I.O.S.U.D. - Universitatea de Vest Vasile Goldiș din Arad ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE

Transcription

1 I.O.S.U.D. - Universitatea de Vest Vasile Goldiș din Arad ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE Arad, 2016

2 TEZA DE DOCTORAT Efectul polifenolilor din plante asupra celulelor canceroase Doctorand: Ancuţa Ioana Oarcea (Isaia) Conducător de doctorat: Prof. univ. dr. Daniela Bratosin

3 CUPRINS INTRODUCERE 12 STADIUL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIU EFECTUL POLIFENOLILOR ASUPRA SĂNĂTĂŢII OMULUI: PREVENIRE ŞI 14 MECANISME DE ACŢIUNE 1.1. Polifenolii din plante - antioxidanţi în domeniul sănătăţii omului Noţiuni generale despre polifenoli Aspecte structurale. Clasificarea polifenolilor Acizi fenolici Flavonoide Stilbeni Lignani Răspândire. Factori care influenţează conţinutul de polifenoli din plante Metode de extracţie utilizate în obţinerea de extracte bogate în compuşi polifenolici Metode cromatografice de caracterizare a extractelor Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC) Cromatografia în strat subţire şi pe hârtie Biodisponibilitatea polifenolilor Aplicaţii ale polifenolilor în prevenţia unor afecţiuni Rolul polifenolilor în cancer Rolul polifenolilor în bolile cardiovasculare Rolul polifenolilor în bolile neurodegenerative Rolul polifenolilor în diabet Rolul polifenolilor în osteoporoză METODE DE EVALUARE A ACTIVITĂŢII ANTIOXIDANTE ŞI A CONŢINUTULUI 43 TOTAL DE COMPUŞI POLIFENOLICI 2.1. Metode chimice de evaluare a activităţii antioxidante Metoda DPPH Metoda TEAC Metoda FRAP Determinarea conţinutului total de compuşi polifenolici Evaluarea activităţii antioxidante prin citometrie în flux 47 CONTRIBUŢIA PERSONALĂ OBŢINEREA ŞI VERIFICAREA CALITĂŢII EXTRACTELOR DE PLANTE 50 SUPUSE STUDIULUI 3.1. Obiective Alegerea taxonilor pentru studiu Materiale și metode Rezultate şi discuţii Concluzii Prepararea extractelor din materialul vegetal recoltat Materiale şi metode Mod de extracţie Caracteristici tehnologice Caracteristici chimice Materiale şi reactivi Rezultate şi discuţii Concluzii 68

4 3.4. Analiza extractelor alcoolice polifenolice prin cromatografie în strat subţire (CSS) Materiale şi metode Rezultate şi discuţii Concluzii EVALUAREA CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE A EXTRACTELOR PRIN METODE 87 CHIMICE ŞI DETERMINAREA CONŢINUTULUI TOTAL DE POLIFENOLI 4.1. Obiective Determinarea activităţii antioxidante a extractelor prin metoda DPPH Materiale şi metode Rezultate şi discuţii Determinarea activităţii antioxidante a extractelor obţinute prin metoda TEAC (ABTS) Materiale şi metode Rezultate şi discuţii Determinarea activităţii antioxidante a extractelor obţinute prin metoda FRAP Materiale şi metode Rezultate şi discuţii Determinarea conţinutului total de compuşi polifenolici din extracte prin metoda Folin 96 Ciocâlteu Materiale şi metode Rezultate şi discuţii Compararea rezultatelor obţinute pentru activitatea antioxidantă prin cele trei metode chimice. Relaţia 99 activitate antioxidantă-conţinut total de polifenoli 4.6. Concluzii DETERMINAREA CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE A EXTRACTELOR PRIN 103 CITOMETRIE ÎN FLUX 5.1. Obiective Materiale și metode Rezultate şi discuţii Concluzii STUDIUL ACŢIUNII UNOR POLIFENOLI IZOLAŢI DIN PLANTE ASUPRA PROLIFERĂRII CICLULUI CELULAR ŞI APOPTOZEI CELULELOR CANCEROASE. POSIBILE APLICAŢII BIOMEDICALE 6.1. Obiective Materiale şi metode Rezultate și discuţii Evaluarea efectului antiproliferativ al extractelor vegetale utilizând testul MTT Determinarea potenţialului anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale testate prin metoda wound healing assay 6.4. Concluzii 124 CONCLUZII GENERALE 126 BIBLIOGRAFIE 129 LISTA DE PUBLICAŢII

5 INTRODUCERE În ultimele decenii au fost realizate progrese semnificative în înţelegerea bolilor care provoacă mortalitate și morbiditate alarmantă la oameni: procesele lor, posibila prevenire şi terapii. Cancerul şi bolile coronariene sunt cele mai importante dintre acestea. Datorită efortului cercetătorilor, este acum bine apreciat că, deși cauzele majore ale cancerului sunt diverse și nenumărate, schimbarea obiceiurilor alimentare și a stilului de viață pot reduce în multe cazuri, riscul acestuia. Studiile au arătat că multe alimente comune au componente nonnutritive, cunoscute în mod obișnuit ca agenți chemopreventivi, care pot oferi o protecție împotriva unei varietăți de boli, inclusiv a cancerului. O astfel de clasă de agenți este reprezentată de antioxidanții polifenolici. Scopul tezei de doctorat l-a constituit cercetarea unor plante din flora spontană sau din culturi ecologice în lupta împotriva cancerului printr-o serie de metode de analiză. Obiectivele urmărite în teza de doctorat sunt: 1. Obţinerea şi caracterizarea extractelor polifenolice din plante recoltate din flora spontană sau culturi ecologice. În acest sens, am ales, din flora locală, din zona Cluj, plante a căror efect antitumoral nu este pe deplin studiat sau despre care lipsesc date referitoare la activitatea anticanceroasă. Am studiat metodele de extracţie utilizate până în prezent, pentru obţinerea extractelor polifenolice, iar dintre acestea am ales metoda de extracţie care permite obţinerea de extracte bogate în polifenoli şi ulterior utilizarea acestor extracte ca suplimente alimentare. În continuare, am recurs la studierea metodelor de identificare şi cuantificare a compuşilor polifenolici utilizate la ora actuală pentru caracterizarea extractelor naturale din plante şi am selectat o metodă simplă şi rapidă care permite caracterizarea şi identificarea extractelor polifenolice obţinute. 2. Determinarea capacităţii antioxidante a extractelor obţinute prin utilizarea unor metode de analiză chimice. Astfel, am evaluat activitatea antioxidantă a extractelor utilizând metodele DPPH, TEAC (ABTS), FRAP, iar conţinutul total de polifenoli al extractelor studiate l-am stabilit utilizând metoda Folin-Ciocâlteu. Am stabilit de asemenea relaţiile între activităţile antioxidante obţinute prin cele trei metode chimice, precum şi relaţia dintre conţinutul total de compuşi fenolici şi capacitatea antioxidantă a extractelor

6 stabilită prin cele trei metode: DPPH, TEAC, FRAP. 3. Determinarea capacităţii antioxidante a extractelor obţinute prin utilizarea citometriei în flux. Extractele care au prezentat o activitate antioxidantă mai mare de 10 µmol Trolox/mL extract obţinută prin metode chimice le-am testat prin citometrie în flux atât ca atare, cât şi în diluţii seriale, în vederea determinării comportamentului extractelor la diferite concentraţii. Am studiat efectul inhibant al extractelor naturale asupra ROS în eritrocitele umane supuse stresului oxidativ şi am demonstrat importanţa utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta împotriva stresului oxidativ. 4. Evaluarea acţiunii extractelor obţinute asupra proliferării ciclului celular şi a efectului citotoxic al acestora. Astfel, am determinat efectul antiproliferativ al extractelor vegetale asupra unor linii celulare de melanom uman A375 și keratinocite HaCat folosind testul MTT. Utilizând metoda wound healing assay, am evaluat potenţialul anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale pe linii celulare de melanom murinic B164A5 și keratinocite HaCat şi am demonstrat astfel importanţa utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta contra cancerului. STUDIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII ÎN DOMENIU Prima parte a prezentei teze de doctorat o reprezintă partea teoretică, care este structurată în două capitole. Primul capitol tratează noţiuni generale despre polifenoli, şi anume efectul polifenolilor asupra sănătăţii omului, mecanism de acţiune, structură, clasificare, răspandire, metode de extractie si caracterizare a acestora. O atenţie deosebită este acordată posibilelor aplicaţii ale polifenolilor în prevenţia unor afecţiuni. Al doilea capitol, tratează metodele utilizate la ora actuală pentru determinarea activităţii antioxidante a extractelor naturale precum şi a conţinutului de compuşi polifenolici. CAPITOLUL 1. EFECTUL POLIFENOLILOR ASUPRA SĂNĂTĂŢII OMULUI: PREVENIRE ŞI MECANISME DE ACŢIUNE

7 Polifenolii sunt compuşi naturali care se găsesc în fructe, legume, cereale şi băuturi. Fructele în stare proaspătă, cum ar fi strugurii, merele, perele, cireşele şi fructele de pădure, conţin până la mg polifenoli în 100 de grame produs proaspăt. De asemenea, produsele fabricate din aceste fructe, conţin polifenoli în cantităţi semnificative. În medie, un pahar de vin roşu sau o ceaşcă de ceai sau de cafea conţine aproximativ 100 mg de polifenoli. Cerealele, leguminoasele uscate şi ciocolata constituie de asemenea un aport de polifenoli [1,2]. Polifenolii pot fi clasificaţi în diferite grupe în funcţie de numărul de inele fenolice pe care le conţin şi pe baza unor elemente structurale care leagă aceste inele între ele. Structurile generale a principalelor clase de polifenoli: acizi fenolici, flavonoide, stilbeni şi lignani [3]. În ceea ce priveste metodele cromatografice de caracterizare a extractelor naturale, cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) se utilizează frecvent pentru separarea eficientă a componenţilor unui amestec fiind caracterizată de o reproductibilitate bună a rezultatelor [4]. Alături de aceasta, cromatografia în strat subţire se foloseşte si în prezent nu numai pentru identificarea, dar şi pentru separarea preparativă a compusilor polifenolici [5, 6]. Biodisponibilitatea polifenolilor diferă, însă nu există nici o legătură între cantitatea de polifenoli din alimente şi biodisponibilitatea lor în corpul uman. În general, agliconii pot fi absorbiţi din intestinul subţire, însă cei mai mulţi polifenoli sunt prezenţi în produsele alimentare, sub formă de esteri, glicozide sau polimeri care nu pot fi absorbiţi în formă nativă [7]. Studiile epidemiologice au demonstrat o asociere inversă între riscul de boli cronice (cancer, afecţiuni cardiovasculare şi neurodegenerative, diabet sau osteoporoză) şi o alimentaţie bogată în polifenoli [1,8-10]. CAPITOLUL 2. METODE DE EVALUARE A ACTIVITĂŢII ANTIOXIDANTE ŞI A CONŢINUTULUI TOTAL DE COMPUŞI POLIFENOLICI În ultimii ani au fost dezvoltate o serie de metode analitice pentru determinarea activităţii antioxidante a produselor naturale. Aceste metodologii se referă la teste care vizează măsurarea capacităţii unei substanţe de a inhiba specii radicalice [11], metodologii care se bazează, în general, pe reacţia dintre o specie antioxidantă şi un compus cromogen. Cele mai utilizate metode sunt: metoda DPPH, metoda TEAC şi metoda FRAP. Pentru determinarea conţinutului total de compuşi fenolici din plante

8 este folosită Metoda Folin-Ciocâlteu. Evaluarea activităţii antioxidante a extractelor naturale, poate fi de asemenea realizată prin citometrie în flux. Citometria în flux se utilizează pentru analiza stresului oxidativ, prin măsurarea producţiei de ROS, atât în studiul apoptozei cât şi în studiul anumitor patologii celulare. Speciile de oxigen reactiv (ROS) sunt produse în mod continuu în celulă ca produşi secundari ai metabolismului şi pot oxida diverse molecule conducând la moarte celulară şi afectare tisulară [12]. CONTRIBUŢIA PERSONALĂ Partea a doua a tezei, constă în contribuția personală şi este structurată în patru capitole. CAPITOLUL 3. OBŢINEREA ŞI VERIFICAREA CALITĂŢII EXTRACTELOR DE PLANTE SUPUSE STUDIULUI Materialul vegetal luat în lucru Materialele vegetale (din flora spontană sau cultivate) au fost colectate în 2013, din judeţul Cluj (Transilvania, România) în perioada de înflorire (mai-august), cu excepţia Salix alba L. (martie-aprilie), Lycopodium clavatum L. (august) şi Viscum album L. (noiembrie-decembrie). Plantele au fost identificate, autentificate, o serie de specimene fiind depozitate în Ierbarul Laboratorului de Control al Calităţii, Laboratoarele Plantextrakt, Rădaia, România. Studiul macroscopic al părţilor de plantă (material vegetal) recoltate s-a realizat conform Florei Republicii Populare Romîne [13]. Prepararea extractelor din materialul vegetal recoltat Materialul vegetal recoltat, proaspăt s-a uscat, s-a mărunţit cu un cutter de laborator şi s-a extras cu etanol 90% (V/V). Raportul solvent/material vegetal a fost stabilit în conformitate cu Farmacopeea Europeană (FE), (Preparate homeopatice Metodele 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4). Extracţia s-a realizat la temperatura camerei (nedepăşind 20 C), prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, urmată de presare. S-a lasat în repaus 5 zile într-un recipient închis, iar apoi s-a filtrat [14]. Am ales ca procedeu de obţinere a extractelor naturale din cele 13 specii de plante studiate, macerarea, deoarece este cel mai simplu procedeu de extracţie şi care permite obţinerea unor extracte etanolice, ce ulterior pot fi utilizate ca suplimente

9 alimentare. Macerarea constă în amestecarea fazei solide cu solventul urmată de filtrarea soluţiei obţinute. Am caracterizat extractele prin aspect, densitate relativă, reziduu uscat şi conţinut de etanol. Aspectul a fost determinat prin observare, iar densitatea relativă a fost determinată utilizând un densitometru digital Anton Paar DMA 35. Reziduul uscat s- a determinat prin tratament termic, în etuvă. Conţinutul de etanol a fost determinat prin distilare şi prin corelarea densităţii distilatului cu datele din tabelele alcoolmetrice. Toate aceste caracteristici au fost determinate conform FE [14]. Analiza extractelor alcoolice polifenolice prin cromatografie în strat subţire (CSS) În vederea analizei extractelor alcoolice polifenolice prin cromatografie în strat subţire, s-au utilizat plăci SilG F254, la developarea cromatogramelor s-a folosit o lampă UV cu aparat de fotografiat digital, iar ca etaloane s-au utilizat: acid cafeic, rutin, borneol, acetat de bornil, (+)-carvonă, papaverină, timol, khelin, citral, cineol, galben de metanil, acid galic, colchicină, clorhidrat de berberină, hiperozid, hipericină, scopoletin, vanilină. În urma acestor analize, am demonstrat identitatea extractelor, rezultatele obţinute fiind în concordanţă cu prevederile FE. CAPITOLUL 4. EVALUAREA CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE A EXTRACTELOR PRIN METODE CHIMICE ŞI DETERMINAREA CONŢINUTULUI TOTAL DE POLIFENOLI Determinarea activităţii antioxidante a extractelor prin metoda DPPH Proba (extractul) s-a diluat corespunzător cu metanol. 0,1 ml de soluţie metanolică s-a adaugat la 2,9 ml soluţie ~ M DPPH în metanol. Inhibiţia radicalului DPPH s-a urmărit prin monitorizarea scăderii absorbanţei la 515 nm timp de 2 ore cu ajutorul unui spectrofotometru. Determinarea activităţii antioxidante a extractelor obţinute prin metoda TEAC (ABTS) Pentru a prepara 50 ml reactiv ABTS s-a dizolvat 0,18 g acid (2,2-azinobis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic)) în 10 ml soluţie tampon de acetat de sodiu în apă cu concentraţia de 20 µmol/ml (ph=4,5). S-a dizolvat 0,033 g persulfat de potasiu în 10 ml soluţie tampon de acetat de sodiu. Cele două soluţii s-au amestecat şi s-au adus la 50 ml cu soluţie tampon de acetat de sodiu. Soluţia astfel obţinută s-a incubat h, la temperatura camerei şi la întuneric. Soluţia s-a diluat corespunzător până la o

10 absorbanţă de 1,0±0,02 la 734 nm. S-a amestecat 0,1 ml extract (diluat corespunzator cu metanol) şi 2,9 ml reactiv ABTS. Amestecul s-a spectrofotometrat la 734 nm timp de 2 h, faţă de apa bidistilată. Determinarea activităţii antioxidante a extractelor obţinute prin metoda FRAP Pentru a prepara 30 ml reactiv FRAP s-a preparat o soluţie tampon de acetat de sodiu în apă de ph 3,6, apoi s-a dizolvat 0,3257 g FeCl3 în apă bidistilată şi s-a adus la 100 ml. 0,3124 g TPTZ s-a dizolvat sub încălzire la 50 C în soluţie HCl 40 µmol/ml. S-a amestecat 25 ml soluţie tampon de acetat de sodiu cu 2,5 ml soluţie TPTZ şi 2,5 ml soluţie FeCl3. Soluţia rezultată s-a diluat cu 2 volume de apă bidistilată şi s-a incubat la 37 C timp de 30 minute. S-a amestecat 0,1 ml extract (diluat corespunzător cu metanol) şi 2,9 ml reactiv FRAP. Amestecul s-a păstrat la temperatura camerei şi la întuneric timp de 2 h apoi s-a citit absorbanţa la 593 nm faţă de apa bidistilată. Tabelul I. Activitatea antioxidantă determinată prin cele trei metode chimice Nr. crt. Extract Activitatea antioxidanta (DPPH) Activitatea antioxidantă (TEAC) Activitatea antioxidantă (FRAP) 1 Lycopodium 0,928 0,402 1,111 2 clavatum Arnica L. 0,950 1,274 1,651 3 montana Chelidonium L. 2,339 1,555 2,555 4 majus Aristolochia L. 3,106 3,140 4,721 5 clematitis Viola tricolor L. L. 4,378 5,382 7,215 6 Tilia tomentosa 9,981 11,017 11,396 7 M. Hypericum 10,317 11,068 11,648 8 perforatum Salvia officinalis L. 10,387 11,925 12,600 9 L. Vaccinium 11,255 13,791 13, myrtillus Melissa officinalis L. 12,534 14,552 15, L. Viscum album L. 11,760 15,210 17, Thymus vulgaris 22,751 25,262 24, L. Salix alba L. 31,425 34,856 31,869 Determinarea conţinutului total de compuşi polifenolici din extracte prin metoda Folin Ciocâlteu S-a amestecat 200 μl extract (diluat in prealabil 1:10 cu apă bidistilată) cu 15 ml apă bidistilată şi 1 ml reactiv Folin-Ciocâlteu. Amestecul s-a incubat 5 minute la temperatura camerei, după care s-a adăugat 3 ml soluţie de carbonat de sodiu în apa 20% şi s-a adus la 20 ml cu apă bidistilată. După incubare timp de 2 ore la temperatura

11 camerei, s-a citit absorbanţa la 765 nm faţă de martor (reactiv Folin-Ciocâlteu preparat cu apă bidistilată). Conţinutul total de fenoli exprimat ca µg echivalent acid galic/ml de extract de plante (µg GAE/mL) este prezentat în tabelul II. Toate probele au fost analizate în triplicat. Tabelul II. Conţinutul total de fenoli din plantele selectate Nr. Extract Total fenoli crt. [µg GAE/mL] 1 Aristolochia clematitis L. 1863,380 2 Arnica montana L. 1188,402 3 Chelidonium majus L. 1282,916 4 Hypericum perforatum L. 2825,880 5 Lycopodium clavatum L. 1023,694 6 Melissa officinalis L. 2774,810 7 Salix alba L. 5853,650 8 Salvia officinalis L. 2899,860 9 Thymus vulgaris L. 4770, Tilia tomentosa M. 2745, Vaccinium myrtillus L. 2965, Viola tricolor L. 2268, Viscum album L. 4239,746 Compararea rezultatelor obţinute pentru activitatea antioxidantă prin cele trei metode chimice. Relaţia activitate antioxidantă-conţinut total de polifenoli Figura 1 prezintă comparativ valorile activităţilor antioxidante obţinute prin cele trei metode, DPPH, TEAC, FRAP. Variaţia conţinutului total de fenoli din plantele selectate este prezentată în figura 2. Figura 1. Compararea activităţilor antioxidante ale extractelor prin cele trei metode

12 Figura 2. Conţinutul total de fenoli din plantele selectate Activitatea antioxidantă evaluată prin metoda DPPH, variază în intervalul 0,928-31,425 µmol Trolox/mL extract. Evaluarea prin metoda TEAC (ABTS) a condus la valori ale activităţii antioxidante între 0,402 şi 34,856 µmol Trolox/mL extract, iar cea prin metoda FRAP la valori în intervalul 1,111-31,869 µmol Trolox/mL extract. Salix alba L. prezintă cea mai mare activitate antioxidantă (DPPH: 31,425 µmol Trolox/mL extract; TEAC: 34,856 µmol Trolox/mL extract; FRAP: 31,869 µmol Trolox/mL extract, urmată de Thymus vulgaris L. etc. S-a constatat că 7 din cele 13 specii de plante luate în studiu prezintă o activitate antioxidantă mai mare de 10 µmol Trolox/mL extract, doar 3 dintre ele având valori mai mici de 3 µmol Trolox/mL extract. În ceea ce priveşte relaţia dintre activitatea antioxidantă şi conţinutul total de compuşi fenolici (fig. 3) am constatat că, în general, există o bună corelaţie între cele două (DPPH: R 2 = 0,9170; TEAC: R 2 = 0,9436; FRAP: R 2 = 0,9626), ceea ce demonstrează că constituenţii fenolici sunt responsabili pentru activitatea antioxidantă a plantelor. Figura 3. Corelaţia dintre activitatea antioxidantă şi conţinutul total de compuşi fenolici

13 CAPITOLUL 5. DETERMINAREA CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE A EXTRACTELOR PRIN CITOMETRIE ÎN FLUX Sângele uman folosit în experienţe a fost obţinut de la donatori sănătoşi şi furnizat de Centrul de Transfuzii din Arad. Sângele a fost prelucrat la maximum 1 h după colectare. Eritrocitele umane au fost sedimentate prin centrifugare (1000 g, 4 C, 5 min) pentru eliminarea plasmei leucocitelor şi plachetelor sanguine prin aspirare împreuna cu o mică cantitate de hematii. Sedimentul eritrocitar a fost ulterior spălat de 3 ori cu o soluţie tampon fosfat salin Dulbecco ph 7,4 (PBS: 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 8,1 mm Na2HPO4şi 1,5 mm KH2PO4). Protocol de lucru pentru citometria în flux 1. S-a preparat o soluţie stoc 100 mm de H2DCFH-DA (50 mg H2DCFH-DA în 1mL DMSO) care s-a conservat la -20 C 2. În momentul analizei s-a preparat o soluţie de lucru 500 µm H2DCFH-DA în H2O distilată 3. (1µL solutie stock în 199 µl H2O distilată) 4. S-a preparat o suspensie celulară de eritrocite umane de aprox celule/ml 5. S-a incubat suspensia obţinută cu 20 µl soluţie de lucru 500 µm H2DCFH-DA pentru o oră la 37 C, în condiţii de obscuritate (concentraţie finală: 10 µm) S-a preparat în condiţiile descrise mai sus un eşantion care a servit de martor pozitiv, producerea de ROS fiind indusă cu H2O2 şi care a fost în continuare tratat astfel: PBS) a. S-a centrifughat 5 minute la rpm pentru îndepărtarea supernatantului b. S-a adaugat 1mL H2O2 2 mm în tampon fosfat salin (PBS) (1µL H2O2 30% în 4410µL c. S-a incubat o oră la 37 C în condiţii de obscuritate d. S-a analizat la FACS, servind drept martor pozitiv pentru analiză. S-a analizat direct prin citometrie în flux pentru fluorescenta verde în FL1. Potrivit rezultatelor obţinute anterior, din totalul de 13 plante studiate, le-am ales pe acelea care au demonstrat cea mai mare activitate antioxidantă şi cel mai mare conţinut de polifenoli. Astfel, 7 plante (tabelul III) au fost în continuare testate pe celule vii, în vederea determinării proprietăţilor antioxidative, utilizând o tehnică revoluţionară, citometria în flux.

14 Tabelul III. Extractele naturale studiate prin citometria în flux Nr. crt. Denumirea plantei E1 Melissa officinalis L. E2 Salvia officinalis L. E3 Viscum album L. E4 Salix alba L. E5 Vaccinium myrtillus L. E6 Tilia tomentosa M. E7 Hypericum perforatum L. Dilutii testate (% v/v) P-a P-b P-c P-d P-e ,5 6,25 Comportamentul extractelor luate în lucru a fost evaluat pe baza mediei intensităţii de fluorescenţă (MFI) în FL1 a produsului fluorescent DCF rezultat din clivarea substratului non fluorescent DCFH-DA de către esterazele celulare şi oxidat de speciile reactive de oxigen (ROS), măsurată prin citometrie în flux (tabelul IV). Cu cât MFI are valori mai mici cu atât activitatea antioxidantă este mai mare. Tabelul IV. Efectul extractelor naturale asupra nivelului ROS în eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2 Media intensităţii de fluorescenţă (MFI) Nr. Denumirea plantei crt. RBCs RBCs+H 2O 2 P-a P-b P-c P-d P-e E1 Melissa officinalis L E2 Salvia officinalis L E3 Viscum album L E4 Salix alba L E5 Vaccinium myrtillus L E6 Tilia tomentosa M E7 Hypericum perforatum L În figura 4 am reprezentat procentul de inhibiţie al celor 7 extracte în cele 5 diluţii studiate.

15 Figura 4. Procentul de inhibiţie al extractelor naturale (E1-E7) testate prin citometrie în flux pe eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2 pentru 5 diluţii seriale ale fiecărui extract (P-a >P-e). Comparând procentul de inhibiţie al peroxidului de hidrogen obţinut în cadrul aceleaşi specii, dar la concentraţii diferite de-a lungul diluţiilor seriale, se constată o inhibiţie mare chiar şi la ultima diluţie (P-e) în cazul Melissa officinalis L. (94,70% (Pa).85,76 (P-e)), spre deosebire de Salvia officinalis L. care a demonstrat un procent de inhibiţie semnificativ la diluţia P-a (94,44%), efect care a scăzut mult până la diluţia finală testată (31,76% (P-e)). O evoluţie similară cu cea a Melissei officinalis L. a prezentat extractul de Hypericum perforatum L. CAPITOLUL 6. STUDIUL ACŢIUNII UNOR POLIFENOLI IZOLAŢI DIN PLANTE ASUPRA PROLIFERĂRII CICLULUI CELULAR ŞI APOPTOZEI CELULELOR CANCEROASE. POSIBILE APLICAŢII BIOMEDICALE Prelucrarea probelor biologice Liniile celulare de melanom uman A375, melanom murinic de șoarece B164A5 și de keratinocite HaCat aparțin Facultății de Farmacie din cadrul Universității de Medicină și Farmacie Victor Babeș din Timișoara. Celulele au fost cultivate în mediu de DMEM suplimentat cu 10% FCS și 1% amestec Penicilina/Streptomicină, într-un incubator la temperatura de 37 C într-o atmosferă de CO2 5%. Când celulele au ajuns la o confluenţă de 70-80% (la fiecare două sau trei zile) s-au desprind de pe placă utilizând o soluţie de 0,25% tripsină-1 mm EDTA. Celulele s-au lăsat la incubator cinci minute, apoi s-a adăugat mediu pentru

16 neutralizarea tripsinei. Suspensia de celule s-a centrifughat 5 minute la 1200 rpm. Celulele au fost apoi recultivate în plăci T75 la o subrată de cultivare de 1:10 pentru a se asigura condiţii optime de proliferare. Numărarea celulelor s-a realizat prin intermediul unei camere de numărat. Toate studiile in vitro au fost realizate în condiţii sterile, în interiorul unei hote cu flux laminar, care este dotată cu o lampă care emite radiaţie UV cu efect germicid la o lungime de undă de 253,7 nm. Testul MTT Celulele au fost cultivate pe o placă cu 96 de godeuri la o densitate 6x10 3 celule/godeu în 100 μl mediu/godeu suplimentat cu 10% FCS. După 24 de ore, mediul celulelor este înlocuit, iar celulele sunt stimulate cu 10 µl extract vegetal dizolvat în 90 µl mediu. Probele de celule martor au fost stimulate cu 10 µl apă distilată în 90 µl mediu DMEM. În cea de a 3-a zi, s-a adăugat 10 μl reactiv MTT/godeu, iar la un interval de 4 ore s-a adăugat un buffer de solubilizare (100μL/godeu). Probele au fost determinate spectrofotometric la o lungime de undă de 570 nm. Metoda wound healing assay Un număr de 2x10 5 celule/godeu s-a cultivat pe plăci de cultură cu 12 de godeuri cu 24 de ore înainte de începerea experimentului. Celulele au fost păstrate la incubator la temperatură constantă de 37 C şi 5% CO2. S-a realizat linii sub forma unor zgârieturi în zone bine determinate la nivelul stratului de celule cu ajutorul unei pipete sterile (10 μl). Celulele detaşate în urma procedurii au fost înlăturate prin spălare cu PBS înainte de stimulare. După adăugarea probelor şi a mediului, celulele s-a incubat pentru 24 h la 37 C şi 5% CO2. Mediul DMEM s-a completat cu apă distilată pentru probele celulare care servesc ca şi control. Celelalte probe de celule au fost stimulate cu extractele apoase testate (150 µl extract în 1350 µl mediu). Evaluarea efectului antiproliferativ al extractelor vegetale utilizând testul MTT Celulele de melanom uman A375 (pasaj 21), de melanom murinic de șoarece B164A5 (pasaj 32), și keratinocitele HaCat (pasaj 24), în prezența celor 7 extracte vegetale, au fost testate în vederea evaluării efectului antiproliferativ. În tabelul V am prezentat inhibiția celulelor A375 și HaCat în prezența extractelor testate.

17 Tabelul V. Procentul de inhibiție celulară a celulelor A375, HaCat și B164A5 obținut în urma stimulării acestora cu cele 7 extracte vegetale prin intermediul testului MTT Extracte testate Inhibiţie (%) celule A375 celule HaCat celule B164A5 Salvia officinalis L. 88,72 13,1-119,29 Melissa officinalis L. 76,69-13,22-159,97 Tilia tomentosa M. 101,2 18,77 22,91 Salix alba L. 307,39 240,85-1,64 Vaccinium myrtillus L. 10,27-40,61-114,69 Hypericum perforatum 19,29-41,4-146,82 Viscum album L. -40,35-74,14-164,8 Astfel, celulele A375 s-au dovedit a fi mult mai susceptibile la stimularea cu cele 7 extracte vegetale apoase decât celulele HaCat și B164A5. Celulele de melanom murinic B164A5 au prezentat o creștere a ratei de proliferare în urma stimulării cu 6 dintre cele 7 extracte vegetale (extractul de Salvia officinalis L., Melissa officinalis L., Salix alba L., Vaccinium myrtillus L., Hypericum perforatum L. și Viscum album L.). Cea mai mare rată a inhibiției celulare s-a observat în cazul stimularii celulelelor HaCat și A375 cu extractul apos de Salix alba L., fiind urmat de extractul apos de Tilia tomentosa M. și de extractul de Salvia officinalis L.. Extractul de Viscum album L. nu a inhibat proliferarea celulelor A375 (-40,35%). În cazul celulelor HaCat, proliferarea acestora nu a fost inhibată în urma stimulării cu extractele de Melissa officinalis L. (-13,22%), Vaccinium myrtillus L. (- 40,61%), Hypericum perforatum L. (-41,4%) și Viscum album L. (-74,14%). În cazul celulelor B164A5, s-a obsevat o inhibiție a ratei de proliferare celulară de 22,91% în urma stimulării acestora cu extractul de Tilia tomentosa M.. Determinarea potenţialului anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale testate prin metoda wound healing assay Capacitatea de migrarea a celulelor de melanom uman A375 (pasaj 21), a celulelor de melanom murinic B164A5 (pasaj 32) și a keratinocitelor HaCat (pasaj 26) în cele 7 extracte vegetale a fost testată in vitro folosind metoda wound healing assay [15]. Au fost realizate fotografii ale culturilor celulare la momentul iniţial, după 3 ore şi după 24 de ore, folosind un microscop optic Optika View. Toate analizele au fost realizate în triplicat.

18 În figurile 5-11 sunt prezentate imaginile înregistrate la momentul iniţial, după 3 ore şi după 24 de ore de la stimularea celor trei tipuri de celulele cu extractele vegetale studiate. Figura 5. Aspectul celulelor HaCat, B164A5 și A375, folosite drept control în cadrul tehnicii wound healing assay, la diferite intervale de timp a Figura 6. Efectul antimigrator al extractelor vegetale apoase de Vaccinium myrtillus L. pe cele trei tipuri de celule HaCat, B164A5 și A375 la trei intevale de timp

19 Figura 7. Efectul antimigrator al extractelor vegetale apoase de Melissa officinalis L. pe cele trei tipuri de celule HaCat, B164A5 și A375 la trei intevale de timp Figura 8. Efectul antimigrator al extractelor vegetale apoase de Salvia officinalis L. pe cele trei tipuri de celule HaCat, B164A5 și A375 la trei intevale de timp

20 Figura 9. Efectul antimigrator al extractelor vegetale apoase de Hypericum perforatum L. pe cele trei tipuri de celule HaCat, B164A5 și A375 la trei intevale de timp Figura 10. Efectul antimigrator al extractelor vegetale apoase de Tillia tomentosa L. pe cele trei tipuri de celule HaCat, B164A5 și A375 la trei intevale de timp

21 Figura 11. Efectul antimigrator al extractelor vegetale apoase de Viscum album L. pe cele trei tipuri de celule HaCat, B164A5 și A375 la trei intevale de timp La momentul inițial efectul anitimigrator al extractului de Salvia officinalis L. este similar cu cel al solventului (apă distilată) în cazul celulelor B164A5. Extractul de Salix alba L. a fost sub forma unei suspensii colorate, ceea ce a împiedicat vizualizarea corectă efectului antimigrator al celulelor stimulate cu extractul respectiv. Extractele de Tilia tomentosa M., Melissa officinalis L., Vaccinium myrtillus L. și Viscum album L. au avut un efect antimigrator, la momentul inițial, comparabil cu cel al probei martor. La 3 ore după stimularea celulelor cu extractele vegetale nu s-au observat diferențe semnificative în ceea ce privește migrarea și proliferarea celulelor stimulate cu extractele vegetale față de proba martor. La 24 ore de la stimularea celulelor B164A5 cu extractele vegetale, cea mai mare rată a migrării și a proliferării celulare s-a observat în cazul celulelor stimulate cu Salvia officinalis L. și Viscum album L.. Extractele vegetale testate au prezentat un efect antiproliferativ și antimigrator mai scăzut pe celulele HaCat decât pe celulele de melanom murinic B164A5, încă de la momentul inițial. Efectul antimigrator al extractelor a fost redus la 3 ore de la stimularea celulelor cu extractele respective. La 24 de ore de la stimulare, s-a observat o rată de migrare crescută în cazul celulelor HaCat stimulate cu Salvia officinalis L., Melissa officinalis L., Vaccinium myrtillus L.. Așa cum s-a observat în cazul testului MTT, și în cazul metodei wound healing assay, cele 7 extracte vegetale testate au prezentat o citotoxicitate crescută asupra

22 celulelor de melanom uman A 375. Extractele de Salvia officinalis L., Melissa officinalis L., Salix alba L., Vaccinium myrtillus L. și Viscum album L. au prezentat cea mai ridicată rată de apoptoză în cazul celulelor A375, în timp ce extractele de Tilia tomentosa M. și de Hypericum perforatum L. au evidențiat un efect antimigrator marcant după 12 ore de la stimularea celulelor. CONCLUZII GENERALE În urma studiului bibliografic şi a experimentelor conduse în vederea demonstrării efectului benefic al polifenolilor în cancer, putem enunţa următoarele concluzii generale: 13 specii de plante, din flora spontană sau de cultură, au fost alese pentru a fi investigate în ceea ce priveşte efectul antitumoral; Pentru obţinerea extractelor polifenolice, am ales ca metodă de extracţie macerarea care permite obţinerea de extracte bogate în polifenoli, extracte care ulterior pot fi utilizate ca suplimente alimentare; Extractele polifenolice obţinute au fost caracterizate conform FE, în ceea ce priveşte proprietăţile organoleptice, densitate relativă, reziduu uscat, conţinut de etanol, reacţii de identificare sau dozare, rezultatele obţinute fiind în concordanţa cu prevederile acesteia; Pe baza studiului realizat în ceea ce priveşte metodele cromatografice de identificare şi cuantificare a compuşilor polifenolici utilizate la ora actuală pentru caracterizarea extractelor naturale din plante şi a prevederilor FE, am selectat ca metodă de identificare a extractelor, cromatografia în strat subţire, o metoda simplă şi rapidă care permite caracterizarea şi identificarea extractelor polifenolice, rezultatele obţinute fiind în concordanţa cu prevederile FE; În urma testelor efectuate pentru determinarea capacităţii antioxidante şi a conţinutului total de polifenoli, rezultatele experimentale au demonstrat că plantele studiate sunt bogate în compuşi fenolici şi prezintă o bună activitate antioxidantă măsurată prin 3 metode chimice diferite, DPPH, TEAC, FRAP. O mare parte din plantele studiate au prezenatat o activitate antioxidantă mai mare de 10 µmol Trolox/mL extract, iar dintre acestea

23 Salix alba L. a avut cea mai mare activitate antioxidantă, fiind urmată de Thymus vulgaris L. cele două specii prezentând şi cel mai mare conţinut total de polifenoli. Reprezentanţii familiei Lamiaceae s-au situat printre plantele cu un nivel ridicat de polifenoli, cel mai mare conţinut de polifenoli fiind obţinut în cazul Thymus vulgaris L.; În ceea ce priveşte relaţia dintre activitatea antioxidantă a extractelor stabilită prin cele trei metode: DPPH, TEAC, FRAP şi conţinutul total de compuşi fenolici s-a constatat că, în general, există o bună corelaţie între cele două, ceea ce demonstrează că constituenţii fenolici sunt responsabili pentru activitatea antioxidantă a plantelor. De asemenea, există o bună corelaţie între valorile activităţii antioxidante obţinută prin aceste trei metode; Extractele alcoolice de Salix alba L. şi Viscum album L. au demonstrat un efect antiradicalic excepţional, putând fi consideraţi ca potenţiali antioxidanţi fenolici naturali; În urma analizei extractelor naturale prin citometrie în flux, s-a demonstrat că toate extractele au prezentat o capacitate inhibantă semnificativă a ROS în eritrocitele umane supuse stresului oxidativ. Extractul de Melissa officinalis L. şi Hypericum perforatum L. au demonstrat o inhibiţie mare chiar şi la ultima diluţie, pe când extractul de Salvia officinalis L. a demonstrat un procent de inhibiţie semnificativ la prima diluţie, efect care a scăzut mult până la diluţia finală testată. Rezultatele sugerează importanţa utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta împotriva stresului oxidativ; În urma evaluării acţiunii extractelor vegetale asupra celulelor canceroase a fost determinat efectul antiproliferativ al extractelor asupra unor linii celulare de melanom uman A375, melanom murinic de șoarece B164A5 și keratinocite HaCat utilizând testul MTT. În acest caz, celulele de melanom uman A375 au dovedit o sensibilitate mai crescută la stimularea cu cele 7 extracte vegetale spre deosebire de keratinocitele HaCat. Cea mai mare rată de inhibiție a proliferării liniilor celulare HaCat și A375 s-a observat în cazul extractului de Salix alba L.;

24 Potenţialul anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale pe linii celulare de melanom uman A375, melanom murinic B164A5 și keratinocite HaCat a fost determinat utilizând metoda wound healing assay, demonstrându-se astfel importanţa utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta anticancer; În ceea ce privește caracterul de noutate al cercetărilor intreprinse în această teză, se evidentiază urmatoarele: o pentru prima dată a fost evaluată, activitatea antioxidantă a extractelor naturale obţinute din plantele aparţinând florei din zona Cluj, prin toate cele trei metode chimice, DPPH, TEAC, FRAP, precum și prin citometrie în flux, realizând o clasificare a acestor plante în funcţie de potenţialul lor antioxidant; o s-a demonstrat dependenţa dintre efectul antioxidant al plantelor studiate și conţinutul total de compuși polifenolici, precum și faptul că există o bună corelaţie între valorile activităţii antioxidante obţinută prin metodele chimice utilizate; o s-a demonstrat capacitatea inhibantă semnificativă a speciilor de radicali liberi (ROS) în eritrocitele umane supuse stresului oxidativ, în prezenţa extractelor testate; o s-a demonstrat efectul antiproliferativ al extractelor obtinute si luate in studiu și potenţialul anticanceros și antimigrator asupra liniilor celulare de melanom uman A375, melanom murinic de șoarece B164A5 și keratinocite HaCat. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Scalbert, A.; Manach, C.; Morand, C.; Remesy, C. Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 2005, 45, , DOI: / Pandey, K.B.; Rizvi, S.I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxid. Med.Cell. Longev. 2009, 2, , DOI: /oxim Spencer, J.P.; Abd El Mohsen, M.M.; Minihane, A.M.; Mathers, J.C. Biomarkers of the intake of dietary polyphenols: strengths, limitations and application in nutrition research. Br. J. Nutr. 2008, 99, 12-22, DOI: /S Hawrył, M. Gradient elution and computer-assisted method development. In High Performance Liquid Chromatography in phytochemical analysis; Waksmundzka-Hajnos, M.; Sherma, J.,

25 Editori; CRC Press: Boca Raton, USA, 2010; p Baerle, A. Studiu privind separarea şi stabilizarea coloranţilor antocianici din Aronia Melanocarpa. Thesis, Universitatea Tehnică a Moldovei, Chişinău, Moldova, Santos-Buelga, C.; Williamson, G. Methods in Polyphenol Analysis; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, UK, D Archivio, M.; Filesi, C.; Benedetto, R.D.; Gargiulo, R.; Giovannini, C.; Masella, R. Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann. Ist. Super. Sanità 2007, 43, Arts, I.C.W.; Hollman, P.C.H. Polyphenols and disease risk in epidemiologic studies. Am. J. Clin. Nutr. 2005, 81, Vauzour, D.; Rodriguez-Mateos, A.; Oruna-Concha, M.J.; Spencer, J.P.E. Polyphenols and human health: prevention of disease and mechanisms of action. Nutrients 2010, 2, , DOI: /nu Del Rio, D.; Rodriguez-Mateos, A.; Spencer, J.P.E.; Tognolini, M.; Borges, G.; Crozier, A. Dietary (poly)phenolics in human health: structures, bioavailability, and evidence of protective effects against chronic diseases. Antioxid. Redox Signal. 2013, 18, , DOI: /ars Grigelmo-Miguel, N.; Rojas-Gräu, M.A.; Soliva-Fortuny, R.; Martín-Belloso, O. Methods of Analysis of Antioxidant Capacity of Phytochemicals. In Fruit and Vegetable Phytochemicals: Chemistry, Nutritional Value and Stability; de la Rosa, L.A.; Alvarez-Parrilla, E.; Gonzalez-Aguilar, G.A., Editori; Wiley- Blackwell: Ames, Iowa, USA, Bratosin, D. Explorarea structurii şi funcţiilor celulare prin citometrie în flux; "Vasile Goldiș" University Press: Arad, Romania, Săvulescu, T. Flora Republicii Populare Romîne; Editura Academiei Republicii Populare Romîne: Bucureşti, România, European Pharmacopoeia 8.5; EDQM, Council of Europe: Strasbourg, France, Fronza, M.; Heinzmann, B.; Hamburger, M.; Laufer, S.; Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 2009, 126, , DOI: /j.jep