PLATELIA LYME IgM /11

Transcription

1 PLATELIA LYME IgM 1 placă Detecţia calitativă a anticorpilor IgM specifici de borrelia burgdorferi sensu lato în ser sau plasmă umană prin analiză imunoenzimatică /11 1. DESTINAŢIA TRUSEI Platelia Lyme IgM este o analiză imunoenzimatică de imunocaptură pentru detecţia calitativă a anticorpilor IgM specifici de Borrelia burgdorferi sensu lato în ser sau plasmă umană. 2. VALOAREA CLINICĂ Borelioza Lyme (sau boala Lyme) este o infecţie necontagioasă cauzată de o bacterie din familia spirochetelor, Borrelia burgdorferi, transmisă de căpuşele din genul Ixodes (2). Diverse animale sunt gazde pentru bacterii, iar transmiterea la om se face prin înţepătura căpuşelor infectate. Riscul transmiterii este proporţional cu contactul avut cu căpuşa. Prevalenţa bolii Lyme este mare în ţările cu climat temperat sau rece din emisfera nordică, de la China la America de Nord, şi din Scandinavia până în nordul Africii. Se estimează că sunt circa cazuri anual în Statele Unite (3), şi probabil peste în Europa, unde cazurile sunt distribuite inegal, în creştere de la vest la est (4). În prezent, s-a demonstrat cu certitudine că Borrelia burgdorferi, descrisă în 1984 ca specie bacteriană unică, este în realitate un complex de mai multe specii, dintre care cinci sunt patogene pentru om: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii și Borrelia bavariensis (7,8). Alte două specii sunt potențial patogene: Borrelia valaisiana și Borrelia lusitaniae. Aceste șapte specii sunt răspândite în Europa, în timp ce în Statele Unite ale Americii este prezentă doar B. burgdorferi sensu stricto. Simptomele clinice ale bolii Lyme sunt diverse şi uneori dificil de recunoscut (6). Evoluţia bolii are trei stadii. Stadiul timpuriu (stadiul I) poate fi asimptomatic şi se caracterizează printr-un sindrom similar cu gripal. În 50-80% din cazuri, la câteva zile sau săptămâni după înţepătura de căpuşă, apare raş cutanat localizat, cu expansiune centripetă, denumit erythema migrans (EM). Fără tratament, diseminarea hematogenă a Borrelia va induce câteva săptămâni mai târziu artrită inflamatoare, tulburări neurologice sau meningeale şi simptome cutanate sau cardiace (stadiul II). După luni sau ani, boala poate evolua la stadiul cronic, asociind la diferite nivele acrodermatitis chronica atrophicans, encefalopatie, encefalomielită şi artrită cronică (stadiul III) (1). Fiecare specie de Borrelia burgdorferi are un tropism particular. Erythema migrans în stadiul I este asociată tuturor celor trei specii. Cu toate acestea, complicaţiile neurologice sunt mai frecvent asociate cu B. garinii, iar artrita este mai frecvent asociată cu B. burgdorferi ss, în timp ce acrodermatitis chronica atrophicans este specifică pentru B. afzelii. Diagnosticul bolii Lyme nu trebuie confirmat fără o investigare atentă a antecedentelor medicale ale pacientului, a criteriilor clinice şi biologice, şi estimarea riscului înţepăturii de căpuşă. Din cauza dificultăţilor decelării directe, ale izolării prin cultură sau implementării metodelor de biologie moleculară, serologia rămâne elementul cheie al diagnosticului biologic în boala Lyme (1,5,9). Anticorpii IgM specifici de Borrelia burgdorferi apar la 3-6 săptămâni după contaminare şi pot persista în evoluţia bolii, în timp ce anticorpii IgG apar mai târziu şi ating maximul doar după luni, sau chiar ani. Chiar dacă serologia este mai puţin utilă în stadiul timpuriu, aceasta este totuşi esenţială în stadiile secundar sau terţiar, mai ales în absenţa erythema migrans. Când serologia este negativă în ciuda unui statut clinic sugestiv, trebuie efectuată o nouă analiză la 3 săptămâni după testarea iniţială. Prezenţa anticorpilor IgM specifici nu indică neapărat o infecţie recentă. Similar, prezenţa anticorpilor IgG specifici nu este întotdeauna asociată unei infecţii trecute. Antigenele şi anticorpii utilizaţi în trusele de analiză Platelia Lyme IgG (cod 72952) şi Platelia Lyme IgM (cod 72951) au fost selectate pentru a permite decelarea anticorpilor IgG şi IgM specifici pentru diverse tulpini Americane şi Europene de Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCIPIUL METODEI Platelia Lyme IgM este un test de detecţie calitativă în ser sau plasmă umană a anticorpilor IgM specifici de Borrelia burgdorferi sensu lato, prin analiză imunoenzimatică de captură a IgM în faza solidă. Anticorpii specifici de lanțuri μ umane sunt acoperiți în faza solidă (godeurile microplăcii). Drept conjugat este utilizat un amestec de antigene native de Borrelia și anticorpi monoclonali ai antigenelor flagelare de Borrelia marcați cu peroxidază. Testul constă în următoarele etape: Etapa 1 Probele bolnavilor şi controalele sunt diluate 1/101 şi apoi distribuite în godeurile microplăcii. În timpul acestei incubări de o oră la 37 C, anticorpii IgM anti-borrelia burgdorferi prezenţi în probă, se leagă la anticorpii anti-µ cu care s-au sensibilizat godeurile microplăcii. După incubare, anticorpii nespecifici nelegaţi şi alte proteine din ser sunt îndepărtate prin spălare. 1

2 Etapa 2 Conjugatul (amestec de antigen Borrelia şi anticorpi anti-borrelia marcaţi cu peroxidază) este adăugat în godeurile microplăcii. În timpul acestei incubări de o oră la 37 C, conjugatul se leagă la anticorpii IgM specifici anti-borrelia. Conjugatul nelegat este îndepărtat prin spălare după terminarea incubării. Etapa 3 Prezenţa complexelor imune (Ac anti-lanţuri-µ umane / IgM anti-borrelia / antigen Borrelia / anticorp monoclonal anti-borrelia marcat cu peroxidază) este demonstrată prin adăugarea în fiecare godeu a unei soluţii de developare enzimatică. Etapa 4 După incubare la temperatura camerei ( C), reacţia enzimatică este oprită prin adăugarea unei soluţii de acid sulfuric 1N. Densitatea optică citită la spectrofotometrul setat la 450/620 nm este proporţională cu cantitatea de anticorpi IgM anti-borrelia burgdorferi prezenţi în probă. 4. CONŢINUTUL TRUSEI Cantităţile livrate ale reactivilor s-au calculat să fie suficiente pentru efectuarea a 96 de teste în maximum 6 serii. Toţi reactivii se vor utiliza exclusiv pentru diagnostic in vitro. R1 R2 R3 R4 R5 R6a R6b R7 R9 Eticheta Natura reactivilor Prezentare Microplacă (gata de utilizare) Microplate 12 barete detaşabile a câte 8 godeuri, sensibilizate cu ac antilanţuri 1 microplacă µ umane Concentrated Washing Soluţie de spălare concentrată (20x) Solution Tampon TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 1 x 70 ml (20x) Conservant: 0,04 % ProClin 300 Control negativ Negative Control Ser uman negativ pentru anticorpi IgM anti- Borrelia burgdorferi, HBs negativ şi negativ pentru anti-hiv1, anti-hiv2 şi anti-hcv 1 x 0,75 ml Conservant: 0,15 % ProClin 300 Control cut-off Cut-off Control Ser uman reactiv pentru anticorpi IgM anti-borrelia burgdorferi, HBs negativ şi negativ pentru anti-hiv1, anti-hiv2 şi anti-hcv 1 x 0,75 ml Conservant: 0,15 % ProClin 300 Control pozitiv Positive Control Ser uman reactiv pentru anticorpi IgM anti-borrelia burgdorferi, HBs negativ şi negativ pentru anti-hiv1, anti-hiv2 şi anti-hcv 1 x 0,75 ml Conservant: 0,15 % ProClin 300 Antigen Antigen (liofilizat) Albumină serică bovină, antigen Borrelia 2 x pentru 8,0 ml Conjugate (51x) Diluent Chromogen TMB Conjugat (51x) Anticorpi monoclonali murini anti-borrelia marcaţi cu peroxidază. Conservant: 0,16 % ProClin 300 Diluant pentru probe şi conjugat (gata de utilizare) Tris-NaCl (ph 7,7), ser fetal de viţel, 0,1% Tween 20 şi roşu fenol Conservant: 0,15 % ProClin 300 Cromogen (gata de utilizare) 3,3.5,5 tetrametil benzidină (< 0,1%), H 2O 2 (<1%) 1 x 0,4 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Soluţie de stopare (gata de utilizare) Soluţie de acid sulfuric 1N 1 x 28 ml Pentru condiţiile de păstrate şi data expirării, vă rugăm să citiţi indicaţiile menţionate pe cutie. 5. ATENŢIONĂRI ŞI PRECAUŢII Fiabilitatea rezultatelor depinde de implementarea corectă a următoarelor recomandări de Bune Practici de Laborator: Nu utilizaţi reactivi expiraţi. Nu amestecaţi sau asociaţi în aceeaşi serie de testare reactivi din loturi diferite. REMARCĂ: Pentru soluţia de spălare (R2, identificare pe etichetă: 20x, scris cu verde), cromogen (R9, identificare pe etichetă: TMB, scris cu turcoaz) şi soluţia de stopare (R10, identificare pe etichetă: 1N, scris cu roşu), este posibilă folosirea altor loturi decât cele din trusă, cu condiţia ca aceşti reactivi să fie strict echivalenţi şi ca în cursul unei serii de testare să se utilizeze acelaşi lot. 2

3 Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 minute pentru a permite reactivilor să ajungă la temperatura camerei ( C). Reconstituiţi sau diluaţi cu grijă reactivii, prevenind orice contaminare. Nu executaţi testul în prezenţa unor vapori reactivi (vapori acizi, alcalini, aldehidici) sau a prafului, deoarece se poate altera activitatea enzimatică a conjugatului. Utilizaţi sticlărie temeinic spălată şi clătită cu apă deionizată sau, preferabil, din materiale de unică folosinţă. Spălarea microplăcii este o etapă critică a protocolului de testare: respectaţi numărul recomandat de cicluri de spălare şi asiguraţi-vă că toate godeurile sunt bine umplute, apoi complet golite. Spălările incorecte pot duce la rezultate imprecise. Nu lăsaţi ca microplaca să se usuce între sfârşitul operaţiei de spălare şi distribuirea reactivilor. Nu utilizaţi niciodată acelaşi container pentru distribuirea conjugatului şi a soluţiei de developare. Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la metale sau ioni metalici. În consecinţă, nu permiteţi niciunui element metalic să intre în contact cu diversele soluţii ce conţin conjugatul sau cromogenul. Soluţia de cromogen (R9) trebuie să fie incoloră. Apariţia culorii albastre arată că reactivul nu mai poate fi folosit, şi ca atare trebuie înlocuit. Utilizaţi un vârf nou de pipetă pentru fiecare probă. Controlaţi precizia şi funcţionarea corectă a pipetelor şi a celorlalte echipamente. Instrucţiuni de igienă şi protecţia muncii Materialele de origine umană utilizate la prepararea reactivilor au fost testate şi găsite nereactive pentru antigenul de suprafaţă al hepatitei B (AgHBs), anticorpi specific de virusul hepatitei C (anti-hcv) şi virusul imunodeficienţei umane (anti-hiv1 şi anti- HIV2). Deoarece nici o metodă nu poate garanta în mod absolut lipsa agenţilor infecţioşi, manipulaţi reactivii de origine umană şi probele bolnavilor ca fiind potenţial capabile de a transmite boli infecţioase. Orice material, inclusiv soluţiile de spălare, care vine în contact direct cu probe şi reactivi conţinând materiale de origine umană, trebuie considerat capabil de a transmite boli infecţioase. La manipularea probelor şi reactivilor, purtaţi mănuşi de unică folosinţă. Nu pipetaţi cu gura. Nu împroşcaţi probele sau soluţiile care conţin probe. Stropii trebuie clătiţi cu clor menajer (hipoclorit de sodiu) diluat la 10%. În cazul stropirii cu un acid, acesta trebuie mai întâi neutralizat cu bicarbonat de sodiu, apoi curăţat cu soluţie de hipoclorit de sodiu diluată la 10% şi uscat cu hârtie absorbantă. Materialele folosite la curăţenie trebuie aruncate în containerul de deşeuri contaminate. Probele de la bolnavi, reactivii conţinând material de origine umană, ca şi materialele şi produsele contaminate, trebuie aruncate numai după decontaminare: - fie prin imersiune în hipoclorit de sodiu de concentraţie 5% timp de 30 de minute, - sau autoclavare la 121 C timp de cel puţin 2 ore. ATENŢIE: Nu introduceţi în autoclavă soluţii conţinând hipoclorit de sodiu. Evitaţi orice contact al cromogenului sau soluţiei de stopare cu pielea şi mucoasele (risc de toxicitate, iritaţie sau arsuri). Reziduurile chimice şi biologice trebuie manipulate şi eliminate în conformitate cu Bunele Practici de Laborator. Toţi reactivii se vor utiliza exclusiv pentru diagnostic in vitro. Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente chimice din acest kit de test, vă rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la 6. RECOLTAREA, PREGĂTIREA ŞI PĂSTRAREA PROBELOR 1. Se recomandă utilizarea probelor de ser şi plasmă (recoltate pe EDTA, heparină sau citrat). 2. Respectaţi următoarele recomandări pentru manipularea, prelucrarea şi păstrarea probelor de sânge: Recoltaţi toate probele de sânge respectând precauţiile de rutină pentru venopuncţie. Pentru ser, lăsaţi probele să coaguleze complet înainte de centrifugare. Păstraţi întotdeauna eprubetele închise. După centrifugare, separaţi serul sau plasma de cheag sau hematii într-o eprubetă de stocare bine închisă. Probele pot fi păstrate la +2-8 C dacă testul este executat în decurs de 7 zile. Dacă testul nu se execută în decurs de 7 zile, sau în vederea transportului, congelaţi probele la -20 C sau mai rece. Nu folosiţi probe care au fost dezgheţate mai mult de cinci ori. Probele anterior îngheţate, trebuie omogenizate viguros (vortex) după dezgheţare, înainte de testare. 3. Probele care conţin 90 g/l de albumină sau 100 mg/l de bilirubină neconjugată, probele lipemice conţinând echivalentul a 36 g/l trioleină (trigliceride) şi probele hemolizate cu până la 10 g/l de hemoglobină, nu afectează rezultatele. 4. Nu trataţi termic probele de testat. 3

4 7. PROCEDEUL DE TESTARE 7.1 Materiale necesare dar nefurnizate Agitator tip vortex. Cititor de microplăci echipat cu filtre pentru 450 nm şi 620 nm (*). Incubator pentru microplăci cu termostat setat la 37±1 C (*). Spălător pentru microplăci automat, semi-automat sau manual (*). Apă distilată sau deionizată sterilă. Mănuşi de unică folosinţă. Ochelari sau mască de protecţie. Hârtie absorbantă. Pipete sau pipete multi-canal, automate sau semi-automate, reglabile sau fixe, pentru măsurarea şi pipetarea volumelor de µl, 2 ml şi 10 ml. Cilindrii gradaţi cu capacitate de 25 ml, 50 ml, 100 ml şi 1000 ml. Hipoclorit de sodiu (clor menajer) şi bicarbonat de sodiu. Conteiner pentru deşeuri biologice. Eprubete de unică folosinţă. (*) Adresaţi-vă departamentului nostru tehnic pentru detalii cu privire la echipamentele recomandate. 7.2 Reconstituirea reactivilor R1: Înainte de deschidere, lăsaţi punga 30 de minute temperatura camerei ( C). Scoateţi cadrul suport, reţineţi numărul de barete necesar şi returnaţi imediat în ambalaj baretele nenecesare şi verificaţi ca deshidratantul să rămână în interior. Închideţi cu grijă punga şi păstraţi-o la +2-8 C. R2: Diluaţi 1/20 soluţia de spălare R2 în apă distilată: de exemplu 50 ml de R2 şi 950 ml de apă distilată, pentru a obţine soluţia de spălat gata de utilizare. În cazul spălării manuale, pregătiţi 350 ml de soluţie diluată de spălare pentru o placă cu 12 barete. R3, R4, R5: Diluaţi 1/101 în diluant (R7) (exemplu: 10 µl de R3 + 1 ml de R7). R6a: Pentru o placă, reconstituiţi antigenul liofilizat prin adăugarea a 8 ml de diluant (R7) în fiecare flacon. Omogenizaţi perfect. Aşteptaţi 15 minute înainte de amestecarea cu conjugatul (R6b) pentru a permite o rehidratare omogenă a antigenei. R6b: Pregătiţi cantitatea necesară de conjugat pentru o serie de testare prin adăugarea a unui volum de conjugat concentrat (51x) la 50 volume de diluant (R7). Pentru o placă, amestecaţi 0,3 ml din R6b şi 15 ml din R7. R6 (R6a+R6b): Amestecaţi volume egale din reactivii R6a şi R6b reconstituiţi. Pentru o placă, amestecaţi 12 ml din soluţia reconstituită R6a şi 12 ml din soluţia reconstituită R6b. Aşteptaţi 45 minute înainte de utilizare. 7.3 Păstrarea şi valabilitatea reactivilor deschişi şi/sau reconstituiţi Trusa trebuie păstrată la +2-8 C. Când trusa este păstrată la +2-8 C înainte de deschidere, fiecare component poate fi utilizat până la data expirării indicat pe eticheta externă a trusei. R1: Odată deschise, baretele rămân stabile până la 1 lună dacă sunt păstrate la +2-8 C în aceeaşi pungă bine închisă (controlaţi prezenţa deshidratantului) R2: După diluare, soluţia de spălare poate fi păstrată timp de 2 săptămâni la C. Soluţia de spălare concentrată păstrată la C, în absenţa contaminării, este stabilă până la data expirării indicată pe etichetă. R3, R4, R5, R6b, R7: După deschidere şi fără nicio contaminare, reactivii păstraţi la +2-8 C sunt stabili timp de maxim o lună. R6a+R7: După reconstituire, antigenul este stabil 15 zile la +2-8 C sau congelat la -20 C. Antigenul reconstituit şi păstrat congelat nu trebuie decongelat de mai mult de trei ori. R6b+R7: După reconstituire, soluţia de conjugat este stabilă timp de 8 ore la temperatura camerei ( C),sau 24 ore la +2-8 C. R6 (R6a+R6b): După reconstituire, soluţia de lucru de conjugat este stabilă timp de 8 ore la temperatura camerei ( C). R9: După deschidere şi în lipsa contaminării, reactivul păstrat la +2-8 C este stabil maxim 2 luni. R10: După deschidere şi în absenţa contaminării, reactivul păstrat la +2-8 C este stabil până la data de expirare indicată pe etichetă. 7.4 Procedeu Respectaţi strict procedeul de analiză şi Bunele Practici de Laborator. Înainte de utilizare, lăsaţi reactivii să ajungă la temperatura camerei ( C). În vederea validării rezultatelor analizei, utilizaţi controalele negativ, cut-off şi pozitiv la fiecare serie de testare. 1. Stabiliţi cu grijă planul de distribuire şi identificare pentru controale şi probele pacienţilor. 2. Preparaţi soluţia diluată de spălare (R2) [vezi secţiunea 7.2]. 3. Scoateţi cadrul suport şi baretele (R1) din punguţa protectoare [vezi secţiunea 7,2]. 4. Reconstituiţi flaconul de antigen R6a prin adăugare a 8 ml diluant (R7). Omogenizaţi bine. 5. Diluaţi controalele R3, R4, R5 şi probele pacienţilor (S1, S2 ) în diluant (R7) pentru obţinerea unei diluţii de 1/101: 10 µl probă şi 1,0 ml diluant (R7). Omogenizaţi la vortex probele diluate. 4

5 6. Preparaţi soluţia de lucru de conjugat (R6): diluaţi 1/51 cantitatea necesară de conjugat (R6b) cu diluant (R7). Apoi amestecaţi volume egale din reactivii reconstituiţi R6a şi R6b [vezi secţiunea 7.2]. Soluţia de lucru de conjugat trebuie preparată cu cel puţin 45 minute înainte de distribuirea în placă. Omogenizaţi bine. 7. Respectând strict ordinea indicată mai jos, distribuiţi în fiecare godeu 200 µl din controalele şi din probele diluate: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 8. Acoperiţi microplaca cu o folie adezivă, apoi apăsaţi bine pentru asigurarea etanşeităţii. Incubaţi microplaca imediat într-o baie de apă termostatată sau în incubator uscat timp de 1 oră ± 5 minute la 37 C ± 1 C. 9. La sfârşitul primei perioade de incubare, îndepărtaţi folia adezivă de etanşare a plăcii. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container pentru deşeuri biologice (care conţine hipoclorit de sodiu). Spălaţi microplaca de 4x cu 350 µl de soluţie de spălat (R2) per godeu. Răsturnaţi microplaca şi pentru îndepărtarea lichidului remanent, tapotaţi-o uşor pe hârtie absorbantă 10. Distribuiţi în toate godeurile 200 µl din soluţia de lucru de conjugat (R6). Agitaţi uşor soluţia înainte de utilizare. 11. Acoperiţi microplaca cu o nouă folie adezivă, apoi apăsaţi bine pentru asigurarea etanşeităţii. Incubaţi microplaca imediat într-o baie de apă termostatată sau în incubator uscat timp de 1 oră ± 5 minute la 37 C ± 1 C. 12. La sfârşitul celei de a doua perioade de incubare, îndepărtaţi folia adezivă de etanşare a plăcii. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container pentru deşeuri biologice (care conţine hipoclorit de sodiu). Spălaţi microplaca de 4x cu 350 µl de soluţie de spălare (R2) per godeu. Răsturnaţi microplaca şi pentru îndepărtarea lichidului remanent, tapotaţi-o uşor pe hârtie absorbantă. 13. Distribuiţi rapid ferit de lumină în fiecare godeu 200 µl de soluţie de cromogen (R9). Lăsaţi reacţia să se dezvolte în întuneric timp de 30 ± 5 minute la temperatura camerei ( C)). În timpul acestei incubări, nu folosiţi folie adezivă. 14. Stopaţi reacţia enzimatică prin adăugarea a 100 µl de soluţie de stopare (R10) în fiecare godeu. Pipetaţi în aceeaşi ordine şi cu aceeaşi viteză ca şi pentru soluţia de developare developare. 16. Ştergeţi cu grijă fundul plăcii. Folosind un cititor de plăci, citiţi densitatea optică la 450/620 nm în decurs de 30 minute după oprirea reacţiei. Baretele trebuie întotdeauna protejate de lumină înainte de citire. 17. Înaintea raportării rezultatelor, verificaţi citirile cu planul de distribuire al probelor în placă. 8 CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR 8.1 Calculul valorii cut-off (CO) Valoarea cut-off (CO) corespunde valorii medii a densităţilor optice (DO) ale duplicatelor controalelor cut-off (R4): CO = media DO R4 8.2 Calculul rapoartelor de reactivitate al probelor Rezultatul probelor este exprimat printr-un raport, utilizând formula următoare: Raportul de reactivitate probă = DO probă /DO CO 8.3 Controlul calităţii Includeţi toate controalele pe fiecare microplacă şi la fiecare serie de testare, apoi analizaţi rezultatele obţinute. Pentru validarea analizei trebuie îndeplinite următoarele criterii: Valori ale densităţii optice: - CO > 0,2-0,80 x CO < DO R4 replicat 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < DO R4 replicat 2 < 1,20 x CO (Valoarea DO pentru fiecare replicat cut-off (R4) nu trebuie să se abată cu mai mult de 20% de la valoarea CO). Raporturile densităţii optice: - Raport R3 (DO R3 / CO) < 0,5 - Raport R5 (DO R5 / CO) > 2,0 Dacă aceste criterii ale controlului calităţii nu sunt îndeplinite, testarea trebuie repetată. 5

6 8.4 Interpretarea rezultatelor Raportul de reactivitate Rezultat Interpretare Raport < 0,80 0,80 Raport < 1,2 Raport 1,2 Negativ Ambiguu Pozitiv Proba se consideră nereactivă pentru prezenţa anticorpilor IgM anti-borrelia burgdorferi sensu lato. Proba se consideră ambiguă pentru prezenţa anticorpilor IgM anti-borrelia burgdorferi sensu lato. Rezultatul trebuie confirmat printr-un test suplimentar executat pe o a doua probă prelevată la cel puţin 3 săptămâni după proba iniţială. Proba se consideră reactivă pentru prezenţa anticorpilor IgM anti-borrelia burgdorferi sensu lato. Dacă se suspectează o infecţie, pentru confirmarea diagnosticului sunt necesare teste serologice complementare, cum ar fi detectarea anticorpilor IgG anti-borrelia. Dacă serologia dă rezultate pozitive sau ambigue, este recomandabilă testarea probei cu o metodă de confirmare, cum este Western-Blot (9). 8.5 Ghid pentru remedierea problemelor Reacţiile nevalidate sau nerepetabile sunt adesea cauzate de: Spălarea necorespunzătoare a microplăcilor. Contaminarea probelor negative cu ser sau plasmă cu titru ridicat de anticorpi. Contaminarea soluţiei de developare de agenţi chimici oxidanţi (clor, ioni metalici, etc.). Contaminarea soluţiei de stopare. 8.6 Exemplu de calcul Notă: Următoarele rezultate sunt date ca exemplu şi nu trebuie folosite în locul rezultatelor reale obţinute de utilizator. Controale şi probe biologice DO (450/620 nm) Raport Rezultat R3 0,155 0,22 Negativ R4 0,709 / / R4 0,697 / / R5 2,280 3,24 Pozitiv Proba 1 1,181 1,67 Pozitiv Proba 2, etc. 0,597 0,85 Pozitiv Valoare cut-off: - CO = (0,709+0,697)/2 = 0,703 Valori ale densităţii optice: - DO CO = 0,703 (N > 0,200) - DO R4 replicat 1 = 0,709 (0,80 x DO CO < DO R4 replicat 1 < 1,20 x DO CO) - DO R4 replicat 2 = 0,697 (0,80 x DO CO < DO R4 replicat 2 < 1,20 x DO CO) Raporturile densităţilor optice: - Raport R3 = 0,22 (N < 0,5) - Raport R5 = 3,24 (N > 2,0) Controlul calităţii: Acceptat 9 PERFORMANŢE 9.1 Prevalenţa Determinarea prevalenţei anticorpilor IgM contra Borrelia burgdorferi sensu lato în ser uman a fost estimată utilizând un panel de 296 de probe obţinute de la donatori de sânge din nordul Franţei. S-au obţinut următoarele rezultate: 286 seruri negative, 8 ambigue şi 2 pozitive. Utilizând testul Platelia Lyme IgM s-a stabilit o prevalenţă de 0,68% (2/296). 9.2 Specificitatea Specificitatea în zone neendemice Specificitatea a fost estimată pe un panel de 286 de seruri obţinute de la donatori de sânge sănătoşi, care trăiesc în nordul Franţei. Probele au fost selectate pe baza rezultatelor negative obţinute cu un test EIA comercial utilizat în Europa (marcat CE) şi considerat drept referinţă. 6

7 9.2.2 Specificitate în zone endemice Specificitatea a fost de asemenea determinată pe un set de 197 de seruri obţinute de la donatori de sânge sănătoşi care trăiesc în estul Franţei, fără semne de boală Lyme (niciun simptom clinic de borelioză, fără istoric de înţepături de căpuşă). Probele au fost selectate pe baza rezultatelor negative obţinute cu un test EIA comercial utilizat în Europa (marcaj CE) şi considerat drept referinţă. Rezultatele obţinute sunt prezentate în următorul tabel: Panel de seruri Negativ Ambiguu (1) Pozitiv (2) Specificitate Zone neendemice (n=286) Zonă endemică (n=197) ,6 % (280/281) [98,0%-100,0%] 99,0 % (191/193) [96,3%-99,9%] (1) Rezultatele ambigue nu au fost luate în considerare la calculul specificităţii. (2) Una din cele trei probe pozitive cu testul Platelia Lyme IgM a fost de asemenea găsită pozitivă prin metoda Western-blot. (3) IC 95%: 95% interval de confidenţă. 9.3 Sensibilitatea Sensibilitatea testului Platelia Lyme IgM a fost calculată şi coroborată cu rezultatele sensibilităţii la testarea cu Platelia Lyme IgG (cod 72952) pe un set de 70 de probe provenind de la pacienţi prezentând diverse forme ale bolii Lyme în diferite stadii clinice. Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor şi au fost comparate cu sensibilităţile obţinute cu teste comerciale EIA utilizate în Europa (marcaj CE) şi considerate de referinţă: Stadiul clinic Număr de seruri Platelia Lyme (1) Referinţă europeană (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG Erythema migrans (Stadiul I) 17 58,8 % [32,9%-81,6%] 66,7 % [38,4%-88,2%] 82,4 % [56,6%-96,2%] 93,3 % [68,1%-99,8%] Neuroborelioză (Stadiul II) 33 36,7 % [19,9%-56,1%] 96,9 % [83,4%-99,9%] 96,9 % [83,4%-99,9%] 97,0 % [84,2%-99,9%] Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadiul III) 5 20,0 % [0,05%-71,6%] [54,9%-100,0%] [54,9%-100,0%] [54,9%-100,0%] Artrită Lyme (Stadiul III) 15 0,0 % [0,0%-18,1%] [81,9%-100,0%] (1) Rezultatele ambigue nu au fost luate în considerare la calculul sensibilităţii. (2) IC 95%: 95% interval de încredere. [81,9%-100,0%] [81,9%-100,0%] 7

8 Sensibilitatea testului Platelia Lyme IgM a fost de asemenea demonstrată pe un panel de probe furnizate de CDC (Center for Disease Control), şi au fost comparate cu sensibilităţile obţinute cu teste comerciale EIA utilizate în Europa (marcate CE) şi SUA (aprobate de FDA), acestea fiind considerate drept referinţă. Rezultatele sunt prezentate în următorul tabel: Stadiul clinic Erythema migrans Număr de seruri 28 Platelia Lyme (1) Referinţă europeană (1) Referinţă SUA (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG IgM + IgG 73,7 % [48,8%-90,9%] 38,5 % [20,2%-59,5%] 86,4 % [65,1%-97,1%] 70,4 % [49,8%-86,3%] 87,0 % [66,4%-97,2%] Artrită / Artralgie 6 40,0 % [5,3%-85,3%] [60,7%-100,0%] [60,7%-100,0%] [60,7%-100,0%] [60,7%-100,0%] Fază necunoscută 4 [0,05%-100,0%] [36,8%-100,0%] [47,3%-100,0%] [19,4%-99,9%] [36,8%-100,0%] (1) Rezultatele ambigue nu au fost luate în considerare la calculul sensibilităţii. (2) IC 95%: 95% interval deconfidenţă. 9.4 Precizia Precizia intra-testare (repetabilitate): Pentru a evalua repetabilitatea intra-serie de lucru, o probă negativă şi trei pozitive au fost analizate de 30 de ori în cursul aceleiaşi serii de testare. Raportul de reactivitate (DO probă / DO CO) a fost determinat pentru fiecare probă. Rapoartele medii, deviaţiile standard (DS) şi coeficienţii de variaţie (CV %) pentru fiecare din cele patru probe sunt prezentate în tabelul de mai jos: Precizia intra-testare ( repetabilitate) N=30 Probă negativă Probă slab pozitivă Probă pozitivă Probă puternic pozitivă Raport (DO probă / valoare cut-off) Medie 0,24 1,17 1,88 4,23 Deviaţie standard 0,040 0,052 0,070 0,104 CV % 15,2 4,4 3,7 2,5 Precizia inter-testări (reproductibilitate) : Pentru evaluarea reproductibilităţii inter-serii de lucru, fiecare din cele patru probe (o probă negativă şi trei pozitive) au fost testate în duplicat în două serii pe zi, în cursul unei perioade de 20 de zile. Raportul de reactivitate (DO probă / DO CO) a fost determinat pentru fiecare probă. Rapoartele medii, deviaţiile standard (DS) şi coeficienţii de variaţie (CV %) pentru fiecare din cele patru probe sunt prezentate în tabelul de mai jos: Precizia inter-serie (reproductibilitate) N=80 Probă negativă Probă incertă Probă pozitivă Probă intens pozitivă Raport (OD probă / valoare cut-off) Medie 0,24 1,21 1,76 4,18 Abatere standard 0,029 0,067 0,104 0,153 CV % 12,0 5,5 5,9 3,7 8

9 9.5 Reactivitatea încrucişată 338 de probe cu caracteristici potenţial generatoare de reacţii nespecifice au fost testate cu testul Platelia Lyme IgM. Rezultatele sunt prezentate în următorul tabel: Panel de probe Număr de probe Incerte (1) Pozitive Reactivitate încrucişată % Sifilis ,2 (2) CMV ,3 (2) EBV ,4 (3) Leptospiroză ,3 (3) Malarie ,0 (3) Anticorpi antinucleari (ANA) ,0 Anticorpi heterofili (HAMA) ,0 Factor reumatoid ,0 HSV ,0 Toxoplasmoză ,6 (2) Rubeolă ,0 Rujeolă ,0 Oreion ,0 HIV ,0 VZV ,0 TOTAL ,8 (1) Rezultatele ambigue nu au fost luate în considerare la calculul reactivităţii încrucişate. (2) Fără diferenţe statistic semnificative de răspândire în zonă endemică (test Fisher, p>0,05). (3) Semnificativ diferit de răspândirea în zonă endemică (test Fisher, p<0,05). Cele 16 probe pozitive în testul Platelia Lyme IgM au fost de asemenea verificate cu testele comerciale EIA utilizate în Europa (marcate CE) şi prin metoda Western-Blot. Rezultatele sunt prezentate în următorul tabel: Proba Testul EIA Western blot (1) Proba Testul EIA Western blot (1) Sifilis Negativ Negativ Leptospiroză Pozitiv Pozitiv CMV Negativ Negativ Malarie Ambiguu NT EBV Pozitiv Pozitiv Malarie Pozitiv NT EBV Pozitiv Negativ Malarie Ambiguu NT EBV Pozitiv Negativ Malarie Pozitiv NT EBV Pozitiv NT Malarie Negativ NT EBV Pozitiv Incert Malarie Negativ NT Leptospiroză Negativ Pozitiv Toxoplasmoză Pozitiv Negativ (1) NT: netestat din cauza volumului insuficient de probă. 9

10 10 LIMITELE ACESTUI TEST Diagnosticul infecţiei cu Borrelia burgdorferi poate fi stabilit doar prin combinarea rezultatelor clinice şi biologice. Rezultatul unui singur test pentru detecţia anticorpilor IgG anti-borrelia burgdorferi nu constituie o dovadă suficientă pentru diagnosticul unei infecţii cu Borrelia burgdorferi sensu lato. Dacă serologia este pozitivă sau ambiguă, este recomandabilă testarea probei cu o metodă de confirmare, cum este Western-Blot (9). 11 CONTROLUL CALITĂŢII LA PRDOUCĂTOR Toţi reactivii produşi sunt preparaţi în conformitate cu sistemul nostru de calitate, începând de la recepţia materiei prime şi până la comercializarea produsului finit. Fiecare lot este supus evaluărilor de control de calitate şi este eliberat pentru comercializare, doar dacă se conformează criteriilor de acceptare prestabilite. Înregistrările cu privire la producţie şi rezultatele controlului fiecărui lot sunt păstrate la firma Bio-Rad. 12 BIBLIOGRAFIE 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: Center for Disease Control and Prevention Lyme disease United States, Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: Hubalek, Z., Halouzka, J Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: Reed, K. D Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: Stanek, G., Strle, F Lyme borreliosis. Lancet. 362: Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): Wilske, B Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3:

11 11

12 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)