REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GR. T. POPA IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT POSIBILITĂŢI DE MODULARE A CARCINOGENEZEI CUTANATE INDUSE EXPERIMENTAL Îndrumător ştiinţific: PROF. DR. MAGDA BĂDESCU Doctorand: RAOUL-VASILE LUPUŞORU IAŞI 2011

2 INTRODUCERE Cancerul cutanat a devenit unul dintre cele mai frecvente tipuri de cancer la om. Cele mai multe neoplazii cutanate au punct de plecare epidermul, iar în unele cazuri acestea se extind spre restul structurilor cutanate sau diseminează, pe cale limfatică sau hematogenă, determinând metastaze. Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) estimează că în fiecare an sunt înregistrate între două şi trei milioane de cazuri noi de carcinoame scuamocelulare şi bazocelulare, precum şi aproximativ de cazuri noi de melanoame (OMS, 2002). Astfel, cu o incidenţă care s-a dublat la fiecare de ani, cancerul cutanat a ajuns una dintre cele mai frecvente afecţiuni la nivel mondial (Schwartz RA, 2008). Ca urmare a creşterii expunerii şi supraexpunerii la radiaţii ultraviolete (RUV), numărul de diagnosticări de cancer cutanat (în principal, carcinoame scuamocelulare, carcinoame bazocelulare şi melanoame) a crescut îngrijorător, după anul 1980 (Long C şi colab., 1996). Majoritatea tumorilor cu punct de plecare cutanat apar, preponderent, la nivelul zonelor expuse la soare. Tumorile sunt mai frecvente pe partea stângă a corpului în SUA şi pe partea dreaptă în Anglia, probabil, din cauza expunerii asimetrice a corpului la soare în timpul şofatului. Pe măsură ce stratul protector de ozon al pământului se subţiază continuu (de Gruijl FR şi van der Leun JC, 2000), pot fi anticipate creşteri viitoare ale incidenţei cancerului cutanat. Frecvenţa cancerului cutanat este proporţională cu durata imunosupresiei şi timpul de expunere la soare. Cancerul cutanat apare frecvent la pacienţii infectaţi cu HIV, fiind mult mai agresiv la această categorie de pacienţi. Pe măsură ce durata de supravieţuire a persoanelor HIV pozitive creşte, cancerul cutanat poate pune reale probleme de tratament, întunecând prognosticul pe termen lung al acestor pacienţi. În acest context, scopul tezei de doctorat a constat în studiul experimental al efectelor expunerii cronice la RUV, în condiţiile utilizării unor extracte vegetale din Syringa vulgaris şi Prunella vulgaris ca potenţiali factori de protecţie cutanată. 1

3 STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 1. PIELEA - PARTICULARITĂŢI MORFO-FUNCŢIONALE Pielea interfaţa dintre corpul uman şi mediul extern este cel mai mare organ al omului. Cântăreşte aproximativ 4 kg şi are o suprafaţă de 2m 2. Acţionează ca o barieră, care protejează organismul de agresiunile mediului extern şi previne pierderile unor constituenţi organici, în special apa. O distrugere a straturilor pielii, ca cea din arsuri sau necroza toxică epidermică, conduce la o alterare a funcţiilor pielii care are consecinţe nefaste asupra întregului organism şi uneori fatale. Grosimea pielii variază între 0,5 şi 5 mm, fiind relativ subţire în regiunile corporale puţin expuse la uzură sau presiune şi mai groasă, la nivelul suprafeţelor care sunt mai solicitate, de exemplu, la nivelul tălpilor. Lamina bazală este o structură extracelulară de suport, vizibilă în microscopia electronică şi în cea optică, folosind coloraţia PAS şi coloraţia argentică. Lamina reticulară (colagenul de tip III sau reticulina) are în structură trei lanţuri de tip α 1. Acest tip de lanţ este bogat în hidroxi-prolină, cisteină, glicină şi sărac în hidroxi-lizină. De asemenea, este PAS pozitiv. Epidermul are origine ectodermică şi este alcătuit dintr-un epiteliu stratificat pavimentos keratinizat. Prezintă o serie de proeminenţe pliuri de suprafaţă care alternează cu depresiuni corespunzătoare unor proiecţii spre derm creste epiteliale întrerupte de proiecţiile dermului papilele dermice. Sub epiderm, în stratul germinativ, celulele se află într-o continuă diviziune. Celulele nou formate sunt încărcate cu o proteină rezistentă, keratina, care determină keratinizarea celulelor. Pe măsură ce iau naştere celule noi, în partea inferioară, celulele keratinizate vor fi împinse spre exterior. Keratinizarea reprezintă forma de diferenţiere terminală a keratinocitelor, desfăşurată ascendent, sub forma unor coloane care implică suprapunerea a doua procese: degenerarea organitelor celulare şi sinteza keratinei. 2

4 Dermul are origine mezodermică, este situat subepidermic şi este compus din ţesut conjunctiv bogat în glicozaminoglicani (dermatan-sulfat); matricea amorfă a ţesutului conjunctiv reprezintă un sistem coloidal apos care conţine un material amorf cu: glicozaminoglicani, proteoglicani, glicoproteine şi un fluid tisular asemănător plasmei. Vascularizaţia pielii este asigurată de două plexuri arteriale şi trei plexuri venoase. Pielea conţine receptori senzoriali ca terminaţii periferice ale nervilor senzoriali şi terminaţii nervoase motorii corespunzătoare vaselor sangvine, muşchilor erectori a firelor de păr şi glandelor sudoripare. Terminaţiile nervoase libere se extind până la nivelul stratului granulos unde percep senzaţiile tactile fine, termice şi senzaţia de prurit. 2. FACTORI DE RISC IMPLICAŢI ÎN CARCINOGENEZA CUTANATĂ Unul dintre cele mai importante roluri ale pielii este acela de a proteja organismul de acţiunea stimulilor proveniţi din mediul extern, cum ar fi, radiaţii, căldură, frig, microorganisme. Tegumentul, în calitatea sa de barieră între mediul extern şi organism, este unul din cele mai expuse organe la acţiunea factorilor nocivi. În diagnosticarea melanomului este foarte important de depistat anumite semne caracteristice. Specialiştii le-au grupat sub denumirea de ABCD-ul melanomului şi ele includ: A. Asimetrie: forma unei jumătăţi nu este identică cu a celeilalte jumătăţi a leziunii tegumentare analizate. B. Borders (margini): marginile leziunii sunt neregulate sau imprecis delimitate. C. Culoare: culoarea este neuniformă, leziunea are zone hiperpigmentare roşiatice, violacee, alternând cu zone hipopigmentare (uneori, chiar albicioase). D. Diametrul: diametrul unei leziuni cu potenţial malign se modifică rapid şi, într-un interval scurt de timp, poate creşte cu mai mult de 6 mm. 3

5 Cei mai frecvenţi factorii de risc în apariţia cancerului de piele sunt: pielea deschisă la culoare; pacienţii cu părul blond şi tenul deschis sau cei roşcaţi sunt cei mai sensibili, ei dezvoltând arsuri solare mai frecvent, uneori chiar şi în prezenţa unor produse adecvate de protecţie; pielea fragilă, sensibilă, uscată este mult mai susceptibil la apariţia cancerului de piele; anumite tratamente împotriva psoriazisului şi eczemelor pot creşte semnificativ riscul de neoplazie cutanată; antecedentele multiple de arsuri solare suprasolicită permanent capacitatea de reparaţie a tegumentului şi, astfel, cresc riscul de apariţie a unor modificări celulare; arsurile solare apărute în copilărie şi cele apărute în viaţa adultă sunt la fel de nocive; istoricul familial de cancer de piele (strămoşi celtici, de exemplu, irlandezi sau scoţieni); deficitele imunologice (pacienţii imunodeprimaţi în context de infecţie HIV, leucemie sau la cei care se află sub tratament imunosupresor posttransplant); nevii displazici pot determina apariţia cancerului de piele; infecţiile cu papilomavirus (HPV); prezenţa unor leziuni cutanate precanceroase; vârsta peste 40 de ani; sexul masculin (bărbaţii dezvoltă cancer de piele mai frecvent decât femeile); persoanele care locuiesc în zonele ecuatoriale, unde razele ultraviolete sunt mai puternice; munca în aer liber fără protecţie împotriva soarelui (agricultorii, constructorii, marinarii sunt categorii care dezvoltă cancer cutanat ca boală profesională); fumatul; expunerea repetată la raze X, anumite chimicale (arsenic, cărbune) şi substanţe radioactive (radiu) (Fauci AS şi Longo DL, 2003). Radiaţia ultravioletă (RUV) este o formă de energie electromagnetică invizibilă, cu lungimea de undă cuprinsă între 4

6 nanometri, cea mai importantă sursă de ultraviolete fiind soarele. Spectrul ultraviolet cuprinde radiaţii electromagnetice cu lungime de undă mai mică de 400nm şi poate fi divizat în mai multe categorii, în funcţie de lungimea de undă şi intensitate. Dintre ultravioletele emise în lumina solară, un procent de până la 99 la sută este absorbit de atmosfera terestră, astfel încât, din punct de vedere al interacţiunii cu pielea, sunt importante doar RUV de tip A, cu lungime de undă cuprinsă între nanometri, şi RUV de tip B, cu lungime de undă cuprinsă între nanometri. RUV de tip A sunt absorbite slab de acizii nucleici şi proteine, iar evenimentul iniţial în declanşarea efectelor biologice constă în absorbţia fotonilor UVA de către diferiţi cromofori din mediul celular: chinone, steroizi, porfirine, flavin coenzime şi proteine cu grupări hem (citocromi, peroxidaze, catalază). Absorbţia fotonilor UVA de către cromofori are ca rezultat formarea speciilor reactive de oxigen sau transferul energiei acumulate către anumite molecule ţintă (Hanson KM şi colab., 2006). Imunosupresia joacă un rol foarte important în iniţierea carcinogenezei şi diseminarea cancerului de piele. Expunerea prelungită la RUV creşte recurenţa infecţiilor cutanate, în special, a celor cu virus herpes simplex. Factorul de risc principal în apariţia cancerului cutanat şi agentul etiologic pe care majoritatea medicilor dermatologi îl incriminează în apariţia cancerului de piele este reprezentat de expunerea la RUV. Nu există, se pare, diferenţe semnificative între expunerea la soare sau în saloanele de bronzare la solar, efectele fiind la fel de nocive. De asemenea, riscul de apariţie al cancerului cutanat nu variază cu sezonul de expunere la RUV, studiile demonstrând că radiaţiile solare din timpul iernii sunt la fel de periculoase ca şi cele estivale. Expunerea cumulată în timp poate duce la apariţia neoplasmului bazocelular şi a celui cu celule scuamoase, în timp ce episoadele de arsuri solare, mai ales cele apărute înainte de 18 ani, sunt adesea factori de risc pentru apariţia melanoamelor maligne la persoanele în vârstă. Un alt factor nociv pentru piele este fumatul, din cauza efectelor locale produse de substanţele active din componenţa 5

7 fumului de ţigară. În cursul fumatului se produc radicali liberi, care sunt instabili şi hiperreactivi, ducând la deteriorarea celulelor pielii. Există o serie de maladii ereditare care determină o susceptibilitate marcată la RUV. 3. POSIBILITĂŢI DE IMUNOMODULARE A CARCINOGENEZEI CUTANATE Imunomodularea sau modularea nespecifică a răspunsului imun reprezintă procesul în care sunt antrenate nespecific un număr mare de clone celulare care ating parametrii optimi de funcţionare (Dale MM şi colab., 1994). Agenţii biologici sau chimici care participă la procesul de imunomodulare sunt denumiţi imunomodulatori sau modificatori ai răspunsului biologic (BRM biological response modifiers). Imunomodulatorii modifică relaţiile dintre organismul gazdă şi agresori de etiologie variată (infecţioasă, neoplazică), modulând în favoarea gazdei procesul biologic care se desfăşoară în aceste relaţii. BRM au rol de stimulare a funcţiilor imune când acestea sunt deprimate (neoplazii), dar şi de reducere a capacităţii imune a organismului, atunci când funcţia sistemului imun este exacerbată (boli autoimune). Prevenirea şi controlul cancerului presupun o acţiune complexă, vizând efectuarea diferitelor studii privind intervenţii specifice pentru diminuarea riscurilor de cancer, precum şi triajul pentru detectarea precoce a cancerului. Conceptul central al prevenirii şi controlului cancerului este următorul: carcinogeneza nu este un eveniment, ci un proces, o serie de modificări celulare discrete care au drept rezultat procese cu evoluţie progresivă. În general, imunomodularea este definită ca un ansamblu de intervenţii corective sau reglatoare ale răspunsurilor imune aberante. Imunomodularea poate include intervenţii stimulatoare sau represive, dependente de nivelul, direcţia, intensitatea şi amploarea alterării răspunsului imun fiziologic. Imunomodularea reprezintă o soluţie pentru tratamentul unor situaţii clinice care asociază afecţiuni cu o 6

8 componentă disimunitară majoră: boli autoimune, boli produse prin hipersensibilizare sau boli datorate imunodeficienţelor primare şi secundare, neoplazii (Lupuşoru CE, 2001). 4. IMUNOMODULATORI DE ORIGINE VEGETALĂ În ultimul timp, o serie de produse naturale obţinute din plante medicinale tradiţionale au fost tot mai mult cercetate şi investigate din punct de vedere chimic şi biologic, pentru efectele lor de stimulare a unor funcţii ale organismului. În acest sens, o categorie aparte de astfel de extracte obţinute din plante medicinale este reprezentată de cele cu calităţi imunomodulatoare, antiinflamatoare şi care, în medicina tradiţională a unor ţări, reprezintă concepte de bază în tehnicile şi metodologiile terapeutice ale unor boli (medicina tradiţională indiană, chineză, japoneză, etc.) (Panossian A, 2003; Alonso JR, 2004). Principalele efecte ale adaptogenilor sunt reprezentate de: creşterea energiei pe parcursul unei zile; diminuarea emoţiilor în condiţii stresante; creşterea rezistenţei şi a capacităţii mentale; asigurarea unui somn profund şi odihnitor. Adaptogenii ameliorează disfuncţiile imune intervenind favorabil în contracararea imunosupresiei provocate de stres sau de diferite medicamente. Asigură protecţie, în special, împotriva bolilor acute (de exemplu, viroze respiratorii), dar şi a manifestărilor alergice, a unor tulburări autoimune, a degenerărilor maligne. Syringa vulgaris este un arbust originar din Orientul Mijlociu, apărând la noi ca specie spontană, cultivată sau sălbatică. Originar din India şi China, Prunella vulgaris (busuiocul de câmp sau busuiocul sălbatic) s-a răspândit repede în regiunile mediteraneene. El a fost adus în Europa de oştile lui Alexandru Macedon de la hinduşi, care îl considerau o plantă sacră. Datorită conţinutului ridicat în ulei eteric şi tanin, frunzele tăiate şi macerate în ulei se folosesc în ameliorarea cefaleei, iar infuzia şi decoctul din tulpini, în boli ale cavităţii orale, gâtului şi împotriva diareei. 7

9 PARTEA PERSONALĂ Teza de doctorat abordează una dintre problemele de maximă actualitate în literatura de specialitate, respectiv, posibilităţile de modulare ale carcinogenezei cutanate, justificând tema, atât prin încercarea de a realiza modele experimentale de expunere cronică la RUV, cât şi prin testarea unor principii active vegetale ca potenţiali factori fotoprotectori. Obiectivele tezei de doctorat au constat în: 1. investigarea prin citometrie în flux a fenotipului imun la animale de laborator expuse cronic la RUV; 2. evaluarea markerilor de stres oxidativ în condiţii de expunere cronică la RUV; 3. determinarea nivelurilor serice ale unor citokine la animale de laborator expuse acţiunii cronice a RUV; 4. obţinerea şi caracterizarea unor forme medicamentoase cu administrare topică conţinând extracte din Syringa vulgaris şi Prunella vulgaris; 5. evaluarea modificărilor unor parametri hematologici la animale de laborator cu şi fără expunere cronică la RUV de tip A (365 nm), în condiţiile administrării topice a extractelor din S. vulgaris şi P. vulgaris; 6. determinarea markerilor de stres oxidativ la animale de laborator cu administrare locală de extracte din S. vulgaris şi P. vulgaris, cu şi fără expunere cronică la RUV de tip A (365 nm); 7. cercetarea experimentală a modificărilor culorii tegumentare la animale de laborator cu şi fără expunere cronică la RUV de tip A (365 nm), în condiţiile administrării topice a extractelor din S. vulgaris şi P. vulgaris; 8. evaluarea histopatologică a efectelor unor extracte din S. vulgaris şi P. vulgaris, în administrare topică, la animale de laborator cu şi fără expunere cronică la RUV de tip A (365 nm). 8

10 1. INVESTIGAREA UNOR PARAMETRI BIOLOGICI LA ANIMALE DE LABORATOR EXPUSE LA RADIAŢII ULTRAVIOLETE Carcinogenicitatea razelor ultraviolete (RUV) a fost demonstrată în foarte multe studii experimentale. Primele şi cele mai complete dovezi experimentale privind relaţia de cauzalitate între RUV şi cancerul cutanat sunt cunoscute încă din perioada (de Gruijl FR şi Forbes PD, 1995). Expunerea experimentală a şoarecilor nuzi la radiaţiile produse prin utilizarea unui arc de mercur, a condus la o creştere a incidenţei tumorilor la nivelul urechilor şi globilor oculari. În 1934, Roffo a expus câteva sute de şobolani la acţiunea directă a razelor solare şi a observat că cele mai multe dintre aceste animale au dezvoltat tumori maligne. Ulterior, MacDonald a raportat o prevalenţă mult crescută a cancerului cutanat în ariile în care lumina soarelui este intensă. În plus, cele mai multe dintre aceste tumori apăreau pe părţile expuse ale feţei, pe gât şi la nivelul extremităţilor membrelor superioare. De asemenea, a raportat că incidenţa cancerului cutanat la bărbaţi este de aproximativ trei ori mai mare decât la femei (O'Neal MA, 1957). În anii 1970, cercetările privind cancerul cutanat indus de RUV au fost intensificate şi datorită raportărilor privind reducerea stratului de ozon din stratosferă (de Gruijl FR şi Forbes PD, 1995) MATERIALE ŞI METODE Am utilizat o lampă de UV (λ = nm) produsă de Institutul Naţional de Metrologie Bucureşti (INMB). Lampa a fost amplasată la o distanţă de cm de animale, iar doza administrată a fost de 2,4 J/cm 2 /zi, timp de 15 minute/zi, 60 de zile. Experimentele s-au efectuat pe 2 loturi a câte 10 şobolani rasa Wistar, cu repartiţie uniformă pe sexe, cu greutatea de g. Cele două loturi experimentale au fost reprezentate de lotul N (lotul martor, menţinut în condiţii standard, neexpus la RUV) şi lotul UV (lotul iradiat cu RUV). La toate animalele utilizate în studiu s-a îndepărtat părul din regiunea dorsală pe o suprafaţă de 9 cm 2 (de câteva ori în timpul experimentelor). Animalele au fost menţinute la un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, la o temperatură de 22±3ºC şi 9

11 o umiditate relativă de 30-70%. Animalele au fost grupate în cuşti pe loturi, au primit hrană standardizată şi au avut acces nelimitat la apă. Citometria în flux (flow-citometria) permite analiza multiparametrică, rapidă, a celulelor marcate fluorescent. Tehnica se bazează pe capacitatea substanţelor fluorescente (fluorocromilor) de emisie a semnalelor luminoase cu lungimi de undă particulare, in urma excitării lor cu fascicule laser. Determinarea intensităţii semnalelor optice emise este realizată prin intermediul unui citometru, sistem analizor complex ce combină componente optice, pneumatice şi electronice, care permite corelarea semnalelor optice emise de celulele care prezintă parametrii celulari de interes (Rahman M, 2006; Shapiro HM, 2003; Zola Z, 2000). S-a dozat malondialdehida (MDA) rezultată din descompunerea endoperoxizilor lipidici cu acid tiobarbituric (TBA) în mediu acid. Determinarea concentraţiei sangvine a glutationului redus (GSH) s-a realizat folosind metoda Ellman, modificată de Seldak şi Sinsdary, de determinare a grupărilor tiolice neproteice. Determinarea concentraţiei plasmatice a ceruloplasminei s-a realizat folosind metoda Ravin. Determinarea activităţii enzimatice a superoxid dismutazei (SOD) eritrocitare a fost realizată utilizând metoda descrisă de Csovari S. şi Angyal T. Dozarea citokinelor a fost realizată prin tehnica ELISA, folosind kiturile ELISA Rat Interleukin-1β (hil-1β) Biosource, Rat TNF-α Biosource, şi Rat IFN-gamma Biosource. Testul NBT decelează modificări metabolice care se produc în timpul proceselor de fagocitoză, corelate cantitativ cu fagocitoza, având la bază reducerea "Nitro Blue Tetrazolium" (NBT). Pentru studiul activităţii complementului seric a fost utilizată tehnica Hartmann-Brécy: complementul seric hemolizează eritrocitele sensibilizate (pe care s-au fixat anticorpi specifici). Pentru evidenţierea modificărilor histopatologice secundare expunerii la radiaţii UV, în contextul acestui experiment, materialul biologic a fost pregătit în vederea examinării în microscopia fotonică. Prelevarea pieselor s-a executat după sacrificare. Pentru prelucrarea statistică a datelor obţinute s-au folosit programul de calcul statistic SPSS 13.0 şi programul de calcul Microsoft Excel Prelucrarea statistică a datelor s-a efectuat 10

12 folosind media aritmetică, abaterea standard (DS) şi s-a utilizat testul "t-student" şi coeficientul de corelaţie Pearson (Boiculese LV, 2007) REZULTATE ŞI DISCUŢII Rezultatele experimentale au evidentiat o creştere semnificativă statistic (p<0,001) a leucocitelor la lotul iradiat cu UV comparativ cu lotul de şobolani normali. Creşterea leucocitelor s-a realizat predominant pe seama limfocitelor (79,94%). De asemenea, în urma analizei formulei leucocitare, s-a remarcat, atât o creştere a numărului de neutrofile, cât şi a numărului de monocite. Prin tehnica citometriei în flux s-a observat stimularea limfocitelor T sub acţiunea RUV (figura 1) cu creşterea predominant a limfocitelor Th CD3+CD4+ pentru lotul UV (2,6390±0,87873) comparativ cu lotul N (0,5618±0,39116). La lotul iradiat cu UV a crescut semnificativ şi numărul de limfocite citotoxice (Tc CD8+), iar raportul Th/Tc este de peste 3 ori mai mare (figura 1). Fig. 1. Modificarea populaţiei de limfocite Th CD3+ CD4+ şi a limfocitelor Tc CD3+CD8+ sub acţiunea radiaţiilor UV 11

13 În condiţiile experimentale realizate, expunerea la radiaţii UV generează stres oxidativ, fapt evidenţiat prin creşterea semnificativă statistic (p<0,001) a concentraţiei sanguine de MDA, GSH, SOD şi ceruloplasminei la lotul UV comparativ cu lotul N (figura 2). Fig. 2. Comparaţie între concentraţiile sangvine de MDA (nmol/ml), GSH (mmoli/dl) la lotul de şobolani iradiat cu radiaţii UV şi lotul neiradiat. Comparaţia dintre activităţile enzimatice ale SOD eritrocitare între cele două loturi (UI SOD/ml plasmă). Comparaţia dintre concentraţiile plasmatice de ceruloplasmină între lotul de martori si lotul de şobolani Wistar iradiaţi (mg/dl plasmă) În condiţiile experimentale utilizate, sub acţiunea radiaţiilor UV a avut loc creşterea secreţiei de citokine, cum ar fi, de exemplu: IL-1beta, TNF-alfa, IFN-gamma. Comparativ cu lotul martor, la care examenul histologic descrie aspect de tegument normal, la lotul iradiat cu UV, modificările semnalate sunt reprezentate de prezenţa infiltratelor inflamatoare, îngroşarea epidermului, mai ales, prin stratul spinos şi bazal, precum şi debut de degradare metaplazică epitelială. 12

14 2. OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNOR FORME MEDICAMENTOASE CU ADMINISTRARE TOPICĂ CONŢINÂND SYRINGA VULGARIS ŞI PRUNELLA VULGARIS Studiul a avut ca obiective determinarea toxicităţii acute a preparatelor de S. vulgaris şi P. vulgaris şi, ulterior, formularea şi prepararea de produse pentru uz extern, încorporate în diferite tipuri de bază. Testele de toxicitate acută permit evaluarea diferitelor manifestări toxice după administrarea unei singure doze de substanţă. Metoda creşterii şi descreşterii sau sus şi jos (sau up and down) a fost descrisă de Dixon şi Mood, în DL50 pentru tinctura de S. vulgaris a fost de 2312,5 mg/kg corp, iar pentru tinctura de P. vulgaris a fost de 759,375 mg/kg corp. În condiţiile de preparare, cele trei produse semisolide conţinând S. vulgaris prezintă aspect omogen, fără urme de separare şi cu o consistenţă adecvată aplicării cutanate. Caracteristicile preparatelor din S. vulgaris realizate corespund cerinţelor FR ediţia a X-a, privind omogenitatea şi valoarea ph-ului. Caracteristicile preparatelor din P. vulgaris realizate corespund cerinţelor FR ediţia a X-a. Unguentul cu baza lipofilă este de tip emulsie H/L, cu o capacitate mare de etalare şi penetrare pe piele. Unguentul hidrofil este de tip soluţie, cu o capacitate de etalare şi penetrare inferioare. Din ambele plante, s-au obţinut preparate omogene brun-verzui, cu miros caracteristic produsului vegetal. 3. EFECTELE UNOR FORME MEDICAMENTOASE CU ADMINISTRARE TOPICĂ CONŢINÂND SYRINGA VULGARIS ŞI PRUNELLA VULGARIS LA ANIMALE DE LABORATOR CU ŞI FĂRĂ EXPUNERE CRONICĂ LA RADIAŢII ULTRAVIOLETE DE TIP A Fotonii UVA au o energie mai mică decât fotonii UVB, dar au o pondere de peste 90% din energia solară din spectrul UV de la suprafaţa Pământului. În plus, radiaţiile UVA penetrează cu uşurinţă epidermul, acţionând asupra stratului proliferativ bazal al 13

15 epidermului şi chiar asupra componentelor sanguine din derm (Leszczynski D şi colab., 1996). UVA acţionează asupra constituenţilor celulari în mod indirect, prin mecanisme oxidative ce implică formarea speciilor reactive de oxigen. Fotoprotecţia se impune ca modalitate profilactică şi terapeutică împotriva fotosenescenţei şi a cancerului cutanat (Gilaberte Y şi González S, 2010). În acest context, un număr important de principii active vegetale sunt dezvoltate şi cercetate pentru efectele lor imunomodulatoare şi antioxidante. Administrate pe cale sistemică sau topică, ele pot reprezenta o alternativă în întârzierea îmbătrânirii celulare induse de expunerea la UV şi în prevenţia cancerului cutanat (Katiyar SK, 2007; Nichols JA şi Katiyar SK, 2011). Cea mai mare parte a produselor dermatocosmetice protejează pielea de acţiunea nocivă a radiaţiilor UVB şi sunt mai puţin eficiente în protecţia anti-uva (de Laat A şi colab., 1997). Totuşi, în literatura de specialitate există numeroase studii care demonstrează efectul nociv pe care radiaţiile UVA le au asupra tegumentului, determinând, prin expunere cronică, cancer cutanat (de Laat A şi colab., 1997). A fost utilizată o lampă de UVA (λ = 365 nm), model Black-Ray B-100AP (UVP, SUA). Lampa a fost amplasată la o distanţă de cm de animale, iar doza administrată a fost de 2,7 J/cm 2 /zi timp de 30 minute/zi, timp de 60 de zile. Experimentele s-au efectuat pe 12 loturi a câte 6 şobolani rasa Wistar, cu repartiţie uniformă pe sexe, cu greutatea de g. Loturile experimentale au fost: L1 (M): martor, neiradiat; L2 (im): expunere la RUVA; L3 (SVC1): administrare zilnică, topică de hidrogel conţinând 5% extract apos din S. vulgaris; L4 (isvc1): administrare zilnică, topică de hidrogel conţinând 5% extract apos din S. vulgaris şi, ulterior, expunere la RUVA; L5 (SVC2): administrare zilnică, topică de cremă hidrofilă conţinând 5% extract apos din S. vulgaris; L6 (isvc2): administrare zilnică, topică de cremă hidrofilă conţinând 5% extract apos din S. vulgaris şi, ulterior, expunere la RUVA; L7 (SVC3): administrare zilnică, topică de unguent hidrofob conţinând 5% extract apos din S. vulgaris; L8 (isvc3): administrare zilnică, topică de unguent hidrofob conţinând 5% extract apos din S. vulgaris şi, ulterior, expunere la radiaţii 14

16 RUVA; L9 (PVH): administrare zilnică, topică de unguent hidrofil cu macrogoli conţinând 10% extract apos din P. vulgaris; L10 (ipvh): administrare zilnică, topică de unguent hidrofil cu macrogoli conţinând 10% extract apos din P. vulgaris şi, ulterior, expunere la RUVA; L11 (PVL): administrare zilnică, topică de unguent lipofil conţinând 10% extract apos din P. vulgaris; L12 (ipvl): administrare zilnică, topică de unguent lipofil conţinând 10% extract apos din P. vulgaris şi, ulterior, expunere la RUVA. La toate animalele utilizate în studiu s-a îndepărtat părul din regiunea dorsală pe o suprafaţă de 9 cm 2 (de câteva ori în timpul experimentelor). După expunerea cronică la RUVA s-a constatat o creştere semnificativă statistic a numărului de leucocite din sângele periferic la lotul iradiat şi netratat, comparativ cu lotul martor. La animalele din loturile tratate topic cu creme şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări ale numărului total de leucocite din sângele periferic, valorile acestui parametru fiind relativ similare cu cele ale lotului martor (netratat şi neiradiat). La loturile iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate a fost observată o leucocitoză moderată, nesemnificativă statistic comparativ cu lotul martor. Protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase a fost semnificativă statistic comparativ cu valorile acestui parametru la lotul iradiat şi netratat. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o creştere nesemnificativă statistic a numărului de neutrofile din sângele periferic la lotul iradiat şi netratat, comparativ cu lotul martor. La loturile iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate a fost observată o neutrofilie moderată, rezultatele nefiind acoperite statistic nici în acest caz, comparativ cu lotul martor. Protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase a diminuat neutrofilia. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o creştere semnificativă statistic a procentelor de limfocite din sângele periferic la lotul iradiat şi netratat (L2/MI), comparativ cu lotul martor (L1/M). La animalele din loturile tratate topic cu creme şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări ale numărului total de limfocite din sângele periferic, valorile acestui parametru fiind relativ similare cu cele ale lotului martor (netratat şi neiradiat). La loturile iradiate, dar 15

17 protejate prin administrarea topică a cremelor testate s-a observat o creştere moderată a procentelor de limfocite, rezultatele fiind acoperite statistic comparativ cu lotul martor. Pe de altă parte, protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase a fost semnificativă comparativ cu valorile acestui parametru la lotul iradiat şi netratat. După o expunere cronică la RUVA s-a fost constatat o scădere semnificativă statistic a numărului de monocite din sângele periferic la lotul iradiat şi netratat, comparativ cu lotul martor. La animalele din lotul tratat topic cu hidrogel conţinând extract de S. vulgaris şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic faţă de lotul martor. La animalele din celelalte loturi tratate topic cu creme şi neiradiate au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale numărului absolut de monocite din sângele periferic, astfel: creşteri semnificative statistic ale acestui parametru la loturile tratate cu PVL, PVH şi SVC2, comparativ cu cele ale lotului martor (netratat şi neiradiat); scădere semnificativă statistic ale valorilor acestui parametru la lotul tratat cu SVC3, comparativ cu cele ale lotului martor (netratat şi neiradiat). După o expunere cronică la RUVA, nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale numărului de eozinofile din sângele periferic la loturile martor (neiradiat şi iradiat). Cu excepţia animalelor din lotul tratat topic cu SVC3 şi neiradiat, animalele din celelalte loturi tratate topic cu creme şi neiradiate, au fost evidenţiate creşteri semnificative statistic ale numărului de eozinofile din sângele periferic, comparativ cu lotul martor. După o expunere cronică la RUVA nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale numărului de globule roşii, hemoglobinei şi hematocritului la martorul iradiat comparativ cu martorul neiradiat. Aplicarea topică a cremelor testate nu a influenţat semnificativ statistic aceşti parametri. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o scădere semnificativă statistic a numărului de trombocite din sângele periferic la martorul iradiat comparativ cu martorul neiradiat. 16

18 La animalele din loturile tratate topic cu creme şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări ale numărului de trombocite din sângele periferic, valorile acestui parametru fiind relativ similare cu cele ale lotului martor neiradiat. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o scădere semnificativă statistic a valorilor testului NBT din sângele periferic la martorul iradiat, comparativ cu martorul neiradiat. La animalele din loturile tratate topic cu creme şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări ale valorilor testului NBT, valorile acestui parametru fiind relativ similare cu cele ale lotului martor neiradiat. La loturile iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate a fost observată o scădere semnificativă statistic a valorilor acestui parametru, comparativ cu lotul martor. Protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase a fost semnificativă comparativ cu valorile acestui parametru la lotul iradiat şi netratat. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o scădere semnificativă statistic a activităţii complementului seric la martorul iradiat, comparativ cu lotul martor neiradiat. La animalele din loturile tratate topic cu creme şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări ale activităţii complementului seric, valorile acestui parametru fiind relativ similare cu cele ale lotului martor (netratat şi neiradiat). După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o creştere semnificativă statistic a nivelurilor SOD şi MDA la martorul iradiat, comparativ cu martorul neiradiat. La animalele din loturile tratate topic cu creme şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări ale SOD şi MDA, valorile acestui parametru fiind relativ similare cu cele ale lotului martor neiradiat. În cazul loturilor iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate, a fost observată o scădere a nivelurilor SOD şi MDA comparativ cu valorile acestor enzime la martorul iradiat, efectul protector anti-stres oxidativ manifestându-se la loturile tratate cu SVC2 şi PVL. Evaluarea variaţiilor de culoare, la începutul şi la finalul experimentului, la loturile incluse în studiu a arătat prezenţa unei modificări semnificative statistic a culorii tegumentului la animalele expuse cronic la acţiunea RUVA şi neprotejate. 17

19 Aplicarea topică a produselor testate la animalele de laborator neexpuse la acţiunea RUVA nu a determinat modificări de culoare comparativ cu martorul neiradiat. Valorile diferenţelor de culoare (ΔE* (n-1) ) a tegumentului animalelor de laborator expuse la acţiunea cronică a RUVA şi protejate cu produsele testate au înregistrat, la finalul experimentului, diferenţe semnificative statistic comparativ cu cele de la lotul iradiat (figurile 3, 4). 12,00 10,00 8,00 L1 ΔE*(n-1) 6,00 4,00 2,00 L2 0, Zile Fig. 3. Variaţia ΔE* (n-1) la şobolani martor şi cei expuşi la RUVA Analiza histopatologică a fragmentelor de tegument recoltate a arătat aspect de piele normală la animalele din lotul martor. Expunerea cronică la acţiunea RUVA, în absenţa protecţiei cutanate, a fost asociată cu aspecte variind de la prezenţa unor infiltrate inflamatoare la nivelul dermului până la prezenţa aspectelor de metaplazie. Aplicarea topică a produselor testate a atenuat modificările histopatologice înregistrate la lotul iradiat şi neprotejat; nici unul din aspectele anatomopatologice ale probelor de la animale care au primit protecţie cutanată nu a prezentat aspecte de metaplazie 18

20 cutanată. Rezultatele analizei histopatologice confirmă potenţialul fotoprotector al cremelor utilizate în experiment, precum şi buna toleranţă a acestora la nivel tegumentar, prin absenţa reacţiilor inflamatoare locale. ΔE*(n-1) 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Zile L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 Fig. 4. Variaţia ΔE*(n-1) la şobolani expuşi la radiaţii ultraviolete A (365nm) şi trataţi topic cu cremele SVC1, SVC2, SVC3, PVH şi PVL 19

21 ASPECTELE DE ORIGINALITATE ALE TEZEI DE DOCTORAT Cancerul cutanat nu este doar unul dintre cele mai frecvente tipuri de cancer, dar, de asemenea, unul dintre cele mai simplu de prevenit; expunerea la soare este un factor determinant major al acestui tip de neoplazie şi descoperirea unor substanţe noi capabile să asigure protecţia tegumentului în faţa acţiunii nocive a radiaţiilor solare reprezintă o provocare pentru lumea medicală. Subiectul tezei de doctorat este, aşadar, unul extrem de actual şi încearcă să deschidă noi perspective de cercetare. Deşi primele observaţii şi studii legate de carcinogeneza cutanată şi factorii de risc implicaţi în apariţia şi progresia acestei afecţiuni au fost realizate în urmă cu aproape un secol, lumea medicală nu a reuşit încă să explice în totalitate implicaţiile clinice ale acestui fenomen. Lumea medicală este într-o continuă căutare a unor preparate noi, capabile să ofere fotoprotecţie adecvată cu minim de efecte adverse. Cercetarea din acest domeniu nu implică doar setea de cunoaştere şi dorinţa dezinteresată a omului de ştiinţă, ci este asociată unei adevărate industrii de produse dermatocosmetice, în care marile companii îşi dispută sume impresionante de bani. În ultima perioadă, tocmai din dorinţa de a aduce noutate, multe cercetări s-au îndreptat spre studiul unor extracte vegetale cu potenţial efect fotoprotector. Capacitatea imunomudulatoare a unora dintre plantele folosite în medicina tradiţională a deschis noi perspective de studiu. Teza de doctorat lansează, în cadrul unui model animal de expunere cronică la acţiunea RUV de tip A, o provocare prin folosirea unor principii active vegetale cunoscute pentru efectele lor imunomodulatoare în administrare sistemică. Preparatele originale din S. vulgaris şi P. vulgaris utilizate în cadrul experimentelor realizate au demonstrat efecte fotoprotectoare în condiţiile expunerii cronice la acţiunea UVA. Teza de doctorat aduce ca element de noutate studiul modificărilor de culoare ale tegumentului expus la iradierea UV cronică. Această metodă poate deveni un parametru de evaluare a potenţialului carcinogenetic pe care iradierea îl are la nivel cutanat. Continuarea cercetărilor şi completarea spectrului de investigaţii, în cadrul altor experimente, sunt necesare pentru a stabili 20

22 cu exactitate capacitatea fotoprotectoare a extractelor folosite. Din determinările realizate în cadrul experimentelor din teza de doctorat, cele două extracte pot deveni o alternativă la terapiile fotoprotectoare existente pe piaţă. PERSPECTIVELE PE CARE LE DESCHIDE TEZA DE DOCTORAT Lumea medicală asistă la diagnosticarea, la nivel mondial, a unui număr record de cancere cutanate, acest tip de neoplazie având o incidenţă cu un ritm de creştere mult mai ridicat decât în cazul celorlalte localizări ale afecţiunii neoplazice. Din această cauză, clinicienii încearcă să pună la punct noi metode de diagnostic şi tratament precoce, dar, în acelaşi timp, caută substanţe originale cu potenţial rol fotoprotector. Expunerea la RUV este unul dintre cei mai importanţi factori de risc în cancerul cutanat din cauza evenimentelor celulare şi moleculare pe care le poate declanşa şi care, în final, pot conduce la degenerarea malignă a celulelor tegumentare. În acest context, teza de doctorat, prin tema de cercetare aleasă, se înscrie în linia literaturii de specialitate ce încearcă să identifice principii farmacologic active care, prin aplicare topică, să reducă acţiunea nocivă a RUV. Efectele administrării sistemice a preparatelor de S. vulgaris şi P. vulgaris sunt parţial cunoscute. Potenţialul efect fotoprotector al acestor plante ar putea fi explicat tocmai prin efectele imunomodulatoare ale principiilor lor active. Testarea efectelor fotoprotectoare ale extractelor din S. vulgaris şi P. vulgaris pe un model experimental animal de expunere cronică la RUVA a permis evidenţierea acţiunii benefice pe care o parte a formulărilor utilizate o au la nivelul tegumentului iradiat. Aceste date preliminare deschid perspectivele unor noi experimente care să identifice rolul principiilor active incluse în studiu în faţa acţiunii întregului spectru de radiaţie solară, inclusiv a RUV de tip B, precum şi a intervalului de timp în care preparatele cu administrare topică oferă protecţie la expunerea la radiaţia solară. 21

23 CONCLUZII FINALE Primul experiment realizat în cadrul tezei de doctorat conduce la următoarele concluzii: 1. Rezultatele cercetării efectuate au evidenţiat o creştere semnificativă statistic a leucocitelor la lotul expus cronic la acţiunea UV comparativ cu lotul de şobolani normali. Creşterea leucocitelor s-a realizat predominant pe seama limfocitelor. 2. Analiza formulei leucocitare a arătat o creştere, atât a numărului de neutrofile, cât şi a numărului de monocite. 3. Prin tehnica citometriei în flux s-a observat stimularea limfocitelor T în condiţiile expunerii cronice la acţiunea RUV, cu creşterea predominant a limfocitelor Th CD3+CD4+ pentru lotul iradiat comparativ cu lotul martor. La lotul iradiat a crescut semnificativ şi numărul de limfocite T citotoxice, cu modificarea raportului Th/Tc. 4. Dintre limfocitele Th CD3+CD4+, s-a constatat o creştere semnificativă statistic a limfocitelor Th naive, mult mai importantă decât în cazul limfocitelor Th cu memorie. Acest aspect determină modificarea raportului dintre cele două tipuri celulare, deşi în valoare absolută şi numărul de limfocite Th cu memorie este mai mare la lotul iradiat comparativ cu lotul martor. 5. În condiţiile experimentale realizate, expunerea la radiaţii UV generează stres oxidativ, fapt evidenţiat prin creşterea semnificativă statistic (p<0,001) a concentraţiei sanguine de MDA şi GSH la lotul iradiat comparativ cu lotul martor. 6. Expunerea cronică la acţiunea UV a determinat o creştere semnificativă statistic a activităţii enzimatice a superoxid dismutazei eritrocitare la lotul de studiu (iradiat). 7. În condiţiile experimentale utilizate, sub acţiunea radiaţiilor UV a avut loc creşterea secreţiei citokinelor determinate (IL-1β, TNF-α, IFN-γ). 22

24 Celelalte două experimente realizate în cadrul tezei de doctorat conduc la următoarele concluzii: 1. În condiţiile de preparare, formele medicamentoase cu administrare topică obţinute, conţinând extracte de S. vulgaris şi P. vulgaris, prezintă un aspect omogen şi au o consistenţă adecvată aplicării cutanate. 2. După expunerea experimentală cronică la acţiunea RUVA s-a constatat o creştere semnificativă statistic a numărului de leucocite din sângele periferic la martorul iradiat, comparativ cu martorul neiradiat. La loturile iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate, s-a observat o leucocitoză moderată, rezultatele nefiind acoperite statistic, comparativ cu lotul martor neiradiat. Pe de altă parte, protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase a fost semnificativă comparativ cu valorile acestui parametru la lotul iradiat şi netratat. 3. După o expunere la RUVA de 60 de zile s-a constatat o creştere nesemnificativă statistic a numărului de neutrofile din sângele periferic la lotul iradiat şi netratat, comparativ cu lotul martor. Protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase la loturile iradiate a diminuat neutrofilia. 4. După o expunere cronică la acţiunea UVA s-a constatat o creştere semnificativă statistic a numărului de limfocite din sângele periferic la lotul iradiat şi netratat, comparativ cu lotul martor. Protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase la loturile expuse la RUVA a fost semnificativă comparativ cu valorile acestui parametru la martorul iradiat. 5. După o expunere la RUVA de 60 de zile s-a constatat o scădere semnificativă statistic a numărului de monocite din sângele periferic la lotul martor iradiat, comparativ cu lotul martor neiradiat. Comparativ cu lotul iradiat şi netratat, la animalele din loturile iradiate şi tratate cu creme protectoare, modificările numărului de monocite din sângele periferic nu au înregistrat semnificaţie statistică. 6. Expunerea animalelor de laborator la RUVA timp de 60 de zile, după protocolul utilizat în experiment, nu a influenţat procentul 23

25 de eozinofile din sângele periferic la lotul iradiat şi netratat, comparativ cu lotul martor. 7. După o expunere cronică la RUVA s-a evidenţiat scăderea semnificativă statistic a numărului de bazofile din sângele periferic la martorul iradiat comparativ cu martorul neiradiat. Aplicarea unguentelor de testat la loturile iradiate a determinat o atenuare a acestui fenomen. 8. După o expunere cronică la RUVA nu au fost evidenţiate modificări semnificative statistic ale numărului de globule roşii, hemoglobinei şi hematocritului la martorul iradiat comparativ cu martorul neiradiat. Aplicarea topică a cremelor testate nu a influenţat semnificativ statistic aceşti parametri. 9. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o scădere semnificativă statistic a numărului de trombocite din sângele periferic la martorul iradiat comparativ cu martorul neiradiat. La loturile iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate a fost observată o trombocitopenie moderată, rezultatele fiind acoperite statistic, comparativ cu lotul martor. Protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase a fost semnificativă statistic comparativ cu valorile acestui parametru la lotul iradiat şi netratat. 10. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o scădere semnificativă statistic a valorilor testului NBT din sângele periferic la martorul iradiat, comparativ cu martorul neiradiat. La loturile iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate a fost observată o scădere semnificativă statistic a valorilor acestui parametru, comparativ cu lotul martor. Protecţia oferită prin administrarea topică a formelor medicamentoase a fost semnificativă comparativ cu valorile acestui parametru la lotul iradiat şi netratat. 11. Expunerea cronică la RUVA a determinat o scădere semnificativă statistic a activităţii complementului seric la martorul iradiat, comparativ cu lotul martor neiradiat. În cazul loturilor iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate, s-a evidenţiat o scădere a valorilor activităţii complementului seric, comparativ cu lotul martor, rezultatele fiind acoperite statistic doar pentru lotul L10. 24

26 12. După o expunere cronică la RUVA s-a constatat o creştere semnificativă statistic a nivelurilor SOD şi MDA la martorul iradiat, comparativ cu martorul neiradiat. La animalele din loturile tratate topic cu creme şi neiradiate nu au fost evidenţiate modificări ale SOD şi MDA, valorile acestui parametru fiind relativ similare cu cele ale lotului martor neiradiat. În cazul loturilor iradiate, dar protejate prin administrarea topică a cremelor testate, a fost observată o scădere a nivelurilor SOD şi MDA comparativ cu valorile acestor enzime la martorul iradiat, efectul protector anti-stres oxidativ manifestându-se mai ales la loturile tratate cu SVC2 şi PVL. 13. Valorile diferenţelor de culoare înregistrate la martorul iradiat, la finalul experimentului, au fost crescute semnificativ statistic, comparativ cu cele ale martorului neiradiat, în timp ce la toate loturile expuse acţiunii cronice a RUVA şi protejate cu produsele testate s-au înregistrat valori ale acestui parametru, evaluat la finalul experimentului, semnificativ statistic mai reduse comparativ cu cele înregistrate la martorul iradiat. 14. Analiza histopatologică, în condiţiile expunerii cronice la acţiunea RUVA fără protecţie cutanată a arătat aspecte variind de la prezenţa unor infiltrate inflamatoare la nivelul dermului până la prezenţa aspectelor de metaplazie. Utilizarea produselor conţinând extractele vegetale testate a diminuat importanţa modificărilor histopatologice, fapt care confirmă potenţialul fotoprotector al acestora. 25

27 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Adams DW. Restoring American Gardens, Timber Press, Agar A, Young AR. Review: Melanogenesis: a photoprotective response to DNA damage? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2005, 571 (1-2): Alam M, Ratner D. Cutaneous squamous-cell carcinoma. N Engl J Med Mar 29; 344(13): Alonso JR. Tratado de Fitofármacos y nutracéuticos, 2-a. ed. Ed. Corpus. Buenos Aires, Andrade R, Gumport SL, Popking L, Rees TD. Cancer of the skin, W.B. Saunders, Andrews EJ, Bennett BT, Clark JD, Houpt KA, Pascoe PJ, Robinson GW, Boyce JR Report of the AVMA panel on euthanasia. J Am Vet Med Assoc 1993; 202: Antoshechkin A. The primary adaptogens: powerful remedies of prophylactic medicine, Clearwater, Ceptima Publishing, Applegate LA, Frenk E. Cellular defense mechanisms of the skin against oxidant stress and in particular UVA radiation. Eur.J.Dermatol. 1995, 5: Arndt AK în colaborare cu Bowers KE, Chuttani AR. Manual of dermatologic therapeutics, Ed. Little-Brown & Co.inc, Bădescu M, Roşca M, Bohotin C. Fiziopatologie generală. Iaşi: Cantes, Balasubramanian D. Ultraviolet radiation and cataract. J.Ocul.Pharmacol.Ther. 2000, 16: Baliga MS, Katiyar SK. Chemoprevention of photocarcinogenesis by selected dietary botanicals, Photochem. Photobiol. Sci 2006;5: Bara C, Imunologie fundamentală, Ed. Medicala 1996, p 13-58,

28 14. Bardeesy N, Wong KK, DePinho RA, Chin L. Animal models of melanoma: recent advances and future prospects. Adv Cancer Res, 2000; 79: Bauknecht T, Gross G, Hagedorn M. Epidermal growth factor receptors in different skin tumors. Dermatologica. 1985; 171(1): Bean WJ. Trees and shrubs hardy in the British Isles, 1980, Edition 8, IV. Ri-Z. 17. Berkelhammer J, Oxenhandler RW, Hook RRJ, Hennessy JM. Development of a new melanoma model in C57BL 6 mice. Cancer Res 1982;42: Blamey M, Grey-Wilson C. Flora of Britain and Northern Europe, Boiculese LV, Dimitriu G, Moscalu M. Elemente de biostatistică. Analiza statistică a datelor biologice. Iaşi: PIM, Bork K. Diagnosis and Therapy of Common Skin Diseases, Boukamp P. Non-melanoma skin cancer: what drives tumor development and progression? Carcinogenesis Oct;26(10): Bradl M, Klein-Szanto A, Porter S, Mintz B. Malignant melanoma in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88: Brash DE. Roles of the transcription factor p53 in keratinocyte carcinomas. Br J Dermatol. May 2006;154 Suppl 1: Braun F, Plewig G, Wolff HH, Winkelmann RK. Dermatology, Brenner M, Hearing VJ. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol May-Jun; 84(3): Broome PM, Gause PR, Hyman P, Gregus J, Lluria-Prevatt M, Nagle R et al. Induction of melanoma in TPras transgenic mice. Carcinogenesis. 1999; 20: Bruce RD An up-and-down procedure for acute toxicity testing. Fund Appl Toxicol 5: Bucur GH. Mică enciclopedie de boli dermato-venerice, Ed. Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti,