,MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII, TINERETULUI ŞI SPORTULUI UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE CRAIOVA TEZĂ DE DOCTORAT

Transcription

1 ,MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII, TINERETULUI ŞI SPORTULUI UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE CRAIOVA TEZĂ DE DOCTORAT CONSIDERAŢII CLINICE, BACTERIOLOGICE ŞI EPIDEMIOLOGICE ÎN TUBERCULOZA PULMONARĂ PAUCIBACILARĂ REZUMAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC PROF. ASOC. DR.CRISTIAN DIDILESCU Cercetător ştiinţific grad I DOCTORAND DR. CONSTANTIN DUŢĂ CRAIOVA 2010

2 Cuprins PARTEA GENERALĂ... 3 INTRODUCERE... 3 CAPITOLUL I. ETIOLOGIA TUBERCULOZEI... 3 CAPITOLUL II. RECOLTAREA, TRANSPORTUL ŞI CONSERVAREA PRODUSELOR PATOLOGICE... 5 CAPITOLUL III. EXAMENUL MICROSCOPIC... 5 CAPITOLUL IV. EXAMENUL PRIN CULTURĂ... 6 CAPITOLUL V. TESTAREA CHIMIOSENSIBILITĂŢII TULPINILOR DE M.TUBERCULOSIS LA MEDICAMENTE ANTIBIOGRAMA... 8 CAPITOLUL VI. EPIDEMIOLOGIA TUBERCULOZEI... 9 CAPITOLUL VII. TUBERCULOZA ÎN LUME ŞI ÎN ROMÂNIA CAPITOLUL VIII. PARTEA SPECIALĂ- MOTIVAŢIA ALEGERII TEMEI CAPITOLUL IX. OBIECTIVELE LUCRĂRII CAPITOLUL X. MATERIAL ŞI METODĂ CAPITOLUL XI. REZULTATE CAPITOLUL XII. DISCUŢII CAPITOLUL XIII. CONCLUZII Abrevieri Bibliografie PARTEA GENERALĂ INTRODUCERE - 2 -

3 Tuberculoza, boală infecto-contagioasă specifică, produsă de bacterii din genul Mycobacterium (specii patogene :M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum), este larg răspândită pe glob, are o evoluţie cronică şi netratată, sau tratată incorect, are o fatalitate importantă, fiind recunoscută ca problemă majoră de sănătate publică la scară mondială. Date ale Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii ( Raportul O.M.S. 2009) arată că, în prezent, aproximativ o treime din populaţia lumii este infectată cu M.tuberculosis şi că anual se înregistrează peste 9 milioane de cazuri noi de îmbolnăvire, fiind raportate circa 2 milioane de decese.[202] În România alterarea profundă a nivelului de trai al populaţiei între anii '80-'90, a determinat între altele şi apariţia unui nou val epidemic de tuberculoză, cu indicatori epidemiometrici care au cunoscut o creştere continuă începând cu anul 1985, atingând un apogeu in 2002 când incidenţa bolii a fost de 142%000 de locuitori.urmare a măsurilor întreprinse în controlul tuberculozei, pe baza implementării PNCT care este structurat pe strategia OMS, în ultimii ani nivelul incidenţei bolii în ţara noastra are un trend descendent, tendinţă confirmată de valorile inregistrate în perioada , când incidenţa globală a scăzut de la 134,6% 000 în 2004 la 105.9% 000 în anul [51] Cu toate acestea, comparativ cu ţările Uniunii Europene (UE), în ţara noastră se înregistreză încă cea mai crescută încidenţă, iar referitor la ţările din Regiunea Europa a OMS, România ocupa în 2007 locul al VII-lea după Kazakhstan, Republica Moldova, Federaţia Rusă, Georgia, Kirghistan şi Tajikistan. La nivel global, în cadrul Strategiei STOP-TB a OMS, au fost formulate principalele obiective ale luptei anti-tb mondiale pînă în anul 2015 :[202] - Reducerea incidenţei TB pînă în 2015; - Reducerea la jumătate până în 2015 a ratei prevalenţei şi mortalităţii raportată la nivelul anului 1990; - Depistarea şi tratarea a cel puţin 70% dintre cazurile noi, frotiu +, în cadrul programului DOTS; - Tratarea cu succes a cel puţin 85% dintre cazurile noi pozitive. CAPITOLUL I ETIOLOGIA TUBERCULOZEI AGENTUL PATOGEN Genul mycobacterium Agenţii etiologici ai tuberculozei umane sunt bacterii din genul Mycobacterium, gen unic al familiei Mycobacteriacae din ordinul Actinomycetales. Genul cuprinde peste 50 de specii, care au în comun următoarele caracteristici: - forma bacilară; - imobilitatea; - acidoalccolorezistenţa; - multiplicarea lentă; - aerobioza; Bacilul tuberculozei a fost identificat de Robert Koch în 1882.[132] Clasificarea micobacteriilor Numele genului Mycobacteria vine de la myces = ciupercă, mucegai şi bacterian = bastonaş în limba greacă. Sunt circa 50 de specii micobacteriene ce pot fi izolate la om după următoarele criterii majore: a) patogenitatea la om (strictă, potenţială sau nulă); b) viteza creşterii pe medii artificiale (lentă sau rapidă); c) pigmentaţia coloniilor (necromogene şi cromogene). După criteriul patogenităţii, o primă distincţie trebuie făcută între micobacteriile tuberculoase ( complexul M.tuberculosis ) şi cele netuberculoase.[155]. După viteza de creştere se clasifica în: A. Micobacterii cu creştere lentă: 1. Complexul M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.bovis, M. Africanum, M.leprae; 2. Grup fotocromogene (M.kansasii, M.marinum, M.simiae, M.asiaticum); 3. Grup scotocromogene: (M.scrofulaceum, M. Szulgai, M.gordonae); 4. Complexul M.avium (M.avium, M.intracellulare, M.paratuberculosis, M.lepraemurium) B. Micobacterii cu creştere rapidă: 1. Grup I necromogene (M.fortuitum, M.chelonei); 2. Grup II termofile (M.smegmatis, M.phlei, M.thermoresistibile); 3. Grup III scotocromogene (M.flavescens etc); 4. Grup IV altele (M.vaccae, M.aurum, M.novum, M.austroafricanum, M.rhodesiae) Morfologia microscopică - 3 -

4 Evidenţierea microscopică a bacililor tuberculoşi în produsele patologice se bazează pe acidoalcoolorezistenţa micobacteriană.. La microscop, bacilii au aspect de bastonaşe drepte sau încurbate cu capete rotunjite, lungi de 1-5µm şi groase de 0,2-0,5 µm, dispuse izolat sau grupate în grămezi. Deseori, ei conţin granule cu diametrul egal cu grosimea bacilară (aspect de mătănii) [133] La microscopul cu fluorescenţă, după colorarea cu fluorocromi (auramină, rodamină), micobacteriile apar ca bastonaşe fluorescente galben-portocalii pe fond întunecat. Microcopia electronică (Kölbel 1982) şi microscopia cu contrast de fază au arătat că micobacteriile sunt delimitate de un perete celular tristratificat (200Å), dublat pe faţa internă de membrana celulară, care prezintă invaginaţii citoplasmatice cu rol mitocondrial (mezozomi)(figura 1) Figura 1. Ultrasecţiuni prin celule de M.tuberculosis peretele celular, mezozomii (după Kölbel, 1982) Genomul micobacteriilor este intens studiat. S-au produs prin inginerie genetică sonde ADN pentru principalele specii: M.tuberculosis, M.leprae, cu ajutorul cărora se poate identifica o anume tulpină, sau evidenţia cantităţi minime de ADN micobacterian în spută, lichid cefalorahidian (LCR), ser sau ţesuturi, ca atare, fie după o prealabilă multiplicare a lanţurilor originale prin tehnologia reacţiei de polimerizare (PCR). [33];[48] Structura biochimică Bacilii tuberculoşi conţin 80-85% apă şi 15-20% reziduu uscat, format din săruri minerale şi substanţe organice (lipide, glucide, protide ).[43];[70]. Caracteristic este conţinutul ridicat de substanţe lipidice ale corpilor bacilari (30-40%), acizi graşi şi tuberculofosfatide, acizi micolici (acidoalcoolorezistenţă), cord-factor (virulenţa micobacteriană) şi fracţiunea ceroasă [17];[133]. Componenta protidică a bacililor tuberculoşi are ca principal reprezentant tuberculina, preparată de Robert Koch şi utilizată în prezent sub formă purificată sub denumirea de PPD ( purified protein derivative ) în diagnosticul infecţiei tuberculoase.[148]. Dezvoltarea pe medii de cultură Mediile de cultură artificiale pentru cultivarea in vitro a micobacteriilor conţin ca elemente nutritive: săruri minerale, glucoză (sursă de carbon), aminoacizi (sursă de azot), substanţe organice naturale (ser, albumină). Cel mai folosit în ţara noastră este mediul solid Löwenstein- Jensen, în compoziţia căruia intră, în afara elementelor nutritive fundamentale şi verde malahit (indicator de ph.[90].un alt mediu solid cu ou, curent folosit, este mediul Tebeglut, produs la Institutul Cantacuzino, în care sursa de azot este reprezentată de acidul glutamic. Medii lichide ca : Youmans, Dubos, Middlebrook, permit efectuarea culturilor pe lamă, metodă rapidă de precizare a diagnosticului.. [133][48].Tehnicile de cultură rapidă, tip BACTEC / MB- BACT, folosesc medii lichide de tip Middlebrook 7H9/7H12. Condiţiile optime de dezvoltare ale bacililor tuberculoşi sunt 37, C şi ph 7-7,5, aerobioza fiind obligatorie. Creşterea bacililor tuberculoşi este foarte lentă, primele colonii încep să apară pe mediile solide cu ou după zile şi devin mature după 3-4 săptămâni. Pe mediul Löwenstein-Jensen, coloniile de M.tuberculosis au aspect de colonii uscate, proeminente, verucoase, rugoase (tip R=,,rough,eugonic) de culoare gălbui, iar coloniile de M.bovis, pe mediul solid, sunt de regulă netede (S= smouth ), plate, de culoare albicioasă, aspect eremos,. [17][90] Celelalte micobacterii dau pe medii solide colonii având macroscopic drept caracteristici comune aspectul lucios ( smouth ) şi disocierea lor rapidă în apă distilată. [137]. Rezistenţa faţă de agenţii fizici şi chimici - 4 -

5 Rezistenţa este mare la frig ( până la C) şi uscăciune.lumina, căldura şi substanţele antiseptice distrug germenii prin expuneri de durată variabilă ( 15 minute 24 ore ), în funcţie de materialul contaminat.agenţii folosiţi curent pentru sterilizarea obiectelor contaminate şi a produselor bacilifere sunt:razele ultraviolete şi lumina solară, căldura umedă (fierbere, autoclavare), substanţe antiseptice : vapori de formol la 50 0 C, cloramină 5-10%, clorură de var 20%, hipoclorit de sodiu 0,5%, fenol 5%, crezol 10%, lizol 1-5%, [17], [137]. CAPITOLUL II RECOLTAREA, TRANSPORTUL ŞI CONSERVAREA PRODUSELOR Recoltarea. Aspecte generale.pentru obţinerea unor rezultate fiabile, calitatea produselor patologice este esenţială, fiind necesare respectarea unor condiţii generale: 1. Să se evite contaminarea cu bacterii şi fungi a produsului patologic.. 2. Recoltarea se face sub supravegherea unui cadru medical instruit. 3. Respectarea NORMELOR GENERALE DE RECOLTARE şi anume : înainte de începerea tratamentului antituberculos. întreruperea tratamentului timp de 3 zile. Repetarea examenului bacteriologic în zile succesive până la nouă spute. Produse patologice pentru diagnosticului tuberculozei pulmonare Sputa Este produsul patologic de elecţie în investigarea tuberculozei pulmonare. Este ideală recoltarea matinală, înainte de masă sau administrare de medicamente; aceasta dă cea mai înaltă rată de pozitivitate în diagnosticul tuberculozei pulmonare, chiar şi la pacienţii care tuşesc şi expectorează puţin;şansa evidenţierii BAAR creşte dacă se examinează 2-3 eşantioane de spută recoltate în interval de de ore;un produs patologic corespunzător constă dintr-un material recent eliminat din arborele bronşic, cu cantităţi minime de secreţii orale sau nazale. O calitate satisfăcătoare implică prezenţa unui material mucopurulent sau mucoid în cantitate de minim 1-3 ml. Transportul către laborator trebuie să se facă imediat după recoltare. [38], [50].. Variante de recoltare acceptate: a) sputa matinală, in primele 1-2 ore de la trezire procedeu de elecţie în staţionare sau la domiciliul bolnavului (recoltare supravegheată de personalul medical); b) sputa colectată în interval de de ore; c) sputa expectorată pe loc cu ocazia consultului medical. Sputa indusă Inhalarea de aerosoli calzi, salini-hipertoni (soluţie de NaCl 5-10%) irită căile respiratorii fiind în măsură să producă tuse şi expectorarea unui produs apos din profunzimea arborelui bronşic. Lavajul laringo-traheal (spălătura bronşică), aspiratul bronşic Au avantajul că în afară de produsul patologic primar este indusă eliminarea sputei în intervalul de timp următor.aspiratul bronşic precum şi lavajul bronho alveolar se pot efectua numai în unităţile care dispun de instrumentarul necesar (fibrobronhoscop) şi recipiente sterile.după manevra de lavaj prin bronhoscop; se va continua recoltarea sputei eliminate spontan în următoarele 24 ore. Lavajul gastric Este metoda recomandată atunci când nici una dintre metodele anterioare nu este posibilă. Sensibilitatea metodei este de până la 70% pentru copii sub 2 ani, scăzând până la 30-40% la copiii de până la 12 ani.recoltarea se face dimineaţa la trezire, după repaus alimentar de 8-10ore, înainte ca pacientul să mănânce.este indicată prelucrarea acestui tip de produs în primele 4 ore de la recoltare. CAPITOLUL III EXAMENUL MICROSCOPIC În 1982, Robert Koch izolează bacilul tuberculozei utilizind cultura pe ser uman solidificat şi folosind coloraţia cu albastru de metilen şi brun bismarck..tot în 1982, la scurtă vreme, Ziehl şi Neelsen (1883) au definitivat tehnica microscopică ( colorare la cald), ce le va purta numele. Dintre tehnicile de colorare la rece, se utilizează în mod curent, colorarea frotiurilor cu fluorocromi (auramină, rodamină) pentru microscopia în fluorescenţă. Principiul metodei se bazează pe conţinutul bogat în lipide al peretului bacterian (acizii micolici), care conferă acid-alcoolorezistenţa caracteristică micobacteriilor şi la care fac apel tehnicile de colorare

6 Efectuarea frotiurilor din spută Coloraţia Ziehl Neelsen implică mai multe etape:etalarea produsului,uscarea, Fixarea, Colorarea (fuxină fenicată), Decolorarea (acid-alcool 3%), Recolorarea (albastru de metil 0,3%). Examinarea frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen se face la microscopul optic folosind obiectivul cu imersie şi oculare 10x sau 7x. În nici un caz nu se vor utiliza ocularele de 5x! Coloraţia cu auramină rhodamină foloseşte soluţie 0,1% auramină 0,01% rhodamină; Frotiurile se examinează imediat după uscare la microscopul UV(ultraviolete) folosind oculare de 10 x şi obiective de 25x şi 45x.Frotiurile pozitive BAAR în fluorescenţă se recolorează Ziehl-Neelsen, pentru confirmarea rezultatelor. [93]; [137]. Examinarea la microscop. Tipurile de microscoape cel mai frecvent folosite pentru detectarea BAAR sunt microscopul optic cu câmp luminat şi microscopul cu lumină ultravioletă. BAAR au aproximativ 1-10 µm lungime şi apar ca bacili subţiri drepţi sau încurbaţi; În coloraţia Ziehl-Neelsen, BAAR apar ca bacili roşii, drepţi sau uşor încurbaţi, uneori cu structură granulară, izolaţi, în perechi sau grupaţi, evidenţiindu-se clar pe fondul albastru al frotiului. [50]; [93].(Figura 2 ). Figura 2. Aspectul microscopic al bacililor Koch în spută În coloraţia cu fluorocromi, dacă utilizăm auramină-rhodamină, bacilii apar coloraţi în galben strălucitor pe fondul întunecat al preparatului. Exprimarea rezultatului este redată în Tabelul 1. Ziehl-Neelsen 1000x Rezultat Mărirea în examinarea în fluorescenţă 250x 450x 0 BAAR NEGATIV BAAR 0 BAAR 0 BAAR 1-9 BAAR / 100 câmpuri Număr exact de BAAR / 100 câmpuri BAAR / 100 câmpuri POZITIV BAAR BAAR / câmp POZITIV BAAR 2+ Se împarte numărul BAAR observaţi la 10 Se împarte numărul BAAR observaţi la 4 > 10 BAAR / câmp POZITIV BAAR 3+ Tabel 1. Exprimarea semicantitativă a rezultatelor examenului microscopic Cauze de eroare în microscopie :prelevat de calitate necorespunzătoare, erori de identificare a lamelor; utilizarea fucsinei nefiltrată, decolorare insuficientă, examinarea superficială a frotiurilor. [93]; CAPITOLUL IV EXAMENUL PRIN CULTURĂ Generalităţi În diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, cultivarea reprezintă metoda de bază. Prin cultură se poate stabili viabilitatea microorganismelor,cultivarea permite atât izolarea, cât şi identificarea bacililor tuberculoşi, confirmând etiologia şi activitatea bolii. De asemenea, obţinerea coloniilor izolate permite testarea chimiosensibilităţii germenilor. Este o metodă foarte sensibilă, cu o limită de bacili/ml produs (faţă de în cazul frotiului direct), dar în acelaşi timp o metodă laborioasă şi complexă care nu poate fi corect şi eficient aplicată decât în laboratoare specializate.izolarea micobacteriilor din spută implică următoarele etape: 1) omogenizare / decontaminare, urmată sau nu de concentrarea germenilor prin centrifugare (pretratarea sputei); 2) însămânţarea pe medii de cultură, incubarea la termostat şi controlul creşterii; 3) notarea şi interpretarea rezultatelor. [17], [50], [93]

7 Metode de omogenizare / decontaminare. Se folosesc agenţi chimici (hidroxid de sodiu 4%) care omogenizează (fluidifică) sputa prin descompunerea structurilor sale organice (mucos, fibrină, detritus) şi concomitent distrug flora microbiană asociată din produs. Însămânţarea pe medii de cultură, incubarea la termostat, controlul creşterii Se utilizează mediul Löwenstein-Jensen, care este cea mai bună alegere deoarece: - asigură creşterea micobacteriilor; - se poate păstra în frigider câteva săptămâni; - inhibă germenii de contaminare prin verdele malahit conţinut; - este ieftin. Are dezavantajul că: - intervalul de timp necesar pentru a obţine o cultură pozitivă este de 4-8 săptămâni în cazul produselor paucibacilare, iar contaminarea conduce la pierderea culturii respective. Incubarea culturilor şi controlul creşterii bacililor. Se incubează culturile până la 2 luni de la însămânţare în termostat, la 36, C; primul control se efectuează la ridicarea tuburilor în poziţie verticală şi permite identificarea mediilor rapid şi integral contaminate (toate cele 3 tuburi); în continuare, culturile vor fi controlate săptămânal până la împlinirea a 8 săptămâni de incubare ( 60 de zile). [93]; [137]. Interpretarea şi notarea rezultatelor Rezultatele se exprimă semicantitativ conform unei gradaţii convenţionale.(tabel 2). CREŞTEREA MICOBACTERIILOR NOTAREA REZULTATULUI Absenţa coloniilor a NEGATIV Sub 30 colonii b POZITIV : se notează numărul exact de colonii colonii POZITIV : 1+ Peste 100 colonii izolate POZITIV : 2+ Colonii confluente nenumărabile POZITIV : 3+ 3 sau 2 tuburi contaminate şi 1 tub fără CONTAMINAT creştere bacteriană Tabel 2. Exprimarea semicantitativă a rezultatelor culturii pe mediul solid tip Löwenstein Jensen - Rezultatele culturilor se eliberează după identificarea preliminară a micobacteriilor din complexul M.tuberculosis. Coloniile de bacili tuberculoşi devin vizibile în cultura primară după cel puţin 3-4 săptămâni de la însămânţare; - culoarea coloniilor este crem gălbui-palid, rugoase, cu aspect conopidiform; în preparatul microscopic, frotiul realizat din cultură ( colorat Ziehl-Neelsen), permite, uneori, evidenţierea unei distribuţii în corzi-serpentine de diferite lungimi, bacilii izolaţi cu lungime de 3-4 µm fiind în număr mic.(figura 3). Figura 3. Aspectul macroscopic al culturii de M.tuberculosis pe mediul Löwenstein Jensen şi distribuţia în corzi-serpentine pe frotiu Cauze de eroare în examinarea prin cultură - cultura fals pozitivă apare atunci când identificarea culturii se face exclusiv pe baza caracterelor morfologice macroscopice ale coloniilor. Este obligatorie verificarea morfologiei microscopice a coloniilor, urmată de teste biochimice de identificare. - rezultatul fals pozitiv este consecinţa contaminării de laborator a unei culturi care în mod real ar trebui să fie negativă. - cultura fals negativă apare atunci când se prelucrează o porţiune de produs patologic cu densitate bacilară mică. în cazul centrifugilor fără sistem de răcire);); - 7 -

8 CAPITOLUL V TESTAREA CHIMIOSENSIBILITĂŢII TULPINILOR DE M.TUBERCULOSIS LA MEDICAMENTE - ANTIBIOGRAMA Aspecte generale. Rezistenţa tulpinilor este în general consecinţa tratamentului incorect prescris sau incorect administrat, putând duce la eşec terapeutic. Spectrul de sensibilitate al tulpinilor micobacteriene poate fi determinat cu ajutorul antibiogramei. Se descrie: Rezistenţa primară-se întâlneşte la pacienţii care nu au primit niciodată vreun tratament antituberculos şi care s-au infectat cu bacili chimiorezistenţi; Rezistenţa dobândită (secundară) -poate fi întâlnită la pacienţii care au primit cel puţin o lună tratament antituberculos; Rezistenţa combinată-reprezintă prevalenţa rezistenţei tulpinilor la toate cazurile de tuberculoză, indiferent dacă au avut sau nu tratament antituberculos anterior;.multidrog rezistenţa (MDR) se defineşte ca rezistenţă a tulpinilor cel puţin la INH şi RMP. Substanţele antituberculoase faţă de care se face testarea: Medicamente de linia I: Izoniazidă, Rifampicină, Etambutol, Streptomicină; Medicamentele de linia a II-a: amikacina, kanamicina, cicloserina, etionamida, protionamida, ofloxacina, ciprofloxacina, rifabutin, capreomicina, clofazimina, faţă de care este indicată testarea tulpinilor rezistente la medicamentele de linia I. Principiul antibiogramei: indiferent de metoda de testare folosită, se compară creşterea bacteriană de pe tuburile test (conţinând medicamente), cu cea de pe tuburile martor, după însămânţarea unui eşantion reprezentativ din populaţia bacilară de testat. Antibiograma directă Principiu: presupune însămânţarea pe mediile solide Löwenstein (7H10 agar), martor şi cu antibiotice incluse, a unui inocul direct de spută omogenizat / decontaminat (N acetilcisteină / NaOH) intens bacilifer ( cel puţin 10 BAAR / 100 câmpuri în microscopie). Metoda antibiogramei directe este tot mai puţin folosită în practică. [93]. Antibiograma indirectă. Inoculul bacterian se prepară din cultură. Are avantajul dimensionării corecte a inoculului bacterian, cu o rată de contaminare nulă (cu condiţia unei tehnici corecte), însă prelungeşte timpul de aflare a rezultatului cu 3-4 săptămâni. Metode standardizate acceptate: A. Folosind mediul solid Löwenstein Jensen: 1. Metoda proporţiilor (Canetti, Franţa); 2. Metoda concentraţiilor absolute (Meissner, Germania); 3. Metoda raportului rezistenţei (Mitchison, Anglia). [50]. B. Folosind mediul lichid: 1. Metoda Bactec 460 (Becton Dickinson) radiometrică; 2. Sistemul MGIT 960 Metode rapide, în curs de standardizare: -Testul luciferazei (Jacobs); LIPA- Rif TB (Line Probe Assay); - FastPlaque TB (Biotech, Ipswich, Suffolk, UK). [38]; [50] ;[93]. Citirea antibiogramelor, efectuate prin metoda indirectă se face la 21 zile. Se apreciază rezistenţa sau sensibilitatea în funcţie de prezenţa sau absenţa creşterii pe tuburile cu substanţe antituberculoase comparativ cu tuburile martor.comunicarea rezultatelor se face numai dacă pe tuburile martor sunt cel puţin 50 de colonii şi nu mai mult de 200 colonii (inocul sub sau supraetalonat), iar coloniile trebuie să fie distincte, numărabile. Interpretarea rezultatelor:tulpină sensibilă = absenţa creşterii sau mai puţin de 20 colonii pe tuburile cu substanţe antituberculoase. Se va nota SENSIBIL ; Tulpină rezistentă = creştere pe tubul cu substanţa antituberculoasă a peste 20 de colonii. Se va nota REZISTENT; Antibiograma contaminată = se constată dezvoltarea unor colonii microbiene de contaminare pe tuburile test sau / si pe tuburile martor. Se va nota antibiograma contaminată; Antibiograma pe mediu lichid. În 1977 Gardner Middlebrook a creat un sistem automat de detectare radiometrică pentru creşterea micobacteriilor în medii lichide, selective, ce a stat la baza dezvoltării tehnicilor de tip BACTEC. Folosirea antibioticelor în mediile de cultură, a stat la baza testării sensibilităţii tulpinilor de micobacterii prin această metodă rapidă de diagnostic. [50]. Metoda radiometrică (BACTEC). Mediul de cultură 7H12B(Middlebrook) conţine acid palmitic marcat cu 14 C radioactiv. Prin creştere, micobacteriile utilizează acid palmitic, iar CO 2 ul eliberat conţine C radioactiv.proporţia critică este de 1% pentru toate antibioticele testate. Nivelul de creştere ( G i ) reprezintă diferenţelor valorilor G i ale unui tub la două măsurători consecutive şi este, de fapt, un corespondent al numărarii coloniilor în tehnicile care utilizează medii solide. [119] [137]. Metoda colorimetrică (MB/BACT). Utilizează medii lichide de tip 7H9, folosind avantajele sistemului BACTEC, dar limitând dezavantajul acestuia (radioactivitatea), iar contorizarea se face colorimetric, prin viraj de la verde la galben, pe măsura acumulării de CO 2 produs de metabolismul - 8 -

9 micobacterian. Densitatea de bacterii la care senzorul (detectorul) fixat pe tuburile luminii, reacţionează este de circa germeni / ml. [93]. Atibiograma prin metode rapide. Testul luciferazei- constituie o metodă rapidă de detecţie a chimiorezisteţelor, pornind de la infectarea micobacteriilor prin bacteriofagi transportori ai genei luciferazei. Aceasta este o enzimă care, în prezenţa ATP ului, interacţionează cu luciferina, emiţând lumină. [50]; [67] ;[120]. METODE GENICE. 1. Reacţia lanţurilor de polimerază PCR (Polymerase Chain Reaction ) A fost introdusă în 1985 de Saiki & al, impunându-se ca o metodă rapidă şi eficientă de generare in vitro a numeroase copii ale unui segment specific de ADN.PCR presupune trei componente esenţiale: 1) un segment acid nucleic dublu-catenar specific; 2) amorsă (primer); 3) ADN polimerază termostabilă.standard, ciclul PCR include: - denaturarea la 95 0 C timp de 1-3 minute, cu desfacerea ADN-ului ţintă în cele două lanţuri monocatenare complementare; - ataşarea amorsei la C, la lanţurile monocatenare de ADN, 1-3 minute; - extensia ADN la 72 0 C, sub acţiunea Taq ADN polimerază. 2. Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphysm) Metoda care utilizează existenţa unor elemente ADN repetitive ca secvenţă de inserţie IS 6110, constituită din 1355 perechi de baze, prezentă exclusiv în genomul speciilor complexului M.tuberculosis. Metoda a fost tot mai folosită în investigaţia epidemiologică, în anchete de filiaţie, ajutând la înţelegerea modului de transmitere a bolii.[93] 3. Reacţia lanţurilor de polimerază polimorfismul conformaţiei lanţului monocatenar (PCR SSCP Polymerase Chain Reaction Single Strand Conformation Polymorphism) Este o metodă genică directă de determinare a chimiorezistenţelor, rapidă, care evită procedurile lungi de timp ale culturilor.pcr SSCP este un instrument de screening pentru rezistenţa la Rifampicină, marker pentru MDR TB. 4. LIPA ( Line Probe Assay)- tehnica pentru diagnosticul rapid al rifampicin-rezistenţei. Metodele genice de apreciere a chimiorezistenţei au ca principale avantaje : rapiditatea, automatizarea, reducerea riscurilor de laborator, iar ca dezavantaje: ostul ridicat, proceduri diferite în funcţie de antibiotic, gena ţintă sau mecanismul pot fi necunoscute, amplificări genice multiple în cazul mai multor gene ţintă. CAPITOLUL VI EPIDEMIOLOGIA TUBERCULOZEI Epidemiologia tuberculozei vizează studiul răspândirii bolii în populaţia umană şi animală, precum şi legătura dintre infecţia bacilară, colectivităţile umane şi condiţiile de mediu. Procesul epidemiologic cuprinde: sursa de contaminare (infecţie), căile şi mecanismele de transmitere a infecţiei, organismul sau terenul receptiv. Principalele surse de infecţie tuberculoasă sunt: bolnavii de tuberculoză pulmonară, bolnavii cu tuberculoze extrapulmonare active, animalele bolnave de tuberculoză (animale domestice -câini, pisici ), animale sălbatice sau animale de laborator. [50]. Căile şi mecanismele de transmitere. Transmiterea se poate face:- pe cale aeriană prin inhalarea unor particule microscopice de secreţii respiratorii, care conţin bacili (picături Pfluge); - prin contaminare directă ( exemplu bronhoscopia, îngrijirea bolnavilor); - transmiterea digestivă (este specifică infecţiei cu M.bovis);-transmiterea cutanată (este descrisă la cei care manipulează produse patologice provenite de la bolnavii de tuberculoză : anatomopatologi, laboranţi, necropsieri). Receptivitatea. Imunitatea antituberculoasă (rezistenţa naturală) este condiţionată de factori genetici, dar şi de tipul şi magnitudinea infecţiei. Astfel, imunitatea cuprinde o componentă de imunitate naturală şi o parte de imunitate de suprainfecţie determinată de prezenţa germenilor vii în organism şi mediată de imunitatea de tip celular întârziat Imunitatea în tuberculoză este relativă iar imunodeficienţele induse de diverse cauze ( ex. infecţia HIV/SIDA) favorizează evoluţia infecţiei latente către tuberculoza activă clinic manifestată. [17];[52] Infecţia şi boala tuberculoasă - 9 -

10 I. INFECŢIA Reprezintă starea în care un organism găzduieşte bacilii tuberculoşi viabili, fără să manifeste semne sau simptome de boală, astfel constituind infecţia latentă cu BK. Majoritatea gazdelor imunocompetente, infectate cu M.tuberculosis, se prezintă în acest status de-a lungul vieţii. [17];[52]. II. BOALA Reprezintă starea de invazie progresivă activă a M.tuberculosis într-unul sau mai multe organe, generând semne şi simptome generale şi specifice de organ. Factorii de risc. Apariţia tuberculozei poate fi condiţionată de mai mulţi factori: Caracterul infecţiei - Cantitatea de germeni eliminaţi în mediul ambiant (densitatea baciliferilor) / km 2 ;calitatea surselor surse cu BK pozitiv microscopic sau paucibacilare;- continuitatea şi durata eliminării lor;- repetarea contactului infectant [50]. Factorii de mediu intervin prin: evoluţie naturală a tuberculozei; evenimente particulare ( epidemiologice, sociale, naturale); programe de supraveghere; susţinere financiară. Condiţii socio-economice defavorabile. Situaţii predispozante Sunt afectate: Persoanele cu venituri reduse, alimentaţie deficitară, categorii de persoane susceptibile (alcoolici, drogaţi, şomeri), imigranţii, persoanele din azilurile şi spitalele de boli psihice cronice, lucrătorii din domeniul medical, din mediul tuberculos şi personalul medical din serviciile de bronhologie, ATI, camere de aerosoli, laboratoare de microbiologie, secţii M.D.R;.grupele de vârstă copiii mici (0-4 ani) şi adulţii după 50 de ani; factori genetici-. gemenii monozigoţi;. Statusul marital bărbaţii divorţaţi; Rasa - populaţiile de rasă neagră; Factori intrinseci -bolnavii cu leziuni vechi de tuberculoză;.sarcina.. [173]. De asemenea, se asociază frecvent cu tuberculoza: Diabetul zaharat, Ulcerul gastro-duodenal, Ciroza hepatică, Boli maligne,.infecţii ce afectează imunitatea ( HIV),Silicoza şi alte pnumoconioze,.stări patologice- corticoterapie prelungită,.transplantul de organ, risc mare prin depresie imunitară.,boli psihice grave, cronice risc de circa 10 ori (după unii autori).fumatul- contribuie la reactivarea tuberculozei. La fumători creşte substanţial concentraţia extracelulară de feritină, în lobii superiori, relevată de lavajul bronhoalveolar.[50];[52]. CAPITOLUL VII. TUBERCULOZA ÎN LUME ŞI ÎN ROMÂNIA Tuberculoza în lume Infecţia este repartizată inegal în lume, atrăgând după sine diferenţe mari ale incidenţei bolii (de la 8-12 cazuri 0 / 0000 până la cazuri 0 / 0000 locuitori). Estimările actuale sugerează că o treime din populaţia globului este infectată cu M.tuberculosis, fiind în pericol să dezvolte tuberculoză la un moment dat pe parcursul vieţii, constituind astfel un rezervor de infecţie care poate genera milioane de cazuri noi de tuberculoză. La nivel mondial s-au estimat aproximativ 9,27 milioane de cazuri noi de TB în 2007, o creştere faţă de 2006 ( 9,24 milioane), 8,3 milioane în 2000 şi 6,6 milioane în [210].. Distribuţia tuberculozei pe regiuni OMS Pe baza datelor existente în anul 2007, s-a arătat că numărul cel mai mare de cazuri de tuberculoză înregistrate pe an există în Sud-Estul Asiei ( aproape jumătate din totalul cazurilor de tuberculoză din lume : 9,27 milioane de cazuri în 2007).La o prevalenţă a TB de 13,7 milioane de cazuri,la nivel mondial, cinci ţări revendică cele mai multe cazuri: India 2 milioane, China 1,3 milioane, Indonezia , Nigeria 460,000 şi Africa de Sud În anul 2008, incidenţa cea mai ridicată a tuberculozei au prezentat-o populaţiile din următoarele regiuni OMS : Africa, / 0000 şi Asia de Sud-Est 183% 000. Cele mai scăzute rate de incidenţă s-au înregistrat în regiunea Americilor şi Europa ( / 0000 )( Figura 4). La nivel global incidenţa a cunoscut o scădere de la 142% 000 în anul 2004 la 139% 000 în 2007.[210]. În anul ,5 milioane de cazuri de tuberculoză au fost semnalate in cadrul programului DOTS, dintre acestea 47% au prezentat frotiu pozitiv al sputei la depistare.( un procent apreciabil al surselor de contaminare).rata de confirmare a cazurilor noi,prin examen microscopic a fost de 63%, fiind variabilă în diferitele regiuni supravegheate de OMS

11 % Americile Mediterana de Est 115 Pacificul de Vest 48 Europa 183 Asia de Sud- Est 351 Africa Figura 4. Incidenţa tuberculozei pe Regiuni OMS, În anul 2007, 1,3 milioane de decese au survenit la cazurile noi HIV ( 20% 000 ) şi decese la cazurile HIV+, echivalent a 33% din cazurile noi HIV plus tuberculoză şi 23% dintre cele două milioane de decese prin HIV/SIDA din 2007 [210].Creşterea incidenţei tuberculozei din regiunea Europa s-a datorat aproape în exclusivitate creşterii riscului de îmbolnăvire al populaţiilor din ţările fostului imperiu sovietic, adăugându-se la acestea şi România.. În anul 2006 un nivel al incidenţei ridicat, de peste / 000, s-a înregistrat în Europa în cinci ţări : Kazahstan (282 0 / 0000 ), Moldova (159.6% 000 ) Kirkizstan (126 0 / 0000 ), România (123 0 / 0000 ) şi Federaţia Rusă (106.3 % 000 ). În ceea ce priveşte nivelul endemiei în zona balcanică, o situaţie a anului 2006 este ilustrată în Figura 14, de unde se observă că România conduce detaşat cu 123,6 0 / 000 (Figura 5). Slovenia Kosovo Turcia România Serbia Macedonia Croaia Bulgaria Albania 10,7 27, ,8 24,9 15, ,6 % Figura 5. Incidenţa tuberculozei în Zona Balcanică, 2006 Tuberculoza este a 5-a cauză de deces în lume printr-o maladie contagioasă şi a doua cauza dedeces dată de un singur agent infecţios. Multidrog rezistenţa în lume Tratamentul inadecvat sau utilizarea incorectă a antibioticelor anti-tuberculoase reprezintă principalele cauze ale MDR-TB. Creşterea MDR, în special a formelor de boală frecvent incurabile, se întâlneşte în câteva zone ale lumii între care : Rusia şi Ţările Baltice pe continentul european, Republica Dominicană şi Argentina pe cel sud-american, Coasta de Fildeş în Africa şi unele ţări din Asia, precum : India şi Coreea. În anul 2007 au fost estimate de cazuri de TB-MDR, 85% provenind din 27 ţări, dintre care 15 sunt în Regiunea Europa. Pe primele locuri: India, China, Federaţia Rusă, Africa de Sud şi Bangladesh.[210]. De asemenea la sfârşitul anului 2008, 55 de ţări au raportat cel puţin un caz de tuberculoză cu rezistenţă extinsă ( TB-XDR ).[53]. În Europa de Est se înregistrează peste de cazuri/ an dintre acestea fiind MDR-TB, realizându-se o rată de zece ori mai mare decât în Europa Occidentală. Câteva din concluziile raportului OMS -2009) sunt semnificative Nivelul incidenţei mondiale a TB a cunoscut o scădere din 2004; Nivelul de depistare a cazurilor a fost de 63% în 2007; Succesul terapeutic s-a înregistrat în procent de 85% în 2006 Tuberculoza în România Evoluţia endemiei de tuberculoză. Caracteristici

12 Deteriorarea nivelului de trai al populaţiei, survenită după anul 1980 şi care continuă într-o măsură şi în prezent, a contribuit la instalarea unei tendinţe de creştere continuă a incidenţei tuberculozei după anul 1985, când incidenţa a fost de 55,8 cazuri noi la % 000 de locuitori, atingând valoarea de 142,2 0 / 0000 în 2002, reprezentând cea mai ridicată valoare din Europa (Figura 6). [50];[53]. % Figura 6. Incidenţa tuberculozei în România Comparativ cu ţările Uniunii Europene (UE), în ţara noastră încă se înregistrează cea mai crescută incidenţă ( 99.7 % 000 în anul 2009), deşi în perioada incidenţa globală a scăzut în România cu 29.8%, cu o rată anuală de scădere de 4.2%. Datorită acestei evoluţii ţara noastră a pierdut locul trei, pe care îl deţinea în perioada , ca nivel al incidenţei printre ţările Regiunii Europa a OMS, situându-se în 2007 pe locul al VII-lea după Kazakhstan, Republica Moldova, Federaţia Rusă, Georgia, Kirghistan şi Tajikistan [53].. În privinţă incidenţei tuberculozei pe medii de provenienţă, studiile au arătat că în 1960 incidenţa tuberculozei a fost de 429,6 0 / 000 la oraşe şi 296,4 0 / 000 la sate, după un interval de 10 ani raportul a suferit o schimbare şi, de atunci, incidenţa bolii este ceva mai mare în zona rurală. Astfel, în 2008 incidenţa tuberculozei a fost mai mare în mediul rural ( 124,8% 000 ) faţă de mediul urban ( 74,6% 000 ). [50];[53].După cum este cunoscut, riscul de îmbolnăvire este mai mare la bărbaţi decât la femei. În anul 1980, incidenţa la bărbaţi era de 74,3 0 / 000 şi la femei de 35,1 0 / 000, deci un raport de 2:1, acesta crescând progresiv ajungând în 2002 la un raport de 2,24:1). În perioada incidenţa tuberculozei a crescut de 2,1 ori la bărbaţi şi de 2,3 ori la femei [50];[53]. După 1985 (7,9% 000 ), pe fondul creşterii cazurilor sursă s-a produs o creştere constantă a numărului de îmbolnăviri în rândul populaţiei infantile, atingând un maxim în anul 2002 de 48,6 0 / 000 ca apoi, scăderea generală a incidenţei, să ducă la reducerea ratei TB la copii, în 2008 la 28% 000. (Figura 7) [53];[120]. % Figura 7. Incidenţa tuberculozei la copii 0-14 ani În structura pe localizări, în ultimii 25 de ani, localizările pulmonare au crescut de la 80% în 1985 la 87,1 % în 2001 fiind 86 % în 2008, iar cele pleurale s-au menţinut între 9-13% din total. O scădere marcată o reprezintă localizările extrarespiratorii, a căror pondere s-a redus de la 6,1% în 1985 la 4,2%.în ]. O componentă specială a incidenţei şi prevalenţei o constituie numărul de bolnavi eliminatori de bacili care asigură transmiterea infecţiei în rândul populaţiei neinfectate. Incidenţa baciliferilor a crescut de la 35,7 0 / 0000 în 1972 la 73,1 0 / 0000 în anul 2002 fiind de 76% 000 în 2007 [50];[53]. În anul 2003 au fost înregistrate cazuri de tuberculoză pulmonară, dintre care au fost confirmate , reprezentând 63,5% din totalul îmbolnăvirilor şi neconfirmate 7730 cazuri, reprezentând 36,5%.Procentul cazurilor noi pulmonare confirmate microscopic a fost de 50,4%, iar

13 cele confirmate numai prin cultură de 13,1%. În anul 2006 s-a înregistrat, la cazurile noi pulmonare, un procent de 58.9 % de confirmări prin microscopie ( sub recomandarea OMS de 65%), iar prin cultură 68.4 %. (Figura 8) [53]. Nr (50.3%) ( 13.1%) ( 58.9%) 1594 ( 9.5%) 0 Pulmonari M+ C+ M- Pulmonari M+ C+ M- Figura 8. Confirmarea bacteriologică a cazurilor noi pulmonare 2003, În anul 2008 din totalul pacienţilor luaţi în evidenţă, au fost confirmaţi bacteriologic 73% dintre bolnavii noi şi 89% dintre cei cu recidivă. În Ancheta Naţională privind Chimiorezistenţa M. Tuberculosis desfăşurată în chimiorezistenţa iniţială pentru TB-MDR a fost de 2.9% în rândul cazurilor noi şi de 11% la cazurile tratate anterior. Analiza bazei de date de la Unitatea Centrală de Coordonare a PNCT a scos în evidenţă faptul că, în comparaţie cu rezultatele anchetei , s-a înregistrat în anul 2008 un procent mai crescut de MDR printre cazurile noi (4%) şi printre cele cu recidivă (12,5%). Ca şi în alte ţări, există deosebiri, uneori apreciabile, privind riscul de îmbolnăvire de tuberculoză în diferite teritorii administrative. În România, valorile incidenţei pe judeţe prezintă o mare amplitudine (diferenţa dintre valoarea maximă şi cea minimă) cuprinsă în 2008 între 160,2 0 / 000 0în judeţul Dolj şi 31,7 0 / 0000 în judeţul Harghita. Raportat la cele 8 regiuni de dezvoltare ale ţării incidenţa medie a fost de 99,7 0 / 0000 în anul 2009, cu variaţii cuprinse între 129,3 0 / 0000 ( regiunea Sud-Vest) şi 67% 000 (regiunea Centru). Evaluarea rezultatelor tratamentului cazurilor noi pulmonare notificate în 2003 a evidenţiat o rata de succes de 79,5% din cazurile confirmate microscopic şi 82% din cele confirmate prin cultură. Aplicarea măsurilor PNCT, cu strategia DOTS extinsă la nivel naţional din 2005, au condus la d la îmbunătăţirea rezultatelor tratamentului, cu rata de succes la cazurile noi de 83,9% în 2006, pentru cazurile bk + şi de 85,5% pentru cele confirmate prin culturi..analizând evoluţia indicatorului mortalitate prin tuberculoză după al doilea război mondial, se constată că prin introducerea isoniazidei în tratament (1950) s-a produs o scădere apreciabilă a riscului de deces prin tuberculoză, de la 180,2 0 / 0000 în 1950 la 44,9 0 / 0000 în Introducerea după anul 1970 a Rifampicinei şi Etambutolului a imprimat o nouă reducere a ratei de deces, care a coborât până la 3,7 0 / 0000 în anul 1980, după care valorile acesteia au cunoscut o creştere in perioada ,la 10,7% 000 decese, pentru ca în ultimii ani valoarea ratei să fie în jurul a 7,% 000 (Figura 9) [ 53 ]. % Figura 9. Mortalitatea prin tuberculoză Riscul de deces prin tuberculoză a fost de 6 ori mai mare la bărbaţi decât la femei în 2002, acesta scăzând în anul 2008 când s-a înregistrat o rată de deces de 10,2 0 / 0000 la bărbaţi şi respectiv 2,3 0 / 0000 la femei

14 CAPITOLUL VIII. PARTEA SPECIALĂ MOTIVAŢIA ALEGERII TEMEI Nivelul actual al endemiei tuberculozei din România, situează ţata noastră, prin cele aproximativ de cazuri noi de tuberculoză înregistrate anual, pe locul al VII-lea între ţarile din Regiunea Europa a O.M.S. şi pe primul loc în Uniunea Europeană (România stat membru al UE din 2007). Deşi se poate vorbi de o tendinţă de stopare a creşterii incidenţei globale începând cu anul 2003, urmare a aplicării recomandărilor P.N.C.T., boala ca fenomen biologic continuă să reprezinte o povară din punct de vedere al sănătaţii publice, al costurilor sociale şi materiale poate chiar un stigmat în conştiinţa românilor. Din analiza datelor privind confirmarea bacteriologică a cazurilor cu localizare pulmonară declarate, se remarcă menţinerea unor valori scăzute pentru cazurile noi şi recidive atât la nivelul întregii ţări cât şi la nivel teritorial. Cu toate că România este ţara cu una dintre cele mai bine organizate reţele de laboratoare de diagnostic al tuberculozei din Europa de Est, se poate afirma că rezutatele investigaţei micobacteriologice, pentru confirmarea etiologică, sunt încă insuficiente. Trebuie acceptat că tuberculoza, cu multiplele ei forme clinico-radiologice şi evolutive de manifestare, pune uneori reale deificultăţi în identificarea agentului cauzal (M.tuberculosis) cu toate progresele în tehnici de laborator din ultimii ani. La susţinerea diagnosticului de tuberculoză pulmonară contribuie anamneza, examenul clinic, examenul radiologic pulmonar dar esenţial este examenul bacteriologic al sputei. În activitatea practică de rutină sunt întâlnite nu puţine cazuri la care diagnosticul de tuberculoză cu localizare pulmonară nu este uşor de obţinut. Este adevărat că, pentru majoritatea bolnaviilor, diagnosticul poate fi stabilit prin examenul sputei (microscopie şi cultura) care evidenţiază agentul etiologic, însă confirmările bacteriologice variază în ultimii ani între 50-70%. Rămâne un procent important de cazuri noi de tuberculoză neconfirmate bacteriologic, la care obţiunea instituirii sau nu a unui tratament antibacilar ridică destule dileme. Există, de asemenea, un număr important de bolnavi la care nu se respectă recomandările O.M.S. privind numărul de examene bacteriologice ale sputei, pentru susţinerea diagnosticului de tuberculoză pulmonară (trei examene de spută prin microscopie şi cultură, un examen însemnând examinarea a două-trei produse). Acest aspect se întâlneşte în special în cazul tuberculozei microscopic negative (paucibacilare), unde diagnosticul este susţinut, în prima etapă, pe baza datelor clinico-anamnestice şi a modificărilor radiologice pulmonare, care se ştie că au o sensibilitate înaltă dar specificitate joasă. De asemenea, se constată o redusă preocupare pentru indicarea tehnicilor de recoltare şi provocare a eşantioanelor valide de spută (examenul edoscopic bronşic cu lavaj şi apiraţie, sputa indusă prin aerosolizare) la pacienţii la care nu se poate recolta sputa datorită eliminării spontane dificile sau absenţa secreţiilor. Studiile din literatura de specialitate (Anderson şi col.; Daley şi col.) au arătat că utilizarea sputei induse şi bronhoscopiei în diagnosticul pacienţiilor cu suspiciunea de tuberculoză, dar examen microscopic negativ, au contribuit la înbunătaţirea procentului de confirmare bacteriologică cu 12% pâna la 19%. Se poate invoca pentru aceste situaţii existenţa unor metode de diagnostic rapid al tuberculozei pulmonare, cea mai utilizată fiind reacţia în lanţ a polimerazei (PCR). Însă aceste metode genetice au costuri mari, necesită laboratoare specializate, sunt investigaţii cu accesibilitate limitată în ţara noastră şi de accea nu sunt şi nici nu trebuie să constituie o rutină pentru un diagnostic de tuberculoză pulmonară. Până în momentul actual niciunul dintre testele bazate pe răspunsul imun (IDR-la PPD, testele de evaluarea a interferonului gamma eliberat IFNγ release assays IGRA din sângele periferic, dozarea anticorpilor circulanţi) nu poate înlocui testele convenţionale (examenul microscopic şi cultura) în diagnosticul tuberculozei active. Tuberculoza neconfirmată bacteriologic sau eliminatoare de puţini bacili (paucibacilară) este acceptată în definiţiile O.M.S., dar evaluarea cazului

15 sub tratamentul instituit, pe alte criterii de diagnostic (epidemiologice, biologice clinico-radiologice), este lipsită de Gold standardul diagnostic, confirmarea etiologică. Ţinând cont de aceste realităţi, tema acestei lucrări de doctorat Consideraţii Clinice, Bacteriologice şi Epidemiologice în Tuberculoza Paucibacilară am considerat-o importantă şi actuală, subliniind importanţa capitală a confirmării bacteriologice, cât mai precoce, a tuberculozei pulmonare, condiţie esenţială pentru iniţierea tratamentului şi implicit pentru reducerea transmisiei bolii în colectivitate. Abordarea unor aspecte legate de tuberculoza negativă (clinice, bacteriologice, radiologice, evolutive, risc epidemiologic) le-am considerat necesare şi din dorinţa ca rezultatele obţinute, analiza unor cauze reale (motivaţii) să fie utile în găsirea unor metode de optimizare a diagnosticului. În ţara noastră, după cum am specificat, metodele moderne de confirmare etiologică a bolii nu au putut fi introduse în practica de rutina datorită costurilor ridicate şi complexităţii procedurilor şi nu în ultimul rând insuficienţei finanţări a sistemului de sănătate. Am dorit, de asemenea, să constat aportul tehnicilor de provocare a tusei şi expectoraţiei (aerosolizare) şi al tehnicilor de recoltare a sputei prin fibrobronhoscopie (aspiratul dupa lavaj bronşic) la creşterea procentului de confirmare bacteriologică la pacienţii cu tuberculoză pulmonară. CAPITOLUL IX. OBIECTIVELE LUCRĂRII 1. Evaluarea datelor referitoare la cazurile declarate cu tuberculoză pulmonară neconfirmată bacteriologic din Lotul Retrospectiv studiat. 2. Particularităţi ale investigaţiei bacteriologică, radiologică şi biologică intâlnite la pacienţii din cele două loturi cercetate. 3. Monitorizarea şi evaluarea conform normelor tehnice a cazurilor, evoluţia focarului de tuberculoză negativă. 4. Aprecierea rezultatelor tehnicilor de provocare a tusei şi expectoraţiei (sputa indusă prin aerosolizare cu soluţie salină 5%),completate cu tehnici de recoltare a sputei (lavaj cu aspiraţie bronşică prin examen fibrobronhoscopic), aplicate bolnavilor din Lotul Prospectiv. CAPITOLUL X. MATERIAL ŞI METODĂ Tipul studiului Lucrarea face referire la un studiu retrospectiv de tip desciptiv observaţional, efectuat pe o perioadă de trei ani ( ) pe bolnavii internaţi, cu diagnosticul de tuberculoză pulmonară neconfirmată bacteriologic (cod: A160), în Spitalul de Pneumoftiziologie Constantin Anastasatu din localitatea Mihăeşti judeţul Vâlcea. Al doilea studiu al lucrării cumprinde un lot de bolnavi internaţi in acelaşi spital (studiul prospectiv) în perioada cu diagnosticul de tuberculoză pulmonară la care pe lângă aplicarea metodelor standard de recoltare şi prelucrare a produsului patologic (sputa) s-au efectuat tehnici de provocare a tusei şi expectoraţiei (aerosolizare) şi tehnici de recoltare a sputei prin examen endoscopic bronşic (lavaj şi aspirat bronşic) în vederea aprecierii aportului acestor metode la creşterea gradului de confirmare etiologică a bolii. STUDIUL RETROSPECTIV Cercetarea am realizat-o în cadrul Spitalului de Pneumoftiziologie Constantin Anastasatu din localitatea Mihăeşti judeţul Vâlcea într-o perioadă de trei ani pe bolnavii internaţi cu diagnosticul de tuberculoză pulmonară fără confirmare bacteriologică (examene microscopice şi prin culturi negative), care au fost declaraţi şi la care s-a administrat tratament tuberculostatic. Studiul a cuprins un număr de 108 bolnavi cu domiciliul stabil în aria judeţului Vâlcea, care au fost internaţi în perioada ei reprezentând 18% din numărul de bolnavi care au fost internaţi în Spitalul Mihăeşti în perioada precizată diagnosticaţi cu tuberculoză pulmonară activă. Pentru fiecare bolnav înscris în lotul de cercetare s-a completat o fişă cu datele extrase din foile de observaţie clinică şi celelalte structuri de documentare descrise, iar rezutatele obţinute au fost prezentate tabelar şi grafic. Datele cuprinse în fişa de observaţie a fiecărui caz au fost:

16 - nume şi prenume; numărul foii de observaţie; sex; vârstă, ocupaţia;nivelul de instruire (şcolarizare);simptome şi semne clinice la internare;durata simptomelor;boli asociate;consum de toxice (fumat, alcool);contact cu sursa TB;examen radiologic pulmonar la internare şi în dinamică;examen tomografic computerizat pulmonar;examene sputa pentru bk (număr examene M şi C) la internare şi în dinamică;tehnici de provocare a sputei (aerosolizare); tehnici de recoltare a sputei (aspirat bronşic); examenul sanguin (număr leucocite, hemoglobina, VSH,), testele hepatice, renale, glicemia;testul HIV; IDR; tratamentul antibiotic nespecific-anterior terapiei antituberculoase;tratamentul tuberculostatic regim standard;regim individualizat;reacţii adverse la tratament;evaluarea tratamentelor; Prelucrarea statistică a datelor rezultate din analiza documentelor medicale înregistrate, tehnicilor cu viză diagnostică efectuate bolnavilor din Lotul Prospectiv, din evaluarea tratamentului aplicat şi investigarea focarelor de tuberculoză, s-a efectuat cu ajutorul unui program computerizat, datele fiind, de asemenea, prezentate tabelar şi grafic pentru o mai bună înţelegere a lor. Cele două loturi au fost testate din punctul de vedere al echivalenţei pe parametri: vârsta, sexul, mediul de viaţă, ocupaţia, aspecte clinice, bacteriologice, biologice, radiologice în momentul internării şi la externare, apoi s-a făcut o analiză descriptivă a modului în care diferiţi parametri ( de investigaţie, terapie şi evoluţie) au influenţat rezultatele de etapă şi finale ale bolnavilor. Prelucrarea statistică s-a făcut cu programul EPI-INFO Pentru a testa semnificaţia diferenţelor statistice s-au folosit următoarele teste: -χ2 ( chi pătrat); -χ2 corelat cu indicele Yates, pentru o valoare exactă a,,p-ului; -valoarea pragului de încredere : p< 0,05, a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic. -ANOVA; -Kruskal-Wallis, care este varianta ANOVA pentru mărimi neparametrice. Variabilele cantitative au fost prezentate sub forma media ± deviaţia standard. Variabilele calitative au fost analizate folosind testul Fisher. In cazul existenţei a 3 sau mai multe grupuri (coloane în tabelul de contingenţă) s-a folosit testul χ 2. CAPITOLUL XI. REZULTATE Rezultatele Studiului Retrospectiv Din lotul de studiu de 108 bolnavi, 29 au fost femei (27%) şi 79 bărbaţi (73%) cu vârste cuprinse între 17 şi 76 de ani, 48% dintre femei având vârsta între 25 şi 44 de ani şi 72% dintre bărbaţi cu vârsta între 40 şi 69 de ani. Vârsta medie a pacienţiilor a fost de 46,48 ani la femei şi 50,59 ani la bărbaţi.referitor la mediul de viaţă 70 de bolnavi (64,8%) provin din mediul rural iar 38 de bolnavi (35,1%) locuiesc în mediul urban. S-a consemnat din foile de observaţie clinică nivelul de instruire (şcolarizare) al bolnaviilor şi s-a constatat că 15% aveau sub patru clase, 45% aveau opt clase, 31% aveau liceeul, 7% şcoala profesională şi doar 2% aveau studii superioare. În ceea ce priveşte ocupaţia la depistare, 44% dintre bolnavi erau pensionari iar 25% dintre femei şi 25% dintre bărbaţi erau făra ocupaţie. În lotul studiat 45% dintre femei erau fumătoare şi 25% consumatoare de alcool, faţă de bărbaţi care în proporţie de 93% erau fumători şi 82% consumatori zilnic de etanol. Analizând simptomatologia prezentă la pacienţii din lotul cercetat la internare,se poate observa că aceasta a fost polimorfă fiind dominată de tuse cu sau fără expectoraţie în 85% din cazuri. De asemenea s-au consemnat:hemoptizie(20%), febră(>38.5 C, sau subfebrilitate) (10%), inapetenţă cu scădere ponderală (48%),transpiraţii nocturne(28%), dureri toracice (29%),dispnee la efort (19%), astenie (21%).Din anamneza consemnată în foile de observaţie s-a reţinut că 70% din pacienţii lotului studiat au raportat o durată a simptomelor până la internare între una şi patru săptămâni. Cele mai frecvente boli asociate tuberculozei au fost:ulcerul gastric şi duodenal,hepatita cronică,diabetul zaharat,bolile neuro-psihice,insuficienţa renală şi etilismul cronic, acestea fiind întâlnite la 32% din pacienţii lotului cercetat. Tabloul radiologic a fost polimorf cu leziuni de tip infiltrativ (cele mai frecvente), limitate la un segment/lob pulmonar s-au prezente bilateral în lobii pulmonari superiori, cu leziuni cazeos-cavitare cu sau fără afectare concomitentă a pleurei s-au leziuni miliare. Aspectele de tip infiltrativ-nodular au fost întâlinite în 74% dintre cazuri, leziunile cazeos-cavitare în 23% dintre cazuri, miliara în 3% iar pleurezia asociată modificărilor pulmonare s-a întâlnit în 4% din cazuri