96 TESTE METODĂ IMUNOENZIMATICĂ PENTRU DETECŢIA CALITATIVĂ ÎN SER SAU PLASMĂ UMANĂ A ANTICORPILOR IgM ANTI-HSV 1+2

Transcription

1 96 TESTE METODĂ IMUNOENZIMATICĂ PENTRU DETECŢIA CALITATIVĂ ÎN SER SAU PLASMĂ UMANĂ A ANTICORPILOR IgM ANTI-HSV 1+2

2 1. DESTINAŢIA TRUSEI Platelia HSV 1+2 IgM este o metodă imunoenzimatică de tip ELISA de captură pentru detecţia calitativă în ser sau plasmă umană a anticorpilor IgM specifici de virus Herpes simplex de tip 1 sau VALOAREA CLINICĂ Virusul Herpes simplex (HSV) este un patogen uman răspândit pe întregul mapamond. S-au descris două subtipuri serologice: HSV-1 şi HSV-2. HSV-1 este asociat mai ales cu infecţia limbii, gurii, buzelor, faringelui şi a ochilor, în timp ce HSV-2 este responsabil îndeosebi de infecţii genitale şi neonatale. Cu toate acestea, ambele tipuri pot determina infecţii genitale, iar HSV-1 este recunoscut din ce în ce mai des ca agent etiologic al infecţiilor genitale. Virusul Herpes simplex se transmite prin contactul direct cu secreţiile persoanelor infectate, indiferent dacă sunt simptomatice sau nu. De fapt, majoritatea infecţiilor genitale se transmit în absenţa oricăror simptome. Infecţia primară cu HSV se poate stabili la orice vârstă, interesând atât nou-născuţii, copiii, cât şi adulţii. După infecţia primară cu HSV, virusul colonizează neuronii senzoriali, iar infecţia latentă se poate reactiva, cauzând o infecţie clinică recurentă. Femeile însărcinate infectate cu HSV pe perioada gravidităţii pot transmite virusul la copil, înainte de sau în cursul naşterii. Infecţiile in utero pot determina avorturi spontane şi naşteri premature. Infecţiile congenitale şi neonatale pot fi cauzate de o infecţie maternă cu HSV, primară sau recurentă, simptomatică sau asimptomatică, şi pot avea drept consecinţă infecţii tegumentare, oculare sau orale ale fătului, dar şi leziuni ale sistemului nervos central. În cursul unei infecţii primare, anticorpii IgM apar în general între 3 şi 7 zile de la debutul simptomelor. Titrul IgM creşte timp de patru până la şase săptămâni, apoi scade până la nivele nedetectabile după două luni. IgM pot fi detectate uneori şi în cursul infecţiilor recurente. Cu toate acestea, producţia şi detecţia IgM anti-hsv la pacienţii cu infecţii recurente sunt mai puţin previzibile şi pot fi corelate cu severitatea infecţiei. Anticorpii IgG anti-hsv apar de obicei după una până la două săptămâni de la debutul infecţiei şi persistă toată viaţa cu nivele variabile. Prezenţa anticorpilor IgG anti-hsv nu permite diferenţierea unei infecţii recente cu Herpes simplex de o expunere în antecedente (infecţie latentă sau reactivare) la virus. În asemenea situaţii, se pot observa IgM remanente, iar detecţia anticorpilor IgM anti-hsv poate fi neconcludentă. Totuşi, detecţia anticorpilor IgM anti-hsv este importantă în cursul fazei precoce a unei infecţii acute, atunci când IgG anti-hsv pot să nu fie încă prezente (2). 2

3 3. PRINCIPIUL TESTĂRII Platelia HSV 1+2 IgM este un test ce permite detecţia calitativă a anticorpilor IgM anti-hsv 1 şi 2 în ser sau plasmă umană, prin analiză imunoenzimatică de captura a IgM în fază solidă. Microplaca este sensibilizată cu anticorpi anti-lanţuri µ umane. Un antigen HSV marcat cu peroxidază serveşte de conjugat. Realizarea testului necesită parcurgerea următoarelor etape: Etapa 1 Probele biologice de cercetat precum şi calibratorul şi controalele se diluează 1/21 şi apoi se pipetează în godeurile microplăcii. În timpul acestei incubări de 1 oră la 37 C, IgM prezente în proba de cercetat sunt captate de anticorpii anti-µ fixaţi în godeurile microplăcii. IgG şi celelalte proteine serice nelegate sunt eliminate prin spălări la sfârşitul perioadei de incubare. Etapa 2 Conjugatul, alcătuit din antigen HSV marcat cu peroxidază, se distribuie în toate godeurile microplăcii. Pe durata acestei incubări de 1 oră la 37 C, dacă proba de cercetat conţine anticorpi IgM specifici de HSV, aceştia vor fixa conjugatul. Conjugatul în exces, nelegat, se elimină prin spălările de la terminarea incubării. Etapa 3 Prezenţa complexelor imune (anti-lanţuri µ umane / IgM anti-hsv / antigen HSV marcat cu peroxidază) formate eventual este evidenţiată prin adăugarea în fiecare godeu a unei soluţii de revelare enzimatică. Etapa 4 După incubarea la temperatura ambiantă ( C), reacţia enzimatică este oprită prin adăugarea unei soluţii de acid sulfuric 1N. Densitatea optică citită la 450/620 nm, interpretată în funcţie de o valoare prag, permite confirmarea sau infirmarea prezenţei IgM anti-hsv în proba testată. 3

4 4. CONŢINUTUL TRUSEI Reactivii furnizaţi sunt în cantităţi suficiente pentru 96 de determinări. Toţi reactivii sunt destinaţi în exclusivitate diagnosticului in vitro. Marcaj Natura reactivilor Prezentare R1 Microplate Microplaca (gata de lucru): 12 barete cu 8 godeuri detaşabile, sensibilizate cu anticorpi anti-lanţuri µ umane R2 R3 Concentrate d Washing Solution (20x) Negative Control Soluţie de spălare (20x): Tampon TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Conservant: < 1,5% ProClin 300 Control negativ: Ser uman negativ pentru anticorpi IgM anti-hsv, AgHBs şi anticorpi anti-hiv1, anti-hiv2 şi anti-hcv Conservant: < 1,5% ProClin 300 R4 Calibrator Calibrator: Ser uman reactiv pentru IgM anti-hsv şi negativ pentru AgHBs, anticorpi anti- HIV1, anti-hiv2 şi anti-hcv Conservant: < 1,5% ProClin 300 R5 Positive Control Control pozitiv: Ser uman reactiv pentru anticorpi IgM anti-hsv, şi negativ pentru AgHBs, anti- HIV1, anti-hiv2 şi anti-hcv Conservant: < 1,5% ProClin 300 R6 Conjugate Conjugat (gata de lucru): Lizat de antigen viral şi proteină gg1, marcate cu peroxidază Conservant: < 1,5% ProClin 300 R7 Diluent Diluant pentru probe (gata de lucru): Tampon Tris (ph 8,5), lapte, roşu fenol Conservant: < 1,5% ProClin 300 R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Cromogen (gata de utilizare): tetrametil benzidină (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) Soluţie de stopare (gata de lucru): Soluţie de acid sulfuric 1N 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2 x 13 ml 1 x 40 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Folii adezive 4 4

5 Pentru condiţii de depozitare şi data expirării, consultaţi indicaţiile menţionate pe ambalaj. 5. AVERTISMENTE ŞI PRECAUŢII Calitatea rezultatelor depinde de respectarea următoarelor Bune Practici de Laborator: Nu folosiţi reactivi expiraţi Nu amestecaţi şi nu asociaţi reactivi din loturi diferite într-o rundă de lucru dată. OBSERVAŢIE: Pentru soluţia de spălare (R2, etichetată: 20X, scris cu verde), cromogen (R9, etichetat: TMB, scris cu turcoaz) şi soluţia de stopare (R10, etichetată: 1N, scris cu roşu), este posibil să se folosească alte loturi decât cele din trusa curentă, cu condiţia ca aceşti reactivi să fie strict echivalenţi şi să se folosească numai un singur lot într-o rundă de lucru dată. OBSERVAŢIE: În plus, soluţia de spălare (R2, etichetată: 20x, scris cu verde) se poate amesteca cu celelalte 2 soluţii de spălare incluse în diverse truse de reactivi Bio-Rad (R2, etichetate: 10x, scris cu albastru, sau 10x scris cu portocaliu), dacă sunt reconstituite corect şi cu condiţia ca într-o rundă de lucru să se folosească un singur amestec. Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 de minute pentru a permite reactivilor să atingă temperatura camerei ( C). Reconstituiţi sau diluaţi cu grijă reactivii, evitând orice contaminare. Nu efectuaţi testarea în prezenţa vaporilor reactivi (acizi, alcalini, aldehidici) sau în încăperi prăfuite, ce pot altera activitatea enzimatică a conjugatului. Folosiţi sticlărie temeinic spălată sau clătită cu apă deionizată sau, de preferinţă, vase de unică întrebuinţare. Spălarea microplăcii este o etapă critică în protocolul de testare: respectaţi numărul recomandat de cicluri de spălare şi asiguraţivă că toate godeurile sunt bine umplute şi apoi complet golite. Spălările incorecte pot conduce la rezultate eronate. Nu lăsaţi microplaca să se usuce între sfârşitul spălărilor şi distribuţia reactivilor. Nu folosiţi niciodată acelaşi recipient pentru distribuţia conjugatului şi a soluţiei de developare. Observaţie : deoarece conjugatul conţine în mod particular peroxidază concentrată, orice contact cu soluţia de TMB (picături, spumă) poate antrena rezultate fals pozitive. Evitaţi distribuirea conjugatului în apropierea oricărui material (vârfuri de pipetă, stative) ce ar putea fi folosit la distribuirea TMB. 5

6 Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la metale şi ionii acestora. Prin urmare, nu permiteţi contactul niciunui element metalic cu diversele soluţii ce conţin conjugat sau cromogen. Soluţia de cromogen (R9) trebuie să fie incoloră. Apariţia unei coloraţii albastre indică imposibilitatea utilizării reactivului, iar acesta trebuie înlocuit. Folosiţi un vârf de pipetă nou la pipetarea fiecărei probe. Verificaţi pipetele şi celelalte echipamente pentru precizie şi operarea corectă. INSTRUCŢIUNI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII Materialul de origine umană folosit la prepararea reactivilor a fost testat şi găsit nereactiv pentru antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B (AgHBs), anticorpii specifici de virus hepatitic C (anti-hcv) şi anticorpii specifici de virusul imunodeficienţei umane (anti-hiv1 şi anti-hiv2). Deoarece nici o metodă de testare cunoscută nu poate garanta absenţa totală a agenţilor infecţioşi, manipulaţi reactivii de provenienţă umană precum şi probele bolnavilor ca potenţial capabile de a transmite boli infecţioase. Orice material, inclusiv soluţiile de spălare, ce vine în contact direct cu probele şi reactivii ce conţin materiale din sursă umană trebuie considerate contaminante. Nu pipetaţi cu gura. Evitaţi stropirea cu probe sau soluţii ce conţin probe. Picăturile se tratează cu clor menajer diluat la 10%. În eventualitatea stropirii cu acizi, neutralizaţi mai întâi cu bicarbonat de sodiu, apoi curăţaţi cu clor menajer diluat la 10% şi uscaţi în final cu şerveţele absorbante. Materialele folosite la curăţenie se aruncă în containerul de deşeuri contaminate. Probele bolnavilor, reactivii ce conţin materiale de provenienţă umană, precum şi materialele şi produsele contaminate trebuie eliminate numai după decontaminare: fie prin scufundare în clor la concentraţie finală de 5 % hipoclorit de sodiu, timp de 30 de minute, Fie prin autoclavarea la 121 C, timp de minim 2 ore. ATENŢIE: Nu introduceţi în autoclavă soluţii ce conţin hipoclorit de sodiu Evitaţi orice contact al soluţiei de stopare cu pielea şi mucoasele Deşeurile chimice şi biologice trebuie manipulate şi eliminate în conformitate cu Bunele Practici de Laborator. Toţi reactivii din trusă sunt destinaţi în exclusivitate diagnosticului in vitro. 6

7 Xi - Iritant Atenţie: Unii reactivi conţin ProClin 300 <1,5% R43: Poate determina sensibilizare la contactul cu tegumentele. S28-37: După contactul cu pielea, spălaţi cu multă apă şi săpun. Purtaţi mănuşi potrivite 6. RECOLTAREA, PREGĂTIREA ŞI DEPOZITAREA PROBELOR 1. Tipurile de probă recomandate sunt seruri sau plasmă (recoltată pe EDTA, heparină sau citrat). 2. Observaţi recomandările ce urmează, la manipularea, prelucrarea şi depozitarea probelor de sânge: Recoltaţi toate probele de sânge luând precauţiile necesare pentru venopuncţie. În cazul serurilor, aşteptaţi coagularea completă a probelor înainte de centrifugare. Păstraţi eprubetele închise în permanenţă. După centrifugare, separaţi serul sau plasma de cheag şi de hematii în eprubete de stocare foarte bine închise. Probele se pot păstra la frigider (+2-8 C) dacă testarea se efectuează în decurs de 7 zile. În caz contrar, sau dacă probele trebuie expediate, congelaţi-le la -20 C sau mai rece. Nu folosiţi probe dezgheţate de mai mult de 5 ori. Probele congelate în prealabil trebuie foarte bine omogenizate la vortex, după dezgheţare şi înainte de testare. 3. Probele ce conţin 90 g/l de albumină sau 100 mg/l de bilirubină indirectă (neconjugată), probele lipemice ce conţin echivalentul a 36 g/l de trioleină (trigliceride), precum şi cele hemolizate cu până la 10 g/l de hemoglobină, nu afectează rezultatele. 4. Nu trataţi termic probele de testat. 7. PROCEDEUL DE TESTARE 7.1 MATERIALE NECESARE NFURNIZATE Vortex Cititor de microplăci echipat cu filtre de 450 nm şi 620 nm (*). Incubator de microplăci termostatat reglat la 37±1 C (*). Spălător de microplăci, semi-automat sau manual (*). 7

8 Apă distilată sau deionizată sterilă. Mănuşi de unică întrebuinţare. Mască sau ochelari de protecţie. Hârtie de filtru sau şerveţele absorbante. Pipete sau pipete multi-canal, automate sau semiautomate, reglabile sau fixe, pentru măsurarea şi pipetarea volumelor de la 10 la 1000 µl, precum şi 1 ml, 2 ml şi 10 ml. Cilindri gradaţi cu capacităţi de 25 ml, 50 ml, 100 ml şi 1000 ml. Hipoclorit de sodiu (clor menajer) şi bicarbonat de sodiu. Container pentru deşeuri cu risc biologic. Eprubete de unică folosinţă (*) Consultaţi serviciul nostru tehnic pentru informaţii amănunţite referitoare la echipamentele recomandate 7.2 RECONSTITUIREA REACTIVILOR R1: Aduceţi reactivii la temperatura camerei ( C) cu 30 de minute înainte de a deschide ambalajul. Scoateţi cadrul suport, reţineţi numărul necesar de barete şi returnaţi-le în pungă imediat pe cele rămase, verificând ca deshidratantul să rămână în interior. Resigilaţi punga cu grijă şi depozitaţi la +2-8 C. R2: Diluaţi soluţia de spălare R2 1/20 în apă distilată: de exemplu, 50 ml de R2 cu 950 ml de apă distilată, pentru a obţine soluţia de spălare gata de lucru. Dacă spălaţi manual, preparaţi 350 ml de soluţie de spălare diluată pentru 1 placă de 12 barete. R3, R4, R5: Diluaţi în proporţie de 1/21 în Diluant (R7) (exemplu: 15 µl de R µl de R7) PĂSTRAREA ŞI VALABILITATAE REACTIVILOR DESCHIŞI ŞI / SAU RECONSTITUIŢI Trusa trebuie păstrată la +2-8 C. Dacă trusa se păstrează la +2-8 C înainte de deschidere, fiecare componentă a trusei se poate folosi până la data de expirare indicată pe eticheta externă a trusei. R1: Odată desigilate, baretele rămân stabile timp de maxim 8 săptămâni, dacă sunt depozitate la +2-8 C, în acelaşi ambalaj resigilat atent (în care nu uitaţi să verificaţi prezenţa substanţei deshidratante). R2: Odată diluată, soluţia de spălare poate fi păstrată timp de 2 săptămâni la C. După deschidere, soluţia de spălare concentrată păstrată la C, în absenţa oricărei contaminări, este stabilă până la data expirării indicată pe etichetă. 8

9 R9: După deschidere şi în absenţa oricărei contaminări, reactivul păstrat la +2-8 C este stabil timp de maxim 8 săptămâni. R10: După deschidere şi în absenţa oricărei contaminări, reactivul păstrat la +2-8 C este stabil până la data de expirare indicată pe etichetă PROTOCOLUL DE LUCRU Respectaţi cu stricteţe procedeul de testare şi bunele Practici de Laborator. Înainte de utilizare, lăsaţi reactivii să se stabilizeze la temperatura camerei ( C). Godeurile detaşabile necesită atenţie specială în timpul manipulării. La fiecare serie de testare, folosiţi calibratorul şi controalele furnizate în vederea validării rezultatelor testării. 1. Stabiliţi cu atenţie planul de repartizare şi identificare în placă a probelor pacienţilor şi a controalelor 2. Pregătiţi soluţia de spălare diluată (R2) [consultaţi capitolul 7.2] 3. Scoateţi cadrul suport şi baretele (R1) din ambalajul protector [consultaţi capitolul 7.2]. 4. Folosind eprubete etichetate corespunzător, diluaţi calibratorul şi Controalele (R3, R4, R5) şi probele bolnavilor (P1, P2, ) în Diluant (R7) realizând o diluţie de 1/21: 300 µl de Diluant (R7) şi 15 µl din probă. Omogenizaţi probele diluate la vortex. 5. Respectând cu stricteţe schema indicată mai jos, repartizaţi în fiecare godeu 200 µl din calibratorul diluat, controalele diluate şi probele de la bolnavi, diluate: 6. Acoperiţi microplaca cu o folie adezivă, apoi apăsaţi cu putere deasupra pentru a asigura etanşeitatea. Incubaţi microplaca imediat într-o baie de apă termostatată sau incubator uscat, timp de 1 oră ± 5 minute la 37 C ± 1 C. 7. La terminarea primei etape de incubare, îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container pentru deşeuri biologice (ce conţine hipoclorit de sodiu). Spălaţi microplaca de 5 ori cu câte 350 µl de soluţie de spălare (R2) per 9

10 godeu. Răsturnaţi microplaca şi tapotaţi pe hârtie de filtru în vederea eliminării lichidului rezidual. 8. Repartizaţi imediat câte 200 µl de soluţie de conjugat (R6) în fiecare godeu [Atenţie - Consultaţi capitolul 5]. 9. Acoperiţi microplaca cu o nouă folie adezivă, apoi presaţi folia cu putere deasupra plăcii pentru a asigura etanşeitatea. Incubaţi microplaca imediat în baia de apă termostatată sau incubatorul uscat, timp de 1 oră ± 5 minute la 37 C ± 1 C. 10. La expirarea celei de-a doua etape de incubare, îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container pentru deşeuri biologice (ce conţine hipoclorit de sodiu). Spălaţi microplaca de 5 ori cu câte 350 µl de soluţie de spălare (R2) per godeu. Răsturnaţi microplaca şi tapotaţi pe hârtie de filtru în vederea eliminării lichidului rezidual. 11. Pipetaţi rapid în fiecare godeu şi protejat de lumină câte 200 µl de soluţie de Cromogen (R9). Lăsaţi reacţia să se dezvolte la întuneric timp de 30 ± 5 minute, la temperatura camerei ( C). NU aplicaţi folie adezivă pe durata acestei incubări. 12. Stopaţi reacţia enzimatică prin adăugarea a 100 µl de soluţie de stopare (R10) în fiecare godeu. Pipetaţi în aceeaşi ordine şi cu aceeaşi viteză cu care aţi pipetat şi soluţia de revelare enzimatică. 13. Ştergeţi cu grijă fundul plăcii. Citiţi densitatea optică la cititorul de microplăci la 450/620 nm, în 30 de minute de la stoparea reacţiei. Înainte de citire, protejaţi întotdeauna baretele de expunerea la lumină. 14. Înainte de a transcrie rezultatele, verificaţi corespondenţa dintre citiri şi planul de distribuţie a probelor în microplacă (diagrama plăcii). 8. INTERPRETAREA REZULTATELOR 8.1. CALCULUL VALORII CUT-OFF (CO) Valoarea cut-off (CO) corespunde valorii medii a densităţilor optice (DO) obţinute pentru duplicatele calibratorului (R4): CO = media DO R4 8.2 CALCULUL RAPOARTELOR DE REACTIVITATE ALE PROBELOR R = DO probă / CO 8.3. CONTROLUL DE CALITATE Includeţi calibratorul şi controalele în fiecare microplacă şi fiecare serie de testare şi analizaţi rezultatele obţinute. În vederea validării testării, trebuie întrunite criterii următoare: 10

11 Valorile densităţilor optice: CO 0,200 0,80 x CO < DO R4 Replicat 1 < 1,20 x CO 0,80 x CO < DO R4 Replicat 2 < 1,20 x CO (DO individuale ale fiecărui duplicat de Calibrator (R4) nu trebuie să difere cu mai mult de 20% din valoare CO). Rapoartele densităţilor optice: R pentru R3 (DO R3 / CO) 0,60 R pentru R5 (DO R5 / CO) 1,50 Dacă aceste criterii de control de calitate nu sunt îndeplinite, seria de testare trebuie repetată. 8.4 INTERPRETAREA REZULTATELOR Raport de reactivitate probă (R) Rezultat Interpretare R < 0,90 Negativ Proba este considerată nereactivă pentru prezenţa anticorpilor IgM anti- HSV-1 şi anti-hsv-2 0,90 R < 1,10 Echivoc Proba este considerată incertă pentru prezenţa anticorpilor IgM anti-hsv-1 şi/sau anti-hsv-2. Rezultatul trebuie confirmat printr-o altă testare efectuată pe o a doua probă. R 1,10 Pozitiv Proba este considerată reactivă pentru prezenţa anticorpilor IgM anti-hsv-1 şi/sau anti-hsv GHID DE PROBLEME Reacţiile invalide sau nereproductibile sunt adesea cauzate de: Spălările inadecvate ale microplăcii. Contaminarea probelor negative cu ser sau plasmă cu titru înalt de anticorpi. Contaminarea soluţiei de developare cu agenţi chimici oxidanţi (clor, hipoclorit, ioni metalici ) Contaminarea soluţiei de Stopare. 11

12 9. PERFORMANŢELE ACESTUI TEST Platelia HSV 1+2 IgM a fost evaluată în 2 locaţii diferite pe un total de 595 probe. Rezultatele obţinute cu Platelia HSV 1+2 IgM au fost comparate cu rezultatele obţinute cu o altă trusă EIA comercială. 9.1 PREVALENŢA Determinarea prevalenţei anticorpilor IgM specifici de Virus Herpes Simplex Tip 1+2 în ser uman a fost estimată folosind un panel de 89 de probe recoltate de la femei gravide. S-au obţinut următoarele rezultate: 66 negative, 7 dubioase şi 16 pozitive. Prevalenţa stabilită cu trusa Platelia HSV 1+2 IgM a fost de 18,0 % (16/89). 9.2 SPECIFICITATEA RELATIVĂ Specificitatea a fost estimată pe un total de 480 de probe: În locaţia 1, un panel de 233 de probe de la donatori, femei gravide, solicitări de serologie HSV şi un panel comercial (BBI (A) ). În locaţia 2, un panel de 247 de probe de la pacienţi spitalizaţi. În ambele locaţii, probele au fost selectate pe baza rezultatelor negative obţinute cu un test EIA comercial pentru IgM şi considerat de referinţă. Panel de probe Negative Dubioase (1) Pozitive Specificitate relativă Locaţie 1 N = Locaţie 2 N = Total N = ,3% (180/211) [79,8%-99,8%] 87,7% (207/236) [82,8%-91,6%] 86,6% (387/447) [83,0%-89,6%] (1) Rezultatele incerte au fost eliminate din calculul specificităţii [IC 95%]: interval de confidenţă de 95% (A) : Panel BBI HSV cu titru mixt. Trebuie observat că, din cele 60 de seruri găsite dubioase sau pozitive cu Platelia HSV 1+2 IgM, 47 au fost pozitive şi la testarea cu Platelia HSV 1 IgG şi/sau Platelia HSV 2 IgG. 12

13 Mai mult decât atât, un ser din panelul BBI testat pozitiv cu trusa Platelia HSV 1+2 IgM şi negativ atât cu trusa EIA IgM comercială cât şi cu trusele Platelia HSV 1 IgG şi Platelia HSV 2 IgG, a fost testat pozitiv 6 alte teste IgM diferite. 9.3 SENSIBILITATEA RELATIVĂ Sensibilitatea a fost estimată pe un total de 87 probe: în locaţia 1, un panel de 71 probe de la donatori de sânge, gravide, solicitări de serologie HSV şi un panel comercial (BBI (A) ). în locaţia 2, un panel de 16 probe de la pacienţi spitalizaţi. În ambele locaţii probele au fost selectate pe baza rezultatelor negative obţinute cu o trusă comercială EIA pentru IgM, considerată de referinţă. Panel de probe Negative Dubioase (1) Pozitive Sensibilitate relativă Locaţie 1 N = Locaţie 2 N = Total N = ,0% (66/71) [84,3%-97,7%] 86,7% (13/15) [59,5%-98,3%] 91,9% (79/86) [84,0%-96,7%] (1) Rezultatele incerte au fost eliminate din calculul specificităţii Trebuie să se ţină seamă de faptul că, din cele 7 seruri găsite negative cu Platelia HSV 1+2 IgM, 3 au fost testate pozitive cu Platelia HSV 1 IgG (72820) şi/sau Platelia HSV 2 IgG (72821). 9.4 SEROCONVERSIILE Dintr-un panel de 33 de pacienţi cu seroconversie, 22 au fost testaţi simultan pozitivi sau dubioşi cu trusa Platelia 1+2 IgM precum şi cu un alt test EIA IgM comercial. De asemenea, 7 au fot mai întâi detectaţi la testarea cu Platelia 1+2 IgM, 3 au fost găsiţi pozitivi numai cu trusa EIA IgM comercială, iar 1 ser nu a fost detectat de niciunul dintre teste. 13

14 9.5. PRECIZIA Precizia intra-testare (repetabilitatea) : Pentru evaluarea repetabilităţii intra-testare, au fost testate 1 probă negativă, 1 probă incertă şi 1 probă pozitivă, de 30 de ori în aceeaşi serie de testare. Raportul de reactivitate (DO probă / CO) a fost determinat pentru fiecare probă în parte. Rapoartele medii, deviaţiile standard (DS) şi coeficienţii de variaţie (CV %) pentru cele trei tipuri de probe menţionate sunt listate în tabelul de mai jos. Precizia intra-testare (repetabilitate) N=30 Proba negativă Proba slab pozitivă Proba intens pozitivă Raport (DO probă / Valoare CO) Medie 0,32 2,22 4,06 DS 0,01 0,20 0,10 CV % 2,8 9,0 2,4 Precizia inter-testări (reproductibilitate): Pentru evaluarea preciziei inter-testări, au fost analizate 4 probe (1 negativă şi 3 pozitive), în duplicate, în două serii de testare pe zi, timp de 20 de zile. Rapoartele de reactivitate (DO probă / CO) au fost determinate pentru fiecare probă testată. Mediile rapoartelor de reactivitate, deviaţia standard (DS) şi coeficienţii de variaţie (CV %) obţinuţi pentru fiecare probă testată sunt prezentaţi în tabelul următor. Precizia inter-testări (reproductibilitate) N = 80 Proba negativă Proba slab pozitivă Proba mediu pozitivă Proba intens pozitivă Rapoarte de reactivitate (DO probă / Valoare CO) Medie 0,40 1,63 3,48 6,68 DS 0,09 0,12 0,22 0,43 CV % 21,9 7,6 6,3 6,4 14

15 9.6 REACŢIILE ÎNCRUCIŞATE Un număr de 129 probe, având caracteristici potenţial generatoare de reacţii nespecifice, au fost testate cu trusa Platelia HSV 1-2 IgM. Rezultatele sunt prezentate în următorul tabel: Număr de probe Număr de seruri pozitive în Platelia HSV 1+2 IgM HIV 10 0 CMV IgM 9 0 Rubella IgM 10 0 EBV IgM 10 0 Toxo IgM 9 1 VZV IgM 19 4 Rujeolă IgM 10 0 Anticorpi antinucleari (ANA) 10 0 Oreion IgM 10 3 Factor reumatoid 10 2 HHV6 9 0 HPV 3 2 Observaţie: rezultatele dubioase au fost excluse din calculul reactivităţii încrucişate. Toate rezultatele pozitive obţinute cu trusa Platelia HSV 1+2 IgM au fost găsite negative testarea cu trusa ELISA comercială. Toate rezultatele pozitive obţinute cu trusa Platelia HSV 1+2 IgM au fost găsite pozitive pentru HSV 1 IgG şi/sau HSV 2 IgG, cu excepţia a două probe pozitive pentru VZV. 10. LIMITELE METODEI Diagnosticul infecţiei cu virusul HSV nu se poate stabili definitiv decât luând în considerare ansamblul datelor clinice şi biologice. Rezultatul 15

16 unei singure testări pentru detecţia anticorpilor IgM anti-hsv nu reprezintă în sine o dovadă suficientă pentru a pune diagnosticul de infecţie virala cu Herpes simplex, deoarece IgM pot fi prezente şi în infecţiile recurente (2). Dată fiind omologia antigenică din familia Herpesviridae, nu se pot exclude reacţiile încrucişate cu membrii acestei familii virale. 11. CONTROLUL DE CALITATE LA PRODUCĂTOR Toţi reactivii produşi şi comercializaţi de compania Bio-Rad se află sub sistemul complet de asigurare a calităţii, începând cu recepţia materiilor prime şi până la punerea pe piaţă a produsului finit. Fiecare lot este supus controlului de calitate şi este eliberat la vânzare numai atunci când îndeplineşte criteriile de admitere. Toate înregistrările referitoare la producţia şi controlul fiecărui lot sunt păstrate la producător. 12. BIBLIOGRAFIE A se vedea şi versiunea în limba engleză. 1. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines MMWR 2002:51 (No. RR-6). 2. R. Morrow and D. Friedrich, Clin. Microbiol. Infect, 2006, 12 : Performance of a novel test for IgM and IgG antibodies in subjects with culture-documented genital herpes simplex virus-1 or -2 infection. 16

17 CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) Marcodo CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In vitro-diagnostika) Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) Marca CE (Directiva europeană 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro For in vitro diagnostic use Pour diagnostic in vitro Para diagnóstico in vitro In vitro-diagnostikum Per uso diagnostico in vitro Para uso em diagnóstico in vitro In vitro diagnostic In vitro diagnose Pentru diagnostic in vitro Manufacturer Fabricant Fabricante Hersteller Produttore Fabricante Tillverkad av Fremstillet af Producător Batch code Code du lot Código de lote Chargen-Bezeichnung Codice del lotto C6digo do Iote Batch nr. Batchkoden Număr de lot Storage temperature limitation Limites de températures de stockage Temperatura limite Lagerungstemperatur Limiti di temperatura di conservazione Limites de temperatura de armazenamento Temperaturbegränsning Temperaturbegrænsning Limitele de temperatură la stocare Catalogue number Référence catalogue Número de catálogo Bestellnummer Numero di catalogo Número de catálogo Katalognummer Katalognummer Număr de catalog Authorised Representative Représentant agréé Representante autorizado Bevollmächtigter Distributore autorizzato Representante Autorizado Auktoriserad representant Autoriseret repræsentant Reprezentant autorizat Expiry date YYYY/MM/DD Date de péremption AAAA/MM/JJ Estable hasta AAAA/MM/DD Vervvendbar bis JJJJ/MM/TT Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG Data de expiração AAAA/MM/DD Utgångsdatum År/Månad/Dag Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD Data expirării AAAA/LL/ZZ Consult Instruction for use Consulter Ie mode d'emploi Consulte Ia instrucción para el uso Siehe Gebruchsanweisung Consultare Ie istruzioni per uso Consulte o folheto Informativo Se instruktionsanvisning vid användning Se instruktion før brug Consultaţi prospectul de utilizare The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Alte traduceri cerute în conformitate cu Directiva Europeană se pot solicita la reprezentanţa Bio-Rad locală. 17