P R O S P E C T U L P R O D U S U L U I

Transcription

1 Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, Connecticut SUA Tel: +1 (203) sau linia gratuită (888) în S.U.A., Canada şi Puerto Rico, Fax: +1 (203) Informaţii despre produs şi traduceri disponibile la: P R O S P E C T U L P R O D U S U L U I KIT DE TIPIZARE LIFECODES SSO HLA Alelă Nulă A se utiliza pentru diagnosticarea in vitro CUPRINS Definirea simbolurilor... 1 Instrucţiuni de utilizare... 4 Kit-uri/Reactivi în funcţie de număr de A. Purificarea ADN-ului genomic... 4 catalog... 2 Domeniul de utilizare... 2 B. Amplificarea ADN-ului (PCR)... 4 Sumar şi explicaţie... 2 C. Hibridizare... 5 Principiile procedurii... 2 D. Analiza cu aparatul Luminex... 5 Reactivi... 3 Rezultate... 6 A. Identificare... 3 Controlul calităţii... 6 B. Avertizări şi precauţii... 3 Limitările procedurii... 6 C. Instrucţiuni de depozitare... 3 Probleme tehnice... 7 D. Purificarea sau tratamentul Valori prevăzute... 7 necesar pentru utilizare... 3 E. Indicaţii privind instabilitatea... 3 Caracteristici specifice de performanţă... 7 Necesarul de instrumente... 3 Referinţe... 7 Recoltarea şi prepararea probelor... 3 Licenţe limitate... 7 Procedură... 3 Mărci comerciale utilizate... 8 A. Materialele furnizate... 3 Anexa A... 8 B. Materiale necesare, dar care nu sunt furnizate... 3 C. Materiale suplimentare ce urmează a fi furnizate de utilizator... 3 Electroforeza în gel... 8 Interpretarea gelului... 8 DEFINIREA SIMBOLURILOR (Etichetele produselor şi documentaţia suplimentară) Lot cod Număr de catalog Limite de temperatură Limita superioară de temperatură Utilizarea de către Data A se feri de lumină Suficient pentru teste N A nu se congela Atenţie A se vedea instrucţiunile de utilizare Consultaţi instrucţiunile de utilizare Producător Reprezentant autorizat în Comunitatea europeană Pericol Pagina 1 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)

2 REACTIVII ÎN FUNCŢIE DE NUMĂRUL DE CATALOG LCT -N Kit de tipizare LIFECODES SSO HLA Alelă Nulă, Nr. Produs # LC-N Kit de tipizare LIFECODES HLA alelă nulă pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs Reagent Product Number Fill volume Storage 50 MX-N1 MX-N2 LIFECODES Alelă Nulă de Clasa 1 Master Mix LIFECODES Alelă Nulă de Clasa 2 Master Mix µl 2 până la 8 C µl 2 până la 8 C BM-N LIFECODES Alelă Nulă Probe Mix µl x 2 2 până la 8 C A se feri de lumină DS Soluţie pentru diluţie ,7 ml 18 până la 30 ºC Suficient pentru 50 de teste TAQ LIFECODES Polimerază Taq µl x 2-10 până la -30 ºC Amestecurile de sonde sunt sensibile la acţiunea luminii: minimalizaţi expunerea la lumină. ATENŢIE: nu folosiţi componentele după data expirării. ATENŢIE: Abaterile de la protocolul recomandat şi de la materialele necesare, inclusiv LIFECODES Polimeraza Taq nu au fost validate. DOMENIUL DE UTILIZARE DNA Typing of Class I and Class II Alleles in conjunction with LIFECODES HLA SSO Typing kits. SUMAR ŞI EXPLICAŢIE Tipizarea HLA pe bază de ADN, folosind ADN-ul amplificat prin PCR (reacţie de polimerizare în lanţ), reprezintă o procedură de laborator obişnuită. Amplificarea prin PCR a ADN-ului este utilizată ca mijloc de creştere a numărului de copii ale unei regiuni de ADN. Pentru tipizarea HLA, este utilizat un test ulterior pentru determinarea proprietăţilor ADN-ului amplificat. Mai multe tipuri de analize, cum ar fi SSP (1), SSOP direct (2), RFLP (3) şi tehnologii inverse dot blot SSOP, au fost utilizate pentru tipizarea HLA. Asemeni metodei SSOP şi metodelor inverse dot blot, kit-urile de tipizare LIFECODES HLA-SSO utilizează oligonucleotide cu secvenţă specifică (SSO) pentru identificarea alelelor HLA, prezente într-o probă amplificată prin PCR. Setul de SSO folosit şi nu metodologia determină posibilitatea de a distinge diferitele alele prezente în amplificarea PCR. În timp ce metodele dot blot şi SSOP utilizează marcaje enzimatice şi substraturi colorimetrice ce necesită dezvoltarea ulterioară, testul LIFECODES reprezintă un sistem omogen multiplu. Adică, toate SSO sunt analizate simultan şi întregul test este realizat într-un singur vas de reacţie cu adăugarea unui singur reactiv. PRINCIPIILE PROCEDURII Procedura de tipizare LIFECODES HLA-SSO se bazează pe hibridizarea produsului PCR monocatenar marcat, la sondele SSO. Amplificarea ADN-ului cu ajutorul PCR necesită, de obicei, cantităţi echimolare atât de primer sens, cât şi antisens pentru a genera ADN dublu catenar. Cu toate acestea, dacă un primer se găseşte într-o cantitate mai mare decât celălalt, reacţia va genera şi ADN monocatenar, pe lângă produsul dublu catenar. Pe parcursul ciclurilor iniţiale ale pasului de amplificare al LIFECODES, se generează ADN dublu catenar. După consumarea primerului de limitare, primerul rămas foloseşte produsul dublu catenar ca matriţă pentru generarea de ADN monocatenar. Această metodă generează atât produse monocatenare, cât şi dublu catenare care după denaturare vor participa împreună la reacţia de hibridizare. Fiecare dintre diferitele sonde poate fi omoloagă cu o secvenţă a ADN-ului amplificat, specifică unei gene alele sau unui grup de alele. Cu alte cuvinte, aceste sonde sunt concepute astfel încât fiecare să hibridizeze preferenţial o regiune complementară care ar putea fi sau nu prezentă în ADN-ul amplificat. În plus, ADN-ul amplificat este, de asemenea, hibridizat la una sau mai multe sonde consens omoloage secvenţelor prezente în toate genele alele ale unui locus. Tipizarea SSO poate fi influenţată de tipul materialului biologic, metoda de purificare, cantitatea şi integritatea ADN-ului genomic. Aşadar, semnalul obţinut de la sonda(ele) conses poate servi ca indicator al reuşitei procedurilor de amplificare şi hibridizare. De asemenea, semnalul obţinut cu ajutorul sondei consens poate fi utilizat pentru normalizarea semnalului sondelor specifice alelelor şi corectarea variaţiilor cantităţii de produs amplificat în reacţia de hibridizare. Analiza rezultatelor generate de tipizarea SSO poate fi utilizată pentru determinarea prezenţei sau absenţei unei anumite secvenţe de ADN în ADN-ul amplificat şi pentru identificarea posibilelor alele din probă. Pentru procedura de tipizare LIFECODES HLA-SSO, sondele sunt legate la microsfere Luminex care sunt utilizare împreună cu instrumentul Luminex. Până la 100 de populaţii diferite de microsfere Luminex pot fi amestecate şi analizate cu instrumentul Luminex, deoarece fiecare populaţie de microsfere poate fi diferenţiată prin indicatorul său unic de fluorescenţă sau culoare. O sondă SSO diferită poate fi asociată fiecărei microsfere colorate. Aşadar, un amestec de mai multe sonde poate fi diferenţiat de celelalte datorită asocierii cu anumite culori ale microsferelor. Instrumentul Luminex poate, de asemenea, să cuantifice cantităţile relative ale produsului PCR marcat ce hibridizează la fiecare microsferă Luminex. Aşadar, semnalul relativ obţinut cu sondele SSO în testul LIFECODES, ca şi cu alte metode SSOP, poate fi utilizat pentru stabilirea reactivităţii pozitive sau negative a sondelor la proba de ADN amplificat (a se vedea secţiunea Rezultate). Aceasta, la rândul ei, oferă informaţiile necesare pentru determinarea fenotipului HLA al probei. Nul 1 este utilizat ca test complementar pentru a mări rezoluţia testelor LIFECODES HLA-A, HLA-B, HLA-C, prin soluţionarea ambiguităţii alelice dintre A*24:02/24:09N, B*51:01/ 51:11N şi C*04:01/04:09N. Nul 2 este utilizat ca test complementar pentru a mări rezoluţia testului LIFECODES HLA-DRB3,4,5, prin soluţionarea ambiguităţii alelice dintre DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N şi DRB5*01:02/DRB5*01:08N Fuzionarea informaţiilor din testul Nul 1 sau 2 cu rezultatele testului cu kit-ul de tipizare LIFECODES SSO corespunzător, specific locusului, în vederea generării unei tipizări sugerate a unei probe poate fi realizată prin analiză manuală sau analiză cu software. Pentru analiza manuală, rezultatul testelor Nul 1 sau 2 identifică prezenţa sau absenţa unor alele nule specifice. Rezultatul obţinut cu kit-urile de tipizare LIFECODES SSO corespunzătoare, specifice locusului, pot crea ambiguităţi care implică aceste alele nule (de ex. A*24:02/24:09N, B*51:01/ 51:11N, C*04:01/04:09N, DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N, sau DRB5*01:02/DRB5*01:08N). Dacă alela nulă este identificată cu produsul Nul, toate combinaţiile de alele care nu includ alela nulă pot fi eliminate din rezultatele obţinute cu kit-ul de tipizare LIFECODES SSO corespunzător, specific locusului. Dacă alela nulă este absentă pe baza rezultatului produsului Nul, toate combinaţiile de alele care includ alela nulă pot fi eliminate din rezultatele obţinute cu kit-ul de tipizare LIFECODES SSO corespunzător, specific locusului. În prospectul produsului şi în software, acest proces de combinare a rezultatelor celor două produse este numit fuzionarea rezultatelor. Pagina 2 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)

3 REACTIVI A. Identificare A se vedea tabelele din secţiunea Kit-uri/Reactivi în funcţie de numărul de catalog pentru lista completă a numerelor de catalog. B. Avertizări sau precauţii 1. A se utiliza pentru diagnosticarea in vitro. 2. Pipetele utilizate pentru manipulări Pre-PCR nu trebuie utilizate pentru manipulări post-pcr. 3. Avertizare cu privire la pericolul biologic: Toate probele biologice şi de sânge trebuie tratate ca potenţial infecţioase. Aplicaţi Măsurile de Precauţie Universale atunci când la manipulaţi. 4. Soluţia pentru diluţie, amestecurile de sonde, polimeraza TAQ şi Streptavidina conjugată cu R-Ficoeritrină conţin compuşi periculoşi. Evitaţi contactul cu pielea şi ochii şi aruncaţi toate materialele după utilizare conform normativelor locale. A se vedea Fişa Tehnică de Securitate pentru mai multe informaţii. C. Instrucţiuni de depozitare 1. Consultaţi eticheta de pe ambalajul componentelor kit-ului pentru temperaturile adecvate de depozitare. 2. Amestecurile de sonde şi Streptavidina conjugată cu R-Ficoeritrină sunt sensibile la lumină. A SE FERI DE LUMINĂ; A NU SE CONGELA. 3. Nu folosiţi componentele după expirarea termenului de valabilitate. D. Purificarea sau tratamentul necesar pentru utilizare A se vedea Colectarea şi prepararea probelor. E. Indicaţii cu privire la instabilitate 1. Dacă sărurile au precipitat din soluţie în timpul transportului sau depozitării, dizolvaţi-le din nou complet înainte de utilizare prin agitare în vortex, la temperatura camerei (18 până la 30 C). 2. Nu utilizaţi Streptavidină conjugată cu R-Ficoeritrină care a fost congelată în timpul transportului sau depozitării. NECESARUL DE INSTRUMENTE 1. Instrumentul Luminex şi platforma XY (Număr produs , ) 2. Următorii termociclori au fost validaţi: Sistem cu 96 de godeuri GeneAmp PCR 9700 calibrat la modul MAX (Nr. cat. bază N , Gold Block Cat Nr ), Termociclor Veriti cu 96 de godeuri calibrat la modul 9700 MAX (Cat. Nr ). Consultaţi Tabelul 2 pentru vitezele maxime de încărcare. Atenţie: Alţi termociclori şi viteze de încărcare nu au fost validate. RECOLTAREA ŞI PREPARAREA PROBELOR A. ADN-ul uman poate fi purificat din sânge integral, straturi leuco-trombocitare, tampon bucal prin metode validate care întrunesc criteriile de mai jos. ADN-ul extras din sângele conservat în EDTA şi ACD (acid-citrat-dextroză) a fost testat, iar performanţa testului a fost cea aşteptată. B. ADN-ul extras din sângele conservat în heparină nu poate fi utilizat în acest test. Alţi stabilizatori ai sângelui conservat nu au fost testaţi. C. ADN-ul izolat trebuie să se găsească în 10 mmde TRIS, la ph 8,0-9,0 sau în apă fără nucleaze. Dacă, în concentraţia finală, apare un agent de chelare, cum ar fi EDTA, concentraţia finală a agentului de chelare nu trebuie să depăşească 0,5 mm. D. Prezenţa alcoolului, detergenţilor sau sărurilor poate influenţa negativ amplificarea ADN-ului E. Concentraţia finală a ADN-ului trebuie să fie cuprinsă între 10 şi 200 ng/µl. F. Determinările de absorbanţă ale probei de ADN la lungimile de undă de 260 şi 280 nm trebuie să dea un coeficient de 1,65 până la 2,0. G. ADN-ul poate fi folosit imediat după izolare sau păstrat la 20ºC timp de maxim 1 an. Congelarea şi decongelarea repetată trebuie evitată deoarece poate determină degradarea ADN-ului. PROCEDURĂ Atenţie: Abaterile de la protocolul recomandat şi de la materialele necesare nu au fost validate. A. Materiale furnizate (A se vedea tabelele din secţiunea Kit-uri/Reactivi în funcţie de numărul de catalog pentru informaţii specifice) Master Mix (MX) adecvat Tabel de valori limită, Tabelul(Tabelele) rezultatelor hibridizărilor Amestec/amestecuri de sonde (BM) adecvat(e) LIFECODES Polimerază Taq* (LIFECODES Cat. Nr ) x 2 Soluţie pentru diluţie (DS) B. Materiale necesare, dar care nu sunt furnizate Următoarele materiale au fost folosite la validarea kit-ului: Fluid Luminex (1x sau 20x, Lifecodes Cat. Nr ) Apă fără nucleaze (Lifecodes Cat. Nr ; 20 ml) Eprubete şi capace PCR bandelete pentru eprubete Corning Thermowell (Costar Cat. Nr. 6542, LIFECODES Cat. Nr ) sau plăci PCR cu 96 de godeuri Corning Thermowell (Cat. Nr. CLS6551) sau placă PCR cu 96 de godeuri Themoscientific AB Gene Superplate (Cat. Nr. AB-2100) Placă Costar (Costar Cat. Nr. 6509, LIFECODES Cat. Nr ) C. Materiale suplimentare ce urmează a fi furnizate de utilizator Agitator de tip Vortex Placă de compresie din silicon Axygen Scientific nr. CM-FLAT sau echivalent Baie ultrasonică Microcentrifugă Vârfuri de pipetă cu filtru Pipete, pipete multicanal şi vârfuri (1-20 µl, µl, 1000 µl) Software pentru analiză cu foi de calcul Incintă de încălzire 70% Izopropanol sau înălbitor 20% Placă suport Applied Biosystems nr (pentru utilizare exclusiv cu termociclorul 9700) Bandă de polietilenă transparentă Thermowell (Costar Nr (LIFECODES Cat. Nr ) Streptavidină conjugată cu R-Ficoeritrină (SA-PE), 1 mg/ml (LIFECODES Cat. Nr ) Kit-uri de calibrare Luminex (Kit de calibrare Luminex 100/200, Kit de verificare a performanţei Luminex 100/200, LIFECODES Cat. Nr şi repectiv ) Pagina 3 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)

4 INSTRUCŢIUNI DE UTILIZARE NOTE: Amestecurile de sonde şi SA-PE sunt sensibile la lumină: a se feri de lumină şi a nu se congela. Încălziţi sferele la 55º până la 60 ºC cel puţin 5-10 minute pentru solubilizarea completă a componentelor din amestecul de sonde. Curăţaţi cu ultrasunete rapid (~15 sec), apoi agitaţi cu ajutorul vortexului amestecul de sonde aproximativ 15 secunde pentru suspendarea completă a sferelor. Acordaţi o atenţie deosebită procesului de alicotare, folosind pipete calibrate. Nerespectarea acestui criteriu poate duce la pierderi de reactivi şi eşecul testului. Toate temperaturile trebuie respectate cu precizie. Fluctuaţii chiar şi de +/- 0,5 C pot afecta rezultatele. În faza de hibridizare, probele nu trebuie să rămână în starea diluată la 56 C mai mult de 5 minute (A se vedea secţiunea Rezultate). Se recomandă testarea probelor amplificate cât mai repede posibil. Dacă probele nu pot fi prelucrate cu ajutorul instrumentului Luminex în aceeaşi zi, produsul amplificat poate fi păstrat până la 3 zile la 2-8 ºC înainte de utilizare. O depozitare mai îndelungată trebuie făcută la 20 ºC timp de până la o săptămână, când sunt pregătite pentru testare. Produsul amplificat poate fi congelat şi decongelat o singură dată. Congelare şi decongelarea repetată va determina degradarea probelor amplificate şi va determina rezultate slabe dacă sunt testate. A. Purificarea ADN-ului genomic, folosind o metodă la alegere; concentraţia finală trebuie să fie cuprinsă între 10 şi 200 ng/µl. Ajustaţi, dacă este necesar, cu apă fără nucleaze. Probele trebuie să aibă concentraţii similare. B. Amplificarea ADN-ului (PCR) 1. Încălziţi Master Mix până la temperatura camerei (18 până la 30 C). 2. Amestecaţi uşor cu ajutorul vortexului aproximativ 10 secunde. Aceasta va asigura prezenţa sărurilor în soluţie. Centrifugaţi rapid (5 până la 10 secunde) în microcentrifugă pentru a aduce conţinutul în partea inferioară a eprubetei. 3. Folosind Tabelul 1 de mai jos, preparaţi componentele pentru amplificare pentru n+1 reacţii, folosind cantitatea indicată din fiecare componentă pentru fiecare reacţie (exceptând ADN-ul). Aduceţi la un volum final de 20µL per reacţie cu apă fără nucleaze. Amestecaţi uşor cu vortexul. 4. Pipetaţi cantitatea potrivită de ADN genomic (40 până la 120 ng) în eprubete pentru PCR. 5. Alicotaţi amestecul de amplificare în eprubetele pentru PCR ce conţin ADN-ul genomic. (Volumul total al amestecului de amplificare şi al ADN-ului genomic trebuie să fie egal cu 20 µl pentru fiecare reacţie de probă). 6. Închideţi bine capacul eprubetelor pentru a evita evaporarea în timpul PCR. 7. Puneţi probele în termociclor şi porniţi programul, a se vedea Tabelul 2 şi Tabelul 3. Tabelul 1. Componentele reacţiei pentru amplificare Componentă Cantitate per reacţie probă PCR LIFECODES Master Mix 6 µl ADN genomic ng/µl Total ~80 ng Polimerază Taq 0,2 µl (1 U) Apă fără nucleaze Până la volumul final de 20 µl Tabelul 2. Condiţiile termociclorului pentru amplificare Thermociclor Sistem GeneAmp PCR 9700 Termociclor Veriti cu 96 godeuri Mod (Viteză de încărcare) Mod MAX (3,9 C/sec) Mod 9700 MAX (3,9 C/sec) Tabelul 3. Condiţiile termociclorului pentru amplificare Etapa Temperatura şi durata de incubare Nr. de cicluri 1 95 º C timp de 3 min ºC timp de 15 sec 60º C timp de 30 sec 72 ºC timp de 30 sec 95 ºC timp de 10 sec 63 ºC timp de 30 sec 72 ºC timp de 30 sec 4 72 ºC timp de 2 min ºC în permanenţă 1 Notă: Pentru a fi siguri de amplificarea probei, citiţi Electroforeza în gel (Anexa A) Pagina 4 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)

5 C. Hibridizarea Asiguraţi-vă de solubilizarea componentelor soluţiei tampon de hibridizare ale amestecului de sonde LIFECODES şi de suspensia completă a sferelor. Porniţi instrumentul Luminex şi Platforma XY pentru a permite încălzirea timp de 30 de minute. 1. Încălziţi amestecul de sonde într-o incintă de încălzire la o temperatură de 55 ºC până la 60 ºC timp de cel puţin 5-10 minute pentru solubilizarea completă a componentelor amestecului de sonde. 2. Curăţaţi cu ultrasunete rapid (~15 sec), apoi amestecaţi folosind vortexul timp de aproximativ 15 secunde pentru suspendarea completă a sferelor. 3. Combinaţi 15 µl din amestecul de sonde adecvat cu 5 µl de produs PCR specific locusului în fiecare godeu al unei plăci cu 96 de godeuri pentru termociclor (Costar Nr. 6509). Când alicotaţi amestecul de sonde în mai mult de 10 godeuri, agitaţi uşor cu ajutorul vortexului amestecul de sonde după fiecare set de zece. Sigilaţi placa cu bandă de polietilenă (Costar Nr ). 4. Puneţi suportul de compresie din silicon deasupra plăcii înainte de hibridizare. 5. Hibridizaţi probele în următoarele condiţii de incubare: Tabelul 4. Condiţiile termociclorului pentru hibridizare Asiguraţi-vă că laserul detector de pe Instrumentul Luminex este activat cu cel puţin 30 de minute înainte de încheierea hibridizării. 6. În timp ce probele sunt hibridizate, pregătiţi un amestec 1:200 SA-PE / soluţie pentru diluţie. Combinaţi 170 µl soluţie pentru diluţie (DS) şi 0,85 µl 1mg/ml SA-PE per probă. Este recomandat să pregătiţi suficient amestec de soluţie pentru diluţie pentru n+1 probe, pentru a ţine cont şi de pierderile apărute în urma pipetării. (A se vedea Tabelul 5) 7. Păstraţi amestecul de soluţie pentru diluţie/sa-pe la întuneric, la temperatura camerei; SA-PE este sensibil la lumină! Soluţia pentru diluţie poate fi încălzită la 45 ºC timp de 5 minute şi amestecată cu ajutorul vortexului când este adusă pentru a vă asigura că toate componentele sunt în soluţie. Soluţia pentru diluţie trebuie să fie la temperatura camerei (18 până la 30 C) înainte de prepararea amestecului. Preparaţi înainte de folosire şi aruncaţi orice cantitate rămasă. Tabelul 5. Volumele de preparare ale soluţiei pentru diluţie 97 ºC timp de 2 minute 47 ºC timp de 10 minute 56 ºC timp de 8 minute 56 ºC MENŢINERE Nr. de probe Soluţia pentru SA-PE diluţie (DS) µl 0,85 µl µl 4,25 µl µl 8,5 µl µl 17 µl µl 42,5 µl Notă: NU ANULAŢI PROGRAMUL DE HIBRIDIZARE ÎNAINTE DE ÎNDEPĂRTAREA PLĂCII DIN TERMOCICLOR! 8. În faza de menţinere la temperatura de 56 ºC, în timp ce placa este în termociclor, diluaţi fiecare probă cu 170 µl din amestecul de soluţie pentru diluţie/sa-pe. Este foarte important să diluaţi toate probele în 5 minute (după pasul de 8 minute al menţinerii la 56 C). 9. Îndepărtaţi placa cu probele din termociclor şi plasaţi-o în instrumentul Luminex. D. Analizarea probei folosind instrumentul Luminex* Pentru cele mai bune rezultate, analizaţi probele imediat cu ajutorul instrumentului Luminex. Probele pot fi citite în cel mult 30 de minute după diluţie. Dacă nu sunt citite imediat, feriţi-le de lumină. 1. Porniţi instrumentul Luminex cu 30 de minute până la 4 ore înainte de citirea probelor. 2. Înainte de analizarea probelor cu instrumentul Luminex, stabiliţi un program de testare a setului conform căruia vor fi analizate probele. a) Selectaţi Create a New Batch din meniul File. De exemplu, dacă analizaţi pentru Nul Clasa I, adăugaţi Batch pentru Nul Clasa I. Batch Template este furnizat pe site-ul web şi, în acest caz, denumit Nul 1 XXXXX (nr. lot). Aveţi în vedere că versiunile model sunt specifice lotului şi corespund numerelor de loturi din amestecul de sonde. Urmaţi pas cu pas instrucţiunile afişate pe ecran pentru crearea seturilor. Când denumiţi setul, nu includeţi virgule în nume deoarece informaţiile de după virgulă vor fi pierdute la exportarea datelor. Pentru mai multe instrucţiuni privind crearea seturilor şi a seturilor multiple, consultaţi Manualul de utilizare pentru Luminex. b) Daţi clic pe pictograma Eject pentru a scoate suportul de plăci. Aşezaţi placa termociclorului cu 96 de godeuri ce conţine probele în incinta de încălzire XYP aflată pe suportul pentru placă. c) Daţi clic pe pictograma Retract. Probele sunt acum pregătite pentru analiză. O etapă iniţială trebuie efectuată înainte de începerea analizei. d) După ce probele au fost analizate cu ajutorul instrumentului, se efectuează dezinfecţia cu izopropanol 70% sau înălbitor obişnuit 20%, urmată de două etape de spălare. Instrumentul poate fi oprit în acest moment dacă nu va mai fi folosit în restul zilei. 3. După terminarea unui set, datele sunt exportate ca fişiere de valori separate prin virgulă (csv). Aceste fişiere sunt numite REZULTAT.CSV şi salvate într-un director cu numele setului. Datele sunt apoi disponibile pentru tipizare, după cum este descris mai jos. *A se vedea Manualul de utilizare Luminex pentru funcţionarea instrumentului, inclusiv punerea în funcţiune zilnică, calibrarea, întreţinerea şi procedurile de închidere. Pagina 5 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)

6 REZULTATE Tipizarea probelor poate fi realizată după cum urmează: Fişierele CSV generate pot fi deschise, iar datele procesate cu ajutorul programelor obişnuite de procesare tabelară, cum sunt Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro sau alte programe similare. Analiza constă din următorii paşi: 1) Verificaţi ca Numărul de Evenimente pentru fiecare SSO, la fiecare probă să fie de cel puţin 60. Această informaţie poate fi găsită în secţiunea DataType: Count a fişierului CSV. 2) Stabiliţi că valorile pentru sondele consens pentru fiecare probă sunt peste minima Mediei Intensităţii de Fluorescenţă (MFI). Pragurile minime sunt specifice fiecărui lot şi pot fi găsite în Tabelul de valori limită. Atenţie: Pentru a obţine rezultate corecte, instrumentul Luminex trebuie să colecteze suficiente date. Colectaţi cel puţin 60 de evenimente pentru fiecare SSO. 3) Scădeţi valoarea Background Control (Control de Fond) pentru fiecare sondă din valorile probelor; astfel obţineţi setul corectat al datelor de fond. Valorile Backgound Control se regăsesc în Tabelul de valori limită şi sunt specifice fiecărui lot. Valorile de fond sunt valorile MFI medii pentru fiecare sferă care compensează zgomotul de fond datorat variaţiei sferelor. 4) Pentru fiecare probă, împărţiţi datele de fond corectate pentru fiecare sondă la valoarea de fond corectată pentru sonda consens corespunzătoare şi veţi obţine setul normalizat de date. MFI (Sondă) MFI (Control blank pentru sondă) MFI (Consens) MFI (Control blank pentru consens) 5) Pentru fiecare sondă, înregistraţi valoarea normalizată în Tabelul de lucru al valorilor limită. 6) După ce au fost alocate toate valorile, modelul rezultatelor sondelor (adică acea combinaţie de alocări pozitive şi negative pentru o anumită probă) poate fi comparat cu Graficul rezultatelor hibridizării (LC1024) furnizat pe site-ul web. Atenţie: Există un tabel al valorilor limită separat pentru fiecare locus. Aceste tabele ale valorilor limită sunt specifice fiecărui Lot; asiguraţi-vă că numărul de Lot din tabelele cu valorile limită corespunde numărului de Lot din kit-ul pentru tipizare. Dacă o valoare normalizată pentru o anumită sondă depăşeşte limita maximă pentru o alocare negativă şi se află sub limita minimă pentru o alocare pozitivă, proba trebuie considerată nedeterminată pentru această sondă. Proba trebuie tipizată, mai întâi presupunând valoarea ca fiind negativă, apoi din nou presupunând că aceasta este pozitivă. A se vedea Secţiunea REZULTATE PREVĂZUTE pentru mai multe informaţii despre valorile limită. CONTROLUL CALITĂŢII Se recomandă realizarea unui control negativ şi a unuia pozitiv la fiecare testare, de exemplu folosind o probă de control a apei şi respectiv o probă tipizată anterior. Sondele SSO consens, regăsite în Tabelul pentru valorile limită, hibridizează în locusul respectiv alele specifice. Valorile obţinute cu ajutorul SSO consens de la controlul pozitiv trebuie să depăşească valoarea limită pentru SSO stabilită în Fişa de lucru cu Tabelul valorilor limită. Amestecul(rile) de sonde LIFECODES conţin(e) una sau mai multe sonde SSO consens, identificate în fişele de lucru ale kit-ului pentru tipizare. Aceste sonde consens hibridizează toate alelele şi acţionează ca un control intern pentru a verifica amplificarea şi pentru a confirma realizarea hibridizării. Dacă nu se obţine valoarea minimă pentru aceste SSO, proba ar putea să nu ofere o tipizare corectă, iar testul pentru probă va trebui repetat. Testul trebuie să se desfăşoare conform recomandărilor din prospect şi trebuie realizat împreună cu celelalte proceduri de control al calităţii conform normativelor locale, de stat, federale şi/sau conform cerinţelor agenţiilor de acreditare. LIMITĂRILE PROCEDURII Condiţiile pentru PCR şi condiţiile de analiză descrise necesită respectarea unor condiţii controlate cu precizie. Abaterile de la aceşti parametri pot duce la eşecul produsului. Toate instrumentele trebuie calibrate conform recomandărilor producătorului şi acţionate conform parametrilor stabiliţi de pr oducător. 1) Sferele trebuie preîncălzite şi suspendate complet înainte de utilizare. Aceasta asigură prezenţa în soluţie a tuturor componentelor soluţiei tampon de hibridizare. 2) Incubările la 47 ºC şi 56 ºC necesită un grad ridicat de acurateţe (+/- 0,5 ºC). Trebuie utilizat un termociclor. Temperatura trebuie verificată în godeurile plăcii cu 96 de godeuri a termociclorului, folosind un termocuplu (ex., Bio-Rad, Model VPT-0300 sau echivalent). Temperatura de la nivelul godeurilor şi dintre godeuri nu trebuie să varieze cu mai mult de +/- 0,5 ºC. 3) Durata de timp la 56 ºC este extrem de importantă şi nu trebuie să depăşească 13 minute. Aceasta include incubarea de 8 minute şi nu mai mult de 5 minute pentru diluarea tuturor probelor cu amestecul soluţie pentru diluţie/sa-pe. 4) După diluare, analiza probelor trebuie finalizată în decurs de 1 oră (a se feri de lumină). 5) Nu amestecaţi componentele din loturi sau kit-uri diferite. Datorită naturii complexe a tipizării HLA, interpretarea datelor şi alocarea tipizării trebuie examinate de către personal calificat. Pagina 6 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)

7 PROBLEME TEHNICE PROBLEMĂ CAUZĂ POSIBILĂ SOLUŢIE Număr redus de sfere Amestecul de sonde nu a fost bine suspendat Preîncălziţi, curăţaţi cu ultrasunete şi agitaţi amestecul de sonde în vortex, apoi repetaţi testul. Instrumentul nu funcţionează corect Necalibrat Calibraţi instrumentul. (A se vedea Manualul de utilizare Luminex IS.) Calea de trecere a probelor blocată Scoateţi şi curăţaţi cu ultrasunete acul. Spălaţi în contracurent. Sunaţi la Immucor Transplant Diagnostics, Inc. dacă problema continuă. (888) 329- Eroare a limitei CON Eşecuri multiple ale SSO sau nu se reuşeşte obţinerea rezultatului tipizării HLA a probei Proba nu a fost amplificată sau a fost amplificată insuficient * ADN redus Sărurile din Master Mix nu sunt în soluţie Polimerază Taq slabă Condiţiile de amplificare nu se încadrează în parametrii specifici Valoare mică a Mediei Intensităţii de Fluorescenţă (MFI) Amplificare specifică alelelor Probă de ADN contaminată ADN parţial degradat Condiţiile de amplificare nu se încadrează în parametri specifici 0255 Verificaţi concentraţia şi puritatea ADN-ului. Încălziţi Master Mix la 37 ºC timp de 5 minute, amestecaţi în vortex uşor şi centrifugaţi rapid. Utilizaţi LIFECODES Polimerază Taq validată, nr. catalog Rulaţi profilul termic pe termociclor pentru a verifica dacă parametrii se încadrează în limitele specificate. Încălziţi soluţia pentru diluţie la 45 ºC timp de 5 minute înainte de folosire şi amestecaţi în vortex. Păstraţi la temperatura camerei. Înlocuiţi Streptavidina conjugată cu R-Ficoeritrină. Rulaţi profilul termic pe termociclor pentru a verificarea dacă parametrii se încadrează în limitele specificate. Repetaţi izolarea ADN-ului din proba de sânge. Evaporare în timpul desfăşurării hibridizării Dacă nu se foloseşte o placă completă, lăsaţi un rând liber pe fiecare parte a probelor ce urmează a fi analizate pentru a permite sigilarea etanşă a plăcii. * Amplificarea PCR poate fi verificată cu ajutorul electroforezei pe gel (a se vedea Anexa A). VALORI PREVĂZUTE Fiecare locus are o sondă CON şi două sonde SSO. Dacă o probă conţine unul dintre locusurile testate, sonda de consens şi cel puţin una dintre sondele SSO pentru acel locus trebuie să fie pozitive. În mod normal, valorile sondelor pot fi separate ca pozitive şi negative. În unele cazuri rare, o valoare poate cădea între valorile limită pozitive şi negative şi, ca urmare, este considerată nedeterminată. Dacă, în cazul unei probe, sunt stabilite valori nedeterminate pentru o anumită sondă SSO, proba trebuie tipizată cu sonda considerată negativă, iar apoi din nou cu ea pozitivă. Dacă două sonde SSO pentru un locus sunt nedeterminate, proba nu poate fi tipizată şi trebuie să fie testată din nou. După cum am notat în secţiunea de Limitările procedurii, este foarte importantă urmarea exactă a protocolului. Orice abatere poate duce la eşecul procesului de tipizare a probei. CARACTERISTICI SPECIFICE DE PERFORMANŢĂ Când kit-urile pentru tipizare LIFECODES HLA SSO Alelă Nulă sunt utilizate respectând procedura descrisă în prospectul produsului, pot fi determinate HLA de Clasa I şi Clasa II din probele de ADN. Testul HLA Alelă Nulă de Clasa I (Nul1) prezintă o concordanţă de 100% (97,4% limita inferioară a intervalului de încredere de 95%) pentru locus A, concordanţă de 100% (97,4% limita inferioară a intervalului de încredere de 95%) pentru locus B şi o concordanţă de 100% (97.4% limita inferioară a intervalului de încredere de 95%) pentru locus C în 139 de probe evaluate, cu compararea rezultatelor obţinute prin secvenţiere bidirecţională. Testul HLA-Alelă Nulă de Clasa 2 (Nul2) prezintă o concordanţă de 97.1% (92,7% limita inferioară a intervalului de încredere de 95%) pentru locus DRB 4 şi o concordanţă de 98.5% (94,8% limita inferioară a intervalului de încredere de 95%) pentru locus DRB 5 în 137 de probe evaluate, cu compararea rezultatelor obţinute cu secvenţiere bidirecţională. REFERINŢE 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39: Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 LICENŢE LIMITATE PolimerazaTaq este produsă de Promega Corp pentru Immucor Transplant Diagnostics. Promega deţine licenţa pentru aceasta sub brevetele S.U.A. nr. 5,338,671 și 5,587,287 şi brevetele străine corespunzătoare. Achiziţionarea acestui produs include o licenţă limitată, netransferabilă conform brevetului U.S. 5,981,180 sau echivalentelor sale străine, deţinut de Luminex Corporation, pentru realizarea unui analize multiple a probelor clinice pentru tipizarea HLA. Producător: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut S.U.A. Telefon: , sau linia gratuită pentru S.U.A., Canada şi Puerto Rico , Fax Reprezentanţi autorizaţi: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322, Germany Phone: (+49) , Fax: (+49) Serviciul Tehnic din Europa: Telefon: +32/ Ultima revizuire şi emitere a acestui document: Rev 04; Pagina 7 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)

8 MĂRCI COMERCIALE UTILIZATE AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Gene Amp Veriti LIFECODES Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. ANEXA A Electroforeza în gel Reacţiile PCR realizate în kit-urile de tipizare LIFECODES HLA-SSO sunt destinate atât producerii produselor monocatenare, cât şi a celor dublu catenare, produsele predominante care hibridizează la SSO. Pentru asigurarea calităţii sau pentru rezolvarea problemelor apărute la un experiment, ar putea fi necesară realizarea electroforezei în gel în vederea examinării reacţiei PCR pentru prezenţa ADN-ului amplificat. Materiale necesare (conform listei de mai jos sau echivalente) Agaroză pentru electroforeză ( Lonza Group, Ltd. IDNA Agaroză Nr ) Aparat de electroforeză/sursă de alimentare 1X tampon gel (40xTAE, Promega Nr. V4281) GelStar Nucleic Acid Stain - pentru colorarea acizilor nucleici (Lonza Group, Ltd. Nr ) Transiluminator UV (ChromatoVUE, UVP Inc. Model TM36) Sistem imagistic fotografic Migrarea relativă a produsului monocatenar este dependentă de concentraţia gelului şi de sistemul tampon utilizat. Migraţiile aproximative pentru fiecare amplificare sunt indicate mai jos pentru probe testate într-un gel de agaroză 2% în 1X tampon TAE. Condiţii pentru electroforeză 1. Scoateţi GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. Nr ) de la congelator pentru dezgheţare. Ţineţi la întuneric. 2. Gelul utilizat pentru această procedură trebuie să aibă o concentraţie de 2%, adică pentru 200 ml suport de gel, utilizaţi 4 grame de agaroză la 200 ml 1X TAE (Diluaţi din 40X TAE). Adăugaţi 10 µl GelStar Nucleic Acid Stain în agaroza topită. Când turnaţi gelul, asiguraţi-vă că lăsaţi suficient spaţiu pentru ca ADN-ul să migreze pe o distanţă semnificativă (între 1 şi 2 inci). FIŢI PRECAUŢI: GelStar are potenţial carcinogen. NOTĂ: Este posibil să folosiţi geluri cu 20 µl din 10 mg/ml bromură de etidiu în locul GelStar Nucleic Acid Stain. Intensitatea benzilor va fi mai redusă în gelurile care conţin bromură de etidiu comparativ cu cele care conţin GelStar. FIŢI PRECAUŢI: Bromura de etidiu este un agent carcinogen recunoscut. 3. Ţineţi gelul la întuneric şi permiteţi solidificarea acestuia. 4. Încărcaţi un amestec de 2,5 µl al fiecărui produs PCR şi 2,5 µl 2X soluţie tampon de încărcare cu colorant vizibil pentru fiecare probă, pentru fiecare amplificare. Lăsaţi gelul la întuneric pentru migrare, la aproximativ 160 volţi, timp de 45 de minute sau până când probele au migrat suficient încât să observaţi benzi separate pentru produsele monocatenare şi dublu catenare (banda albastră de bromfenol sau alţi indicatori vizibili migrează 1 până la 2 inci din godeuri). 5. Fotografiaţi folosind transiluminatorul UV împreună cu un filtru fotografic galben GelStar (Lonza Group, Ltd. Nr ). ATENŢIE: Purtaţi echipament de protecţie când manipulaţi GelStar Nucleic Acid Stain sau bromura de etidiu şi când fotografiaţi gelul folosind transiluminatorul UV. 6. Analiza gelului Nul Clasa 1 Nul Clasa 2 Dublu catenar (bp) ~210, ~180, ~280 ~280 Monocatenar (bp) ~150,~180 ~140,~180 Interpretarea gelului Godeu ADN dublu catenar ADN monocatenar Banda primerului Amplificare (luminos) (mai puţin luminos) Lipsa amplificării Pagina 8 din 8 LC1437CERO.4 (07/16)