat au fost raportate o serie de tipuri de leziuni ale mucoasei bucale, inclusiv lichen plan şi stomatita recurentă aftoasă. Nu toate rezultatele studiului au arătat această asociere deşi aceste tulburări sunt relativ frecvente și sunt adesea observate la pacienţii care nu au diabet. În contrast, candidoză orală a fost o constatare mai consistent la pacienţii cu diabet [65]. Candidoza orală este o manifestare a unui status imunocompromis şi a unei reduceri a fluxului salivar. De asemenea, răspunsul imun este deficitar la aceşti pacienţi [162], cu o creştere de interleukinele, cum ar fi IL-6 şi IL-1β, împreună cu factorul alfa de necroză tumorală (TNF) şi prostaglandină E2 (PGE2). Unii autori consideră că aceşti factori ar putea acţiona prin stimularea răspunsului inflamator parodontal. [150] Cert este că în timpul evoluţiei bolii parodontale, bacteriile invadează învelişul epitelial al gingiei şi apoi ţesutul conjunctiv. Această invazie a fost demonstrată în gingivitele acute ulceronecrotice, periodontitele juvenile localizate, periodontitele rapid progresive ale adultului şi la copii cu 9

10 sindrom Papillon-Lefevre asociat periodontopatiilor. Folosind criterii morfologice sau coloraţii cu anticorpi fluorescenţi, au fost identificaţi în aceste ţesuturi următoarele tipuri de germeni: spirochete, Actinobacilus actinomicetes, bacteroides gingivalis, Bacteroides intermedius, specii de Actinomices, Fusobacterii nucleate, şi Micoplasme. Studii recente de microscopie optică, microscopie electronică şi bacteriologie, au demonstrat că invazia şi prezenţa bacteriilor în cement şi în dentina radiculară a dinţilor cu boală periodontală. Bacteriile pot fi prezente în dentină şi chiar în pulpa dentară. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC AL PARODONTOPATIILOR LA PACIENȚII CU DIABET ZAHARAT I. INTRODUCERE În ultimii 30 de ani, tehnicile microscopice de imunohistochimie au adus date extrem de valoroase în diagnosticul pozitiv și diferențial al diverselor stări patologice, în special în domeniul oncologiei. Imunohistochimia (IHC) este utilizată pentru identificare celulelor, a organitelor infracelulare, a activității enzimatice a receptorilor celulari sau chiar a unor elemente biochimice, numite generic antigene celulare şi tisulare. Toate tehnicile de IHC se bazează pe interacţiunea specifică dintre un antigen și anticorpul complementar. Imunohistochimia reprezintă o posibilitate de a completa diagnosticul histopatologic, dar nu reprezintă un diagnostic în sine. În ultimii ani, în întreaga lume, tehnicile de imunohistochimie sunt larg utilizate în stabilirea unui diagnostic pozitiv şi diferenţial al unor leziuni, în stabilirea etiologiei sau histogenezei unor celule, în diagnosticul metastazelor cu origine primară necunoscută, în studii de embriologie, de medicină legală, etc. În vederea începerii secvenţelor de imunohistochimie, secţiunile au fost întâi deparafinate în trei băi succesive de xilen (câte 15 minute în fiecare) şi apoi rehidratate prin spălare în alcooluri de concentraţie descrescândă (100%, 70%, 50%, câte 15 minute fiecare). În final secţiunile au fost aduse în apă distilată pentru a înlătura de pe secţiunea histologică orice urmă de alcool. Tehnica de imunohistochimie propriu-zisă a cuprins un algoritm standard, cu unele variaţii în funcţie de anticorpii folosiţi. III. REZULTATE Studiul imunohistochimic al reacţiei imune în leziunile parodontale Mecanismele imuno-celulare implicate în patogenia parodontopatiei la pacienții cu diabet zaharat, constituie încă o provocare pentru numeroşi cercetători şi medici de medicină dentară deoarece reacția imunitară locală poate avea efect benefic în evoluția favorabilă a leziunii parodontale sau, dimpotrivă, poate amplifica distrugerile tisulare ducând la pierderea dintelui. La ora actuală este 10

11 bine cunoscut faptul că boala parodontală reprezintă o complicație destul de frecventă a diabetului zaharat, dar și parodontopatia este considerată ca un factor de risc pentru evoluția diabetului zaharat. Această relaţie bidirecţională între boala parodontala şi a diabetul zaharat, face diabetul să fie o afecțiune de importanţă majoră pentru medici stomatologi care au de tratat diverse leziuni ale cavității orale, cum sunt gingivita și parodontoza, cariile dentare, stomatita aftoasă, disfuncţii salivare, boli ale mucoasei bucale, infecţii orale (candidoza, lichenul plan), tulburări ale gustului şi tulburări neurosenzoriale. Pe preparatele noastre colorate cu coloraţii clasice am pus în evidenţă prezenţa unor celule rotunde mononucleare de tip limfocitar, plasmocitar şi macrofagic și foarte rar celule de tip granulocitar. Acest aspect microscopic confirmă faptul că în parodontopatiile asociate diabetului zaharat există un proces inflamator cronic, cu sau fără pusee de acutizare. Pentru diferenţierea celulelor din infiltratul inflamator al parodonțiului, am utilizat mai mulţi anticorpi specifici și anume: - CD3, pentru evidențierea limfocitelor T, - CD20, pentru punerea în evidență a limfocitelor B, - CD68, pentru studiul distribuției celulelor de tip macrofagic. Anticorpul CD3 utilizat pentru punerea în evidență a limfocitelor T reacţionează cu lanţul epsilon a antigenului CD3 de pe suprafaţa limfocitelor T. Studiul nostru ne-a permis să evidențiem în epiteliul gingival de acoperire prezența unor celule CD68 pozitive care pot fi celule dendritice sau mai exact celule Langerhans. Aceste celule aparțin tot sistemului celulelor monocito-macrofagic cu originea în maduva osoasă roșie, dar care au capacitatea de a străbate membrana bazală a epiteliilor de acoperire și de a se localiza printre celulele epiteliale. Aceste macrofage intraepiteliale au rolul de a capta antigenele de la suprafața epiteliului de acoperire, de al prelucra și de al prezenta celulelor sistemului imunitar, în principal limfocitelor T, pentru a induce un răspuns imun adecvat. Studiul imunohistochimic al modificărilor vasculare din parodonţiu s-a realizat utilizând anticorpul CD34, care marchează specific celulelor endoteliale dar și angioblastele Anticorpului anti-cd34 recunoaşte o proteină transmembranară cu masă moleculară de 110 kd, intens fosforilată. Această proteină se pare că ar putea juca un rol în adeziunea celulară, acţionând ca şi ligand pentru diferite clase de lectine. În acest mod, CD34 şi precursorii săi hematopoietici ar adera de celulele ce exprimă lectine la nivelul măduvei osoase. Antigenul este prezent în aproximativ 1% din celulele mononucleare din măduva osoasă, inclusiv precursorii hematopoietici/celula stem. În condiţii fiziologice, procesul de angiogeneză la individul adult este foarte redus, celulele endoteliale prezente în vasele normale aflându-se într-o stare neproliferativă, indicele mitotic fiind mai mic de 0,01%. Apariția unor agresiuni locale ce perturbă homeostazia vasculară și tisulară, este urmată de apariția unui proces inflamator și a procesului de regenerare vasculară. Regenerarea vasculară 11

12 reproduce etapele histologice ale organogenezei normale în condiţiile particulare, legate de natura, gradul şi localizarea ţesutului sau organului atins de procesul distructiv iniţial. Aşa cum se observă pe preparatele noastre, în primele faze, procesul de angiogeneză este exclusiv capilar. Noile vase sanguine rezultă din cele preexistente, prin transformarea celulelor endoteliale în angioblaste, celule capabile de mitoze rapide și de generarea de muguri vasculari. IV. DISCUŢII Așa cum se cunoaște de multă vreme, boli cronice parodontale sunt infecţii bacteriene care afectează parodonțiul, având ca rezultat apariția unui proces inflamator ce deteriorează progresiv mecanismele de susținere și fixare a dinților în alveole cu alterarea ireversibilă a suportului fiziologic al acestora. Ele sunt asociate frecvent cu leziuni inflamatorii locale, bacteriemie și un răspuns imunitar puternic. În studiul nostru, utilizând anticorpi specifici în cadrul studiului imunohistochimic, am constatăm că dintre toate celulele sistemului imunitar cele mai bine reprezentate au fost limfocitele T. Limfocitele T au fost prezente atât la nivelul epiteliului gingival cât și la nivelul corionului. Este cunoscut faptul că limfocitele T îndeplinesc funcții complexe, atât ca celule efectoare ale răspunsului imun mediat celular cât și ca celule reglatoare, prin intermediul unor factori umorali pe care-i secretă, numiți limfochine. Deși morfologic sunt identice, din punct de vedere biologic, limfocitele T sunt foarte diferite. Ele exprimă pe suprafața lor o multitudine de imunomarkeri. Cei mai cunoscuți sunt CD4 și CD8, molecule care aparțin suprafamiliei imunoglobulinelor și care caracterizează funcționalitatea celulară: celulele CD4 au de obicei funcție helper, iar cele ce exprima markerul CD8 sunt citotoxice. Limfocitele T realizează, în cadrul răspunsului imun, mai multe funcții: lizează celulele care exprima molecule non-self pe suprafața lor, reglează răspunsul imun, mediază reacțiile de hipersensibilitate întârziată, etc. Aceste funcții sunt rezultatul heterogenității funcționale si se datorează prezenței unor subpopulații distincte de limfocite T: - limfocite Tc (Tcl, citotoxice sau citolitice) care exprimă pe suprafața lor markerul T8 (CD8); - limfocite Th (helper) care au pe suprafața celulară markerul CD4; - limfocite Ts (supresoare), purtătoare ale markerului CD4; - limfocite TD sau TDH (delayed hypersensitivity) care exprima markerul CD8. Cele mai numeroase limfocite sunt de tip Th, apreciindu-se ca ar reprezenta circa 65% din limfocitele corpului uman. Funcțiile limfocitelor Th se realizează prin intermediul citokinelor secretate. In funcție de limfochinele pe care le sintetizează, limfocitele Th se clasifica in doua subseturi:th-1 si Th-2. Celulele Th-1 (Th-c) secretă IFN gama, IL-2 si TNF beta (citochine de tip 1, stimulatoare ale imunității mediate celular). Citochinele de tip 1 produc următoarele efecte: stimulează reacția de 12

13 citotoxicitate și inflamatorie asociata cu reacțiile de hipersensibilitate întârziată. În esență, limfocitele Th-1 au rol în edificarea unui răspuns imun mediat celular (RIMC). Celulele Th-2 (Th-b) secretă citochine de tip 2: IL-4, IL-5, IL-6 si IL-10 (dar nu secreta Il-2) și stimulează activitatea limfocitelor B de memorie. Citochinele tip 2 (IL-4, IL-5) stimulează răspunsul imun umoral fața de paraziții extracelulari (stimulează diferențierea limfocitelor B spre plasmocite) și instalarea stărilor alergice prin capacitatea lor de a induce sinteza IgE și de a stimula mastocitele. În ceea ce privește boala parodontală, numeroși autori au arătat că răspunsul imun împotriva agenţilor patogeni parodontali poate fi afectat sau împiedicat în diabet, fapt ce ar putea duce la înmulţirea exagerată a anumitor specii [131]. Citokinele inflamatorii cum ar fi IL-1, IL-6 şi TNF-α, toate mediatori importanţi ai inflamaţiei parodontale, joacă de asemenea un rol important în metabolismul glucidic şi lipidic. Concentraţiile plasmatice de IL-6 şi TNF-α pot fi crescute la indivizii obezi şi diabeticii tip 2. Trebuie notat faptul că IL-6 şi TNF-α acţionează ca adipokine ce servesc la promovarea catabolismului şi scăderii ponderale şi sunt de asemenea implicate în rezistenţa la insulină. A fost sugerat faptul că parodonţiul inflamat ar putea acţiona ca o sursă de tip endocrin de mediatori ai inflamaţiei cum ar fi TNF-α, IL-1 şi IL-6, care pot determina creşterea consecutivă a rezistenţei la insulină [143]. Determinarea în sânge a unor mediatori ai inflamaţiei, cum ar fi TNF-α şi IL-6 la persoanele diabetică au avut, de asemenea, concentraţii crescute atunci când s-au asociat cu parodontită cronică [34, 69, 46]. Deși unii autori au subliniat importanța polimorfonuclearelor neutrofile în evoluția parodontopatiilor, noi nu am găsit decât foarte rar și foarte puține polimorfonucleare neutrofile. Aceste aspecte ne fac să afirmăm că în parodontopatiile cronice, infiltrarea cu neutrofile este extrem de redusă. Totuși, unii autori [68] consideră că neutrofilul este primă linie de apărare împotriva agenţilor patogeni parodontali. Alți autori [106, 21] au observat la diabetici deficitele de funcţie şi recrutare a neutrofilelor. Bissada şi colaboratorii săi au arătat că neutrofilele din sângele pariferic au o activitate chemotactică redusă, la diabeticii tip 1 cu parodontită severă comparativ cu diabeticii cu parodontită moderată şi non-diabeticii cu parodontită severă. În ceea ce privește reacția celulelor sistemului monocito-macrofagic, la pacienții cu parodontopatie cronică și diabet zaharat, noi am constatat că per ansamblu, numărul acestui tip de celule a fost redus, comparativ cu al limfocitelor, iar dispunerea a fost total neomogenă. Noi considerăm că în procesele reparatorii locale, limitate, cum este parodontopatia cronică, angioblastele provin din celulele endoteliale ale vaselor sanguine normale, neafectate de procesul patologic, dar care sunt stimulate de numeroşi factori biochimici eliberaţi de diverse celule (limfocite, granulocite, macrofage) în focarul inflamator. Sub influenţa unor factori mitotici, celulele endoteliale din vase sanguine acumulează material nuclear şi citoplasmatic şi proliferează intens, generând cordoane de celule. 13

14 CONCLUZII Trusa API s-a dovedit a fi un sistem util si sensibil în depistarea bacteriilor anaerobe, deşi relativ greoaie. Pacienţii diabetici cu parodontopatii prezintă spre deosebire de lotul martor nondiabetic suprainfecţii cu bacterii anaerobe mai numeroase. Bacteriile anaerobe întâlnite in studiul nostru sunt din categoria diverse, dar mai rară întâlnite (Gemella) comparativ cu cele întâlnite in literatura de specialitate la pacientii nondiabetici. Modificările histologice înregistrate la nivelul epiteliului gingival la pacienții cu diabet zaharat și parodontopatii, au mers de la necroza totală a epiteliului de acoperire hiperplazie cu hiperkeratoză. Ţesutul conjunctiv periodontal a fost sediul unui proces inflamator cronic, format preponderent din limfocite, plasmocite şi macrofage, de intensitate variabilă de la un caz la altul şi chiar de la o zonă la alta. la acelaşi caz. Considerăm că procesul inflamator parodontal a fost declanşat de pătrunderea florei microbiene din cavitatea orală la nivelul parodonţiului ca urmare a condiţiilor particulare create de diabetul zaharat. Dintre celulele aparţinând sistemului imunitar, cele mai numeroase au fost limfocitele. Prezenţa limfocitelor în focarul inflamator parodontal se datorează faptului că sunt celule mobile prezentând mişcări de locomoţie foarte active. Ele au capacitatea de a recunoaşte structurile proteice proprii organismului de structurile proteice străine organismului, împotriva cărora limfocitele B secretă anticorpi (imunoglobuline), iar limfocitele T secretă limfokine. Procesul inflamator cronic al parodonţiului a indus şi modificările fibrilare, în special ale fibrelor de colagen care au apărut disociate, fragmentate, probabil prin acțiunea metaloproteinazele secretate de bacterii, dar şi de fibroblaste, macrofage şi granulocite. 14

15 Apariţia congestiei vasculare se datorează faptului că în corionul parodontal prezenţa antigenelor a stimulat producerea de către celulele sistemului imun a unor mediatori biochimici cu efect vasodilatator. Congestia vasculară este o componentă esenţială a procesului inflamator şi este răspunzătoare de eritemul şi edemul parodonţiului. Analiza imunohistochimică, cantitativă și calitativă a celulelor sistemului imun, prezente în infiltratul inflamator parodontal ne-a permis să constatăm că limfocitele T au fost cele mai bine reprezentate celule ale sistemului imun în parodontopatiile asociate cu diabetul zaharat. Ele au fost dispuse neomogen în structura conjunctivă a parodonțiului, cele mai multe limfocite T fiind identificate sub epiteliul de acoperire şi în jurul vaselor de sânge. Relativ frecvent s-au identificat limfocite T și în structura epiteliului de acoperire. Spre deosebire de celulele T, limfocitele B au fost relativ puţine în infiltratul inflamator al ţesutului conjunctiv din parodonțiu, fiind identificate perivascular sau la nivelul corionului papilar. Celule de tip macrofagic au fost mult mai rare, răspândite difuz în ţesutul conjunctiv al parodonțiului inflamat, ceea sugerează că intensitatea reacției inflamatorii din parodontopatii este variabilă de la un pacient la altul în funcţie de cantitatea de antigene prezente în parodonțiu, dar și de distrugerile tisulare care să atragă celulele de tip macrofagic. Frecvent au fost observate leziuni ale peretelui vascular, cu microhemoragii în țesutul conjunctiv al parodonțiului, ceea ce ne face să considerăm că la persoanele diabetice microorganismele din placa bacteriană au o agresivitate crescută putând determina direct sau prin factorii toxici eliberați, leziuni vasculare. O altă modificare vasculară observată la pacienții noștri a fost angiogeneza, caracterizată prin formare a unei noi vase pornind de la vascularizaţia preexistentă. Apreciem că apariția procesului de angiogeneză caracterizează potențialul regenerator al parodonțiului. Mecanismele care caracterizează angiogeneza sunt procese extrem de dinamice, modulate de interacţiunile intercelulare şi celule-matrice extracelulară, în prezenţa factorilor de creştere şi morfogeneză eliberați de celulele infiltratului inflamator. 15

16 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Aguirrebengoa K., Romana M., Lopez L., Martin J., Montejo M., Gonzalez De Zarate P. - Oral and cervicofacial actinomycosis, Aidan Ryan Æ Madeline Murphy Æ Catherine Godson ÆFionnuala B. Hickey, Diabetes mellitus and apoptosis: inflammatory cells Apoptosis (2009) 14: American Academy of Periodontology - Periodontal Disease Risks Anna Messoria, Francesca Bartoluccia, Marco Dinib, Alessandra Mataloni Paggib, Riccardo A Ricciutic, Franco Rychlickic, Ugo Salvolinia - Gemella morbillorum deep brain abscess successfully treated with combined stereotactic, medical, and imaging approach,volume 44,Issue 2, Pages (November 2002). 5. Ardeleanu Carmen, Comanescu Violeta, B. Zaharia - Imunohistochimie 1999; pg Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, Silver M, Kearne M, Magner M, Isner JM - Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res, 1999, 85(3): Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM - Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science, 1997, 275(5302): Avery J.K.- Oral development and histology, Toronto 1988; pg Avery J.K.- Orban s oral histology and embriology,st. Louis 1980; pg Avrămescu Carmen Silvia, Adriana Turculeanu, Maria Bălăşoiu, Carmen Luminiţa Slavu Îndrumar practic de microbiologie clinică, Editura Gutenberg Univers 2005; 62-81, Azizov RF, Agaeva NA, Suleimanova TG Bacteriological factor in the etiology of inflammatory parodontosis, 2009 sept; (174): Bissada NF, Manouchehr-Pour M, Haddow M, Spagnuolo PJ - Neutrophil functional activity in juvenile and adult onset diabetic patients with mild and severe periodontitis. J Periodontal Res 1982; 17: ; 16

17 13. Boboc Gheorghe - Aparatul dento-maxilar, Formare şi dezvoltare, Bucureşti 1979; Bogdan Florin Histologie. Curs UMF. Reprografia Universitatii din Craiova, 1989; Bogdan Florin, Mogoanta Laurentiu, Craitoiu Stefania, Radu Ioan, Bold Adriana, Fusaru Monica, Mirescu Nicolae, Sirbu Garofita Histologie volumul I Tesuturile Lucrari practice; Brian C O'Riordan - Oral Submucous Fibrosis.Journal of Oral Pathology & Medicine,February 1997, Volume 26,Issue 2,pages Brook, I, Lewis, MAO, Sandor, GKB, Jeffcoat, M. Samaranayake, LP, Rojas, VR Clindamycin in dentistry: more than just effective prophylaxis for endocarditis? Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontics 2005; 100: Buiuc Dumitru Microbiologie clinica, Ed. Didactica si Pedagogica, R.A. Bucuresti, 1998; pg Cerri PS, Goncalves Jde S,Sasso Cerri E Area of rests of Malassez in young and adult rat molars :evidences in the formation of large rests.anat Rec Hoboken Feb;292(2): Craitoiu Stefania Curs de histologie generala, 1999 ; Craitoiu Stefania, Craitoiu M.- Histologia cavitatii bucale. Editura Sitech, Craiova, 1995,pag Dumitriu Silvia, Horia Dumitriu Etiologia microbiana in parodontopatiile marginale cronice, Ed Cermaprint, Bucuresti, 2004, pag Graves DT, Cochran D - The contribution of interleukin-1 and tumor necrosis factor to periodontal tissue destruction. J Periodontol 2003;74: Graves DT, Liu R, Alikhani M, Al-Mashat H, Trackman PC - Diabetes-enhanced inflammation and apoptosis: impact on periodontal pathology. J Dent Res 2006;85(1): Greenwood D, Slack R, Peutherer J - Medical microbiology (16th edn), Chs Churchill Livingstone, Edinburgh, Grossi SG, Genco RJ Periodontal disease and diabetes mellitus: a two-way relationship. Grossi SG si Genco RJ Periodontal disease and diabetes mellitus: a two-way relationship.ann Periodontol Jul;3(1):

18 27. Guggenheimer J, Moore PA, Rossie K, et al. - Insulin-dependent diabetes mellitus and oral soft tissue pathologies, II: prevalence and characteristics of Candida and Candidal lesions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2000;89(5): Gurkan Ali, Gulmur Emingil,Serhat Cinarik si Afig Berdeli - Gingival crevicular fluid transforming growth factor-b in several forms of periodontal disease.arch Oral Biol Oct; Epub 2006 Jun 19,51(10): Harrison Principiile Medicinei Interne 14th edition, volumul 1, Editura Teora 2001; pg Hart TC, Shapira L, Van Dyke TE - Neutrophil defects as risk factors for periodontal diseases. J Periodontol 1994; 65: Kenneth Todar - Bacterial Pathogens and Diseases of Humans University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology. 32. Kesic L., Petrovic D., Obradovic R., Gasic J., Todorovic K Diabetes mellitus and periodontal disease.med Pregl.2009 Nov-Dec; 62(11-12): Khader YS, Dauod AS, El-Qaderi SS, Alkafajei A, Batayha WQ - Periodontal status of diabetics compared with nondiabetics: a meta-analysis. J Diabetes Complications 2006; 20: Kidd EAM, Fejerskov O - Dental Caries: The Disease and Its Clinical Management, Blackwell Munksgaard, Copenhagen, 2003; 35. Kinane DF Periodontitis modified my systemic factors. Kinane DF Periodontitis modified my systemic factors.ann Periodontal Dec; 4(1): Manolescu Mirela, Lucica Rosu Agenti parazitari si micotici implicati in patologia oro-faringiana, Editura Sitech, 2005; pg Manolescu Mirela, Lucica Rosu, Anca Ungureanu - Ghid practic de microbiologie, Editura Scorillo Craiova,1999;pg Socransky SS, Haffajee AD - The bacterial etiology of destructive periodontal disease: current concepts. J Periodontol 1992;63: Xiang XM, Liu KZ,Man A, Ghiabi E, Cholakis A,Scott DA Periodontitis - specific molecular signatures in gingival crevicular fluid. J. Periodontal Res Mar 9;45(3):