MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA

Transcription

1 MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA 1 placă 96 teste plăci 480 teste TRUSĂ IMUNOENZIMATICĂ PENTRU DETECŢIA INFECŢIEI CU HCV (VIRUSUL HEPATITEI C) ÎN SER SAU PLASMĂ UMANE Controlul de calitate al fabricantului Toţi reactivii fabricaţi şi comercializaţi de Bio-Rad sunt supuşi sistemului complet de asigurare a calităţii, începând de la recepţia materiilor prime şi până la comercializarea produsului finit. Calitatea fiecărui lot este atent controlată, iar acesta este eliberat pe piaţă numai atunci când corespunde criteriilor de acceptare. Informaţiile referitoare la producţia şi controlul fiecărui lot sunt proprietatea companiei noastre.

2 CUPRINS 1 - APLICAŢII CLINICE 2 - PRINCIPIUL TESTĂRII 3 - COMPOZIŢIA TRUSEI 4 - MATERIALE NECESARE NEFURNIZATE 5 - INSTRUCŢIUNI PRIVIND IGIENA ŞI PROTECŢIA MUNCII 6 - PRECAUŢII 7 - RECOLTAREA PROBELOR 8 - RECONSTITUIREA REACTIVILOR - VALABILITATE - STABILITATE 9 - PROCEDEUL DE TESTARE 10-ADAPTĂRI LA SISTEME AUTOMATE 11-CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR 12-VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR 13-PERFORMANŢELE ACESTUI TEST 14-LIMITELE METODEI 15-BIBLIOGRAFIE 2

3 1. APLICAŢIILE CLINICE MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA este o metodă de detecţie imunoenzimatică pentru evidenţierea infecţiei cu HCV, care se bazează pe detecţia anticorpilor şi a antigenului capsidar asociate unei infecţii cu virusul hepatitei C, în serul sau plasm bolnavilor. 2. PRINCIPIUL TESTĂRII Microplaca (faza solidă) MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA este sensibilizată cu : anticorpi monoclonali specifici de proteina capsidara a virusului HCV 2 proteine recombinate produse in E.coli, caracteristice regiunii NS3: genotip 1 şi 3a Un antigen recombinat caracteristic regiunii non-structurale NS4 O peptidă capsidară mutantă din regiunea structurală a genomului virusului HCV. Conjugatele folosite sunt: Conjugat 1 (R6): anticorpi monoclonali de şoarece, biotinilaţi, dirijati împotriva capsidei virale C. Aceşti monoclonali nu reacţionează cu peptida capsidară C mutantă cu care este sensibilizată placa. Conjugat 2 (R7): anticorpi de şoarece marcaţi cu peroxidază, specifici de IgG umane, şi streptavidină marcată cu peroxidază. Realizarea testului se bazează pe următoarele etape de reacţie: 1) Conjugatul 1, probele de testat şi serurile de control se pipetează în godeurile microplăcii. Dacă anticorpii anti-hcv sunt prezenţi, aceştia se vor lega la antigenele fixate la faza solidă, iar dacă antigenul capsidar C este prezent, acesta se va lega atât la anticorpii monoclonali cu care s-a sensbilizat placa, cât şi la anticorpii monoclonali biotinilaţi specifici de antigenul capsidar C (conjugat 1) 2) După incubarea la 37 C timp de 90 minute şi o etapă de spălare, se adaugă anticorpii anti- IgG umane marcaţi cu peroxidază şi streptavidina marcată cu peroxidază (Conjugat 2). Conjugatul streptavidină-peroxidază reacţionează cu anticorpii monoclonali biotinilaţi specifici de antigenul capsidar C, dacă sunt prezenţi. În acelaşi timp, conjugatul anti-igg umane marcat cu peroxidază reacţionează cu anticorpii anti-hcv, dacă sunt prezenţi. 3) După 30 minute de incubare la 37 C, conjugatul enzimatic nelegat este îndepărtat printr-o etapă de spălare, iar complexul antigen-anticorpi format este evidenţiat prin adăugarea substratului. 4) Reactia se stopează după 30 de minute, apoi se citeşte absorbţia (sau densitate optică, DO) cu ajutorul unui spectrofotometru la 450/ nm. Absorbţia măsurată a probei permite detectarea prezenţei sau absenţei anticorpilor anti-hcv sau/şi a antigenului capsidar viral HCV. Intensitatea culorii este proporţională cu cantitatea de anticorpi anti-hcv şi/sau de antigen capsidar de HCV, legate la faza solidă. 3

4 3. COMPOZIŢIA TRUSEI MARCAJ R1 R2 R3 R4 R5a R5b R6 R7 R8 R9 R10 NATURA REACTIVILOR MICROPLACĂ 12 barete sensibilizate cu anticorpi monoclonali anti-capsidă de HCV şi antigene recombinate purificate (NS3, NS4) şi un peptid capsidar mutant, specifice de HCV SOLUŢIE DE SPĂLARE CONCENTRATĂ (20x) Tampon Tris NaCl ph = 7,4 Conservant: Proclin 300 (0,1%) CONTROL NEGATIV Tampon Tris HCl suplimentat cu Albumina Serică Bovină (ASB). Conservant: Proclin 300 ( 0,1%) ANTICORP POZITIV CONTROL Ser uman ce conţine anticorpi anti-hcv, testat negativ pentru AgHBs, anti-hiv1 şi anti-hiv2, diluat în tampon Tris HCl suplimentat cu ASB, inactivat fotochimic. Conservant: Proclin 300 ( 0,1%) ANTIGEN POZITIV DE CONTROL Antigen pozitiv sintetic de control, ce conţine un liofilizat de peptid capsidar. DILUANT PENTRU ANTIGENUL DE CONTROL Diluant pentru R5a. Apă cu conservant : Proclin 300 ( 0,5%) CONJUGAT 1 Anticorpi monoclonali de şoarece, biotinilaţi, specifici de capsida HCV. De culoare violet. Conservanţi: Azidă de sodiu (< 0,1%) şi Cosmocil 0,025% CONJUGAT 2 Anticorpi de şoarece anti-igg umane, marcaţi cu peroxidază şi streptavidină marcată cu peroxidază. De culoare verde. Conservant: Proclin 300 (0,5%) TAMPON SUBSTRAT PENTRU PEROXIDAZĂ: Soluţie de acid citric şi acetat de sodiu ph=4,0, cu H 2O 2 (0,015%) şi dimetil sulfoxid 4% (DMSO) CROMOGEN Soluţie ce conţine tetrametil benzidină (TMB) SOLUŢIE DE STOPARE Soluţie de acid sulfuric 1N PREZENTARE 1 placă 5 plăci 1 70 ml 1 ml 1,5 ml pentru 1 ml 1 ml 15 ml 15 ml 60 ml 5 ml 28 ml ml 1 ml 3 ml pentru 1 ml 1 ml 2 flacoane 2 x 30 ml 2 flacoane 2 x 30 ml 2 flacoane 2 x 60 ml 2 flacoane 2 x 5 ml 3 flacoane 3 x 28 ml 4. MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ Apă distilată sau complet demineralizată Hipoclorit de sodiu (apă de javel) şi bicarbonat de sodiu Hârtie absorbantă Mănuşi de protecţie de unică utilizare Ochelari de protecţie 4

5 Eprubete de plastic de unică utilizare Micropipete automate sau semiautomate, reglabile sau fixe, ce pot distribui volume de 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl şi 1 ml Cilindri gradaţi cu capacităţi de 10 ml, 200 ml şi 1000 ml Agitator tip Vortex Spălător de microplăci automat*, semiautomat* sau manual Baie de apă termostatată sau incubator* pentru microplăci, reglate la 37 0 C ± 1 0 C. Container pentru deşeuri contaminate Cititor pentru microplăci* (echipat cu filtre de 490, 620, 450/ nm). (*) Informaţii suplimentare privind echipamentele validate le obţineţi de la departamentul tehnic. 5. INSTRUCŢIUNII PRIVIND IGIENA ŞI PROTECŢIA MUNCII Toţi reactivii conţinuţi în trusă sunt destinaţi diagnosticului in vitro. Purtaţi mănuşi de unică folosinţă în timpul manipulărilor reactivilor şi probelor şi spălaţi-vă bine pe mâini după aceste manipulări. Nu pipetaţi niciodată cu gura. Serul de control pozitiv R4 este inactivat fotochimic. Materialul de origine umană utilizat la prepararea martorului pozitiv (R4) a fost testat şi găsit nereactiv pentru antigenul de suprafaţă al hepatitei B (AgHBs) şi anticorpii specifici virusurilor imunodeficienţei umane (anti-hiv-1 şi anti-hiv-2). Deoarece nici o metodă de testare cunoscută nu garantează absenţa totală a agenţilor infecţiosi, consideraţi reactivii şi toate probele pacienţilor ca potenţial infecţioase şi trataţi-le cu precauţiile de rigoare. Consideraţi orice material care vine în contact direct cu probele şi reactivii de origine umană, precum şi soluţiile de spălare, ca produse contaminate. Evitaţi stropirea cu probe sau soluţii care conţin probe. În caz de stropire a suprafeţelor de lucru, clătiţi cu hipoclorit de sodiu diluat la concentraţia finală de 10%. Dacă lichidul de contaminare este un acid, neutralizaţi mai întâi cu bicarbonat de sodiu şi apoi curăţaţi cu hipoclorit de sodiu şi uscaţi cu hârtie absorbantă. Materialul folosit la curăţenie trebuie aruncat în containerul pentru deşeuri contaminate. Probele, reactivii de origine umană, precum şi materialele şi produsele contaminate, trebuie decontaminate înainte de a fi aruncate. - fie prin imersie timp de 30 de minute în hipoclorit de sodiu la o concentraţie finală de 5% (1 volum de hipoclorit la 10 volume de deşeuri lichide contaminate) - fie prin autoclavare la C timp de cel puţin 2 ore. ATENŢIE: nu introduceţi în autoclavă soluţii ce conţin hipoclorit de sodiu. Evitaţi orice contact al tamponului substrat, cromogenului şi al soluţiei de stopare cu pielea sau mucoasele (risc de intoxicaţie, inflamaţie sau arsuri). Informaţiile de siguranţă în exploatare şi protecţia mediului (MSDS) sunt disponibile la cerere. Nu omiteţi să neutralizaţi şi/sau să autoclavaţi soluţiile, lichidele reziduale de spălare sau alte lichide ce conţin probe biologice, înainte de a le arunca în chiuvetă. Mai mulţi reactivi din trusă includ conservantul azidă de sodiu. Azida de sodiu poate reacţiona cu conductele de plumb sau cupru din canalizarea de laborator, formând azide metalice explozive. Pentru a evita acumularea de azide în conducte, lăsaţi să curgă prin acestea un volum mare de apă curentă după ce aţi aruncat în chiuvetă soluţii cu azidă. Unii reactivi conţin ProClin 300 (0,04%, 0,1% şi/sau 0,5%) XI : PRODUS IRITANT R43 : Poate determina sensibilizare la contactul cu pielea. S28/37: După contactul cu pielea, spălaţi imediat cu multă apă şi săpun. Purtaţi mănuşi de protecţie. MSDS este disponibilă la cerere. 5

6 6. PRECAUŢII Calitatea rezultatelor depinde de respectarea şi aplicarea corectă a următoarelor Bune Practici de Laborator: Nu utilizaţi reactivi expiraţi. Nu amestecaţi şi nu combinaţi în aceeaşi serie de lucru reactivi din loturi diferite. Denumirea testului, ca şi un număr de identificare specific sunt inscripţionate pe cadrul suport al fiecărei microplăci. Acelaşi număr de identificare specific mai apare şi pe fiecare baretă. Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA : Număr de identificare specific = 55 Verificaţi numărul de identificare specific înainte de fiecare utilizare. Orice baretă pe care lipseşte numărul de identificare specific sau diferă de cel corespunzător testului realizat un trebuie folosită. REMARCĂ: se pot utiliza alte loturi decât cele din trusă pentru : soluţia de spălare (R2, etichetă de identificare : 20x, scris cu verde), tamponul substrat pentru peroxidază (R8, etichetă de identificare : TMB buf, scris cu albastru), cromogen (R9, etichetă de identificare : TMB 11x., scris cu violet) şi soluţia de stopare (R10, etichetă de identificare : 1N, scris cu roşu), sub rezerva folosirii unui singur şi aceluiaşi lot în cursul unei serii de lucru. Aceşti reactivi pot fi utilizaţi şi cu alte produse BIO-RAD (R2, etichetă 10x scris cu albastru sau 10x scris cu portocaliu), cu condiţia să fie reconstituite corect şi să se folosească un singur amestec în cursul unei testări date. Contactaţi serviciul nostru tehnic pentru informaţii suplimentare privind compatibilitatea acestor reactivi generici cu alte truse. Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 de minute pentru ca reactivii să ajungă la temperatura camerei. Reconstituiţi cu grijă reactivii pentru a evita orice contaminare. Nu realizaţi testul în prezenţa vaporilor reactivi (acizi, baze, aldehide) sau a prafului deorece se poate altera activitatea enzimatică a conjugatului. Utilizaţi sticlărie bine spălată şi clătită cu apă distilată sau, de preferinţă, folosiţi vase de unică întrebuinţare. Nu lăsaţi microplaca să se usuce între sfârşitul etapei de spălare şi distribuţia reactivului următor. Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la orice metale sau ionii acestora. În consecinţă, nici un element metalic nu trebuie să vină în contact cu soluţiile ce conţin conjugatul sau substratul. Soluţia de developare (tamponul substrat + cromogen) trebuie să fie de culoare roz. Modificarea acestei culori la câteva minute după reconstituire indică faptul că reactivul nu poate fi utilizat şi trebuie înlocuit. Soluţia de developare trebuie preparată în recipiente de plastic de unică folosinţă, sau în recipiente din sticlă prespălate cu soluţie de HCl 1N, clătite bine cu apă distilată şi apoi uscate. Acest reactiv se pastrează la întuneric. Utilizaţi un con nou de pipetă pentru fiecare ser. Spălarea corectă este o etapă critică în realizarea acestui test: respectaţi numărul recomandat de cicluri de spălare şi verificaţi dacă godeurile sunt bine umplute şi apoi golite complet. Spălarea incorectă poate antrena rezultate eronate. Nu utilizaţi niciodată acelaşi container pentru distributia conjugatului şi a soluţiei de developare. 7. RECOLTAREA PROBELOR Sângele trebuie recoltat în conformitate cu practicile curente pentru venopuncţie. Testările se efectuează pe ser sau plasmă nediluate (recoltate pe anticoagulanţi pe bază cum sunt EDTA, citrat, ACD). Probele ce conţin agregate trebuie clarificate prin centrifugare înainte de testare. Particulele sau agregatele de fibrină în suspensie pot conduce la rezultate fals pozitive. Probele vor fi stocate la +2/+8 0 C dacă urmează să fie testate în decurs de 7 zile, sau vor fi congelate la C. Evitaţi congelările/dezgheţările repetate. Dacă probele trebuie transportate, 6

7 va trebui să le ambalaţi în conformitate cu reglementările în vigoare privind transportul agenţilor etiologici, preferabil în stare congelată. NU UTILIZAŢI SERURI CONTAMINATE BACTERIOLOGIC, HIPERLIPEMICE SAU INTENS HEMOLIZATE. REMARCĂ: Nu afectează rezultatele probele ce conţin până la 90 g/l de albumină, 50 µg/ml de biotină şi 100 mg/l de bilirubină, nici probele lipemice cu până la 36 g/l de trigliceride şi nici ce hemolizate ce un depăşesc 87 g/l de hemoglobină. S-au testat probe negative şi probe pozitive pentru anti-hcv sau AgHCV, înainte şi după tratare termică la 56 C timp de 30 minute, ca şi după 3 cicluri de congelare/decongelare. Nici unul din aceste tratamente nu a afectat detecţia anti-hcv. Totuşi, tratarea termică reduce semnificativ valorile absorbţiilor înregistrate la detecţia antigenului HCV cu trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA. 8. PREPARAREA REACTIVILOR - VALABILITATE - STABILITATE Înainte de utilizarea trusei MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA lăsaţi reactivii să ajungă la temperatura camerei timp de 30 de minute. 1) Reactivi gata de utilizare Microplaca (R1) Fiecare cadru suport cu 12 barete este ambalat într-o pungă cu nervură. Tăiaţi punga cu foarfeca sau bisturiul la 0,5-1 cm deasupra nervurii. Deschideţi punga şi scoateţi cadrul. Reţineţi numărul necesar de barete şi apoi reintroduceţi în pungă baretele pe care nu le veţi utiliza. Resigilaţi cu grijă ambalajul apăsând la nervură şi păstraţi la +2/+8 0 C. Conjugat 1 gata de utilizare (R6) Omogenizaţi prin răsturnare înainte de utilizare. Conjugat 2 gata de utilizare (R7) Omogenizaţi prin răsturnare înainte de utilizare. 2) Reactivi de reconstituit Soluţia de spălare R2 (20x) Diluaţi soluţia de spălare R2 cu apă distilată în proporţie de 1 :20. Astfel se obţine soluţia de spălare gata de lucru. Preparaţi 800 ml pentru o placă cu 12 barete. Soluţia de revelare enzimatică (R8+R9) Diluaţi 1 : 11 reactivul R9 în reactivul R8 (de exemplu: 1 ml de reactiv R9 în 10 ml de reactiv R8). Pentru 12 barete sunt necesari şi suficienţi 10 ml. Omogenizaţi. Antigen pozitiv de control (R5a+R5b): Soluţie de lucru. Turnaţi întregul conţinut al diluantului R5b în flaconul R5a. Puneţi la loc dopul flaconului şi lăsaţi-l timp de 10 minute să se dizolve la temperatura laboratorului, agitând din timp în timp prin răsturnarea flaconului. 3) Valabilitate Trusa trebuie păstrată la +2/+8 0 C. Fiecare componentă a trusei păstrată la +2/+8 0 C poate fi folosită până la data de expirare indicată pe ambalajul trusei (cu excepţia cazurilor pentru care sunt menţiuni speciale). R1 : După desigilare, baretele conservate la +2 /+8 0 C în punga originală bine închisă se pot folosi timp de 1 lună. R2 : Soluţia de spălare diluată se poate păstra la C tim de 2 săptămâni. Soluţia de spălare concentrată (R2) se poate păstra la R5a+R5b :Soluţia de lucru de antigen pozitiv de control se poate păstra 1 lună la +2 /+8 0 C şi 2 luni la C (cu până la 5 cicluri de congelare/decongelare, după congelare la C). R8 + R9 : După reconstituire, soluţia de developare enzimatică păstrată la întuneric este utilizabilă în interval de 6 ore la temperature ambientală ( C). 7

8 9. PROCEDEUL DE TESTARE Urmaţi în mod strict protocolul propus. Utilizaţi serurile de control negativ şi pozitiv la fiecare serie de determinări, pentru a valida calitatea testării Aplicaţi Bunele Practici de Laborator Metodă: 1) Stabiliţi cu grijă un plan de distribuire şi identificare a probelor de testat. 2) Preparaţi soluţia de spălare diluată R2 ca şi soluţia de lucru de antigen pozitiv de control (R5a+R5b). 3) Scoateţi din ambalajul protector cadrul suport şi numărul necesar de barete (R1). 4) Distribuiţi direct în godeuri în următoarea ordine, fără prespălarea prealabilă a plăcii: 4.1) 100 µl de conjugat 1 (R6) în fiecare godeu. 4.2) 50 µl de control negativ (R3) în A1, 50 µl de control pozitiv de anticorpi (R4) în B1, C1, D1, 50 µl de soluţie de lucru de antigen pozitiv de control (R5a+R5b) în E1, 50 µl din prima probă de testat în F1, 50 µl din a doua probă de testat în G1, etc Omogenizaţi amestecul prin minim 3 aspiraţii cu pipeta, sau 5 secunde cu un agitator de microplăci). Dacă pipetarea probelor durează mai mult de 10 minute, este recomandabil să distribuiţi martorii negativi şi pozitivi după pipetarea probelor de testat. În funcţie de sistemul folosit, este posibilă modificarea poziţiei sau a ordinii de pipetare a controalelor. Notă: După distribuţia probelor, godeurile ce conţin probe (sau controale) + conjugat 1 îşi schimbă culoarea de la violet la albastru. Este posibil să se verifice prezenţa probelor de testat în godeuri prin citire spectrofotometrică la 620 nm (consultaţi capitolul 12: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A CONJUGATULUI). 5) Acoperiţi microplaca cu folie adezivă şi presaţi bine pe toată suprafaţa plăcii pentru a asigura etanşeitatea adecvată a godeurilor. 6) Incubaţi microplaca în baie de apă termostatată sau incubator uscat timp de 90 ± 5 minute la 37 0 C ± 1 0 C. 7) Îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul fiecărui godeu în containerul pentru deşeuri contaminate (ce conţine hipoclorit de sodiu) şi adăugaţi cel puţin 0,370 ml de soluţie de spălare în fiecare godeu. Aspiraţi din nou. Repetaţi spălarea de încă 4 ori (un total de 5 cicluri de spălare) şi uscaţi microplaca la nevoie prin răsturnare şi tapotare pe hârtie absorbantă. Volumul rezidual în godeuri trebuie să fie mai mic de 10 µl. 8) Dacă aveţi la dispoziţie un spălător automat, respectaţi aceiaşi parametri de spălare. 9) Distribuiţi rapid 100 µl de soluţie de Conjugat 2 (R7) în toate godeurile. Conjugatul trebuie agitat uşor înainte de utilizare. Acoperiţi din nou placa cu folie adezivă şi incubaţi 30 ±5 minute la 37 0 C ± 1 0 C. Notă: Conjugatul este de culoare verde. Este posibil să se verifice prezenţa conjugatului în godeuri prin citire spectrofotometrică la 620 nm (consultaţi capitolul 12: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A CONJUGATULUI). 10) Îndepărtaţi folia adezivă, goliţi godeurile prin aspirare şi spălaţi de 5 ori urmând protocolul descris anterior. 11) Preparaţi soluţia de developare enzimatică (ca în capitolul 8, reactivul R8 + R9). 11) Adăugaţi rapid în fiecare godeu câte 80 µl de soluţie de developare a activităţii enzimatice (R8 +R9), proaspăt preparată. Incubaţi la întuneric şi la temperatura camerei ( C) timp de 30 ± 5 minute. Nu utilizaţi folie adezivă în timpul acestei incubări. 8

9 Notă: Soluţia de developare este de culoare roz. Este posibil să se verifice prezenţa solutiei de developare în godeuri în această etapă : se observă o diferenţă semnificativă de culoare între un godeu cu soluţie roz de developare şi un godeu gol (consultaţi capitolul 12 : VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR). 12) Distribuiţi câte 100 µl de soluţie de stopare (R10) în godeuri, în aceeaşi ordine şi cu aceeaşi viteză ca şi pentru soluţia de developare. Notă: Puteţi verifica în această etapă pipetarea în godeuri a soluţiei de stopare incoloră. După adăugarea acesteia, culoarea substratului, anterior roz, dispare (în godeurile cu probe negative), sau virează de la albastru la galben (în godeurile cu probe pozitive). 13) Ştergeţi cu grijă fundul microplăcii, fără a lăsa scame. Citiţi densitatea optică la cititorul de microplăci la 450/ nm după cel puţin 4 minute de la pipetarea soluţiei de stopare, dar fără a depăşi intervalul de 30 minute de la stoparea reacţiei. 14) Verificaţi rezultatele înainte de transcriere, pentru a vă asigura că există o corespondenţă perfectă între citiri şi planul de distribuire şi identificare al placilor şi al probelor. 10. ADAPTĂRI LA SISTEMELE AUTOMATE SPĂLAREA : Pentru a obţine performanţele maxime la testare, respectaţi cu stricteţe protocolul de spălare descris anterior. Pentru unele instrumente s-ar putea să fie necesar să măriţi numărul de cicluri de spălare pentru a obţine un fond negativ acceptabil. 11. CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Prezenţa sau absenţa anticorpilor anti-hcv sau/şi a antigenului capsidar HCV se determină prin compararea absorbţiei măsurate pentru fiecare probă cu valoarea calculată a pragului (cut-off). 1. Calculaţi media valorilor absorbţiei măsurate pentru serul de control pozitiv (DO R4): Exemplu: Control pozitiv (R4) Martor pozitiv R4 Densitate optică B1 1,636 C1 1,704 D1 1,650 Total 4,990 Densitatea optică totală 4,990 Media DO R4 = = = 1, Calculaţi valoarea prag (cut-off, CO): DOR4 CO = Exemplu: media DO R4 = 1,663 1,663 CO = = 0, Criteriile de validare sunt următoarele: a) Pentru martorul negativ R3: valorile măsurate ale absorbţiei trebuie să fie mai mici decât DO cut-off x 0,6. b) Pentru anticorpul poztiv de control R4: 9

10 Valoarea medie a absorbţiei măsurate trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,800 şi mai mică sau egală cu 2,400 Dacă una din valorile individuale ale martorului pozitiv se abate cu mai mult de 30% de la valoarea medie calculată, această valoare aberantă se elimină şi se reface calculul cu cele 2 valori rămase valide. c) Pentru soluţia de lucru de Antigen pozitiv de control (R5a + R5b): Valoarea măsurată a absorbţiei trebuie să fie >0,500. Testul nu este valid dacă controlul negativ R3, soluţia de lucru de Antigen pozitiv de control (R5a + R5b) şi/sau dacă mai mult de un anticorp pozitiv de control R4 sunt în afara limitelor precizate anterior. 4. Interpretarea rezultatelor Probele cu o densitate optică mai mică decât valoarea prag calculată (CO) sunt considerate negative în testul MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA. Probele a căror densitate optică se situează imediat sub valoarea prag calculată (CO 10% < DO probă < CO) trebuie interpretate cu prudenţă şi retestate în duplicate, dacă sistemele şi protocoalele de laborator o permit. Probele cu o densitate optică mai mare sau egală cu valoarea cut-off CO sunt considerate iniţial reactive şi înainte de interpretarea finală se vor retesta în duplicat. După retestare, proba este considerată pozitivă în testul MONOLISA HVC Ag-Ab ULTRA dacă unul din cele 2 duplicate este pozitiv, adică mai mare sau egal cu valoarea cut-off. Proba va fi considerată negativă dacă ambele valori la retestare sunt mai mici decât valoarea cut-off. 12. VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBEI ŞI A REACTIVILOR (OPŢIONALĂ) VERIFICAREA PRIMEI ETAPE : PREZENŢA CONJUGATULUI 1 (R6) ŞI A PROBELOR Prezenţa conjugatului 1 (R6) + probă în godeuri se poate verifica prin citire automată la 620 nm. Fiecare godeu în care s-au pipetat conjugatul 1 şi proba de testat trebuie să aibă DO > 0,800. REMARCĂ : După adăugarea probelor, culoarea conjugatului 1 virează de la violet la albastru. VERIFICAREA CELEI DE-A DOUA ETAPE: PREZENŢA CONJUGATULUI 2 (R7) Conjugatul 2 (R7) este de culoare verde. Prezenţa conjugatului 2 (R7) în godeuri se controlează prin citire automată la 620 nm: valoarea DO măsurată în fiecare godeu trebuie să fie mai mare de 0,300 (o valoare mai mică decât această normă indică o pipetare necorespunzătoare a conjugatului). VERIFICAREA PIPETĂRII SOLUŢIEI DE DEVELOPARE Prezenţa în godeuri a soluţiei de developare de culoare roz poate fi verificată prin citire automată la 490 nm : un godeu în care s-a pipetat soluţia de developare trebuie să aibă DO mai mare ca 0,100 (DO mai joasă este indicativă pentru proasta pipetare a soluţiei de developare). Se constată modificarea semnificativă de culoare a godeurilor goale, de la incolor la roz, după pipetarea soluţiei cromogene de substrat. 13. PERFORMANŢELE ACESTUI TEST A STUDII DE SPECIFICITATE Pentru a stabili specificitatea la testare s-au folosit eşantioane prelevate de la donatori de sânge şi bolnavi, care s-au testat atât cu trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA, cât şi cu altă trusă folosită în mod curent în laboratoarele de rutină din diferite laboratoare. Specificitatea la testarea donatorilor de sânge Studiile au fost efectuate în 3 locaţii diferite, testându-se eşantioane de ser de la donatori fidelizaţi sau noi. 10

11 Locaţii Rungis B.B Franţa Bordeaux B.B Franţa Donatori din Montpellier Franţa Total Nr. probe testate Nr. probe repetat reactive Din cei 7161 de probe de donatori, 12 probe au fost repetat reactive la testarea cu trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA în conformitate cu recomandările de interpretare din prospectul de lucru, dar ele nu au fost confirmate HCV pozitive prin PCR-HCV sau imunoblot Deciscan HCV PLUS. Specificitatea determinată la donatori de sânge este de 99,83% (99,71% - 99,91%, interval de confidenţă de 95%). Specificitatea la pacienţi internaţi în spital În 2 locaţii s-au evaluat 469 de seruri recoltate prospectiv de la pacienţii internaţi. Un număr de 440 de probe au fost testate negative cu truse de anti-hcv marcate CE şi cu trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA. Din total, 22 de seruri au fost găsite pozitive cu MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA şi cu testele de rutină folosite local, iar 21/22 au fost confirmate pozitive, în timp ce 1/22 a fost găsit probabil pozitiv cu Deciscan. Pentru 7 probe rezultatele obţinute cu MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA erau discordante faţă de imunoblotul Deciscan HCV PLUS şi testarea PCR. Rezultatele următoare se referă la cele 7 probe discordante: 2 probe pozitive cu testul de rutină (negative în PCR-HCV şi imunoblot Deciscan HCV PLUS) şi negative cu MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA au fost conchise ca fals pozitive la testarea cu trusele de rutină. Pentru 2 probe nu s-a putut trage nici o concluzie întrucât rezultatul PCR nu a fost interpretabil. Aceste probe au fost eliminate din calculele ulterioare. Una probă a fost gasită pozitivă cu testul de rutină, negativă cu MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA, indeterminată cu imunoblot Deciscan HCV PLUS şi negativă în PCR. Numai 2 probe pozitive cu MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA (cu rapoarte de reactivitate scăzute, situate sub 1,7) şi pozitive şi cu testele de rutină pentru anti-hcv, erau negative PCR şi indeterminate în imunoblot Deciscan HCV (cu bandă NS4 slab pozitivă). Specificitatea calculată pe baza acestui studiu este de 99,5% (443/445) dacă ultimele 2 probe sunt interpretate ca fals pozitive, şi de 100% dacă sunt interpretate ca real-pozitive datorită prezenţei anticorpilor remanenţi consecutiv infecţiei iniţiale (profil indeterminat în imunoblot). Specificitatea pe probe cu potenţial de interferenţă S-au studiat în plus 429 probe cu potenţial de reactivitate încrucişată la testarea imunoenzimatică. Aceste probe au fost recoltate astfel: De la pacienţi cu boli infecţioase cum ar fi hepatitele B şi A, rubeola, toxoplasmoza, parotidita, rujeola, CMV, HSV, EBV, VZV, HTLV I, HIV, Chagas, flaviviroze, sau vaccinaţi antigripal De la pacienţi cu Factor Reumatoid pozitiv De la pacienţi cu maladii autoimune (LES), mieloame, pozitivi pentru HAMA & ANA De la gravide, pacienţi cu ciroză, pacienţi cu insuficienţă renală cronică şi dializaţi. Din cele 429 de probe, 1 a fost repetat reactivă cu trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA şi pozitivă HCV cu una din trusele de anti-hcv marcate CE. Specificitatea reieşită din testarea acestor probe dificile a fost de 100% (428/428). B STUDII DE SENSIBILITATE Sensibilitatea testului a fost evaluată prin testarea în serie mare de probe pozitive HCV, provenite din paneluri comerciale de seroconversie, probe Bio-Rad sau din locaţiile experţilor. Rezultatele cumulate sunt sistematizate în continuare. 11

12 Sensibilitatea la testarea probelor confirmate HCV pozitive S-au testat în total 646 probe HCV pozitive provenite preponderent de la pacienţi cu infecţii cronice (cu anti-hcv prezenţi), din care 405 erau genotipate HCV. Toate aceste 646 de probe au fost intens reactive în testul MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA, prin urmare sensibilitatea obţinută a fost de 100%. Sensibilitatea la testarea probelor HCV pozitive genotipate Din totalul de 405 probe pozitive cu genotip cunoscut, 133 au fost genotipate în diferite unităţi, iar 272 au fost genotipate în laboratoarele clinice. Repartiţia genotipurilor testate a fost următoarea: Genotip 1a 1b 1c 1d 1a/b 2 2a 2b 2c 2i 2a/c 3 3a 3b Număr Genotip 3a/b 4 4a 4c 4d 4h 4k 4f 4c/d 5a 6a 6d 1b, 1a/b, Total 2a/2 2a/c Număr Toate aceste probe au fost testate pozitive: sensibilitate de 100%. Probe de la pacienţi cu infecţie acută Sensibilitatea a fost evaluată pe probe de la pacienţi aflaţi în fază acută de infecţie cu HCV (faza iniţială a infecţiei). S-au testat cu MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA 53 de paneluri de seroconversie corespunzătoare unui total de 421 de probe, şi s-au comparat rezultatele cu cele obţinute cu trusele de detecţie anti-hcv marcate CE. Trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA detectează mai devreme infecţia, practic în toate panelurile: 119 probe detectate în plus faţă de puterea de detecţie a truselor de anti-hcv marcate CE cu care s-a realizat comparaţia. 53 paneluri de seroconversie Trusă anti-hcv MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA (421 probe) Număr probe pozitive Din cele 53 paneluri de seroconversie, 11 pornesc cu o probă neviremică, permiţând o estimare mai precisă a fazei de fereastră serologică fară anticorpi anti-hcv. Panel Genotip Număr de zile până la primul rezultat pozitiv, faţă de prima recoltare (în zile) ARN HCV** Trusă anti-hcv Trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA Diferenţa între trusa anti-hcv şi MONOLISA HCV Ag- Ab ULTRA (în zile) BCP a BCP a BCP a BCP a BCP a BCP a BBI-PHV919 1a BCP a BCP-9055 NG* BCP-6216 NG* NABI-SC90 NG* Media în zile 38,2 64,9 40,7 24,2 * Negenotipat ** Rezultatul la testarea ARN este cel indicat de furnizorii de paneluri 12

13 În aceste 11 paneluri, trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA detectează infecţia cu HCV în medie cu 24 de zile mai devreme faţă de trusa anti-hcv marcată CE. Acest beneficiu se datorează mai ales detecţiei simultane a antigenului capsidar de HCV realizată de trusa MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA. Sensibilitatea la detecţia antigenului Sensibilitatea la detecţia Ag HCV a fost de asemenea abordată prin studiul unor paneluri de seroconversie, de exemplu BBI 917. Graficul următor compară sensibilitatea trusei MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA cu performanţele unui test EIA de anti-hcv al competiţiei. Studiile de reproductibilitate Studiile de reproductibilitate intra- şi inter-testări au fost efectuate folosind 7 probe : una nereactivă, 3 reactive anti-hcv şi 3 reactive Ag HCV. Pentru reproductibilitatea intra-testare, probele au fost lucrate de 30 de ori în aceeaşi serie de lucru. Reproductibilitatea inter-serii de lucru a fost evaluată prin testarea de către 2 tehnicieni, timp de 20 de zile (Dupa procedeul NCCLS EP5). Mediile rapoartelor de reactivitate (R), deviaţiile standard (DS) şi coeficienţii de variaţie (CV) calculate sunt prezentate în următoarele tabele: Tabel 1: Reproductibilitatea intra-testare Probe Medie R DS CV % Negative 0,14 0,01 6,1 Slab pozitive anti-hcv 1,12 0,04 3,65 Pozitive anti-hcv 2,39 0,08 3,39 Intens pozitive anti-hcv 4,88 0,18 3,7 Slab pozitive Ag HCV 1,14 0,03 3,04 Pozitive Ag HCV 1,97 0,06 3,02 Intens pozitive Ag HCV 5,86 0,14 2,38 CV obţinuţi cu cele 6 probe pozitive au valori sub 10% 13

14 Tabel 2: Reproductibilitatea inter-serii de lucru Probe Medie R DS CV% Negative 0,16 0,02 12,4 Slab pozitive anti-hcv 1,2 0,08 6,65 Pozitive anti-hcv 2,39 0,13 5,38 Intens pozitive anti-hcv 4,77 0,17 3,58 Slab pozitive Ag HCV 1,13 0,09 7,97 Pozitive Ag HCV 2,0 0,15 7,73 Intens pozitive Ag HCV 5,99 0,37 6,2 CV obţinuţi cu cele 6 probe pozitive au valori sub 15% 14. LIMITELE ACESTUI TEST Ţinând cont de diversitatea răspunsurilor imunologice la pacienţii infectaţi cu virusul hepatitei C (în special în perioada de seroconversie), pot fi observate diferenţe de detecţie între teste, funcţie de natura proteinelor antigenice utilizate. Un rezultat analitic negativ cu un test de depistare nu exclude posibilitatea unei expuneri sau a unei infecţii cu virusul hepatitei C. Toate tehnicile ELISA sunt, într-o măsură oarecare, generatoare de reacţii fals pozitive. Se recomandă verificarea specificităţii de reacţie pentru oricare probă găsită repetat reactivă conform criteriilor de interpretare ale testului MONOLISA HCV Ag-Ab ULTRA, folosind o metodă adecvată: un test de detecţie anti-hcv de tip ELISA, sau un test de detecţie anti-hcv de tip imunoblot, pentru a dovedi prezenţa anticorpilor anti-hcv depistaţi la screening. La nevoie se poate folosi şi un test de detecţie a genomului viral HCV, sau un test de detecţie specifică a antigenului HCV urmat de un test de neutralizare. Metoda colorimetrică de verificare a pipetării probelor, a conjugatului şi a soluţiei de developare, NU permite şi verificarea preciziei volumelor pipetate. Această metodă confirmă numai prezenţa probei în godeuri, a conjugatului şi a soluţiei de developare. Procentul rezultatelor eronate utilizând această metodă este strâns legat de precizia sistemului utilizat (un coeficient de variaţie cumulat la pipetare şi citiri, de peste 10%, determină scăderea semnificativă a calităţii acestei verificări). 15. BIBLIOGRAFIE A se vedea şi versiunea în limba franceză. Busch MP, Kleinman SH. Committee report : nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40 : Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA. 2003, 289 : Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total core HCV core antigen quantification : a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, vol 36 : Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43 : Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al. Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay : Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3) : Laperche S, Le Marr ve to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43 : Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion : Masalova OV, Atanadze SN, Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, 14

15 15 - BIBLIOGRAFIE Busch MP, Kleinman SH. Committee report : nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40 : Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA. 2003, 289 : Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total core HCV core antigen quantification : a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, vol 36 : Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43 : Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al. Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay : Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3) : Laperche S, Le Marrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez-Montreuil M, Levayer T, Zappitelli JP, Lefrère JJ. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes : an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43 : Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion : Masalova OV, Atanadze SN, Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, Fields HA, Kushch AA. Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle populations. Journal of Medical Virology. 1998, 55 : 1-6. Pawlotsky JM. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology. 2002, 36 : Pillonel J, Laperche S, Saura C, Desenclos JC, Couroucé AM et al.. Trends in residual risk of transfusion-transmitted viral infections in France between 1992 and Transfusion. 2002, 42 : Simmonds P. HCV heterogeneity : the science and the practice. In Hepatitis C Yanamouchi Europe BV Ed. p Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : Centers for Disease Control. Guidelines for Laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003, 52 : RR-3. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. Journal of Hepatology. 1999, 30 : NIH Consensus Statement on Management of hepatitis C : NIH Consensus and State-of-the- Science Statements. 2002, 19 N 3. 46p.

16 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

17 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

18 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code: