NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM

Transcription

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội

2 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM Mã số: Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội 2015

3 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, thầy luôn tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS. Nguyễn Văn Minh và Cn. Phùng Bảo Khánh và các anh chị em làm việc tại phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm. Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Y tế Thái Bình, Trƣởng khoa Y học cơ sở và các anh em trong bộ môn Y học cơ sở đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc đi học nâng cao trình độ của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin g i lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng chức năng của Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập, hoàn thành chƣơng trình học Cao học. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi hoàn thành khóa học. Hà Nội, tháng 12 năm 2015 HVCH: Bùi Thị Khánh

4

5 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN..... ii MỤC LỤC.... iii DANH MỤC C C K HI U VÀ CHỮ VIẾT TẮT...vi DANH MỤC C C BẢNG... viii DANH MỤC C C HÌNH...ix MỞ ĐẦU... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LI U CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI Cấu trúc của ty thể Chức năng của ty thể Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào Ty thể và quá trình lão hóa Ty thể và quá trình tự chết của tế bào Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể Hệ gen ty thể Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể Tính chất dị tế bào chất và tốc độ đột biến của ty thể ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ C C B NH LIÊN QUAN Các loại đột biến gen ty thể Đột biến điểm Đột biến cấu trúc mtdna Các bệnh do đột biến gen ty thể Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa trna Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rrna Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtdna HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) Các đột biến của hội chứng MERRF iii

6 Đột biến A8344G Đột biến T8356C Đột biến G8363A Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời bệnh Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism) Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time PCR Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học CHƢƠNG 2: NGUYÊN LI U VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU NGUYÊN LI U Mẫu bệnh phẩm Các hóa chất, nguyên liệu khác M Y MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU Tách chiết DNA tổng số Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) Điện di trên gel agarose Điện di trên gel polyacrylamide Kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid) CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN THU THẬP MẪU M U B NH NHÂN VÀ T CH CHIẾT DNA TỔNG SỐ iv

7 3.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích Tách chiết DNA tổng số của các mẫu SÀNG LỌC C C ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƢỜI VI T NAM BẰNG PHƢƠNG PH P PCR-RFLP Sàng lọc đột biến A8344G Nhân bản đoạn gen từ bằng PCR Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP Sàng lọc đột biến T8356C Nhân bản đoạn gen từ bằng PCR Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP Sàng lọc đột biến G8363A Nhân bản đoạn gen từ Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp real-time PCR để định lƣợng đột biến A8344G Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G Th nghiệm khả năng phát hiện và định lƣợng đột biến A8344G SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƢƠNG PH P GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP Kết quả giải trình tự vùng gen mang đột biến MERRF trên hệ gen ty thể KẾT LUẬN TÀI LI U THAM KHẢO PHỤ LỤC..79 v

8 DANH MỤC CÁC K HIỆU VÀ CH VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate ANT Adenine nucleotide translocase ADP Adenine diphosphat ATP Adenine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ huỳnh quang) CoQ Coenzyme Q CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên) Cyt c Cytochrome c Cyt b Cytochrome b D-loop Vòng chuyển vị dntp Deoxyribonucleoside triphosphate ddh 2 O Deionized distilled H 2 O (nƣớc cất loại ion, kh trùng) EtBr Ethidium bromide FAD + Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) FADH 2 Flavin adenine dinucleotide (dạng kh ) IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase KSS Kearns-Sayre syndrome (Hội chứng KSS) LB Luria Bertani LHON Leber s hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber) LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa) MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like Episodes (Hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch) MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres (Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều) MIDD Maternally inherited diabetes and deafness vi

9 (Bệnh tiểu đƣờng và câm điếc di truyền theo mẹ) MRI Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ) mtdna Mitochondrial DNA (DNA ty thể) ndna Nuclear DNA (DNA nhân) NAD + Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng kh ) NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos (Hội chứng gây liệt, mất sự điều hòa và viêm võng mạc OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEO Progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Sự đa hình các đoạn phân cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng) SDS Sodium dodecylsulphate TAE Tris -Acetate-EDTA TBE Tris -Borate-EDTA TEMED N, N, N, N - Tetramethyl-Ethylenediamine T m Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi) vii

10 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF. 29 Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến MERRF Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR Bảng 3.6: Tƣơng quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định bằng real-time PCR Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn viii

11 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc ty thể... 3 Hình 1.2. Cấu tạo màng ty thể... 4 Hình 1.3. Hệ gen ty thể Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman Hình 3.1. Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen của bệnh nhân 46 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen của bệnh nhân 49 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen của bệnh nhân 51 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mẫu dò...60 Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR Hình Sự tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết 60 Hình Th nghiệm định lƣợng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR Hình Kết quả blast của trình tự 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J ix

12 MỞ ĐẦU Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năng cung cấp năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Ty thể sản xuất năng lƣợng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trình chuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H 2 O, CO 2, và năng lƣợng dƣới dạng ATP. Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân. DNA ty thể ngƣời tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc bp, với 37 gen, mã hóa cho 2 RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. DNA ty thể dễ bị tổn thƣơng do ty thể là môi trƣờng giàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế s a chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hƣởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chức khác nhau. Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty thể ngƣời gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber s hereditary optic neuropathy - LHON). Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể ngƣời đã đƣợc xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khả năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau. MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hƣởng đến hệ thần kinh và cơ xƣơng cũng nhƣ các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của DNA ty thể. Ngoài ra, ngƣời mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh, mất điều hòa vận động, suy nhƣợc và mất trí nhớ. Triệu chứng thƣờng khởi phát ở trẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thƣờng, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé, thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát đƣợc các u mỡ khu trú dƣới da. Tế bào 1

13 cơ bất thƣờng và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm với Gomori trichrome và quan sát dƣới kính hiển vi. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứng MERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng nhƣ tính di truyền của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ chế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phƣơng pháp thăm khám lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thƣờng quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh nhân MERRF vẫn chƣa đƣợc phát hiện và không có phƣơng pháp điều trị hiệu quả. Ở Việt Nam, gần nhƣ chƣa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện và định lƣợng đột biến MERRF ở ngƣời Việt Nam. Nhằm góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và tƣ vấn di truyền đối với các bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam. 2

14 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI Cấu trúc của ty thể Ty thể là bào quan phổ biến đƣợc tìm thấy trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn. Chức năng chính của ty thể là cung cấp năng lƣợng hóa học cần thiết cho các hoạt động sinh tổng hợp và vận động của tế bào. Ty thể đƣợc lần đầu tiên tìm thấy trong tế bào cơ năm 1857 bởi nhà giải phẫu học ngƣời Thụy Sĩ, Kollier. Đến năm 1890, nhà mô học ngƣời Đức, Richard Altmann, bằng phƣơng pháp nhuộm fuchsine đã quan sát đƣợc ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dƣới kính hiển vi quang học [27]. Ty thể có đƣờng kính khoảng 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Hình dạng và số lƣợng ty thể tùy thuộc vào nhu cầu năng lƣợng của mỗi loại tế bào khác nhau, các tế bào mô cơ xƣơng hoặc thận cần một lƣợng ty thể lớn hơn các tế bào khác trong cơ thể. Ty thể có thể hình cầu, hình que hay hình sợi nhƣng đều có cấu trúc chung giống nhau. Ty thể có khả năng thay đổi hình dạng, kích thƣớc, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc nhỏ hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý bên trong tế bào [35]. Hình 1.1. Cấu trúc ty thể [68] 3

15 Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng trong và màng ngoài, bao lấy khối chất nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng đƣợc gọi là xoang gian màng. Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tƣơng tự nhƣ màng sinh chất, nhƣng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất lý hóa chuyên trách cho việc thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng [35]. Màng ngoài của ty thể có độ dày 6 nm, có tỷ lệ protein (P)/ lipid (L) lớn hơn hoặc bằng 1. Màng ngoài ty thể chứa tỷ lệ cholesterol thấp (bằng 1/6 so với màng tế bào hồng cầu), tỷ lệ phosphatidyl choline cao gấp hai lần so với màng tế bào. Màng ngoài có nhiệm vụ tiếp thu phần lớn protein sản xuất từ tế bào chất để xây dựng ty thể và kiến tạo màng. Đặc biệt, màng ngoài của ty thể có tính bán thấm rộng hơn với các ion và các phân t lớn cho phép các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngƣợc lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng nhƣ các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [35]. Hình 1.2. Cấu tạo màng ty thể [67] Màng trong của ty thể có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lƣợng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53. Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lƣợc. Cấu trúc mào làm tăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cƣờng vận chuyển điện t và tổng hợp ATP. Màng trong 4

16 chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na +, K +, Ca 2+ và H +. Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện t (phức hợp I-IV), ATP synthase (phức hợp V, còn gọi là F 1 F 0 -ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) [9]. Xoang gian màng (khoảng xen kẽ giữa hai màng) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng, môi trƣờng cũng tƣơng tự và cân bằng với bào tƣơng của tế bào. Xoang gian màng chứa nhiều ion H + từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện t, chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện t cơ động cho chuỗi hô hấp, giải phóng Cyt c vào bào tƣơng sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [32]. Chất nền (matrix) là một vùng vật chất không định hình chứa nhiều cấu trúc đặc biệt. Chất nền này là một phức hệ protein tan trong nƣớc, tƣơng đối đậm đặc và chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể. Nhƣ vậy, ở tế bào động vật, thực vật và ngƣời ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể. Ty thể có vật chất di truyền và bộ máy của riêng nó để tổng hợp nên các RNA cũng nhƣ protein của chúng. Các DNA ngoài nhiễm sắc thể này mã hóa một số các peptide của ty thể (ở ngƣời là 13 loại peptide). Các peptide này gắn vào lớp màng trong cùng với các protein khác đƣợc mã hóa trong nhân tế bào [32]. Ty thể nhân lên theo phƣơng thức rất giống với tế bào vi khuẩn. Khi chúng trở nên quá lớn, chúng bắt đầu chia đôi. Quá trình này xảy ra sau khi bộ DNA của ty thể đƣợc nhân đôi hoàn toàn, đƣợc thực hiện bằng sự tạo thành rãnh bên trong và sau đó màng ngoài thắt lại hình thành hai ty thể con. Đôi khi các ty thể mới đƣợc tổng hợp ở các trung tâm giàu protein và polyribosome cần thiết. Tuy nhiên, nhiều ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy). Cơ chế này giúp duy trì số lƣợng ty thể đặc trƣng trong một tế bào [9]. 5

17 Chức năng của ty thể Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lƣợng của tế bào. Quá trình hô hấp biến đổi hóa học và trao đổi chất tại ty thể đã giúp chúng chuyển đổi năng lƣợng hóa học tiềm tàng trong các hợp chất hữu cơ tạo ra CO 2, H 2 O và giải phóng năng lƣợng vào phân t cao năng ATP (adenosine triphosphate). ATP đƣợc tạo thành từ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa dựa trên các phức hệ hô hấp (gọi là chuỗi vận chuyển điện t ) nằm trên màng trong của ty thể. Quá trình oxy hóa của tế bào s dụng nguồn các đƣơng lƣợng kh NADH và FADH 2 nhƣ nguồn điện t chính trong chuỗi vận chuyển điện t. Các thành phần của chuỗi vận chuyển điện t nằm ở màng trong của ty thể bao gồm bốn phức hợp I, II, III và IV và một số chất mang điện t. Các điện t đƣợc vận chuyển dọc theo chuỗi, ba trong bốn phức hợp hoạt động nhƣ máy bơm proton, đẩy proton từ chất nền tạo thành dòng chuyển proton. Nhờ gradient proton và sự chênh lệch điện thế qua màng, mà ATP đƣợc tổng hợp từ ADP và Pi bởi phức hệ F 0 F 1 synthase, do đó cho phép các proton trở lại chất nền. Sự kết hợp vận chuyển điện t và tổng hợp ATP hoạt động theo cơ chế hóa thẩm. Có hai giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện t nằm ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme [23]. Nguồn tạo ra năng lƣợng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein đƣợc lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate. Các hợp chất carbohydrate, chủ yếu là glucose thông qua quá trình đƣờng phân (glycolysis) đƣợc phân cắt và biến đổi cuối cùng tạo thành pyruvate, chất kh NADH và một lƣợng ATP. Pyruvate đƣợc đƣa vào ty thể và bị oxy hóa, decarboxyl hóa để tạo thành acetyl- CoA (acetyl-coa có thể tạo ra từ quá trình oxy hóa acid béo) và tiếp tục đƣợc oxy hóa hoàn toàn qua chu trình Krebs để tạo thành CO 2, H 2 O và năng lƣợng chủ yếu đƣợc tích trữ dƣới dạng ATP. Trong chu trình Krebs, điện t và proton H + đƣợc tách ra và chuyển đến các phân t nhận điện t là NAD + và FAD + trong chuỗi vận 6

18 chuyển điện t để tạo thành NADH và FADH 2. Chuỗi vận chuyển điện t bao gồm bốn phức hợp: nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase (NADH- CoQ reductase/ phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II), ubiquinol cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV) và hai phân t vận chuyển điện t giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt c. Phức hệ I và II có vai trò xúc tác cho sự nhận điện t của CoQ từ NADH và succinate. Sau đó phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện t từ CoQ đến Cyt c. Cuối cùng phức hệ IV xúc tác cho sự vận chuyển điện t từ Cyt c tới chất nhận cuối cùng là oxy phân t. Ở mỗi giai đoạn, điện t đi qua các phức hệ, năng lƣợng đƣợc giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H + ) từ chất nền qua màng trong ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng. Do đó, hệ thống F 0 F 1 synthase hoạt động và tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ [35]. ATP là nguồn năng lƣợng lớn đƣợc s dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào. Vì vậy, khi ty thể bị tổn thƣơng, quá trình sản sinh ra năng lƣợng bị chậm lại, thậm chí là ngừng lại hoàn toàn. Pyruvate không đƣợc chuyển hóa tiếp, nên bị biến đổi thành lactate, vì vậy các bệnh nhân bị bệnh ty thể thƣờng có hàm lƣợng lactate trong máu và trong dịch não tủy cao. Do gần nhƣ tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp nên khi ty thể bị tổn thƣơng có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hƣởng đến nhiều loại tế bào cũng nhƣ mô và các cơ quan [35] Ty thể và quá trình lão hóa Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, là yếu tố nguy cơ lớn cho sự phát triển của ung thƣ, thoái hóa thần kinh và các bệnh tim mạch. Cơ chế phân t của sự lão hóa là vấn đề phức tạp, tuy nhiên quá trình oxy hóa và nitrat hóa protein trong tế bào đã đƣợc đề xuất là cơ sở cho việc suy giảm chức năng của tế bào và làm giảm khả năng chống chịu của cơ thể [60]. Các gốc tự do, chủ yếu là các dạng oxy phản ứng (ROS Reactive oxygen species) đƣợc xem là những phân t tín hiệu của nhiều hoạt động sinh lý. Những 7

19 năm 1990, hydrogen peroxide đƣợc làm sáng tỏ là có liên quan đến cytokine, insulin, yếu tố tăng trƣởng, AP-1 và tín hiệu NF-кB [48]. Sau đó, nhiều báo cáo chỉ ra rằng H 2 O 2 có thể thúc đẩy sự bất hoạt phosphatase bằng sự oxy hóa cysteine làm ảnh hƣởng đến con đƣờng truyền tín hiệu [58]. Hệ quả của các phản ứng hô hấp trong ty thể là các điện t chƣa ghép cặp, sự tƣơng tác của các điện t này với oxy tạo thành các gốc superoxide rất hoạt động, các gốc tự do có hoạt tính cao. Có tám điểm trong ty thể có khả năng sản xuất O 2-, superoxide đƣợc chuyển hóa thành hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) bởi superoxide dismutase (SODs) khi có sự tham gia của một điện t và 2 proton H + [48]. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ROS có thể gây ra những thay đổi trong quá trình dịch mã protein. Cụ thể, H 2 O 2 có thể oxy hóa nhóm thiol (-SH) trong cysteine để tạo thành axit sulphenic (-SOH), tiếp theo phản ứng với GSH sinh ra glutathionylate (-SSG) mang liên kết disulfide (-S-S-) hoặc amide sulfenyl (-SN). Mỗi sự thay đổi này có thể ảnh hƣởng đến hoạt động của một protein nhất định. Phosphorylase bị tác động khá nặng bởi ROS, làm ức chế hoạt động tách gốc phosphate [48]. Hơn nữa, các gốc tự do khác nhƣ các gốc hydroxyl (OH - ) và hydrogen peoxyde (H 2 O 2 ) cũng có thể tồn tại ở nồng độ tƣơng đối cao, gây nên nguy cơ oxy hóa lipid làm tổn thƣơng màng tế bào và ảnh hƣởng đến cấu trúc DNA. Đáng chú ý rằng sự tác động của các gốc tự do này tới DNA ty thể sẽ lớn hơn DNA trong nhân do DNA ty thể không liên kết với Histone và không có cơ chế tự s a chữa. Khả năng tạo năng lƣợng ATP của ty thể giảm và tăng quá trình oxy hoá làm hƣ hại cấu trúc tế bào. Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát, tế bào không tăng trƣởng, không đƣợc s a chữa và chết. ROS phá hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp protein, lipid, đƣờng, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho collagen, elastin mất tính đàn hồi khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [22]. ROS đƣợc cho là tác nhân chính gây ra những tổn thƣơng sinh lý của tế bào. Sự tích lũy ROS và các tác nhân oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm 8

20 các bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đƣờng, ung thƣ và lão hóa sớm. ROS và các gốc tự do gây ra các đột biến gen, tăng sự hình thành và tích lũy các đột biến DNA ty thể ở các mô trong quá trình lão hóa [48]. Theo thuyết ty thể về lão hoá, việc tích luỹ những tổn thƣơng ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtdna, protein, lipid làm ảnh hƣởng đến chức năng của ty thể. Nói chung, những tổn thƣơng của mtdna trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn đến ty thể bị rối loạn, thậm chí ngừng hoạt động là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị lão hoá [21] Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào Chết theo chƣơng trình (apoptosis) là một quá trình quan trọng giúp các sinh vật đa bào duy trì sự toàn vẹn và chức năng của mô và để loại bỏ những hƣ hại hoặc các tế bào không mong muốn. Ty thể đóng vai trò cốt lõi trong việc điều tiết sự chết của tế bào bằng cách cung cấp nhiều yếu tố quan trọng bao gồm cả sự hoạt hóa caspase và phân mảnh nhiễm sắc thể. Ty thể có vai trò quan trọng trong cơ chế tích tụ Ca 2+ và rối loạn quá trình oxy hóa, sự tích lũy lƣợng Ca 2+ đủ lớn trong ty thể dẫn đến sự chết tế bào theo chƣơng trình. Nồng độ và khả năng hoạt động của Ca 2+ trong ty thể đƣợc điều khiển bởi họ protein Bcl-2, yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [34]. Tín hiệu gây chết nội bào phụ thuộc vào sự phóng thích Cyt c. Tác động của Cyt c là liên kết với thụ thể protein hoạt hóa procaspase (Apaf-1), tổ hợp lại với nhau tạo thành heptamer gọi là apoptosome. Apaf-1 trong apoptosome hoạt hóa procaspase mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn sự chết tế bào. Bcl-2 điều hòa con đƣờng apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sự phóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bào chất. Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kích thích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngƣợc lại, ức chế sự giải phóng Cyt c từ đó kìm hãm sự chết của tế bào [32, 60]. Nồng độ Ca 2+ trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào. Sự kích hoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca 2+ trong ty thể phải đủ 9

21 lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c và hoạt hóa caspase. Mặt khác, khi một lƣợng lớn Ca 2+ tích tụ trong ty thể, sẽ tƣơng tác với cyclophilin D để kích thích mở lỗ bán thấm trên màng trong của ty thể làm chất nền bị trƣơng lên làm vỡ màng ty thể và phát tán Cyt c. Hơn nữa, Ca 2+ còn kích thích sự tổng hợp các gốc tự do có hoạt tính cao (ROS). Sự dƣ thừa ROS trong ty thể hoạt động nhƣ chất trung gian của các con đƣờng truyền tín hiệu chết theo chƣơng trình [34]. Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tố gây độc cho gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chƣơng trình Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể Hệ gen ty thể Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. DNA ty thể ngƣời tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc bp, gồm 37 gen mã hóa cho 2 phân t ARN ribosome, 22 phân t ARN vận chuyển và 13 phân t protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. Hình Hệ gen ty thể [11] 10

22 ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hợp (NADH-ubiquinone oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ đƣợc mã hóa bởi mtdna (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 mã hóa cho 3 tiểu đơn vị của phức hợp V (ATP synthase). Các phân t protein còn lại của chuỗi hô hấp đƣợc mã hóa bởi gen nhân, đƣợc dịch mã trong tế bào chất, sau đó đƣợc vận chuyển vào bên trong ty thể [59]. Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không mã hóa xen kẽ với vùng mã hóa. D-loop nằm giữa gen trna Phe (gen MT-TK) và trna Pro (gen MT-TP) là vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản. Hai gen mã hóa cho rrna (12S và 16S rrna) và 22 gen mã hóa cho 22 trna đƣợc nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho sự tổng hợp protein bên trong ty thể [11]. Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng trong ty thể nhƣng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân mã hóa. Quá trình phiên mã và dịch mã của DNA ty thể lại đƣợc điều khiển bởi gen nhân. Hệ gen ty thể đƣợc phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên mã sau đó đƣợc endonuclease phân cắt để hình thành nên phân t rrna 12S và 16S, trna và mrna tiền thân. Phân t mrna hoàn thiện của ty thể không đƣợc gắn mũ nhƣng có đuôi polya. Mô hình phiên mã trên có nhiều điểm giống với một operon của vi khuẩn [11, 59]. Các tế bào ngƣời có thể chứa tới hàng ngàn bản sao mtdna trong một tế bào và có số lƣợng dao động tùy thuộc vào nhu cầu s dụng năng lƣợng của từng loại tế bào. Số bản sao mtdna giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng nhƣng dƣờng nhƣ tăng đột ngột trong quá trình tạo trứng. Số lƣợng bản sao mtdna thay đổi rất lớn ở các mô khác nhau và đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt trong thời kỳ đầu của quá trình phát triển của động vật. Số bản sao mtdna tăng khi quá trình trao đổi chất tăng [46]. 11

23 Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể Sự di truyền của các gen trên mtdna là sự di truyền qua tế bào chất. Giống nhƣ các DNA ngoài nhân, DNA ty thể đƣợc di truyền theo dòng mẹ, ngƣời mẹ truyền gen ty thể cho các con, nhƣng chỉ con gái của bà mới có thể truyền các kiểu gen này cho thế hệ tiếp theo. Cơ chế di truyền này đƣợc lý giải bởi tế bào trứng của ngƣời phụ nữ trung bình chứa khoảng phân t DNA ty thể, trong đó một tinh trùng khỏe mạnh chỉ chứa trung bình phân t, mặt khác sự suy thoái của mtdna trong đƣờng sinh dục nam và sự phá hủy mtdna của tinh trùng khi vào tế bào trứng là rất rõ ràng nên mtdna trong tế bào hợp t thƣờng chỉ đƣợc thừa hƣởng từ trứng [29, 61]. Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhƣng hệ gen ty thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những kiểu di truyền riêng đặc trƣng cho chúng. Đột biến mtdna đƣợc truyền từ mẹ sang con nhƣng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rất khác nhau [29, 46]. Một đặc điểm khác biệt nổi bật về tính di truyền gen ty thể là tần số xuất hiện của gen đột biến giữa mẹ và con cái. Ví dụ, một ngƣời mẹ khỏe mạnh mang đột biến mtdna có thể sinh ra hai ngƣời con với tần suất mang gen đột biến hoàn toàn khác nhau, một ngƣời con khỏe mạnh và một ngƣời con có biểu hiện bệnh trầm trọng ngay từ khi còn nhỏ. Kiểu di truyền này đƣợc gọi là nút cổ chai, theo đó tần suất mang mtdna đột biến của các thế hệ con cháu khác nhau đáng kể và cũng khác với mẹ [14, 46, 50] Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể Mỗi tế bào có thể chứa hàng ngàn bản sao DNA. Vì vậy, khi xuất hiện đột biến thì trong cùng một mô có thể có cả mtdna bình thƣờng và mtdna đột biến, hiện 12

24 tƣợng này đƣợc gọi là tính không đồng nhất (Heteroplasmy). Nếu các bản sao của mtdna đều giống nhau thì đƣợc gọi là đồng nhất giữa các bản sao ty thể (Homoplasmy). Số bản sao mtdna đột biến so với tổng lƣợng mtdna của tế bào sẽ xác định mức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Đa số các đột biến mtdna gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy. Những hiểu biết về mức độ dị plasmid của ngƣời mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiên lƣợng đƣợc tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể [14]. mtdna có tốc độ đột biến cao gấp lần so với DNA trong nhân, do hệ gen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone nhƣ hệ gen nhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do [54]. Ngoài ra, ty thể không có cơ chế s a chữa DNA hiệu quả nhƣ với DNA trong nhân. Hiện nay, đã có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Các đột biến gen ty thể này thƣờng gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN Các loại đột biến gen ty thể Bộ gen ty thể có tỷ lệ đột biến rất cao, cao hơn từ 10 đến 20 lần so với đột biến DNA trong nhân. Hầu hết những thay đổi trên DNA ty thể là đa hình và có vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự di cƣ của con ngƣời. Những đột biến mtdna gây bệnh đầu tiên đã đƣợc xác định vào năm Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtdna gây bệnh đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là đột biến điểm và đột biến cấu trúc. Các đột biến mtdna có tính không đồng nhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ của bệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn. Ƣớc tính ở phía Đông Bắc nƣớc Anh có tỷ lệ 1/ ngƣời đã có biểu hiện lâm sàng bệnh ty thể và 1/6000 ngƣời có nguy cơ mắc bệnh. Nghiên cứu tỷ lệ sinh gần đây đã báo cáo tần số đột biến là 13

25 0,14% đối với đột biến A3243G và 0,2% đối với đột biến A1555G liên quan đến MT-RNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những hiểu biết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56] Đột biến điểm Đột biến điểm là đột biến thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide xảy ra trong cấu trúc của gen tại một điểm trên phân t DNA. Hơn 250 đột biến điểm gây bệnh đã đƣợc xác định trên gen ty thể qua các bệnh nhân với hàng loạt các rối loạn khác nhau ( thƣờng di truyền từ mẹ sang con và liên quan đến nhiều hệ thống cơ quan. Đột biến điểm trên mtdna có thể xảy ra trên gen mã hóa trna, rrna hay protein, tuy nhiên hơn một n a trong số các đột biến điểm đƣợc báo cáo liên quan đến gen trna của ty thể [31]. trna ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với trna trong tế bào chất (mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạng hình L của trna, ảnh hƣởng đến cấu trúc bậc ba của chúng. Một số đột biến trên trna ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS. Tùy thuộc vào điểm đột biến trên gen trna ty thể sẽ ảnh hƣởng đến các kênh vận chuyển điện t khác nhau trong chuỗi hô hấp tế bào. Các nguyên nhân gây ra khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp các trna ty thể là rất nhiều bao gồm: kết thúc phiên mã, biến đổi trna trƣởng thành, thay đổi bộ ba đối mã, ảnh hƣởng đến cấu trúc và chức năng của trna do đó giảm khả năng gắn acid amin, giảm liên kết với các yếu tố dịch mã mteft hoặc các ribosome ty thể. Đột biến điểm ở gen mã hóa protein ty thể đặc biệt ảnh hƣởng đến các chức năng của phức hợp chuỗi hô hấp tế bào mà nó đảm nhiệm [56]. Đột biến điểm trên mtdna chủ yếu ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), tỷ lệ đột biến giữa các mô trong cùng một cá thể cũng rất khác nhau. Một số đột biến gen ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) đang đƣợc nghiên cứu nhiều hơn, đột biến này thƣờng ảnh hƣởng đến các mô xác định và có biểu hiện lâm sàng đặc 14

26 trƣng. Tuy nhiên, đột biến điểm gen ty thể rất đa hình nên việc xác định tỷ lệ đột biến gen gây bệnh ty thể là vấn đề cần đƣợc nghiên cứu nhiều hơn nữa [31] Đột biến cấu trúc mtdna Đột biến cấu trúc gen ty thể bao gồm mất đoạn, lặp đoạn và một số sự sắp xếp cấu trúc phức tạp khác đã nghiên cứu đƣợc trong các tình trạng bệnh lý. Phần lớn đột biến cấu trúc mtdna đƣợc phát hiện liên quan đến mất đoạn, thay đổi kích thƣớc khoảng 1,3-8 kb hay một vài gen. Đột biến mất đoạn mtdna thƣờng xảy ra ở giai đoạn sớm trong quá trình phát triển của hợp t dẫn đến tần số xuất hiện và biểu hiện bệnh ở các mô là tƣơng tự nhau. Kích thƣớc đoạn mtdna bị mất có thể do đột biến gen nhân quy định việc duy trì, sao chép và trao đổi nucleotide trong mtdna (ví dụ, POLG và PEO1 mã hóa Twinkle) [56]. Ở cấp độ phân t, khoảng 60% đột biến mất đoạn mtdna xảy ra trong khu vực mtdna mà hai bên là trình tự lặp ngắn, kiểu mất đoạn này đƣợc gọi là đột biến mất đoạn type I. Khoảng 30% đột biến mất đoạn mtdna xảy ra tại những vùng có trình tự lặp không tuyệt đối, đƣợc gọi là mất đoạn type II. Còn lại khoảng 10% đột biến mất đoạn xảy ra ở vùng không có trình tự lặp. Mất đoạn mtdna phổ biến nhất, gặp ở khoảng 1/3 số bệnh nhân, là đột biến mất đoạn 5 kb ( ) đƣợc giới hạn bởi trình tự lặp 13 bp (type I) [24]. Mặc dù có nguồn gốc khác nhau, hầu hết đột biến mất đoạn mtdna đều có đặc điểm chung, chủ yếu xảy ra từ quá trình phiên mã. Cơ chế xảy ra đột biến cũng giống nhau, Krishnan và cộng sự [24] đã đề xuất rằng mất đoạn mtdna phát sinh trong quá trình s a chữa các sai hỏng trong phân t mtdna tái bản. Số lƣợng nucleotide bị mất và tần suất xuất hiện của đột biến trong các mô là cơ sở quan trọng cho việc xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh, nhƣng có thể không tỷ lệ thuận với nhau Các bệnh do đột biến gen ty thể Ty thể là bào quan sản xuất năng lƣợng quan trọng trong các tế bào nhân chuẩn. Bệnh ty thể là bệnh lý trong đó khả năng sản xuất năng lƣợng và đảm 15

27 nhiệm vai trò bình thƣờng trong tế bào của ty thể bị tổn hại. Nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến mtdna là một trong các nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở ngƣời, ngoài ra một số đột biến gen nhân cũng có thể làm mất chức năng của ty thể gây nên bệnh ty thể [56]. Bệnh ty thể có ảnh hƣởng đến nhiều cơ quan với tập hợp các triệu chứng liên quan đến cơ, hệ thần kinh và các cơ quan thiết yếu cho sự sống cần năng lƣợng cao. Biểu hiện lâm sàng của bệnh ty thể rất đa dạng, có những triệu chứng đan xen vào nhau, thƣờng đƣợc xác định bởi tình trạng thiếu năng lƣợng tế bào do khiếm khuyết quá trình phosphoryl hóa oxy hóa. Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu hiện của bệnh ty thể chịu sự chi phối của một số yếu tố bao gồm hiệu ứng ngƣỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lƣợng bản sao DNA đƣợc nhân lên trong ty thể, và sự di truyền nút cổ chai. Nhiều đột biến gen gây bệnh ty thể ở trạng thái không đồng nhất, trong trƣờng hợp này thì tỷ lệ gen đột biến có liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh. Tỷ lệ gen đột biến nhỏ nhất cần thiết có thể gây nên những biến đổi sinh hóa và chức năng của tế bào dẫn đến biểu hiện lâm sàng của bệnh đƣợc gọi là ngƣỡng biểu hiện của đột biến. Giá trị ngƣỡng này khác nhau đối với từng loại đột biến và giữa các mô, cơ quan trong cơ thể; sự hô hấp của tế bào theo con đƣờng hiếu khí sẽ bị ảnh hƣởng sớm hơn so với con đƣờng kị khí. Thông thƣờng các giá trị ngƣỡng trong khoảng 60-90% gen đột biến mtdna [14]. Trong quá trình phân bào, ty thể đƣợc tách ngẫu nhiên và trong tế bào con sẽ không có sự đồng nhất về tỷ lệ đột biến mtdna, sự thay đổi này đôi khi thấp hơn hoặc cao hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh. Mặt khác, mỗi ty thể của tế bào có hàng ngàn bản sao DNA dẫn đến sự thay đổi tỷ lệ mtdna đột biến trong tế bào và mô. Cơ chế di truyền nút cổ chai cũng quyết định sự biểu hiện bệnh ty thể ở các con sinh ra từ trứng của ngƣời mẹ mang đột biến gen ty thể ở dạng không đồng nhất, bởi sự di truyền ngẫu nhiên lƣợng mtdna đột biến vào tế bào trứng của mẹ tạo nên tỷ lệ không đồng nhất ở tế bào hợp t cao hơn hay thấp hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh [46]. 16

28 Từ việc xác định đƣợc các đột biến mtdna đầu tiên vào năm 1988, sau đó đã có nhiều nghiên cứu quan trọng đi sâu tìm hiểu những rối loạn di truyền mtdna dẫn đến tình trạng bệnh lý. Hiện nay, đã có hơn 250 đột biến mtdna gây bệnh đƣợc xác định. Ngoài ra còn có nhiều báo cáo về các đột biến gen nhân làm thay đổi protein trong chuỗi hô hấp của ty thể gây nên bệnh ty thể. Những nghiên cứu này làm sáng tỏ cơ chế phân t của bệnh ty thể, đặc biệt tập trung vào các khuyết tật di truyền mtdna, hệ quả chức năng đặc trƣng của đột biến mtdna nhằm mang lại sự tiến bộ về phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ty thể Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa trna Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes) là hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch, đƣợc di truyền từ mẹ sang con. Bệnh có ảnh hƣởng đến nhiều hệ thống của cơ thể, đặc biệt là não bộ, hệ thần kinh và cơ bắp. Các dấu hiệu và triệu chứng của rối loạn này thƣờng xuất hiện ở trẻ em sau một thời gian phát triển bình thƣờng, có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi. Triệu chứng của bệnh bao gồm yếu cơ, đau cơ, đau đầu, nôn, và co giật, một số cá nhân có thể bị đột quỵ trƣớc tuổi 40. Bệnh tiến triển có thể là liệt n a ngƣời, bất thƣờng về thị giác, co giật và nhức đầu nghiêm trọng, những lần đột quỵ lặp lại làm tổn thƣơng não dẫn đến mất thị lực, mất chức năng trí tuệ [6, 56]. Hầu hết bệnh nhân MELAS đều bị tích tụ acid lactic trong cơ thể dẫn đến nhiễm toan làm nôn m a, đau bụng, rất mệt mỏi, yếu cơ và khó thở. Một số trƣờng hợp MELAS co thắt cơ không tự chủ, giảm thính lực, bệnh tim và thận, tiểu đƣờng, mất cân bằng nội tiết tố [40]. Nguyên nhân là do một trong các loại đột biến A3243G, A3251G, T3271C, T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho trna Leu ; đột biến G13513A, A12770G và A13514G trên gen MT-ND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I, G583A trên gen MT-TF mã hóa cho trna Phe, G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho trna Val, A5814G trên gen MT-TC 17

29 mã hóa cho trna Cys. Trong đó, đột biến A3243G chiếm 80% số ca mang hội chứng MELAS, tiếp theo là đột biến T3271C xảy ra khoảng 7,5% [16]. MELAS có thể gây ra bởi các đột biến điểm mtdna ở các gen khác nhƣ COXIII, ND1, ND5 hoặc gen mã hóa trna Phe, trna Val, trna Cys, rrna hoặc mất đoạn với kích thƣớc ngắn. Tuy nhiên, đột biến trên trna Leu vẫn là đột biến phổ biến nhất liên quan đến kiểu hình MELAS. Trong số đó, đột biến A3243G đƣợc báo cáo đầu tiên trên gen mã hóa cho trna Leu và là đột biến phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc [1]. Nhƣ vậy, đột biến A3243G là một chỉ tiêu quan trọng để chẩn đoán hội chứng MELAS ngoài các kiểm tra lâm sàng. Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội chứng liệt cơ mắt ngoài tiến triển do rối loạn chức năng ty thể, thƣờng gặp ở ngƣời lớn. Triệu chứng điển hình của bệnh là liệt cơ mắt, sa mí mắt, rối loạn tâm thần và đột t. CPEO là một bệnh tiến triển chậm, có thể bắt đầu ở mọi lứa tuổi và tiến triển trong khoảng thời gian 5 đến 15 năm. Các triệu chứng đầu tiên xuất hiện thƣờng là mí mắt sụp xuống làm giảm giới hạn vận động của mắt, hạn chế tầm nhìn của mắt, và tổn thƣơng giác mạc. Bệnh nhân thƣờng s dụng cơ trán để giúp nâng mí mắt nên có thể xảy ra teo các nhóm cơ trên mặt, khó khăn trong việc nhai, một số bệnh nhân đục thủy tinh thể, suy giảm thính giác, đau thần kinh sợi trục, mất điều hòa co cơ, Parkinson [56]. CPEO là tình trạng bệnh gây nên bởi những khuyết tật trong ty thể làm ảnh hƣởng đến quá trình phosphoryl oxy hóa trên chuỗi hô hấp tế bào. Trong một số trƣờng hợp, đột biến ở gen MT-TL1 trên mtdna gây nên CPEO. Nguyên nhân của bệnh là do đột biến A3243G nằm trên gen mã hóa trna Leu(UUR) và đột biến T4274C nằm trên gen mã hóa trna Ile. Mất đoạn mtdna là nguyên nhân quan trọng gây nên hội chứng CPEO, những mất đoạn có kích thƣớc 3,4 đến 6,9 kb với mức độ không đồng nhất dao động trong khoảng 18,8 đến 85,5% cho thấy các biểu hiện lâm sàng khác nhau. Một nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể ở 18

30 Malaysia cho thấy rằng độ dài, vị trí mất đoạn và mức độ không đồng nhất đóng vai trò quan trọng trong việc xác định kiểu hình lâm sàng của bệnh nhân CPEO, hai bệnh nhân nặng đƣợc tìm thấy mất đoạn mtdna có kích thƣớc 4320 bp và 4717 bp. Bệnh nhân CPEO có thể mang đột biến điểm, bao gồm các đột biến trên trna Leu, trna Ile và trna Asp. Mặt khác, các đột biến gen POLG, SLC25A4 và C10orf2 trên DNA nhân cũng là nguyên nhân gây bệnh, những gen này rất quan trọng để bảo vệ mtdna. Mặc dù cơ chế chƣa rõ ràng, nhƣng đột biến bất kỳ trong 3 gen này đều dẫn đến mất đoạn lớn trên mtdna, dao động từ 2-10 kb [17] Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein Hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)/NARP (neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos) Hội chứng Leigh và NARP (yếu cơ do thần kinh, mất điều hòa và viêm sắc tố võng mạc) là một phần của chuỗi các rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển gây ra bởi sự bất thƣờng của chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể [53]. Hội chứng Leigh đặc trƣng bởi tình trạng thoái hóa thần kinh tiến triển, trong đó đặc biệt ảnh hƣởng đến não, não trung gian và hạch thần kinh, thƣờng dẫn đến t vong do suy hô hấp. Các dấu hiệu đầu tiên ở trẻ mắc hội chứng Leigh là nôn m a, tiêu chảy, khó nuốt dẫn đến ăn uống kém, không phát triển, giảm trƣơng lực cơ, co cơ không kiểm soát, mất cảm giác và yếu ở các chi, triệu chứng phổ biến là c động khó khăn. Một số cá nhân liệt cơ mắt, teo dây thần kinh thị giác, phì đại cơ tim. Ngoài ra, khó thở thƣờng gặp ở những ngƣời mắc hội chứng Leigh dẫn đến suy hô hấp, hoặc sự tích tụ lactate trong cơ thể đo đƣợc ở máu, dịch não tủy và nƣớc tiểu [56]. NARP đƣợc đặc trƣng bởi yếu cơ do thần kinh gây mất cảm giác thần kinh, mất điều hòa và bệnh võng mạc sắc tố. Triệu chứng khởi phát là mất điều hòa vận động và trí tuệ chậm phát triển, thƣờng xuất hiện ở trẻ em. Một số bệnh nhân NARP 19

31 có thể tƣơng đối ổn định trong nhiều năm, nhƣng có thể bị xuống cấp từng đợt, thƣờng có biểu hiện rõ ràng khi kết hợp với các bệnh do virus [66]. Hầu hết các đột biến gen ty thể gây ra hội chứng Leigh đƣợc báo cáo là trên các gen MT-ATP6, MT-ND3 và MT-ND5, một vài đột biến đƣợc xác định trên các gen MT-ND2, MT-ND6 và MT-ND4. Ngoài ra, còn có trƣờng hợp trên gen liên quan đến quá trình tổng hợp protein, đó là gen MT-TV mã hóa cho trna Val, gen MT-TL1 mã hóa cho trna Leu, gen MT-TW mã hóa cho trna Trp và gen MT-TK mã hóa cho trna Lys. MT-ATP6 là gen duy nhất bị đột biến gây NARP [66]. Trong các trƣờng hợp của hội chứng Leigh, đa số các đột biến nằm trên gen MT-ATP6, đặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C. Sự biến đổi T thành G tại 8993 trong mtdna ngƣời là một trong các đột biến ty thể kèm theo hội chứng Leigh đƣợc mô tả nhiều nhất. Đột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí 156 trên ATPase 6 của ty thể, một trong hai tiểu đơn vị của tiểu phần F o của phức hệ ATPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng hợp ATP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc oxy tự do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [53]. Hội chứng Leigh còn liên quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫn đến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124. ND5 là gen chức năng gồm 1812 bp (từ vị trí tới 14148) đƣợc mã hóa bởi chuỗi nặng của mtdna. Sản phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ NADH-ubiquinon oxidoreductase. Sản phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nƣớc của phức hệ I. Protein này là một trong 7 tiểu phần đƣợc mã hóa bởi mtdna trong số 42 tiểu phần của phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnh trong đó có LHON, Leigh và MELAS [61]. Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây hội chứng teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt. Bệnh thƣờng phát triển ở tuổi trƣởng thành, tỷ lệ ảnh hƣởng của nam giới cao hơn 4 đến 5 lần so với nữ giới. Ngƣời mang bệnh ban đầu hoàn toàn không có biểu hiện cho đến giai 20

32 đoạn phát triển thị giác làm mờ một mắt, mắt còn lại biểu hiện tƣơng tự sau 2-3 tháng, khoảng 25% bệnh nhân khởi phát bệnh với 2 mắt ở cùng thời điểm. Thị lực giảm nghiêm trọng đến mức không thể đếm đƣợc ngón tay hoặc kém hơn nữa. Sau giai đoạn cấp tính, đĩa quang trở nên teo. Bất thƣờng về thần kinh nhƣ run chân tay, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh cơ và rối loạn vận động đƣợc báo cáo là thƣờng gặp ở bệnh nhân LHON, ở nữ giới có thể phát triển triệu chứng đa xơ cứng [69]. Khoảng 95% trƣờng hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A trên gen ND4 (50-70% trƣờng hợp), đột biến G3460A trên gen ND1 (15% trƣờng hợp) và đột biến T14484C trên gen ND6 (10% trƣờng hợp). Đột biến G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON. Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác liên quan đến gen ND5 và ND6 [3]. Các đột biến trên gen ND6 bao gồm T14484C, T14459C, các đột biến này không những gây ra các triệu chứng của hội chứng LHON mà còn gây ra hội chứng Leigh. Đột biến G14453A cũng trên gen này, tác động lâm sàng phức tạp hơn, kèm theo các triệu chứng của LHON còn có các biểu hiện của MELAS. LHON thƣờng là do một đột biến mtdna homoplasmy và các con sẽ kế thừa các đột biến từ mẹ. Tuy nhiên khoảng 50% nam giới sẽ biểu hiện bệnh, trong khi chỉ có 10% nữ giới bị mất thị giác. Sự tiến triển của bệnh phụ thuộc vào gen đột biến, 71% bệnh nhân đột biến T14484C có dấu hiệu phục hồi, trong khi đó ở bệnh nhân A11778G chỉ là 25%. Phần lớn các bệnh nhân mang đột biến A11778G sớm khởi phát triệu chứng LHON, đã có một vài báo cáo về kiểu hình suy thoái thần kinh thị giác [69] Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rrna Bệnh do đột biến trên gen mã hóa rrna chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Đột biến A1555G và C1494T đƣợc phát hiện trên gen mã hóa cho rrna 12S, các đột biến này gây mất khả năng nghe do kích thích bởi aminoglycoside và mất khả năng nghe không có hội chứng. Trong đó, đột biến A1555G phổ biến hơn C1494T. 21

33 Đột biến A1555G là đột biến điểm mtdna nằm trên gen MT-RNR1, quy dịnh sự tổng hợp 12S rrna. Đột biến này nằm trên vị trí mã hóa tiểu đơn vị rrna và đƣợc dự đoán gây ra một sự thay đổi trong cơ cấu thứ cấp của rrna. Sự thay đổi này làm suy yếu tổng hợp protein và tăng cƣờng tƣơng tác với kháng sinh aminoglycoside, tiếp tục làm trầm trọng hơn tình trạng bệnh [2]. Đột biến đơn thuần thƣờng không dẫn đến tình trạng bệnh lý, nhƣng khi kết hợp với các yếu tố môi trƣờng nhƣ kháng sinh nhóm aminoglycoside sẽ biểu hiện triệu chứng bệnh điển hình, thƣờng quan sát đƣợc là mất thính lực ở các mức độ khác nhau. Đột biến A1555G thƣờng ở dạng đồng nhất nhƣng biểu hiện triệu chứng bệnh của các thành viên trong gia đình là rất khác nhau. Trong một nghiên cứu cũng chỉ ra rằng biểu hiện của bệnh chịu ảnh hƣởng của việc s dụng kháng sinh amimoglycoside với 96,5% ở nhóm tuổi 30 điều trị kháng sinh và 39,9% với nhóm không điều trị kháng sinh [7]. Đột biến khác trên gen rrna 12S là T1095C, gây nên sự thay đổi base bảo thủ ở vòng xoắn 25 của rrna 12S. Nucleotide này nằm ở vị trí P của ribosome, có vai trò quan trọng trong giai đoạn khởi đầu của quá trình tổng hợp protein của ty thể. Sự thay đổi cấu trúc bậc ba của rrna 12S làm ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp protein, vì vậy dẫn đến mất chức năng của ty thể và gây ra mất khả năng nghe Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtdna Hội chứng Kearns-Sayre (KSS) là bệnh liên quan đến sự phát triển sắc tố võng mạc và liệt cơ mắt ngoài tiến triển, thƣờng khởi phát trƣớc tuổi 20. Nguyên nhân là do mất đoạn mtdna khoảng 2-4 kb, thƣờng là 4997 bp từ vị trí , tại điểm đứt gãy thƣờng có một đoạn 13 bp lặp lại. Ngoài những triệu chứng nhƣợc cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, thoái hóa sắc tố võng mạc, bệnh nhân thƣờng có các biến chứng bao gồm thất điều tiểu não, suy giảm nhận thức và điếc, tắc nghẽn cơ tim, dáng ngƣời thấp bé, nuốt khó [56]. Hội chứng Pearson là một rối loạn hiếm gặp, thƣờng khởi phát trong những năm đầu đời, đặc trƣng bởi thiếu máu hồng cầu, tủy xƣơng và suy tụy ngoại tiết. 22

34 Diễn biến lâm sàng ở trẻ em có thể nặng dẫn đến t vong sớm, những trƣờng hợp sống sót thƣờng có biểu hiện thiếu máu sau đó phát triển các đặc điểm lâm sàng của KSS. Bệnh thƣờng đƣợc xác định là do mất đoạn mtdna quy mô lớn, có mặt ở tất cả các mô [65]. Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển (progressive external ophthalmoplegia- PEO) đƣợc đặc trƣng bởi sự suy yếu của các cơ mắt, thƣờng xuất hiện ở độ tuổi Dấu hiệu phổ biến và khác so với bệnh liệt mắt tiến triển kinh niên (CPEO) nhƣ nhƣợc cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, rách cơ. Nguyên nhân gây bệnh là những khuyết tật trong ty thể, hay gặp ở các rối loạn mất đoạn mtdna quy mô lớn, trong một số trƣờng hợp là đột biến gen MT-TL1. Mặt khác, các đột biến gen nhân POLG, SLC25A4 và C10orf2 cũng là nguyên nhân gây nên bệnh này. Các nghiên cứu gần đây chƣa chứng minh đƣợc sự tƣơng quan giữa kích thƣớc và vị trí đoạn mtdna bị mất với mức độ biểu hiện của bệnh [54]. Bệnh Parkinson/hội chứng MELAS gối nhau do đột biến mất đoạn TTAA bắt đầu ở vị trí của gen CYTB. Bệnh nhân biểu hiện rối loạn tiến triển nặng, bắt đầu từ 6 tuổi với biểu hiện khó phối hợp và tập trung vận động. Sau này, bệnh nhân thể hiện hội chứng Parkinson, rung giật cơ và nhồi máu não [24]. Mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xảy ra ở vùng không mã hóa nằm giữa gen mã cho cytochrome oxidase II (COII) và trna Lys trong hệ gen ty thể. Vùng không mã hóa gồm hai trình tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp từ vị trí trên hệ gen ty thể. Hiện tƣợng mất đoạn 9 bp đƣợc xem là một dạng đột biến của hệ gen ty thể và có tỷ lệ cao ở các quần thể ngƣời châu bao gồm Trung Quốc (15%), Việt Nam (20%), Thái Lan (29%) và Nhật Bản (20%) [62]. Đột biến mất đoạn xuất hiện do những sai hỏng trong quá trình tái bản không đƣợc s a chữa hoặc do quá trình sao chép bị lỗi. Vì vậy, mất đoạn 9 bp có lẽ xuất hiện nhƣ kết quả của một lỗi không đƣợc s a chữa trong quá trình sao chép của mtdna. Hiện tƣợng mất đoạn 9 bp đƣợc xem xét trên hai phƣơng diện đó là nguồn gốc tiến hóa và mối liên quan giữa mất đoạn 9 bp với bệnh tật đặc biệt là các rối loạn ty thể. 23

35 Ngoài ra, một số bệnh ty thể còn liên quan đến sự đảo đoạn. Nghiên cứu đầu tiên về một đột biến đảo đoạn trong mtdna gây bệnh cơ đƣợc phát hiện bởi Musumeci và tập thể vào năm 2000 [41]. Bệnh nhân đƣợc phát hiện mang đột biến đảo đoạn 7 nucleotide (ACCTTGC thành GCAAGGT) ở vùng thuộc gen mã hóa cho ND1 của NADH ubiquinone oxidoreductase. Đột biến đảo đoạn này dẫn đến thay thế 3 acid amin (D199G, L200K, và A201V) có tính bảo thủ cao trong chuỗi polypeptide, là đột biến ở dạng không đồng nhất 80% và đƣợc phát hiện trong cơ nhƣng không có trong máu bệnh nhân. Sự thay đổi 3 acid amin liên tiếp từ Asp-Leu-Ala thành Gly-Lys-Val, liên quan đến một vùng bảo thủ cao của gen ND1 có vai trò quan trọng trong việc gắn ubiquinone HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liên quan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên đƣợc mô tả. Sau đó các trƣờng hợp khác tiếp tục đƣợc mô tả, Fukuhara và cộng sự [28] đã đƣa ra các tính năng cơ bản của bệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều đƣợc gọi là hội chứng MERRF. Bệnh nhân MERRF đƣợc chẩn đoán bởi các tiêu chí: rung giật cơ, động kinh, thất điều tiểu não, sinh thiết cơ cho thấy sợi cơ đỏ bị rách. Mặc dù đó là những biểu hiện chính nhƣng thực tế lâm sàng tìm thấy nhiều bệnh nhân MERRF có triệu chứng không đồng nhất, có thể gặp bệnh nhân điếc, không chịu đƣợc vận động, mất trí nhớ, u mỡ đối xứng, bệnh sắc tố võng mạc [15, 37]. Hội chứng lần đầu tiên đƣợc mô tả là do đột biến A8344G trên gen mã hóa cho trna Lys của ty thể [13, 20, 42]. Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MT-TK mã hóa cho trna Lys gây ra, tất cả đột biến đều tồn tại ở dạng không đồng nhất. Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [9, 42]. MERRF cũng đƣợc mô tả ở bệnh nhân bị mất đoạn mtdna. Các hội chứng gối nhau với đặc điểm MELAS/MERRF đã đƣợc báo cáo ở đột biến T7572C và T8356C trên trna Ser [18]. 24

36 Các đột biến của hội chứng MERRF Đột biến A8344G Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK của ty thể làm thay đổi bộ ba mã hóa trên trna lys, do đó giảm khả năng tƣơng tác với bề mặt ribosome. Đột biến tại vùng này ảnh hƣởng đến sự hợp nhất của dƣ lƣợng lysine vào protein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi hô hấp trong ty thể. Từ đó, ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là các phức hợp I (NADH dehydrogenase) và IV (cytochrome c oxidase) [10, 20, 33]. Đột biến A8344G đƣợc di truyền độc lập từ mẹ sang con và thƣờng tồn tại ở dạng không đồng nhất, nhƣng mức độ phân bố của thể đột biến rất khác nhau giữa các cá thể và các mô trong cùng một cá thể [10]. Một nghiên cứu cho thấy rằng ở một phụ nữ lƣợng gen đột biến A8344G trong cơ xƣơng là 94%, trong máu là 38%, trong nƣớc tiểu là 18%, cũng định lƣợng đột biến tƣơng tự trên mẹ và em gái cho thấy, ở mẹ có 16% gen đột biến trong máu và 18% trong nƣớc tiểu, kết quả của em gái là 3% gen đột biến trong máu và 4% trong nƣớc tiểu. Định lƣợng đƣợc tỷ lệ gen đột biến nhằm xác định mức độ ảnh hƣởng của bệnh đến cá thể mang đột biến. Tỷ lệ đột biến A8344G có tƣơng quan với sự giảm tổng hợp protein, giảm tiêu thụ oxy và thiếu cytochrome c oxidase, cũng nhƣ các polypeptid lớn và giàu lysine bị ảnh hƣởng nặng nề gợi ý rằng các đột biến MERRF trực tiếp hạn chế quá trình tổng hợp protein của ty thể. Hơn thế nữa, stress oxy hóa và oxy hóa trên các mô bị ảnh hƣởng bởi thiếu chuỗi hô hấp dẫn đến sự tiến triển các triệu chứng của bệnh ty thể [30]. Mặc dù đƣợc mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứng MERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ rách nham nhở nhƣng đột biến A8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất. Một nghiên cứu ở ngƣời phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứng MERRF còn có nhiều triệu chứng khác nhƣ suy hô hấp và loạn dƣỡng cơ. Một số trƣờng hợp biểu hiện tầm vóc ngắn, mất thính lực, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh 25

37 cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận. Kết quả nghiên cứu mối tƣơng quan giữa kiểu gen đột biến A8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thể biểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh, rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30] Đột biến T8356C Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc biết đến với đột biến A8344G, nhƣng không quan sát thấy trong khoảng 10-20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu biểu của hội chứng MERRF. Một nghiên cứu giải trình tự gen trna lys của năm bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng đƣợc xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh), mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền s gia đình tƣơng thích với sự kế thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy nhiễm toan acid lactic, sinh thiết cơ cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy có sự thay đổi nucleotide tại vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base đƣợc bảo tồn trong phân t mtdna gốc [51]. Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356C cũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhƣng sự phân bố của gen đột biến cũng rất khác nhau, kết quả phân tích trên 1 bệnh nhân mang đột biến trong cơ là 100% còn trong máu là 47%. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này cũng khá phức tạp, có bệnh nhân xuất hiện triệu chứng rung giật cơ, động kinh, điếc và đột quỵ giả tai biến giống nhƣ hội chứng MELAS [6] Đột biến G8363A Năm 1996, nhóm nghiên cứu Filippo M. Santorelli và cộng sự [45] đã s dụng phƣơng pháp phân tích đa dạng cấu hình DNA sợi đơn (SSCP) và giải trình tự trực tiếp của tất cả 22 gen trna mã hóa mtdna để phát hiện tình trạng đột biến trong 9 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tƣơng tự nhƣ hội chứng MERRF bao gồm tăng acid lactic và pyruvic trong máu, rối loạn thần kinh ngoại biên, thất điều não, giảm thính lực, sinh thiết cơ cho thấy các sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy cả 9 bệnh nhân trong 2 gia đình đều mang đột biến thay đổi 26

38 nucleotide A bằng G tại vị trí 8363 trên mtdna. Phân tích RFLP cho thấy rằng đột biến tồn tại ở dạng không đồng nhất và có mức độ phân bố ở các mô khác nhau nhƣ ở cơ là 95%, ở máu là 59-94% [49]. Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa (OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biến G8363A gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gen trna lys. Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hƣởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp của tế bào, ảnh hƣởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thƣờng trong nguyên bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A [45, 49, 57]. Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng không đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính giác, nhiều u mỡ,... đƣợc chẩn đoán giống hội chứng Leigh Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời bệnh Ty thể là bào quan s dụng oxy để chuyển hóa các sản phẩm trung gian của thức ăn thành năng lƣợng thông qua một quá trình phosphoryl oxy hóa. Những đột biến gây MERRF làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo ra các protein, s dụng oxy và sản xuất năng lƣợng. Những đột biến này ảnh hƣởng đến các cơ quan và các mô với nhu cầu năng lƣợng cao nhƣ não và cơ. Bệnh thƣờng biểu hiện trong các mô và dễ dàng phát hiện trong mtdna từ bạch cầu trong máu [37]. Tuy nhiên, sự xuất hiện của dạng không đồng nhất có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện ở các mô mang đột biến. Do đó những ngƣời có triệu chứng ít phù hợp với MERRF có thể không đƣợc phát hiện từ bạch cầu mà chỉ phát hiện ở các mô khác nhƣ nguyên bào sợi da nuôi cấy, niêm mạc miệng,... nhƣng đáng tin cậy nhất là phát hiện từ các tế bào cơ xƣơng [38]. Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc chẩn đoán lâm sàng dựa trên các triệu chứng bao gồm: tăng nồng độ lactate, pyruvate trong máu và trong dịch não tủy. Protein dịch não tủy có thể tăng lên trong hội chứng MERRF. Kỹ thuật chụp ảnh não nhƣ 27

39 hình ảnh cộng hƣởng từ có thể tìm thấy các tổn thƣơng nhƣ đột quỵ. Điện tâm đồ có thể đƣợc s dụng để chẩn đoán bất thƣờng về tim. Bảng 1.1 liệt kê các triệu chứng và dấu hiệu thấy đƣợc trong 62 bệnh nhân mang đột biến MERRF [70]. Các đặc điểm lâm sàng thƣờng gặp nhất có tỷ lệ tƣơng ứng là: giật cơ, yếu cơ, mất điều hòa (35-45%); động kinh tổng quát, mất thính lực (25,0-34,9%); suy giảm nhận thức, nhiều u mỡ, bệnh thần kinh, không dung nạp tập thể dục (15,0-24,9%); tăng CK, teo dây thần kinh thị giác, teo cơ, suy hô hấp, tiểu đƣờng, đau cơ, run, và chứng đau n a đầu (5,0-14,9%) [70]. 28

40 Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF [70] Biểu hiện lâm sàng Tần số xuất hiện Tỷ lệ % Giật cơ 62/62 100% Động kinh 62/62 100% Phát triển ban đầu bình thƣờng 17/17 100% Sợi cơ đỏ rách nham nhở 47/51 92% Giảm thính lực 41/45 91% Tăng acid lactic máu 24/29 83% Tính kế thừa theo dòng mẹ 34/42 81% Không dung nạp tập thể dục 8/10 80% Mất trí 39/52 75% Bệnh thần kinh 17/27 63% Ngƣời thấp bé 4/7 57% Giảm cảm giác 9/18 50% Liệt dây thần kinh thị giác 14/36 39% Bệnh cơ tim 2/6 33% Hội chứng Wolff- Parkinson-White 2/9 22% Bệnh võng mạc sắc tố 4/26 15% U mỡ 2/60 3% Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hƣởng đến nhiều 29

41 bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy việc phân tích mtdna là quan trọng ở nhiều trƣờng hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP [25, 30, 45] Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA đƣợc phân cắt giới hạn. Phƣơng pháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phân cắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự thay đổi về trình tự nucleotide của DNA dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho các đoạn DNA bị phân cắt có kích thƣớc khác nhau, có thể nhận biết đƣợc dựa trên phổ băng khi điện di. Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DNA tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA khi đƣợc cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tƣợng này đã tạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel thì có thể phát hiện đƣợc các đột biến. Kỹ thuật RFLP đã trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reation). PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng kéo dài chuỗi của DNA polymerase để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu. DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn - mồi, trong môi trƣờng thích hợp có các dntp thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản đƣợc đoạn DNA đích, ngƣời ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu. Đây là một kỹ thuật rất nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứng cũng có thể diễn ra. Việc kết hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phát hiện các đột biến di truyền, trong đó có đột biến điểm trên gen ty thể. PCR-RFLP là công cụ chẩn đoán sớm đƣợc s dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong 30

42 mtdna. Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc chính sau: (1) đoạn mtdna chứa vị trí đột biến đƣợc khuếch đại nhờ các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu; (2) sản phẩm PCR đƣợc phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn DNA cắt đƣợc điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide không biến tính, nhuộm ethidium bromide (EtBr) và đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại. Việc lựa chọn enzyme giới hạn có ý nghĩa quyết định trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtdna. Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn DNA chứa đột biến hoặc đƣợc chủ động tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR mà có thể xác định đƣợc đột biến và không đột biến sau phản ứng cắt với enzyme. Trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng, PCR-RFLP là phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc s dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm gen ty thể. Đây là phƣơng pháp đơn giản và hiệu quả để phát hiện đột biến mtdna khi sàng lọc với số lƣợng mẫu lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có độ nhạy tƣơng đối, đôi khi đột biến khó đƣợc phát hiện vì sự có mặt của các băng DNA mờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ mtdna đột biến trong mẫu thấp [26]. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP nhuộm ethidium bromide là 5-10% [8] Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen [10] Kỹ thuật giải trình tự đƣợc s dụng để phát hiện, tìm kiếm đột biến trong hệ gen ty thể. Xác định trình tự nucleotide có thể phát hiện và khẳng định chắc chắn loại đột biến trên DNA ty thể. Tuy vậy kỹ thuật này tốn nhiều thời gian và chi phí cao, vì vậy nó thƣờng đƣợc s dụng để khẳng định chắc chắn sự có mặt của các đột biến trong đó có đột biến điểm mtdna Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism)[12] Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Các cấu hình khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Vì vậy, khi xuất hiện 31

43 đột biến trong phân t mtdna sẽ làm thay đổi cấu trúc bậc hai, cho phép phân tách sợi DNA đột biến và không đột biến. Phƣơng pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chƣa biết ở bệnh nhân nghi ngờ rối loạn mtdna Định lượng đột biến MERRF bằng phương pháp real-time PCR [19, 52] Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đo tín hiệu huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lƣợng DNA tƣơng ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm đƣợc khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị C t (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mối quan hệ của mẫu chuẩn đã biết rõ số lƣợng DNA đích ban đầu và mẫu nghiên cứu với giá trị chu kỳ ngƣỡng [5, 8]. Ƣu điểm chính của real-time PCR là cho phép xác định số bản sao ban đầu của mẫu DNA ở tỷ lệ thấp với độ chính xác và độ nhạy cao. Kết quả real-time PCR có thể tính sự có mặt hay vắng mặt của alen hoặc định lƣợng số bản sao. Ngoài ra, lƣợng sản phẩm DNA đích có thể theo dõi đƣợc sau mỗi chu kỳ mà không cần kiểm tra bằng phƣơng pháp điện đi [5, 8] Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học [71] Biochip là một kỹ thuật mới, đƣợc s dụng trong sàng lọc phát hiện các đột biến mtdna, với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng vi tính. Để sản xuất các chip DNA, các cặp mẫu dò đƣợc thiết kế đặc hiệu cho từng loại đột biến, bao gồm mẫu dò cho trình tự bình thƣờng và mẫu dò cho trình tự đột biến. Mẫu dò đƣợc cài trên phiến kính một cách tự động, mỗi phiến kính với diện tích khoảng 1 cm 2 có thể chứa hàng trăm đến hàng ngàn mẫu dò khác nhau. DNA khuôn đƣợc đánh dấu và lai với các mẫu dò. Các phƣơng pháp đánh dấu bao gồm 32

44 gắn trực tiếp chất đánh dấu vào DNA khuôn, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Ở Việt Nam, một bệnh nhân MELAS mang đột biến A3243G đã đƣợc phát hiện lần đầu tiên bởi Lê Thị Bích Thảo và tập thể [4] bằng phƣơng pháp PCR-RFLP và giải trình tự nucleotide. Năm 2014, Trƣơng và tập thể [55] đã s dụng phƣơng pháp PCR-RFLP sàng lọc 106 bệnh nhân cơ não tuy nhiên các tác giả không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến thuộc hội chứng MERRF. Nhƣ vậy đột biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đã đƣợc nghiên cứu tuy nhiên các thông tin có đƣợc còn hạn chế. Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở ngƣời Việt Nam, đặc biệt là việc định lƣợng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến để đƣa ra mối tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến và biểu hiện lâm sàng của bệnh là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. 33

45 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Mẫu bệnh phẩm Mẫu máu ngoại vi của 312 bệnh nhân ngƣời Việt Nam nghi bị bệnh ty thể (Phụ lục 1) đƣợc lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ƣơng. Các mẫu máu đƣợc bảo quản ở -80 o C. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đƣợc nghi ngờ mắc hội chứng MERRF dựa trên sự có mặt của ít nhất hai trong ba đặc điểm sau: - Tác động lâm sàng liên quan đến các cơ quan: hệ thần kinh trung ƣơng, cơ xƣơng và cơ tim, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa. - Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch não tủy. - Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ não không bình thƣờng Các hóa chất, nguyên liệu khác Plasmid chèn đoạn gen có và không mang đột biến A8344G là sản phẩm của đề tài KC.04.10/11-15 Các kit tách chiết DNA tổng số đƣợc mua từ hãng Qiagen; các cặp mồi và mẫu dò đƣợc mua từ hãng Integrated DNA Technologies; thang chuẩn DNA, hỗn hợp dntp; (Enzynomics, Hàn Quốc); enzyme giới hạn đƣợc mua từ hãng Thermoscientifics, Kapa probe fast qpcr, Master Mix đƣợc mua của hãng Kapabiosystems. Các hóa chất còn lại đều đƣợc mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân t MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy NanoDrop TM 8000, máy PCR gradient (Eppendorff), máy real-time PCR iqtm 5 cycler (Biorad), máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad). 34

46 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số đƣợc tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân theo QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. Quy trình thực hiện nhƣ sau: Hỗn hợp tách DNA chứa 20 µl protease Qiagen, 200 µl mẫu máu, 200 µl đệm AL và 4 µl RNase 10 mg/ml. Hỗn hợp đƣợc trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây để thu đƣợc một dung dịch đồng nhất và đƣợc ủ ở 56 o C trong 10 phút. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm nhẹ vòng/phút. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc bổ sung 200 µl ethanol 100%, trộn đều và ly tâm nhẹ vòng/phút. Dung dịch trong ống đƣợc chuyển vào cột Qiagen, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc bổ sung 500 µl AW1 và ly tâm ở vòng/phút trong 1 phút, sau đó dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột tiếp tục đƣợc cho thêm 500 µl AW2, ly tâm vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và đƣợc bổ sung 150 µl nƣớc cất vô trùng và để yên trong 1 phút, sau đó đƣợc ly tâm ở vòng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là DNA tổng số. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20 o C cho đến khi s dụng Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết Sự có mặt của DNA đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 5 µl DNA đƣợc trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên giếng gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel, các băng DNA đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại. Nồng độ của DNA tách chiết đƣợc định lƣợng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng t ngoại của các acid nucleic ở bƣớc sóng 260 nm (A 260 ) trên máy Nano- Drop. Nguyên tắc của phƣơng pháp là dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng t ngoại ở bƣớc sóng 260 nm (A 260 ) của các phân t DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm của các phân t DNA, với hệ số A 260 = 1 tƣơng đƣơng với hàm lƣợng DNA sợi đôi là 50 μg/ml, s dụng công thức C = A 260 x 50 x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lƣợng DNA có trong mẫu tách chiết. 35

47 Phƣơng pháp này đơn giản, nhanh, nhƣng có hạn chế là giá trị đọc đƣợc về độ hấp thụ có thể bị ảnh hƣởng khi trong mẫu chứa RNA và protein. Vì vậy, trong thực tế phƣơng pháp này thƣờng đƣợc dùng để định lƣợng các mẫu DNA tinh khiết, tỉ số A 260 /A 280 đƣợc s dụng để đánh giá độ sạch DNA của chế phẩm. DNA đƣợc cho là sạch khi giá trị A 260 /A 280 nằm trong khoảng 1,8-2, Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR Đoạn gen ty thể mang đột biến MERRF đƣợc khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các cặp mồi đặc hiệu đã đƣợc thiết kế và chế độ nhiệt thích hợp. Khuôn cho phản ứng PCR là DNA tổng số đƣợc tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Theo tính toán lý thuyết, các đoạn gen chứa đột biến sẽ đƣợc nhân lên bằng kĩ thuật PCR với kích thƣớc 212 bp (đột biến A8344G), 220 bp (đột biến T8356C), 241 bp (đột biến G8363A). Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm Taq DNA polymerase 10X; 1 µl Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl); 2,5 µl dntps 2 mm; 1 µl mồi xuôi 10 pmol; 1 µl mồi ngƣợc 10 pmol; 2 µl DNA khuôn (40-45 ng/µl) và 15 µl ddh 2 O cho tổng thể tích 25 µl. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, đặt vào máy PCR và tiến hành chạy với 3 bƣớc chính: biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu trình nhiệt đƣợc thiết lập nhƣ bảng 2.1. Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến MERRF Chu trình nhiệt o C Thời gian Biến tính khởi động 95 4 phút Biến tính giây 35 chu kỳ Gắn mồi * 30 giây Kéo dài giây Kéo dài hoàn tất 72 5 phút Bảo quản mẫu 4 + (* là nhiệt độ gắn mồi, MRAG là 58 o C, MRTC là 60 o C, MRGA là 53 o C) 36

48 Mẫu đối chứng âm tính (không chứa DNA) đƣợc đặt cùng thí nghiệm để kiểm tra khả năng nhân bản không đặc hiệu. Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%. Sau khi PCR kết thúc, 5 µl sản phẩm đƣợc trộn đều với 1 µl dung dịch đệm tra mẫu có chứa ethidium bromide ở nồng độ 50 µg/ml, tra lên giếng gel đã chuẩn bị trong đệm TAE 1X. Thang chuẩn DNA 100 bp đƣợc điện di song song cùng với mẫu. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu cách mép bản gel khoảng 2 cm. Bản gel chứa các băng DNA đƣợc quan sát trên máy soi và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad) Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) Đoạn gen chứa đột biến đƣợc nhân bản bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn trong đệm tƣơng ứng (reaction buffer). Phản ứng cắt đƣợc thực hiện với thành phần nhƣ sau: 1 µl đệm enzyme giới hạn 10X; 0,5 µl enzyme giới hạn (50 đơn vị/µl); 7,5 µl sản phẩm PCR và 6,25 µl ddh 2 O cho tổng thể tích 15 µl, hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 37ºC, từ giờ. Sau đó, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và đột biến đƣợc phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dƣới ánh sáng t ngoại Điện di trên gel agarose Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trƣờng tác động vào các phân t tích điện và kích thƣớc lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân t (polymer) đƣợc liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lƣới với kích thƣớc các mắt lƣới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân t (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân t đƣợc phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trƣờng tác động lên chúng, kích thƣớc của phân t so với kích thƣớc lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân t. 37

49 Gel agarose 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mm để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Sản phẩm PCR DNA đƣợc trộn với đệm mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và tra vào các giếng trên gel. Quá trình điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại (kích thƣớc bản gel agarose 2% chiều dài và chiều rộng là 5x6 cm) Sau khi kết thúc điện di, bản gel đƣợc lấy ra ngâm dƣới ethidium bromide ở nồng độ 50 μg/µl 5-7 phút và soi dƣới ánh sáng t ngoại của máy soi chụp ảnh Geldoc (Biorad). Để phƣơng pháp quan sát DNA trong gel agarose thuận lợi nhất, dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr để nhuộm gel. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dƣới tia UV, cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhƣng khả năng xác định gel trực tiếp dƣới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ƣu thế rõ rệt Điện di trên gel polyacrylamide Trong nghiên cứu này, gel polyacrylamide 12% đƣợc s dụng với các thành phần nhƣ trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% STT Thành phần Thể tích 1 Dung dịch acrylamide 30% 2 ml 2 TAE 5X 1 ml 3 APS 10% 35 μl 4 TEMED 3,5 µl 5 Nƣớc cất kh trùng µl Tổng thể tích 5 ml Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn đƣợc trộn với đệm mẫu và tra vào đƣờng chạy điện di trong đệm TAE 0,5X với 38

50 hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 3 cm thì dừng lại (kích thƣớc bản gel polyacrylamide chiều dài và chiều rộng là 10x8 cm). Gel đƣợc nhuộm bằng EtBr hòa trong nƣớc, sau khoảng 5 phút, bản gel đƣợc lấy ra, r a dƣới vòi nƣớc và soi dƣới ánh sáng t ngoại của máy soi chụp gel IQ5 (Biorad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA - locked nucleic acid) Trong thí nghiệm này, đột biến A8344G đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5 của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến và HEX (535/556 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến, còn đầu 3 của mẫu dò có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher). Ngoài ra, để tăng nhiệt độ tách chuỗi (T m ) và tính đặc hiệu của mẫu dò, trong trình tự của mẫu dò còn có cải biến bằng nucleotide dạng khóa (locked nucleic acid) (Hình 2.1). Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA Nguyên tắc của phƣơng pháp: Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích. Khi chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn, 39

51 huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ do nguyên lý cộng hƣởng năng lƣợng huỳnh quang (nguyên lý FRET), ống phản ứng sẽ không phát đƣợc huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì mẫu dò huỳnh quang sẽ bắt cặp với khuôn và bị hoạt tính 5 -exonuclease của enzyme Taq DNA polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung, do vậy reporter sẽ rời xa quencher và phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích (Hình 2.2). Sự phân cắt của mẫu dò trong quá trình PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lƣợng reporter tự do càng nhiều và cƣờng độ huỳnh quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận đƣợc. Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman 40

52 Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real time PCR Mẫu dò/mồi Trình tự Vị trí trên DNA ty thể RT8344-Fw 5 AGC CCA CTG TAA AGC TAA C RT8344-Rv 5 GGC ATT TCA CTG TAA AGA GGT Wt-8344A- FAM Mt-8344G- HEX 6FAM-AGA T+TA +A+GA +GA+A +CC- IBFQ HEX-GAT +TA+A +GAG +A+GC C- IBFQ Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA Đoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí đƣợc nhân bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến đƣợc phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX. Thành phần của phản ứng real-time PCR gồm qpcr master mix (2X), 1 µmol/l mỗi loại mồi, 0,125 µmol/l mỗi loại mẫu dò (Wt-8344A-FAM/Mt-8344G- HEX) và 10 ng DNA khuôn cho tổng thể tích 25 l. Real-time PCR đƣợc thực hiện với chế độ nhiệt 95 C, 10 phút tiếp nối 40 chu kỳ với 95 C, 15 giây để biến tính và 60 C, 60 giây để bắt cặp và kéo dài chuỗi. Cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang đƣợc ghi nhận và phân tích bởi hệ thống iq5 cycler (Biorad). Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu chuẩn và mẫu phân tích có các đƣờng biểu diễn khuếch đại tƣơng ứng. Từ giá trị chu kỳ ngƣỡng (C t ) của mẫu nghiên cứu, dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập bằng cách trộn mẫu DNA plasmid mang đột biến và không mang đột biến với các tỷ lệ khác nhau từ đó tính ra phần trăm đột biến của mẫu phân tích. 41

53 Dãy DNA plasmid từ bản sao/µl (hệ số pha loãng 10) chứa trình tự đột biến và không đột biến đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 ở cùng nồng độ chạy cùng với mẫu trong mỗi phản ứng. Lƣợng đột biến trong mỗi mẫu đƣợc đo 3 lần (n = 3) và số liệu đƣợc x lý theo phƣơng pháp thống kê Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến Trình tự đoạn gen đƣợc xác định dựa theo phƣơng pháp Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide - ddntp) thông qua dịch vụ phân tích bởi Công ty 1 st base (Singapore). Do ddntp chỉ chứa đầu 3 -H thay cho 3 -OH nên khi các nucleotide này đƣợc gắn vào chuỗi DNA đang đƣợc tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại. Theo đó, từ một đoạn DNA khuôn ban đầu sẽ tổng hợp nên nhiều đoạn sợi đơn mới đƣợc đánh dấu ở một đầu tận cùng là ddntp và các đoạn này có độ dài hơn kém nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn đó đƣợc phân tách trên gel acrylamide dạng mao quản và máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DNA gốc. 42

54 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THU THẬP MẪU MÁU BỆNH NHÂN VÀ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ Một số đặc điểm của mẫu phân tích Mẫu máu từ các bệnh nhi có độ tuổi từ 1 tháng đến 15 tuổi, trẻ dƣới 5 tuổi (từ 1 tháng tuổi đến 5 tuổi) đƣợc nghiên cứu chiếm tỷ lệ 87,5%, từ 6 đến 15 tuổi chiếm tỷ lệ 12,5%. Trong đó, tỷ lệ nam là 57,1%, nữ là 43,9%. Theo các dẫn liệu chẩn đoán lâm sàng bởi các bác sĩ Bệnh viện Nhi Trung ƣơng, các bệnh nhi lấy mẫu nghiên cứu đều xuất hiện các triệu chứng của bệnh thần kinh cơ (encephalomyopathy) nhƣ động kinh co giật, rối loạn chuyển hóa, chậm phát triển tinh thần vận động, tăng acid lactic máu Tách chiết DNA tổng số của các mẫu DNA tổng số từ 200µl mẫu máu của bệnh nhân đƣợc tách theo Kit của Qiagen (Mục ), chế phẩm DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.1) cho thấy các chế phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng DNA rõ nét, với độ di động điện thấp (gần vạch xuất phát), chứng tỏ DNA tổng số tách đƣợc đều nguyên vẹn. Hình 3.1. Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân 43

55 M: Thang chuẩn DNA 1 kb (-): Đối chứng âm 1-5: DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân Kết quả đo mật độ hấp thụ ánh sáng t ngoại ở 260 nm của chế phẩm DNA tổng số (Phụ lục 1) cho thấy các mẫu DNA đều có tỷ số A 260 /A 280 nằm trong khoảng 1,8-2,0; chứng tỏ chế phẩm DNA ít lẫn protein hay RNA. Hàm lƣợng DNA trung bình đạt 44,5 ng/µl. Nhƣ vậy, chúng tôi đã thu đƣợc các sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bƣớc thí nghiệm tiếp theo SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP Sàng lọc đột biến A8344G Nhân bản đoạn gen từ bằng PCR Để xác định sự thay đổi nucleotide G thành A tại vị trí 8344 trên mtdna chúng tôi đã tiến hành nhân bản đoạn gen có kích thƣớc 212 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế bởi Trƣơng Thị Huệ và tập thể [56], nhƣ bảng 3.1. Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình nhiệt Sản phẩm PCR Những cải tiến 5 GGT ATA Mồi Rv chứa một MRAGFw MRAGRv CTA CGG TCA ATG CTC 3 5 TTT CAC TGT AAA GAG GTG 94ºC: 30 giây 58ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây 212 bp nucleotide không ghép cặp (T đƣợc thay thế bằng G tại vị trí 8347) để tạo điểm cắt cho BanII khi có đột TGG G 3 biến 44

56 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (Hình 3.2) cho thấy sản phẩm DNA khuếch đại của đoạn gen có kích thƣớc nhƣ tính toán lý thuyết (212 bp), điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen từ mẫu DNA tổng số của các bệnh nhân. Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm (không chứa DNA khuôn) (+): Sản phẩm PCR từ plasmid mang đột biến A8344G 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP Đoạn gen chứa đột biến sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR và kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen không chứa đột biến sẽ bị cắt thành ba đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp; trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ cắt thành bốn băng với kích thƣớc lần lƣợt là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp, đột biến làm xuất hiện điểm cắt của enzyme BanII khiến băng 72 bp bị cắt thành hai băng 50 bp và 22 bp (Bảng 3.2). 45

57 Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII Trình tự cắt GGGCC/C GAGCC/C GGGCC/C Đệm dùng cho enzyme R Sản phẩm cắt DNA đột biến DNA không đột biến 99 bp, 41 bp, 50 bp 99, 41 bp và 72 bp và 22 bp Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DNA dƣới ánh sáng t ngoại (Mục 2.2.6). Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA (-): Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344A (+):Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP (hình 3.3) cho thấy các mẫu DNA nhân bản của bệnh nhân (đƣờng chạy 4-10) đều xuất hiện 3 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với sản phẩm cắt của plasmid không mang đột biến, trong khi đó đối chứng dƣơng là plasmid mang đột biến bị cắt thành 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp (đƣờng chạy thứ 3). Chứng tỏ, 46

58 kết quả PCR-RFLP của chúng tôi là đáng tin cậy, các mẫu bệnh nhân (nêu ở đây là 7 bệnh nhân) đƣợc sàng lọc không mang đột biến A8344G. Thực tế, chúng tôi đã sàng lọc đột biến A8344G ở 312 bệnh nhân và không phát hiện thấy bệnh nhân nào mang đột biến A8344G Sàng lọc đột biến T8356C Tiếp tục sàng lọc các đột biến thuộc hội chứng MERRF, chúng tôi tiến hành điều tra đột biến T8356C trên 182 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty thể (Phụ lục 1) bằng phƣơng pháp PCR-RFLP theo các bƣớc tƣơng tự nhƣ trên Nhân bản đoạn gen từ bằng PCR Đoạn gen chứa đột biến T8356C phải đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đƣợc thiết kế bởi Trƣơng Thị Huệ và tập thể [56], nhƣ bảng 3.3, chúng tôi nhân bản đƣợc đoạn DNA từ vị trí 8166 đến 8358, với kích thƣớc 220 bp. Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình nhiệt Sản phẩm PCR Những cải tiến 5 GTCAAT Mồi Rv chứa MRTCFw GCTCTGA AATCTGT một nucleotide không ghép cặp GGAG 3 94ºC: 30 giây (G đƣợc thay thế 5 GTAGTA 60ºC: 30 giây 220 bp bằng T tại vị trí TTTAGTT 72ºC: 30 giây 8359) để tạo MRTCRv GGGGCAT điểm cắt cho TTCACTT DraI khi không TA 3 đột biến Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2%, cho kết quả (Hình 3.4) là một băng DNA duy nhất có kích thƣớc 220 bp đƣợc nhân lên. 47

59 Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR là đúng so với những tính toán lý thuyết. Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm (+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến T8356C 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn DraI. Enzym này sẽ nhận điểm cắt có trình tự TTT/AAA trên đoạn gen không chứa đột biến và cắt đoạn DNA 220 bp thành hai đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 192 bp và 28 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến không có trình tự này nên không bị cắt. Kiểm tra sản phẩm cắt bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DNA dƣới ánh sáng t ngoại. 48

60 Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA (+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356C (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356T 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân Phổ băng điện di cho thấy kết quả tất cả sản phẩm PCR của các mẫu bệnh nhân (đƣờng chạy 2-8) đều bị cắt thành 2 đoạn DNA có kích thƣớc 192 bp và 28 bp (hình 3.5) giống nhƣ tính toán lý thuyết, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến T8356C. Thực tế, chúng tôi đã điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trƣờng hợp nào mang đột biến T8356C Sàng lọc đột biến G8363A Nhằm xác định nguyên nhân gây ra triệu chứng lâm sàng trên những bệnh nhân đã đƣợc lấy mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiếp tục sàng lọc đột biến G8363A trên 182 bệnh nhân có biểu hiện mắc hội chứng MERRF nói trên (Phụ lục 1) Nhân bản đoạn gen từ Chúng tôi dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với sợi xuôi và sợi ngƣợc của đoạn mtdna nghiên cứu, đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen ty thể, nhƣ bảng 3.4, để nhân lên đoạn DNA có kích thƣớc 241 bp ( ) s dụng khuôn là mẫu DNA tổng số đƣợc tách từ mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân. 49

61 Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen Chu trình Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi nhiệt Sản phẩm PCR MRGAFw MRGARv GAACCAACACCT CTTTACAG 3 5 GCGGGTAGGCCT AGGATTGTGG 3 94ºC: 30 giây 53ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây 241 bp Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2% cho kết quả (Hình 3.6) là một băng DNA duy nhất có kích thƣớc 220 bp đƣợc nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR là đáng tin cậy so với những tính toán lý thuyết. Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm (+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến G8363A 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân 50

62 Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn NlaIII. Theo tính toán lý thuyết, enzyme NlaIII sẽ nhận biết điểm cắt GTAC đoạn gen không chứa đột biến sẽ bị cắt thành hai đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 220 bp và 21 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ không bị cắt. Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DNA dƣới ánh sáng t ngoại. Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA (+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363A (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân Phổ băng điện di trên đƣờng chạy 2-8, cho thấy kết quả tất cả các mẫu sản phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt thành 2 đoạn DNA 220 bp và 21 bp, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến G8363A. Thực tế, chúng tôi đã điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trƣờng hợp nào mang đột biến G8363A. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp có thể áp dụng để phát hiện ra sự có mặt của đột biến A8344G trên gen ty thể nhƣ PCR-RFLP, SSCP, xác định trình tự gen, 51

63 DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), real-time PCR. Tuy nhiên, PCR- RFLP vẫn là một kỹ thuật phân t đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sàng lọc thông dụng một lƣợng mẫu lớn. Cao và tập thể đã s dụng PCR-RFLP để sàng lọc mẫu bệnh nhân và phát hiện 158 trƣờng hợp mang đột biến mtdna gây bệnh, tất cả các trƣờng hợp đƣợc khẳng định lại bằng xác định trình tự gen đều phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP [16]. Bốn bệnh nhân Trung Quốc mang đột biến A8344G trong nghiên cứu của Yu Qi và cộng sự, đã đƣợc giải trình tự cho kết quả tƣơng tự nhƣ kết quả PCR-RFLP [44]. Trƣơng Thị Huệ và tập thể [55] đã nghiên cứu sàng lọc đột biến gen ty thể bằng phƣơng pháp PCR-RFLP trên 106 bệnh nhân Việt Nam, nhƣng cũng không phát hiện đƣợc bệnh nhân nào mang đột biến A8344G và T8356C. Trong các đột biến gây nên hội chứng MERRF thì hơn 80% là A8344G, còn đột biến T8356C và G8363A chỉ khoảng 10-20%. Trên thế giới đã có nhiều công bố về sàng lọc đột biến A8344G trên bệnh nhân cơ não ty thể với kết quả đáng chú ý nhƣ nghiên cứu của Qi và cộng sự [44] điều tra đột biến gen ty thể trên 552 bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể, ở miền Bắc Trung Quốc, bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, phát hiện 4 bệnh nhân mang đột biến A8344G (chiếm 0,72%); Cũng một nghiên cứu khác trên 124 bệnh nhân Trung Quốc nghi mắc hội chứng Leigh, Zhang và cộng sự đã phát hiện ra 2 bệnh nhân mang đột biến A8344G (1,61%) [63]; Seon-joo Kwon và tập thể [36], khi nghiên cứu đột biến gen ty thể trên 65 bệnh nhân Hàn Quốc, đã phát hiện đƣợc 3 trƣờng hợp mang đột biến A8344G (4,6%). Nhƣ vậy, có thể thấy tần suất phát hiện đột biến A8344G trong các nghiên cứu là rất khác nhau. Theo chúng tôi, sự khác nhau này có thể liên quan nhiều đến cách khu trú lấy mẫu điều tra ban đầu và có thể còn những nguyên nhân khác nữa cần đƣợc làm rõ. 52

64 3.3. XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA Việc thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe về cơ bản đƣợc thực hiện theo các nguyên tắc thiết kế mồi chung cho PCR. Đột biến điểm A8344G (MERRF) đƣợc chúng tôi nghiên cứu định lƣợng bằng kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dò Taqman khóa cầu methyl. Kỹ thuật này đƣợc phát triển dựa vào enzyme Taq DNA polymerase có hoạt tính 5 -exonuclease khi mẫu dò đƣợc gắn vào cùng sợi khuôn với mồi và phản ứng cắt này chỉ xảy ra khi gen đích đƣợc khuếch đại. Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, đƣợc đánh dấu reporter và quencher. Khi mẫu dò nguyên vẹn, quencher làm hấp thu tín hiệu huỳnh quang từ reporter do sự cộng hƣởng năng lƣợng huỳnh quang (nguyên lý FRET) do khoảng cách giữa reporter và quencher khá gần nhau. Sự phân cắt của mẫu dò trong khi PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang và máy đo tín hiệu huỳnh quang sẽ ghi nhận đƣợc tín hiệu. Đây là phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng đột biến nhanh, nhạy và chính xác, có giá trị khi xác định tỷ lệ đột biến mtdna thấp. Đột biến A8344G là đột biến không đồng nhất, s dụng real-time PCR với mẫu dò Taqman thông thƣờng đã cho tín hiệu nền cao do việc gắn không đặc hiệu của mẫu dò vào trình tự đích vì vậy không có giá trị để xác định tỷ lệ đột biến thấp. Vì vậy để xác định chính xác tỷ lệ đột biến A8344G thì một trong những thách thức cơ bản là thiết kế mẫu dò Taqman phải có khả năng phân biệt đƣợc các gen đích chỉ khác nhau một nucleotide. Điều này đạt đƣợc khi khoảng cách ΔT m giữa T m của mẫu dò bắt cặp hoàn toàn (mẫu dò match) và T m của mẫu dò bắt cặp không hoàn toàn (mẫu dò mismatch) càng lớn. Khoảng ΔT m càng lớn thì việc lựa chọn nhiệt độ bắt cặp/kéo dài trong phản ứng PCR bên trong khoảng ΔT m càng thuận lợi, mẫu dò sẽ bắt cặp chính xác hơn. 53

65 Trong thí nghiệm này, mẫu dò huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5 của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến và HEX (535/556) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến, còn đầu 3 của mẫu dò có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là BFQ (Black Fluorescence Quencher). Với mục đích tăng nhiệt độ tách chuỗi (T m ) và tính đặc hiệu của mẫu dò, mẫu dò bắt cặp đúng và bắt cặp sai cần có nhiệt độ tách chuỗi (T m ) cao hơn (T m ) của mồi khoảng 10 o C và mẫu dò phải ngắn thì tác động của sự thay đổi một nucleotide càng lớn nên mẫu dò bắt cặp đặc hiệu hơn. Vì vậy, chúng tôi đã cải tiến mẫu dò Taqman dƣới dạng Taqman LNA. LNA là dạng acid nucleic có chứa nucleotide cải biến với cầu methyl giữa vị trí oxy 2 và carbon 4 của gốc đƣờng. Liên kết này đã hạn chế tính linh động của nucleotide bị khóa nên làm tăng độ bền nhiệt và độ đặc hiệu của mẫu dò trong quá trình lai. Điều này làm cho mẫu dò Taqman LNA hấp dẫn hơn khi s dụng để phát hiện đột biến điểm trên hệ gen ty thể. Dựa trên nguyên tắc đã phân tích, chúng tôi đã thiết kế mẫu dò Taqman LNA đặc hiệu để phát hiện đột biến A8344G bằng real-time PCR (Bảng 3.5). Mẫu dò/mồi Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR Vị trí trên Trình tự DNA ty thể RT8344-Fw 5 AGC CCA CTG TAA AGC TAA C RT8344-Rv 5 GGC ATT TCA CTG TAA AGA GGT Wt-8344A-FAM 6FAM-AGA T+TA +A+GA +GA+A +CC- IBFQ Mt-8344G-HEX HEX-GAT +TA+A +GAG +A+GC C-IBFQ Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA 54

66 Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G Đoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí đƣợc nhân bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến đƣợc phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX. Các th nghiệm kiểm tra mẫu dò đƣợc thực hiện s dụng DNA khuôn là plasmid đột biến và không đột biến đƣợc pha loãng bản sao/µl. Qua nhiều lần thăm dò, chúng tôi đã xác định đƣợc nồng độ mẫu dò thích hợp cho phản ứng real-time PCR là 0,02 µmol/l mỗi loại mẫu dò cho 25 l thể tích phản ứng; với hàm lƣợng mẫu dò này thì cƣờng độ huỳnh quang đƣợc ghi nhận là cao nhất. Nhiệt độ bắt cặp của mồi và mẫu dò là 60 o C, đây là nhiệt độ bắt cặp tối ƣu của mẫu dò Taqman, với nhiệt độ bắt cặp này mẫu dò sẽ bắt cặp vào sợi đích trƣớc khi mồi bắt cặp, nhờ đó enzyme Taq DNA polymerase dễ dàng thủy phân mẫu dò, giúp cho việc phát huỳnh quang của reporter. Đoạn DNA ty thể chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí đƣợc khuếch đại bằng PCR s dụng cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến đƣợc phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Mt-8344G-HEX và Wt-8344A-FAM với các plasmid mang đột biến và không mang đột biến ở nồng độ 5x10 6 bản sao để kiểm tra sự hoạt động của mẫu dò và tính đặc hiệu của probe. 55

67 A: Mẫu dò với plasmid mang đột biến 8344G B: Mẫu dò với plasmid không mang đột biến 8344A Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mẫu dò (probe) Kết quả phân tích real-time PCR (hình 3.8) cho thấy khi chạy real-time PCR với plasmid mang đột biến 8344G thì tín hiệu huỳnh quang chỉ lên với kênh HEX 56

68 trong khi phản ứng chứa đồng thời cả 2 mẫu dò Mt-8344G-HEX và Wt-8344A- FAM. Tƣơng tự, với plasmid không mang đột biến (tức chỉ là A8344), thì chỉ có tín hiệu FAM. Kết quả này khẳng định mẫu dò mà chúng tôi thiết kế có khả năng phân biệt đặc hiệu mẫu đột biến và mẫu không đột biến Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp realtime PCR để định lƣợng đột biến A8344G Xác định số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G Để xây dựng đƣờng chuẩn của đoạn gen mang đột biến A8344G thuộc hội chứng MERRF bằng real-time PCR, plasmid mang DNA có đột biến và không đột biến A8344G đƣợc chuẩn bị ở các nồng độ bản sao khác nhau, dựa trên kích thƣớc hay trọng lƣợng phân t và nồng độ của DNA plasmid thu nhận đƣợc. Cụ thể, chúng tôi đã tính đƣợc số bản sao của Plasmid 8344A = 2,1 x bản sao, Plasmid 8344G = 1,7 x bản sao Số bản sao của 2 plasmid đƣợc pha loãng về cùng một nồng độ là 1 x bản sao/µl và đƣợc pha loãng theo hệ số 10 dùng cho các thí nghiệm tiếp theo Xây dựng đường chuẩn của đột biến A8344G S dụng khuôn là hỗn hợp plasmid đột biến và không đột biến theo tỷ lệ 1:1 có nồng độ 5x10 7-5x10 2 bản sao / l. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu chuẩn có số chu kỳ ngƣỡng khác nhau tƣơng quan với số lƣợng DNA đích ban đầu (Bảng 3.6). 57

69 Bảng 3.6: Tƣơng quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định bằng real-time PCR Mẫu dò HEX (cho đột biến) Mẫu dò FAM (cho không đột biến) Số chu kỳ ngƣỡng Số bản copy Số chu kỳ ngƣỡng Số bản copy 16, , , , , , , , , , , , Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR A: Các đường cong biểu thị mức độ nhân bản của các đoạn gen đích, B: Đồ thị thể hiện tương quan gi a logarit số bản sao gen mang đột biến A8344G (đỏ) và không mang đột biến (xanh) với giá trị chu kỳ ngư ng. 58

70 Kết quả phân tích real-time PCR (Hình 3.9) cho thấy đƣờng chuẩn màu xanh là của DNA không mang đột biến và màu đỏ là dạng DNA mang đột biến, tạo ra bằng việc s dụng các tỷ lệ nồng độ khác nhau giữa plasmid chứa đoạn gen ty thể mang đột biến A8344G và không mang đột biến có độ tuyến tính cao, giá trị của hệ số tƣơng quan R 2 giữa số bản sao DNA ty thể và số chu kỳ ngƣỡng với mẫu dò Wt- 8344A-FAM (không mang đột biến) là 0,999 và Mt-8344G-HEX (mang đột biến) là 0,999, hiệu quả PCR nằm trong khoảng %. Slope của probe Wt-8344A-FAM là -3,458, probe Mt-8344G-HEX là -3,317. Nhằm kiểm tra độ nhạy và độ tin cậy của phƣơng pháp chúng tôi đã tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn tỷ lệ đột biến bằng cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến là 0,01% - 100% đột biến bằng cách trộn plasmid mang đột biến và không đột biến với các thể tích nồng độ tƣơng ứng (Bảng 3.7). Sau đó chúng tôi tiến hành định lƣợng mẫu chuẩn và xây dựng đồ thị sự tƣơng quan tuyến tính giữa phần trăm tỷ lệ độ biến thực tế và lí thuyết. Đánh giá độ nhạy và độ tin cậy của phƣơng pháp (Hình 3.10). Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn Tỷ lệ đột biến (%) Plasmid đột biến (µl) Plasmid không đột biến (µl) 0,01 1 x ,99 x ,1 1 x ,9 x x x x x x x x x x x x x

71 Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn. % đột biến lý thuyết % đột biến thực tế 0,01 0,0 0,1 0,3 1 1,4 10 8, , , , ,0 Hình Sự tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết Kết quả thu đƣợc ở hình 3.10 cho thấy giới hạn phát hiện đột biến của phƣơng pháp thiết lập đƣợc là 0,1%, sự tƣơng quan tuyến tính giữa tỷ lệ đột biến thực tế và lý thuyết có độ tin cậy cao (R 2 = 0,997). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho kết quả giống nhau. Nhƣ vậy đƣờng chuẩn chúng tôi thiết lập đƣợc có độ tin cậy và độ nhạy tƣơng đƣơng với nghiên cứu của Trƣơng Thị Huệ và tập thể (2012) trong việc xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng đột biến A3243G bằng 60

72 phƣơng pháp real-time PCR s dụng mẫu dò Taq man LNA (độ nhạy đạt 0,1%, R 2 =0,999) [1] Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lƣợng đột biến A8344G Trong 312 mẫu bệnh phẩm đã sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, chúng tôi không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến A8344G. Để khẳng định thêm về kết quả này chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3, BN4, BN5) và th nghiệm bằng phƣơng pháp real-time PCR đã đƣợc thiết lập ở trên. Kết quả định lƣợng ở hình 3.11 cho thấy cả 5 mẫu bệnh phẩm đƣợc th nghiệm chỉ thu đƣợc tín hiệu FAM, là tín hiệu không đột biến trong khi đó tín hiệu HEX là tín hiệu đột biến đều không phát hiện đƣợc. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có độ tuyến tính cao (R 2 > 0,99). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho kết quả giống nhau. Vì vậy chúng tôi một lần nữa khẳng định 5 mẫu bệnh phẩm này đều không mang đột biến A8344G, sự phù hợp về kết quả của hai phƣơng pháp PCR- RFLP và real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang LNA. Hình Thử nghiệm định lƣợng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR 61

73 3.3. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP Nhƣ đã nêu ở trên, qua sàng lọc bằng PCR-RFLP, chúng tôi đã không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang các đột biến A8344G, T8356C và G8363A thuộc hội chứng MERRF. Để một lần nữa khẳng định kết quả nghiên cứu bằng PCR- RFLP là chính xác chúng tôi đã lựa chọn 29 mẫu bệnh nhân nghi ngờ (Phụ lục 1) bị hội chứng MERRF với triệu chứng rõ nhất để giải trình tự đoạn gen thuộc vùng các đột biến này Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF trên hệ gen ty thể. Đoạn gen ty thể dài 1137 bp của 29 bệnh nhân nghi bị MERRF đƣợc chúng tôi nhân gen từ phản ứng PCR với khuôn là mẫu DNA bệnh phẩm đƣợc nhân lên bằng PCR và giải trình tự nucleotide s dụng mồi theo cả hai chiều. Kết quả phân tích trình tự thu đƣợc cho thấy không có trƣờng hợp nào mang đột biến A8344G, T8356C và G8363A của hội chứng MERRF (Hình 3.12). Nhƣ vậy, kết quả xác định trình tự một lần nữa khẳng định kết quả phân tích bằng PCR-RFLP là chính xác và đáng tin cậy. 62

74 Hình Kết quả blast của trình tự đoạn gen ty thể của 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J