REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GR. T. POPA IAŞI REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT CERCETĂRI EXPERIMENTALE PRIVIND EFECTELE FARMACODINAMICE ALE UNOR EXTRACTE VEGETALE Conducător de doctorat: PROF. DR. LUPUŞORU Cătălina-Elena Doctorand: GRIGORE Gică-Dacian IAŞI 2015

2 Teza de doctorat conţine: de pagini; - 82 de tabele; - 84 de figuri; de referinţe bibliografice. Rezumatul păstrează numerotarea tabelelor și figurilor din teză, iar cuprinsul este cel din teza de doctorat. Cuvinte cheie: Pinus brutia, doza letală medie, stres, teste de comportament, animale de laborator.

3 CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT PARTEA GENERALĂ INTRODUCERE UTILIZAREA PLANTELOR ÎN TERAPIE Date istorice Importanţa plantelor în terapie Date generale despre fitoterapie IMPLICAŢII TERAPEUTICE ALE PRINCIPIILOR ACTIVE OBŢINUTE DIN SPECIILE DE PIN Importanţa terapeutică a speciilor de pin Preparate fitoterapeutice din specii de pin PINUS BRUTIA Dendrocronologie Încadrarea sistematică Arealul de răspândire Particularităţi genetice Climatul de creştere Particularităţi morfologice PARTEA PERSONALĂ MOTIVAŢIA, SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR MATERIAL ŞI METODE Colectarea şi prelucrarea plantelor Determinarea cantitativă a principiilor active Selecţia speciilor de animale Etica experimentelor şi recoltarea probelor biologice Prelucrarea şi interpretarea statistică a datelor Investigarea toxicităţii acute a extractului din frunze de Pinus brutia Testarea biocompatibilităţii in vivo Testarea biocompatibilităţii la şoareci Testarea biocompatibilităţii la şobolani i

4 6.8. Evaluarea efectelor asupra stresului cronic indus experimental Evaluarea efectelor asupra comportamentului la animale de laborator Testul Actimetrului Testul benzii rulante (sau testul de locomoţie forţată) Testul labirintului în Y (sau testul Y-maze) REZULTATE Obţinerea extractului din frunze de Pinus brutia Determinarea cantitativă a principiilor active Rezultatele evaluării toxicităţii acute Rezultatele testării biocompatibilităţii in vivo Testarea biocompatibilităţii la şoareci Testarea biocompatibilităţii la şobolani Rezultatele evaluării efectelor asupra stresului cronic indus experimental Determinarea hemoleucogramei la animalele de laborator expuse stresului Determinarea parametrilor biochimici la animalele de laborator expuse stresului Efectele extractului din frunze de P. brutia asupra activităţii enzimelor antioxidante la animalele de laborator expuse stresului Rezultatele evaluării efectelor asupra comportamentului la animale de laborator Testul Actimetrului Testul benzii rulante (sau testul de locomoţie forţată) Testul labirintului în Y (sau testul Y-maze) DISCUŢII CONCLUZII ASPECTELE DE ORIGINALITATE ALE TEZEI DE DOCTORAT PERSPECTIVELE PE CARE LE DESCHIDE TEZA DE DOCTORAT BIBLIOGRAFIE LISTA LUCRĂRILOR PUBLICATE ii

5 PARTEA GENERALĂ 1. INTRODUCERE Fitoterapia reprezintă una din cele mai vechi forme de tratament al bolilor, ale cărei începuturi sunt menţionate încă din era paleolitică. Este o ramură a terapiei naturiste, care foloseşte plantele şi preparatele din plante ca mijloace de prevenire şi tratare a diferitelor stări patologice ale organismului. Din cele mai vechi timpuri, plantele au constituit principala sursă de supravieţuire, atât în ceea ce priveşte alimentaţia, cât şi în vindecarea bolilor. Treptat, cunoştinţele în legătură cu efectele anumitor plante s-au lărgit, acestea fiind folosite ca atare sau în variate forme de preparare. Cu origini străvechi, perfecţionată odată cu trecerea anilor şi îmbogăţită prin experienţă practică, fitoterapia constituie, în prezent, o ştiinţă de sine stătătoare şi o ramură a terapeuticii alternative. În prezent, la noi în ţară, fitoterapia este inclusă printre competenţele medicale. Competenţa în fitoterapie se obţine de către medicii de diferite specialităţi, în urma absolvirii unor cursuri de specialitate. Printre avantajele fitoterapiei se pot enumera: accesibilitatea (plantele sunt ieftine şi uşor de procurat); acţiunea de intensitate moderată şi lipsa efectelor adverse severe (când se respectă dozele adecvate); acţiunea complexă asupra organismului (extractele vegetale determină efecte farmacodinamice diferite, inclusiv efecte psiho-emoţionale şi de refacere a homeostaziei organismului); previne, ameliorează şi tratează anumite boli; oferă posibilitatea folosirii extractelor vegetale ca un adjuvant terapeutic la medicamentele existente (în condiţiile în care nu există risc de interacţiuni medicament adjuvant cu riscuri severe pentru pacienţi). 1

6 Valoarea terapeutică a plantelor medicinale are la bază relația dintre structura chimică a principiilor active conţinute şi acţiunea lor farmacodinamică pe care o exercită asupra organismului. În majoritatea cazurilor, acţiunea plantelor medicinale este foarte variată, fapt explicat prin compoziţia complexă a lor (cum ar fi, de exemplu, cea reprezentată de: alcaloizi, flavonoide, glicozide, vitamine, taninuri şi compuşi, precum cumarina), ce poate cuprinde de la câteva, până la câteva zeci de principii active. 2. UTILIZAREA PLANTELOR ÎN TERAPIE Din timpuri îndepărtate, oamenii îşi doreau să descopere remedii pentru bolile lor şi încercau să lupte pentru vindecarea acestora, cu mijloacele pe care le aveau la dispoziţie. Ei apelau la cunoştinţele transmise, în acest sens, din generaţie în generaţie, iar pentru tratarea bolilor foloseau, cel mai adesea, plantele medicinale. Ulterior, pe parcursul timpului, au fost descoperite o serie de dovezi, care atestă dezvoltarea fitoterapiei de la etapele de început ale evoluţiei sale, când se realiza mai mult empiric, până în epoca modernă, când a devenit o ştiinţă de sine stătătoare, care constituie un tip de terapie neconvenţională şi un mod de promovare alternativă a sănătăţii organismului. Medicina complementară constituie o alternativă pentru refacerea şi/sau menţinerea homeostaziei organismului, pentru stimularea apărării imunitare, oferind posibilităţi de utilizare a diferitelor principii active de origine vegetală în scop profilactic şi curativ. Este foarte important ca extractele obţinute din diferite surse vegetale să conţină cele mai active principii, folosind metode eficiente de extragere. În egală măsură, standardele calitative de cultivare şi preparare sunt la fel de importante. Produsele imunomodulatoare obţinute din plante, numite formule adaptogene, au fost folosite din timpuri străvechi, pentru a asigura adaptarea organismului la diferite condiţii de stres (Mendes, 2011; Ulrich-Merzenich et al., 2007). În literatura de specialitate există date care evidenţiază faptul că multe din efectele reglatoare ale adaptogenilor se datorează 2

7 capacităţii constituienţilor prezenţi în componenţa unor plante de a mima acţiunile hormonilor şi ale moleculelor endogene, structural identice cu aceştia. Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) estimează faptul că peste 80% din populaţia lumii foloseşte plante medicinale, în scop curativ, în medicina primară (WHO Monographs, 2010). În mod obişnuit se apelează la plante în scopul promovării stării de sănătate. Cele mai frecvente stări patologice pentru care se folosesc terapii alternative, atât la adult, cât şi la copil sunt: afecţiunile osteroarticulare însoţite de durere, bolile virale şi inflamatorii, tulburările afective, perturbările metabolismului lipidic, dereglările de somn ( 3. IMPLICAŢII TERAPEUTICE ALE PRINCIPIILOR ACTIVE OBŢINUTE DIN SPECIILE DE PIN Unele dintre speciile de plante, cu o istorie îndelungată în ceea ce priveşte implicaţiile terapeutice, sunt coniferele. Călugării taoişti din munţii Chinei au observat adaptarea coniferelor la temperaturile scăzute din timpul iernii. În decursul timpului, prin încercări succesive, a fost evidenţiat faptul că extractele din diferite părţi componente ale pinului prezintă proprietăţi farmacodinamice cu implicaţii în terapia diferitelor afecţiuni. Astfel, pinul a devenit un simbol al longevităţii în cultura chineză (Ritchason, 1995). Pinul, în general, este cultivat în plantaţiile forestiere sau este plantat ca arbore ornamental. Pentru scopuri terapeutice, se recoltează mugurii (cu miros aromatic, plăcut, specific), primăvara, numai din exploatările forestiere. Aceştia sunt bogaţi în uleiuri volatile, răşini, principii amare, pinitol, flavonoizi, vitamina C. Acele de pin se folosesc sub formă de infuzii, iar din scoarţa de pin se prepară decocturi (Ritchason, 1995; În compoziţia pinului se găsesc o serie de principii active (uleiuri volatile: pinen, limonen, beta felandren, silvestren, delta 3

8 caren; răşini, acetone, alcooli, pinipicrozida, pinitol, coniferozida, aldehida anisica, taninuri, fitoncide, substanţe antibiotice, vitamina C, bioflavonoizi), care sunt responsabile de efectele la nivelul diferitelor aparate şi sisteme (Pedersen, 1998). 4. PINUS BRUTIA Această specie de conifer, specifică regiunii est mediteraneene, este cunoscută sub denumirea de pin turcesc, dar, în diferite regiuni, are şi alte denumiri. Pinus brutia (P. brutia) este cunoscut încă din Grecia antică (cu denumirea de pitis ), ca unul din cei mai importanţi arbori din estul ariei mediteraneene. Alte denumiri cunoscute ale P. brutia sunt: pin turcesc, pin calabrian, pin afgan, pin eldaric, pin est-mediteranean. Această specie de pin este originară din Turcia, dar arealul său de răspândire se extinde în zona estică insulară a Greciei, în Marea Egee, în Rusia, Ucraina, Crimeea, Iran, Georgia, Azerbaijan, nordul Irak-ului, vestul Siriei, Israel, Liban şi Cipru. Studiile de specialitate au evidenţiat faptul că există o mare plasticitate a taxonilor acestei specii, răspunzătoare de adaptarea particulară la diferite condiţii de mediu. Astfel, această plasticitate a taxonilor multiplelor subspecii de P. brutia constituie unul dintre principalii factori ecologici ce explică modul de adaptare la caracteristicile de mediu variate, în ceea ce priveşte altitudinea şi distanţa faţă de mare la care se dezvoltă (Içgen, 2006; Isik, 1999; Isik, Kara, 1997; Kandemir, 2004; Kaya, Isik, 1997). Încălzirea globală şi modificările colaterale ale regimului de precipitaţii pot modifica dramatic domeniul de distribuţie a acestor specii de pin. Tipul cel mai comun de climat unde creşte P. brutia este cel mezo-mediteraneean, dar acest pin se poate dezvolta, de asemenea, în zona termo- şi supra-mediteraneeană, în locuri cu soare puternic, cu sub-umiditate şi ariditate. Solul unde creşte în mod natural P. brutia cuprinde o varietate de roci, precum: marnă, calcar, dolomită, nisipuri acide, roci vulcanice şi gresie. În mod normal, solul este umed, cu o textură argiloasă, cu un drenaj bun sau mediu, un ph neutru sau uşor bazic şi puţini nutrienţi (Nahal, 1983). 4

9 PARTEA PERSONALĂ 5. MOTIVAŢIA, SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR Această lucrare abordează una dintre problemele de maximă actualitate în literatura de specialitate, respectiv, cercetarea experimentală privind efectele farmacodinamice ale unor extracte vegetale de P.brutia, justificând tema, prin utilizarea din ce in ce mai frecventă a fitoterapiei la nivel mondial şi de absenţa studiilor care sa evalueze toxicitatea acestor preparate, dar şi efectele acestora asupra funcţiei diferitelor organe şi sisteme. Aşa cum reiese din datele statistice puse la dispoziţie de către O. M. S., aproximativ 75% din populaţia de pe glob este dependentă de medicina naturistă, atât în scop profilactic, cât şi în scop terapeutic. În acest context, scopul cercetărilor din teza prezentă constă în investigarea unui extract din frunze de Pinus brutia, din punct de vedere al toxicităţii acute, la două specii de animale de laborator, evaluarea biocompatibilităţii în vivo, precum şi cercetarea experimentală a efectelor extractului vegetal obţinut asupra modificărilor homeostazice induse de stres, asupra funcţiilor motorii şi a capacităţii de efort fizic, a funcţiilor cognitive, la animale de laborator. Cercetările experimentale au avut următoarele obiective: obţinerea unor extracte din frunze de Pinus brutia; determinarea dozei letale medii (DL50) la şoareci Swiss şi la şobolani Wistar; evaluarea biocompatibilităţii in vivo, la şoareci Swiss şi la şobolani Wistar, după administrarea acută, pe cale intraperitoneală, a unei singure doze; cercetarea experimentală a efectelor extractului vegetal pe modele animale cu stres indus experimental; cercetarea experimentală a efectelor extractului vegetal obţinut asupra funcţiilor motorii şi a capacităţii de efort fizic, la animale de laborator; 5

10 cercetarea experimentală a efectelor extractului vegetal obţinut asupra funcţiilor cognitive, la animale de laborator. 6. MATERIAL ŞI METODE 6.1. Colectarea şi prelucrarea plantelor Frunzele (acele) de Pinus brutia au fost recoltate în luna mai 2012 din zona pădurii Paphos - Cipru. Au fost uscate la temperature camerei şi la întuneric. Acele de Pinus brutia (450 g), uscate şi pulverizate, au fost delipidate prin extracţii succesive cu hexan ( ml) şi diclormetan ( ml). Reziduul vegetal a fost apoi extras cu metanol ( ml) la temperatura camerei, sub agitare continuă Determinarea cantitativă a principiilor active Determinarea cantitativă a polifenolilor totali s-a realizat prin metoda Folin-Ciocâlteu, care se bazează pe proprietatea polifenolilor de a reduce reactivul Folin-Ciocâlteu (amestec de acizi fosfotungstic H3PW12O40 și fosfomolibdenic H3PMo12O40) la oxizi de culoare albastră a căror absorbanță se determină la λ = 765 nm. Determinarea cantitativă a flavonoidelor s-a realizat printr-o metodă spectrofotometrică bazată pe proprietatea acestora de a forma, în prezenţa nitritului de sodiu şi a clorurii de aluminiu, complecşi de culoare roz, a căror absorbanţă se măsoară la λ = 510 nm. Determinarea cantitativă a saponinelor totale: sapogenolii existenți ca atare în extract și cei eliberați prin hidroliza acidă a saponozidelor, dezvoltă în prezența vanilinei în mediul acid o colorație roșie; absorbanța amestecului de reacție a fost determinată la 540 nm Selecţia speciilor de animale: pentru experimente s-au folosit şoareci albi rasa Swiss (greutate grame) şi şobolani albi rasa Wistar (greutate g) proveniţi de la biobaza Universităţii de Medicină şi Farmacie Gr.T. Popa Iaşi Etica experimentelor şi recoltarea probelor biologice: experimentele au fost efectuate după obţinerea avizului etic (nr. 6

11 14749 din 17 iulie 2014) al Comisiei de Etică a Cercetării, din Universitatea de Medicină şi Farmacie Gr.T. Popa, Iaşi. Studiile au fost derulate în conformitate cu Legea cercetării nr. 206 din 27 mai 2004 privind buna conduită în cercetarea ştiinţifică, dezvoltarea tehnologică şi inovare, precum şi cu legislaţia europeană în vigoare sau normativele etice internaţionale, privind lucrul pe animale de laborator Prelucrarea şi interpretarea statistică a datelor: datele au fost centralizate şi prelucrate statistic utilizând testul t-student din programul Windows EXCEL sau metoda ANOVA unifactorială şi programul SPSS, varianta 17.0 pentru Windows Investigarea toxicităţii acute a extractului din frunze de Pinus brutia Investigarea toxicităţii acute a extractului din frunze de Pinus brutia a constat în determinarea dozei letale medii (50), doză care apreciază cantitatea minimă estimativă de extract vegetal care produce moartea a cel puţin 50% din animalele de experienţă, după administrare unică (Dănilă, 1984). Pentru determinarea DL50 s-a folosit metoda aritmetică Karber, care are avantajul că intervalul de toxicitate apreciat este mic. Stabilirea DL50 la animale de laborator este deosebit de utilă pentru aprecierea gradului de toxicitate acută a unei substanţe nou testate (Botham, 2004). Suplimentar s-a efectuat examenul necropsic minuţios şi examenul histopatologic, la toate animalele moarte sau sacrificate. Prelevarea pieselor s-a executat după sacrificare. Fixarea fragmentelor de organ s-a făcut în formol 10%. Acestea au fost colorate cu hematoxilină-eozină sau van Gieson Testarea biocompatibilităţii in vivo Testarea in vivo a biocompatibilităţii substanţelor aflate în studiu se bazează pe determinarea profilului hematologic şi biochimic al animalelor care primesc substanţele de testat (extractele vegetale) şi pe evaluarea histologică a organelor recoltate după sacrificare (Comitetul Tehnic de Omologare a Metodelor de Diagnostic Paraclinic Veterinar Metode Toxicologice, 1998). Dozele au reprezentat 1/5, 1/10, 1/20, respectiv, 1/40, din DL50 intraperitoneal, la fiecare din speciile testate. 7

12 Testarea biocompatibilităţii la şoareci Animalele (şoareci albi Swiss, codificaţi cu litera s ) au fost repartizate în 5 loturi de câte 6 şi au primit substanţele intraperitoneal, în doză unică, după următoarea schemă: Lotul 1 (Martor, codificat SFs): ser fiziologic 0,1 ml/10g corp şoarece; Lotul 2 (codificat PBD1s): extract din frunze de P. brutia (350 mg/kg corp); Lotul 3 (codificat PBD2s): extract din frunze de P. brutia (175 mg/kg corp); Lotul 4 (codificat PBD3s): extract din frunze de P. brutia (87,5 mg/kg corp); Lotul 5 (codificat PBD4s): extract din frunze de P. brutia (43,75 mg/kg corp) Testarea biocompatibilităţii la şobolani Animalele (şobolani albi rasa Wistar, codificaţi cu litera w ) au fost repartizate în 5 loturi de câte 6 şi au primit substanţele intraperitoneal, în doză unică, după următoarea schemă: Lotul 1 (Martor, codificat SFw): ser fiziologic 0,5 ml/100g corp şobolan; Lotul 2 (codificat PBD1w): extract din frunze de P. brutia (450 mg/kg corp); Lotul 3 (codificat PBD2w): extract din frunze de P. brutia (225 mg/kg corp); Lotul 4 (codificat PBD3w): extract din frunze de P. brutia (112,5 mg/kg corp); Lotul 5 (codificat PBD4w): extract din frunze de P. brutia (56,25 mg/kg corp). La 14 zile după administrarea substanţelor de testat, animalele (şoareci şi şobolani) au fost anesteziate cu eter etilic şi s-a recoltat sânge, pentru determinări: - hematologice: hemoleucograma; - biochimice: o alaninaminotransferaza (ALAT) - denumită şi transaminaza glutampiruvică (TGP); 8

13 o aspartat aminotransferaza (ASAT) - denumită şi transaminaza glutamică oxalacetică (TGO); o glicemie; o proteine totale serice; o uree serică; o creatinină serică; o acid uric seric; o colesterol total; o trigliceride Evaluarea efectelor asupra stresului cronic indus experimental Pentru realizarea experimentului au fost utilizaţi şobolani albi rasa Wistar (în greutate de g), cu repartiţie uniformă pe sexe. În cadrul experimentului au fost testate două doze diferite dintr-un extract din ace (frunze) de Pinus brutia (în doză de 112,5 mg/kg corp, care reprezintă 1/20 din DL50, intraperitoneal, respectiv, în doză de 56,25 mg/kg corp, ce reprezintă 1/40 din DL50, intraperitoneal). Pentru studierea efectelor celor două doze de extract de P. brutia, stresul a fost indus prin expunerea şobolanilor, timp de 28 de zile, la lumină continuă (24 ore de lumină), respectiv, întuneric continuu (22 ore de întuneric, cu perioade de lumină, între ora 16 şi 18, pentru curăţarea cuştilor şi introducerea hranei). Au fost realizate 9 loturi de câte 6 animale pe lot, iar substanţele au fost administrate pe cale intraperitoneală, în acelaşi volum, în doză unică zilnică, timp de 28 de zile, astfel: Lotul 1 (codificat M): ser fiziologic 0,5 ml/100g corp martor; Lotul al 2-lea (codificat M-î): ser fiziologic 0,5 ml/100g corp martor întuneric, şobolani menţinuţi la întuneric continuu; Lotul al 3-lea (codificat M-lu): ser fiziologic 0,5 ml/100g corp martor lumină, şobolani menţinuţi la lumină continuă; Lotul al 4-lea (codificat PB-1): extract de P. brutia (112,5 mg/kg corp); Lotul al 5-lea (codificat PB-1-î): extract de P. brutia (112,5 mg/kg corp), menţinute la întuneric continuu; Lotul al 6-lea (codificat PB-1-lu): extract de P. brutia (112,5 mg/kg corp), menţinute la lumină continuă; 9

14 Lotul al 7-lea (codificat PB-2): extract de P. brutia (56,25 mg/kg corp); Lotul al 8-lea (codificat PB-2-î): extract de P. brutia (56,25 mg/kg corp), menţinute la întuneric continuu; Lotul al 9-lea (codificat PB-2-lu): extract de P. brutia (56,25 mg/kg corp), menţinute la lumină continuă; Determinarea hemoleucogramei a fost realizată cu un analizor hematologic automat HEMAVet 950FS, produs de firma DrewScientific, SUA. Determinările biochimice au fost realizate cu un analizor automat ACCENT200, produs de firma Cormay, Polonia. Studiile privind activitatea antioxidantă enzimatică la animalele de laborator expuse şi neexpuse stresului, tratate sau nu cu extract din frunzele de P. brutia, au constat în determinări ale valorilor sanguine ale superoxid dismutazei (SOD), catalazei (CAT), glutation peroxidazei (G-Px) şi malondialdehidei (MDA) Evaluarea efectelor asupra comportamentului la animale de laborator Bateria de teste de comportament permite atât explorarea comportamentului spontan, cât şi a celui modificat. Toate testele se efectuează în perfectă linişte, pentru a evita stresarea animalului. Pentru experiment au fost folosiţi şobolani albi rasa Wistar (greutate g). În cadrul experimentului s-au testat două doze diferite dintr-un extract din ace de Pinus brutia (în doză de 112,5 mg/kg corp, care reprezintă 1/20 din DL50 intraperitoneal, respectiv, în doză de 56,25 mg/kg corp, ce reprezintă 1/40 din DL50 intraperitoneal). S-au folosit 4 grupe de câte 7 animale fiecare, care au primit substanţele pe cale intraperitoneală, în acelaşi volum, în doză unică zilnică, timp de 14 zile astfel: Lotul 1 (codificat M): ser fiziologic 0,1ml/100g corp martor; Lotul 2 (codificat MgCl2): clorură de magneziu (1 mmol/kg corp); Lotul 3 (codificat PB-1): extract de Pinus brutia (112,5 mg/kg corp); Lotul 4 (codificat PB-2): extract de Pinus brutia (56,25 mg/kg corp). 10

15 Testul Actimetrului Prin intermediul acestui test de comportament se înregistrează activitatea motorie spontană a animalului de laborator, prin contorizarea numărului de mişcări efectuate în plan orizontal, în plan vertical şi a mişcărilor stereotipe. Testările s-au realizat folosind dispozitivul denumit Actimetru (al firmei PanLAB), pe un interval de timp de 20 minute (Boissier, Simon, 1965) Testul benzii rulante (sau testul de locomoţie forţată) Banda rulantă pentru testarea animalelor de laborator, este un dispozitiv, ce le forţează să alerge pe o bandă aflată în mişcare de rotaţie, cu viteză constantă, aparatul, având acelaşi principiu de funcţionare, ca şi banda rulantă, pe care omul o foloseşte, pentru a practica exerciţii fizice (Kregel et al., 2006). În cadrul acestui experiment însă, dispozitivul permite aplicarea unor stimuli electrici suplimentari (cu intensitate constantă de la 0 la 2 ma, denumiţi - şocuri electrice). Aceste şocuri, constituie elemente de penalizare şi totodată de impulsionare a animalului, pentru continuarea deplasării, în momentul în care acesta are tendinţa de a se opri sau când se împiedică şi cade pe banda aflată în mişcare (Kemi et al., 2002) Testul labirintului în Y (sau testul Y-maze) Acest model experimental investighează memoria spaţială şi de recunoaştere, pe baza instinctelor naturale ale rozătoarelor de a explora mediul înconjurător (Morris, 2002). Testul clasic se efectuează fără folosirea unor recompense pentru animal, cu scopul de a indica preferinţa naturală a acestuia pentru spaţiul explorat. Sunt evaluate totodată, performanţele motorii şi capacitatea de învăţare spaţială a animalului de experienţă (Baddeley, 1992; Baker, 2011). 11

16 7. REZULTATE 7.1. Obţinerea extractului din frunze de Pinus brutia Extractele vegetale (extrase cu metanol) au fost reunite şi concentrate la sec sub presiune redusă la 40ºC. Astfel s-au obţinut 91,3 g extract uscat Determinarea cantitativă a principiilor active Analiza cantitativă a principiilor active din extractul din frunze de P. brutia testat a arătat următoarea compoziţie: Conţinut polifenolic 68,05±0,51 mg/g Extract de P. brutia Conţinut flavonoidic 24,79±0,35 mg/g Conţinut saponine 482,51±7,00 mg/g 7.3. Rezultatele evaluării toxicităţii acute Dozele letale 100 (DL100), după administrare intraperitoneală au fost: la şoarece, 3000 mg/kgc, iar la şobolan, 3750 mg/kgc. Compararea dozelor letale medii obţinute, pentru administrare intraperitoneală, la animale (1750 mg/kg corp, respectiv 2250 mg/kg corp) a extractului obţinut din planta Pinus brutia, cu scara toxicităţii după Voicu VA (1997), arată încadrarea acestuia în grupa substanţelor moderat toxice, fapt care permite continuarea cercetărilor asupra biocompatibilităţii in vivo a acestui extract. Analiza histologică a organelor recoltate de la şoarecii cărora le-au fost administrate doze toxice din extractul testat a evidenţiat următoarele modificări: - la nivelul cordului: cord cu arhitectură normală, edem interstiţial, cardiomiocite cu aspect ondulant, agregat de fibrină aderent focal la endocard, miocitoliză focală, necroză focală a benzilor de contracţie, hipereozinofilie citoplasmatică focală; - la nivelul plămânului: emfizem pulmonar focal; - la nivelul rinichiului: rinichi cu arhitectură normală, degenerescenţă hidropică granulară tubulară izolată; - la nivelul ficatului: ficat cu arhitectură normală, proces degenerativ paralel cu proces regenerativ, stază focală. 12

17 Analiza histologică a organelor recoltate de la şobolanii cărora le-au fost administrate doze toxice din extractul testat a evidenţiat modificări în organele vitale: - la nivelul plămânului: distrucţie masivă a pereţilor alveolari cu debut de proces inflamator; - la nivelul ficatului: fibroză hepatică, macrosteatoză extinsă; - la nivelul rinichiului: dilatări tubulare multiple, hemoragii peri- şi intratubulare renale. Modificările histologice au fost dependente de dozele toxice administrate Rezultatele testării biocompatibilităţii in vivo Testarea biocompatibilităţii la şoareci Nu au fost constatate modificări semnificative statistic ale numărului de eritrocite, ale valorilor hemoglobinei, hematocritului, la şoarecii care au primit extractul testat comparativ cu animalele din lotul martor, la 14 zile în cadrul experimentului (p>0,05). De asemenea, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale valorilor componentelor formulei leucocitare (polimorfonucleare neutrofile, limfocite, eozinofile, monocite, bazofile) determinate din analiza sângelui recoltat de la animalele care au primit extractul din Pinus brutia, în cele 4 doze, comparativ cu animalele din lotul martor (p>0,05). Nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale nivelurilor parametrilor biochimici testaţi, comparativ cu lotul martor (p>0,05). Analiza histologică a organelor recoltate de la şoareci cărora le-a fost administrat extractul testat în doze reprezentând 1/5, 1/10, 1/20 şi, respectiv, 1/40 din DL50 nu a evidenţiat modificări în organele vitale Testarea biocompatibilităţii la şobolani Nu au fost constatate modificări semnificative statistic ale numărului de eritrocite, ale valorilor hemoglobinei, hematocritului, la şobolanii care au primit extractul testat comparativ cu animalele din lotul martor, indiferent de momentul determinării (p>0,05). 13

18 De asemenea, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale valorilor componentelor formulei leucocitare (polimorfonucleare neutrofile, limfocite, eozinofile, monocite, bazofile) determinate din analiza sângelui recoltat de la animalele care au primit extractul din Pinus brutia, în cele 4 doze, după 24 de ore şi la 14 zile, comparativ cu animalele din lotul martor (p>0,05). Nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale nivelurilor parametrilor biochimici testaţi, comparativ cu lotul martor (p>0,05). Analiza histologică a organelor recoltate de la şobolani cărora le-a fost administrat extractul testat în doze reprezentând 1/5, 1/10, 1/20 şi, respectiv, 1/40 din DL50 nu a evidenţiat modificări în organele vitale Rezultatele evaluării efectelor asupra stresului cronic indus experimental Determinarea hemoleucogramei la animalele de laborator expuse stresului La animalele din lotul martor M1-î, expuse la întuneric continuu, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale parametrilor hemoleucogramei, comparativ cu valorile acestora la animalele din lotul martor M. Animalele din lotul martor M-lu, expuse la lumină continuă, au prezentat scăderi semnificative statistic ale eritrocitelor şi hemoglobinei, precum şi creşteri semnificative statistic ale numărului total de leucocite şi ale numărului de polimorfonucleare neutrofile, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. După administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, expunerea la stresul indus de menţinerea la întuneric continuu nu a determinat modificări semnificative statistic, ale hemoglobinei şi numărului de eritrocite, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează un efect protector al extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la nivelul eritrocitelor, faţă de aceste condiţii experimentale menţionate. După administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, expunerea la stresul indus de menţinerea 14

19 la lumină continuă a determinat scăderi, dar nesemnificative statistic, ale hemoglobinei şi numărului de eritrocite, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează un efect protector parţial al extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la nivelul eritrocitelor, faţă de aceste condiţii de stres induse prin expunerea la lumină continuă. La animalele din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, expuse stresului prin menţinerea la întuneric continuu sau prin menţinerea la lumină continuă, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale valorilor hemoglobinei şi ale numărului de eritrocite, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Aceste rezultate demonstrează un efect protector la nivelul eritrocitelor faţă de stresul indus, la şobolanii trataţi cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp. După administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, expunerea la stresul indus de menţinerea la întuneric continuu nu a determinat modificări ale numărului total de leucocite sau ale numărului de polimorfonucleare neutrofile, limfocite, monocite, bazofile şi eozinofile, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează un efect protector al extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la nivelul leucocitelor, deci, faţă de sindromul de răspuns inflamator sistemic. După administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, expunerea la stresul indus de menţinerea la lumină continuă a determinat creşteri, dar nesemnificative statistic, ale numărului total de leucocite şi ale numărului de polimorfonucleare neutrofile, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează un efect protector parţial al extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la nivelul leucocitelor, deci, faţă de sindromul de răspuns inflamator sistemic. După administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, expunerea la stresul indus de menţinerea la întuneric continuu, respectiv, la lumină continuă nu a determinat 15

20 modificări ale numărului total de leucocite sau ale numărului de polimorfonucleare neutrofile, limfocite, monocite, bazofile şi eozinofile, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează un efect protector al extractului din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, la nivelul leucocitelor, deci, faţă de sindromul de răspuns inflamator sistemic. Nu au fost evidenţiate modificări ale hemoleucogramei la animalele de laborator tratate cu cele două doze din extractul din frunze de P. brutia, neexpuse stresului indus de menţinerea la întuneric continuu, respectiv, la lumină continuă, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M Determinarea parametrilor biochimici la animalele de laborator expuse stresului La animalele din lotul martor M1-î, expuse stresului cronic indus de menţinerea la întuneric continuu, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale parametrilor biochimici analizaţi, comparativ cu valorile acestora la animalele din lotul martor M, menţinute în regim de iluminare normal. Animalele din lotul martor M-lu, expuse stresului indus de menţinerea la lumină continuă, au prezentat creşteri semnificative statistic ale valorilor sanguine ale ureei, creatininei, acidului uric şi scăderi, de asemenea, semnificative statistic ale proteinelor totale, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. De asemenea, la animalele din lotul M-lu, au fost evidenţiate creşteri semnificative statistic ale valorilor sanguine ale: ASAT, ALAT, colesterolului total şi trigliceridelor. La animalele din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, expuse formelor de stres realizate, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale valorilor sanguine ale ureei, creatininei, acidului uric, ale proteinelor totale, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. De asemenea, la animalele de laborator din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, expuse formelor de stres realizate, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale valorilor sanguine ale: ASAT, ALAT, 16

21 colesterolului total şi trigliceridelor, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Aceste rezultate demonstrează efectele renoprotectoare, hepatoprotectoare şi asupra metabolismului lipidic, determinate de extractul din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, la animalele de laborator expuse formelor de stres realizate. După administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la şobolani expuşi stresului indus de menţinerea la lumină continuă, au fost observate creşteri nesemnificative statistic ale valorilor sanguine ale ureei, creatininei, acidului uric şi scăderi, de asemenea, nesemnificative statistic ale proteinelor totale, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. De asemenea, la animalele de laborator din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la şobolani expuşi stresului indus de menţinerea la lumină continuă, au fost evidenţiate creşteri nesemnificative statistic ale valorilor sanguine ale: ASAT, ALAT, colesterolului total şi trigliceridelor, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Aceste rezultate demonstrează efectele protectoare parţiale renale, hepaice şi asupra metabolismului lipidic, determinate de extractul din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la animalele de laborator expuse la lumină continuă. La animalele din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, expuse stresului indus de menţinerea la întuneric continuu, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale valorilor sanguine ale ureei, creatininei, acidului uric şi ale proteinelor totale, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. De asemenea, la animalele de laborator din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, la şobolanii expuşi stresului indus de menţinerea la întuneric continuu, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale valorilor sanguine ale: ASAT, ALAT, colesterolului total şi trigliceridelor, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Aceste rezultate demonstrează efecte protectoare renale, hepatice şi la nivelul metabolismului lipidic, faţă de stresul oxidativ, la şobolanii trataţi cu 17

22 extract din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, expuşi stresului indus prin menţinerea la întuneric continuu. La şobolanii din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, respectiv, în doză de 56,25 mg/kg corp, neexpuşi stresului, nu au fost evidenţiate modificări ale parametrilor biochimici analizaţi, comparativ cu valorile înregistrate la animalele din lotul martor M Efectele extractului din frunze de P. brutia asupra activităţii enzimelor antioxidante la animalele de laborator expuse stresului Animalele de laborator din lotul martor M1-î, expuse stresului cronic indus de menţinerea la întuneric continuu au prezentat scăderi, dar nesemnificative statistic, ale nivelurilor sanguine ale SOD, CAT şi G-Px, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Lipid peroxidarea a fost crescută de inducerea condiţiilor de stres, acest aspect fiind evidenţiat de o creştere, de asemenea nesemnificativă statistic, a nivelurilor serice ale MDA, la animalele din lotul M1-î, comparativ cu valorile acestui parametru la animalele din lotul martor M. Animalele din lotul martor M-lu, expuse stresului indus de menţinerea la lumină continuă, au evidenţiat scăderi, semnificative statistic, ale nivelurilor sanguine ale SOD, CAT şi G-Px, precum şi creşteri, semnificative statistic, ale nivelurilor serice ale MDA, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, a determinat o diminuare, semnificativă statistic, a efectelor stresului indus de menţinerea la întuneric continuu, asupra nivelurilor sanguine ale SOD, CAT, G-Px, precum şi asupra lipid peroxidării (evaluate prin determinarea nivelului sanguin al MDA), comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează faptul că, extractul din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, determină un efect protector asupra activităţii SOD, CAT şi G-PX, precum şi împotriva lipid peroxidării, la animalele de laborator expuse stresului prin menţinerea la întuneric continuu. 18

23 Administrarea extractului din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, a determinat o diminuare, dar nesemnificativă statistic, a efectelor stresului indus de menţinerea la lumină continuă, asupra nivelurilor sanguine ale SOD, CAT, G-Px, precum şi asupra lipid peroxidării (evaluate prin determinarea nivelului sanguin al MDA), comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează faptul că, extractul din frunze de P. brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, determină un efect protector parţial al activităţii SOD, CAT şi G-PX, precum şi împotriva lipid peroxidării, la animalele de laborator expuse stresului prin menţinera la lumină continuă. La animalele din loturile tratate cu extract din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, expuse formelor de stres realizate, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale nivelurilor sanguine ale SOD, CAT, G-Px, precum şi ale nivelului sanguin al MDA, comparativ cu valorile acestor parametri la animalele din lotul martor M. Rezultatele obţinute demonstrează faptul că, extractul din frunze de P. brutia, în doză de 112,5 mg/kg corp, determină un efect protector al activităţii SOD, CAT şi G-PX, precum şi împotriva lipid peroxidării, la animalele de laborator expuse stresului, prin menţinere la întuneric continuu/lumină continuă. La ambele doze, extractul din frunze de P. brutia nu a influenţat activitatea SOD, CAT, G-Px şi MDA, la animalele menţinute în regim de iluminare normal, alternant, cu raport lumină / întuneric = 12h/12h Rezultatele evaluării efectelor asupra comportamentului la animale de laborator Testul Actimetrului Cercetările experimentale efectuate au condus la evidenţierea a trei tipuri de informaţii cu privire la activitatea motorie spontană a animalului de laborator: mişcările efectuate în plan orizontal, în plan vertical şi mişcările stereotipe. Prelucrarea statistică a datelor obţinute evidenţiază următoarele: - tratamentul cu clorură de magneziu (1mmol/kg corp) a produs scăderea numărului de mişcări totale (2128.0±89.55), semnificativ statistic (**p<0.01) faţă de lotul martor ( ±463.32), la testul actimetrului (fig. 7.30); 19

24 - administrarea de extract de Pinus brutia (112,5 mg/kbw) a determinat reducerea mişcărilor globale la şobolan ( ±217.05), semnificativ din punct de vedere statistic, comparativ cu lotul martor (**p<0.01), pe acelaşi interval de timp (fig. 7.30); - efectul asupra numărului de mişcări totale, produs de PB-1 a fost de intensitate mai redusă decât cel determinat de MgCl2, pe acest model de comportament utilizat; - utilizarea extractului de Pinus brutia, în doză de 56,25 mg/kg corp, s-a asociat cu o slabă diminuare a numărului mişcărilor totale ( ±378.54), nesemnificativă din punct de vedere statistic, comparativ cu lotul ce a primit ser fiziologic (Fig. 7.30). Fig Testul Actimetrului la şobolan - efectele celor două doze de extract din Pinus brutia asupra mişcărilor totale. Fiecare coloană reprezintă media ± eroarea standard a mediei numărului de mişcări totale, pentru 7 animale. Valorile coeficientului *p<0.05, **p<0.01 sunt considerate semnificative din punct de vedere statistic în raport cu martorul. Contorizarea numărului de mişcări efectuate în plan orizontal oferă date despre comportamentul general al animalului, de explorare a mediului nou în care este plasat. Testul actimetrului oferă posibilitatea înregistrării variaţiilor numărului de mişcări în plan orizontal efectuate de animalele de laborator. Administrarea, timp de 20

25 14 zile, a clorurii de magneziu (1mmol/kg corp) a determinat scăderea numărului de mişcări orizontale, semnificativ statistic (**p<0.01), comparativ cu lotul martor. PB-1 a produs reducerea mişcărilor în plan orizontal, semnificativ statistic (**p<0.01), faţă de lotul cu ser fiziologic, la testul actimetrului. Scăderea numărului de mişcări orizontale produsă de PB-1 a fost mai puţin accentuată decât cea determinată de MgCl2, în acelaşi interval de timp. Injectarea intraperitoneală, timp de 14 zile, a PB-2, a determinat o tendinţă de diminuare a numărului de mişcări în plan orizontal, dar fără semnificaţie statistică, comparativ cu lotul martor. Utilizarea clorurii de magneziu (1mmol/kg corp) produce scăderea importantă a numărului de mişcări în plan vertical, semnificativ statistic (**p<0.01), comparativ cu martorul, la testul actimetrului la şobolan. Administrarea intraperitoneală, timp de 14 zile a PB-1 s-a asociat cu reducerea mişcărilor în plan vertical, semnificativ statistic (**p<0.01) faţă lotul care a primit ser fiziologic, pe acelaşi interval de timp al determinării. Efectul de scădere a numărului de mişcări verticale produs de PB-1 a fost mai slab decât cel determinat de MgCl2, în cadrul acestui test de comportament. Tratamentul cu PB-2, pe o durată de timp de 14 zile, nu a influenţat semnificativ statistic numărul de mişcări în plan vertical, în comparaţie cu lotul martor. Administrarea de clorură de magneziu (1mmol/kg corp) se însoţeşte de o reducere a numărului de mişcări stereotipe ale şobolanilor, semnificativ statistic (*p<0.05) faţă de lotul cu ser fiziologic, la testul actimetrului. Tratamentul, timp de 14 zile, cu PB-1, a determinat diminuarea numărului de mişcări stereotipe ale animalelor, dar nesemnificativ din punct de vedere statistic, în comparaţie cu lotul martor, în acest test de comportament utilizat. PB-2, injectat intraperitoneal, timp de 14 zile, nu a modificat semnificativ statistic numărul de mişcări stereotipe ale şobolanilor, în comparaţie cu lotul ce a primit ser fiziologic, pe acelaşi interval de timp al determinării Testul benzii rulante (sau testul de locomoţie forţată) Cu ajutorul acestui test de efort, se poate măsura distanţa parcursă de animalul de laborator, aflat în mişcare pe banda rulantă, 21

26 în scopul aprecierii capacităţii de rezistenţă la efort fizic, în perioada de timp acordată determinărilor. În intervalul de timp de 10 minute a experimentului, clorura de magneziu (1 mmol/kg corp) a produs mărirea distanţei parcurse de animal pe bandă, semnificativ statistic (**p<0,01) comparativ cu lotul martor la testul de locomoţie forţată. Administrarea timp de 14 zile a PB-1 s-a asociat de alungirea distanţei parcurse de animal pe banda rulantă, semnificativ statistic (*p<0,05) comparativ cu lotul care a primit ser fiziologic, la testul de efort. Tratamentul cu durată de 14 zile cu PB-2 a determinat o tendinţă de creştere a distanţei parcurse de animal, dar nesemnificativ statistic faţă de martor. Efecte produse de PB-1 au fost mai reduse ca intensitate, asupra distanţei parcurse de animal, decât cele determinate de clorura de magneziu, pe acelaşi interval de timp la testul benzii rulante (Fig. 7.34). Fig Testul benzii - efectele celor două doze de extract din Pinus brutia asupra distanţei parcurse. Fiecare coloană reprezintă media ± eroarea standard a mediei distanţei parcurse, pentru 7 animale. Valorile coeficientului *p<0.05, **p<0.01 sunt considerate semnificative din punct de vedere statistic în raport cu martorul. 22

27 Testul de locomoţie forţată, poate să determine de câte ori şobolanul atinge capătul opus al benzii, element care se corelează în mod direct cu rezistenţa sa la efort. Injectarea intraperitoneală, timp de 14 zile de clorură de magneziu (1 mmol/kg corp) a determinat creşterea numărului de atingeri al capătului opus al benzii rulante, semnificativ statistic (**p<0,01) faţă de lotul martor la testul de efort. Utilizarea timp de 14 zile a PB-1 s-a însoţit de creşterea numărului de atingeri al capătului opus al benzii rulante, semnificativ statistic (*p<0,05) în comparaţie cu lotul martor, la testul de locomoţie forţată. Administrarea timp de 14 zile de PB-2 a produs o mărire a numărului de atingeri ale capătului opus al benzii de alergare, semnificativ statistic (*p<0,05) faţă de lotul tratat cu ser fiziologic. Creşterea numărului de atingeri ale capătului opus benzii rulante produs de PB-1 au fost mai puternice decât cele induse de PB-2, dar mai slabe, decât cele determinate de clorura de magneziu, pe acelaşi interval de timp, la testul benzii rulante (Fig. 7.35). Fig Testul benzii - efectele celor două doze de extract din Pinus brutia asupra numărului de atingeri ale capătului opus al benzii Fiecare coloană reprezintă media ± eroarea standard a mediei numărului de atingeri ale capătului opus al benzii rulante, pentru 7 animale. Valorile coeficientului *p<0.05, **p<0.01 sunt considerate semnificative din punct de vedere statistic în raport cu martorul. 23

28 Cu ajutorul testul de locomoţie forţată se poate determina durata de timp până la aplicarea primului şoc electric, parametru, care permite aprecierea timpului de rezistenţă fizică la efort a animalului, până când este necesară impulsionarea sa, pentru continuarea alergării pe bandă. Utilizarea, timp de 14 zile a clorurii de magneziu (1 mmol/kg corp) s-a însoţit de mărirea duratei de timp până la aplicarea primului şoc electric, semnificativ statistic (**p<0,01) comparativ cu martorul, la testul de locomoţie forţată. Injectarea intraperitoneală, o perioadă de 14 zile, a PB-1 a produs creşterea duratei de timp până la aplicarea primului şoc electric, semnificativ statistic (*p<0,05) faţă de martor, pe acelaşi interval de timp al determinării. Tratamentul cu PB-2, s-a însoţit de o slabă alungire a duratei de timp până la aplicarea primului şoc electric, dar nesemnificativă din punct de vedere statistic, în comparaţie cu lotul martor. Efectul determinat de PB-1 asupra duratei de timp până la aplicarea primului şoc electric este mai slab, decât cel produs de clorura de magneziu, la testul benzii rulante (Fig. 7.36). Fig Testul benzii - efectele celor două doze de extract din Pinus brutia asupra duratei de timp până la aplicarea primului şoc electric. Fiecare coloană reprezintă media ± eroarea standard a mediei duratei de timp până la aplicarea primului şoc electric, pentru 7 animale. Valorile coeficientului *p<0.05, **p<0.01 sunt considerate semnificative din punct de vedere statistic în raport cu martorul. 24

29 Prin intermediul testului benzii rulante s-a contorizat numărul de şocuri aplicate animalului în condiţii de efort forţat, pentru aprecierea necesităţii stimulării activităţii motorii, în situaţia în care acesta oboseşte. Tratamentul cu durată de 14 zile cu clorură de magneziu (1 mmol/kg corp), a produs scăderea marcată a numărului de şocuri electrice aplicate animalului, semnificativ statistic (**p<0,01) faţă de lotul martor la testul de efort. PB-1, administrat în priză unică zilnică, timp de 14 zile, a determinat reducerea numărului de şocuri electrice aplicate şobolanului, semnificativ statistic (*p<0,05), în comparaţie cu lotul tratat cu ser fiziologic. Injectarea intraperitoneală pentru o perioadă de 14 zile de PB-2, s-a asocit de o diminuare a numărului de şocuri electrice aplicate, semnificativ statistic (*p<0,05) comparativ cu martorul, pe acelaşi interval de timp în experiment. Efectul produs de PB-1 asupra numărului de şocuri electrice aplicate, a fost mai puternic decât cele al PB-2, dar mai slab, decât cel determinat de clorura de magneziu, la testul benzii rulante la şobolan (Fig. 7.37). Fig Testul benzii - efectele celor două doze de extract din Pinus brutia asupra numărului de şocuri electrice aplicate. Fiecare coloană reprezintă media ± eroarea standard a mediei numărului de şocuri electrice aplicate, pentru 7 animale. Valorile coeficientului *p<0.05, **p<0.01 sunt considerate semnificative din punct de vedere statistic în raport cu martorul. 25