CRITERII SEMI-CANTITATIVE ŞI CANTITATIVE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ MAMARĂ

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GRIGORE T. POPA IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ CRITERII SEMI-CANTITATIVE ŞI CANTITATIVE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ MAMARĂ REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC PROF. DR. IRINA-DRAGA CĂRUNTU DOCTORAND DANIELA CIOACĂ (MIHALACHE) 2013

2 CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT CAPITOLUL 1 GLANDA MAMARĂ NORMALĂ ELEMENTE STRUCTURALE ȘI FUNCȚIONALE CITOLOGIA GLANDEI MAMARE NORMALE STRUCTURA HISTOLOGICĂ A GLANDEI MAMARE ELEMENTE DE MORFOGENEZĂ ȘI HISTOFIZIOLOGIE CELULELE STEM ÎN DEZVOLTAREA NORMALĂ ŞI CARCINOGENEZA GLANDEI MAMARE 8 CAPITOLUL 2 TRĂSĂTURI CITO-HISTOLOGICE ALE CANCERULUI MAMAR CLASIFICAREA CARCINOAMELOR MAMARE ASPECTE CITOLOGICE ALE CARCINOAMELOR MAMARE ASPECTE HISTOLOGICE ALE CARCINOAMELOR MAMARE 18 CAPITOLUL 3 TEHNICI DE LUCRU CHIRURGICALE UTILIZATE PENTRU DIAGNOSTICUL 26 CITOLOGIC ȘI HISTOLOGIC AL CANCERULUI MAMAR 3.1. EXAMENUL CITOLOGIC. PUNCȚIA ASPIRATIVĂ CU AC FIN (FNA) EXAMENUL HISTOLOGIC TERMINOLOGIA UTILIZATĂ ÎN DIAGNOSTICUL CITOLOGIC ȘI HISTOLOGIC AL PUNCȚIEI ASPIRATIVE ȘI PUNCȚIEI BIOPSIE MAMARE (DIAGNOSTIC NON- 31 OPERATIV) CAPITOLUL 4 MOTIVAŢIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL 35 CAPITOLUL 5 CRITERII DE GRADARE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ INTRODUCERE MATERIAL ȘI METODĂ LOTUL DE STUDIU. ORGANIZAREA BAZEI DE DATE METODOLOGIA DE LUCRU EXAMENUL CITOLOGIC GRADAREA CITOLOGICĂ EXAMENUL HISTOPATOLOGIC ANALIZA STATISTICĂ REZULTATE EVALUAREA GRADING-ULUI CITOLOGIC EVALUAREA GRADING-ULUI HISTOLOGIC CORELAȚII GRADING CITOLOGIC VERSUS GRADING HISTOLOGIC DISCUȚII EVALUAREA IMPORTANȚEI GRADINGULUI CITOLOGIC GRADING CITOLOGIC VERSUS GRADING HISTOPATOLOGIC 65 CAPITOLUL 6 CRITERII DE GRADARE ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ INTRODUCERE MATERIAL ŞI METODǍ LOTUL DE STUDIU. ORGANIZAREA BAZEI DE DATE METODOLOGIA DE LUCRU EXAMENUL HISTOPATOLOGIC SISTEMUL DE GRADARE NOTTINGHAM STADIALIZAREA PTMN REZULTATE PROFILUL HISTOPATOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC 71 i

3 GRAD DE DIFERENŢIERE ŞI SCOR NOTTINGHAM CARACTERISTICILE CLINICO-PATOLOGICE - SINOPSIS DISCUŢII VALOAREA SCORULUI NOTTINGHAM VALOAREA PROFILULUI IMUNOHISTOCHIMIC 86 CAPITOLUL 7 CRITERII OPERAŢIONALE ÎN EVALUAREA MORFOMETRICĂ A LEZIUNILOR 91 GLANDEI MAMARE CONCEPERE ŞI DEZVOLTARE DE TEHNICĂ 7.1. INTRODUCERE CRITERII MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ MATERIAL ŞI METODĂ REZULTATE ALGORITM DE EVALUARE PRIN MORFOMETRIE COMPUTERIZATA CONCEPEREA ŞI TESTAREA MACROULUI MAMAR_CIT TEXTUL SURSA AL MACROULUI MAMAR_CIT TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA BENIGNĂ ŞI CITOLOGIA MALIGNĂ TRASATURI MORFOMETRICE IN CITOLOGIA MALIGNA VERSUS GRADING CITOLOGIC TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA MALIGNĂ VERSUS GRADING HISTOLOGIC DISCUŢII REPERE FUNDAMENTALE PENTRU APLICAŢIILE MORFOMETRIEI ÎN CITOLOGIA MAMARĂ PARAMETRI MORFOMETRICI FIABILI CRITERII MORFOMETRICE ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ MATERIAL ŞI METODĂ REZULTATE ALGORITM DE EVALUARE PRIN MORFOMETRIE COMPUTERIZATĂ CONCEPEREA ŞI TESTAREA MACROULUI MAMAR_HP TEXTUL SURSĂ AL MACROULUI MAMAR_HP TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CARCINOM DUCTAL INVAZIV TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CARCINOMUL NEDIFERENŢIAT TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CARCINOMUL DUCTAL INVAZIV VERSUS CARCINOM NEDIFERENŢIAT DISCUŢII REPERE FUNDAMENTALE PENTRU APLICAŢIILE MORFOMETRIEI ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ PARAMETRI MORFOMETRICI FIABILI MORFOMETRIA COMPUTERIZATĂ VALOAREA METODEI DEZVOLTAREA KNOW-HOW -ULUI ÎN ANALIZA DE IMAGINE ASISTATĂ DE CALCULATOR CONTRIBUŢII PERSONALE 125 CAPITOLUL 8 CONCLUZII 127 BIBLIOGRAFIE 128 Teza de doctorat este ilustrată prin 91 figuri şi 27 tabele. În rezumat sunt incluse doar unele tabele selectate din ansamblul celor prezente în teză. ii

4 INTRODUCERE Glanda mamară este caracterizată printr-o histoarhitectonie particulară, rezultat al interacţiunii dintre elementele epiteliale şi ţesutul conjunctiv specializat, de tip mixoid, hormono-dependent (Cunha, 1994). Glanda mamară prezintă o structură complexă ramificată, formată din două componente principale: unitatea terminală ducto-lobulară (UTDL) şi marele sistem ductal (McCarty, Nath, 1997), deosebit de importante datorită relației directe cu patologia glandei mamare (Rosai, 2004). UTDL este formată din lobuli şi ducte terminale şi reprezintă porţiunea secretorie a glandei. Întregul sistem epitelial ducto-lobular este tapetat de un epiteliu bistratificat specializat, ce prezintă aspecte distincte ultrastructurale şi imunohistochimice. Numeroase cercetări au demonstrat că cele două linii celulare de bază epitelială şi mioepitelială - derivă dintr-o celulă comună, cu aspecte fenotipice de celulă stem (Amălinei, 2005, Mills, 2012). În mecanismul patogenic al carcinogenezei mamare, se consideră că rolul de promotor revine unei populaţii de celule tumorale cu caracteristici de celule stem, numite celule stem canceroase (Al-Hajj et al., 2003, Stingl, Caldas, 2007). Pentru definirea compartimentului celulelor stem și al celulelor precursor ale cancerului mamar este relevantă diferențierea transformărilor de la nivelul țesutului mamar uman din etapa de dezvoltare fetală, pubertate, homeostazie tisulară ciclică lunară și perioada de sarcină (Petersen, Polyak, 2010). Celulele stem/progenitor mamare pot fi la originea unuia din cele cinci subtipuri moleculare de carcinom mamar (luminal A, luminal B, HER2, bazal-like și normal-like) (Sorlie et al., 2003), fapt ce susţine existența unor stadii diferite de diferenţiere a celulelor epiteliale mamare și explică heterogenitatea morfologică şi moleculară a cancerului mamar (Polyak, 2007, Donțu et al., 2004, Behbod, Rosen, 2005, Stingl, Caldas, 2007). Având în vedere morbiditatea și mortalitatea prin cancer mamar, asistăm la eforturi deosebite de a depista această afecțiune cât mai precoce. Un diagnostic patologic precoce al leziunilor palpabile solide sau chistice sau leziunilor nepalpabile, detectate mamografic, ultrasonografic sau prin rezonanță magnetică (MRI sau RMN) (Koss et al., 2006) se poate realiza prin puncția aspirativă cu ac fin (FNA) (Ku et al., 1994). Metoda de investigare prezintă două avantaje majore: scăderea morbidității prin evitarea intervenției chirurgicale și, consecutiv, evitarea tratamentului excesiv al tumorilor low-grade și, simultan, selectarea cazurilor care ar beneficia de terapia neoadjuvantă (Saha et al., 2013). Această metodă nu necesită spitalizare, putându-se efectua în sala de operaţie, nu lasă cicatrici, spre deosebire de biopsii, oferă confort psihic mai bun decât o intervenţie chirurgicală, fiind mai puţin traumatizantă (Mogoanta et al., 2007). În realizarea citodiagnosticului, este foarte important cunoaşterea aspectelor normale și a variațiilor fiziologice ale celulelor, precum şi a celorlaltor modificări morfologice care, în absența cancerului, determină anomalii celulare substanțiale (procese inflamatorii diverse, modificări proliferative, metaplazice, degenerative, procese neoplazice benigne, alterări celulare iatrogene) (Koss, Melamed, 2006). Grupurile de cercetare axate asupra citologiei mamare au propus, în timp, diferite sisteme de scor, urmărind o caracterizare cât mai precisă a modificărilor celulare şi, respectiv, nucleare, astfel încât încadrarea diagnostică într-un anumit grading citologic să reflecte cât mai bine gradul de severitate al leziunilor, în corespondenţă directă cu imaginea histopatologică corespondentă. Cel mai înalt grad de reproductibilitate îl oferă sistemul de gradare Robinson (Elston, Ellis, 1991, Sinha et al., 2009). CAPITOLUL 4. OBIECTIVELE ŞI MOTIVAŢIA STUDIULUI PERSONAL Cancerul mamar reprezintă cel mai frecvent tip de neoplazie care afectează sexul feminim, cu morbiditate şi mortalitate în continuă creştere în pofida progreselor înregistrate în diagnosticul precoce şi terapia adjuvantă. Studiul doctoral realizat a avut, ca punct de plecare, experienţa personală de diagnostic citologic şi histopatologic în patologia tumorală mamară. Rolul patologului în evaluarea citologiei mamare este uneori mai dificil decât în formularea diagnosticului patologic. În evoluţia conceptelor diagnostice, evaluarea convenţională, bazată pe aprecierea subiectivă a caracteristicilor microscopice, fundamentată pe cunoştinţe teoretice şi practice solide, a fost permanent completată cu o serie de criterii semi-cantitative, în scopul de a oferi criterii cât mai obiective care să permită o încadrare cât mai precisă. Aceste criterii, aplicate în diagnosticul citologic şi histopatologic, au fost completate în ultimele decade prin facilităţile analizei de imagine asistată de calculator, care au condus la dezvoltarea tehnicilor de morfometrie computerizată, cu rezultate cantitative care se pot transfera spre caracterizarea transformării maligne. Pornind de la aceste considerente generale, tema de cercetare pentru studiul doctorala fost axată pe 1

5 evaluarea unor criterii semi-cantitative şi cantitative în patologia tumorală malignă. În mod concret, obiectivele urmărite au vizat: - compararea unor criterii de gradare operaţionale în citologia mamară, prin analiza a 8 tipuri de scoruri, şi corelarea grading-ului citologic cu grading-ul histologic; - analiza criteriilor de gradare operaţionale în examenul histopatologic, şi a gradului de diferenţiere tumorală versus sistem de gradare Nottingham, urmărind aplicabilitatea lor în practica curentă de diagnostic; - dezvoltarea unei tehnici originale de citometrie computerizată, care să permită un studiu complex în citopatologia şi histopatologia mamară INTRODUCERE CAPITOLUL 5. CRITERII DE GRADARE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ Cancerul mamar constituie un domeniu de interes major în cercetarea medicală. Eforturile concertate ale comunităţii medicale preocupate de acest subiect sunt orientate asupra căilor moleculare complexe care fundamentează carcinogeneza mamară, urmărind nu numai descifrarea mecanismului patogenic, ci şi identificarea de markeri cu valoare predictivă şi prognostică. Heterogenitatea markerilor moleculari în raport cu tipul histologic primar complică evoluţia şi răspunsul la terapie, fiind departe de a avea răspunsuri cu valoare de adevăr ştiinţific absolut. Conform studiilor efectuate de multiple echipe de cercetători, gradarea citologică a cancerului mamar și-a dovedit fezabilitatea. Este astfel recomandată includerea gradingului obținut pe materialul obținut prin citologie aspirativă cu ac fin în cadrul unor rapoarte cu valoare prognostică (Abati, McKee, 1998, Saha et al., 2013). Analiza literaturii de specialitate relevă că în 1955 a fost introdus conceptul de gradare nucleară (Black et al., 1955), modificat ulterior (Fisher et al, 1980, Cajulis et al., 1997). Pentru aprecierea grading-ului nuclear au fost propuse, în timp, numeroase sisteme de scor. Sistemul Scarff Bloom Richardson cu modificările Nottingham, descris de Elston și Ellis, denumit și metoda Bloom Richardson modificată de Elston, constituie cel mai apreciat sistem de gradare, acceptat și apreciat pe plan internațional (Elston, Ellis, 1991, Ellis et al., 2002). Suplimentar, analiza morfometrică poate aduce informații prețioase în asociere cu sistemul recunoscut de gradare citologică (Kalhan et al., 2010). În mod concret, obiectivele urmărite în cadrul studiului doctoral au constat în: - analiza comparativă a 8 sisteme de scor aplicate pentru gradarea nucleară în examenul citologic, în scopul extragerii unor informații prețioase privind valoarea lor individuală prin prisma avantajelor pentru diagnostic, terapie și prognostic; - analiza comparativă dintre grading-ul nuclear citologic şi cel obținut în gradarea histologică, în scopul stabilirii corelaţiei existente între cele două tipuri de grading, prin prisma corespondenţei de încadrare diagnostică citologică versus histopatologică MATERIAL ŞI METODǍ Lotul de studiu. Organizarea bazei de date Lotul de studiu a inclus 137 de cazuri diagnosticate citologic în perioada 1 ianuarie iulie 2013, la Serviciul de Anatomie Patologică şi Prosectură, Spitalul Judeţean Brăila, şi Cytopath SRL Brăila. Conform protocolului studiului doctoral, cercetarea a fost avizată de Comisia de Etică a U.M.F. Grigore T. Popa Iaşi, în baza consimţământului informat al pacientelor, în vederea utilizării produsului biologic. Din totalul celor 137 de cazuri, 90 de cazuri au prezentat caractere citologice de malignitate, iar 47 de cazuri au fost încadrate ca leziuni benigne. Un rezultat citologic de tip benign a fost fals negativ, examenul histopatologic susţinând diagnosticul de carcinom ductal invaziv. Un caz cu diagnostic citologic de malignitate a fost exclus din lotul analizat, deoarece diagnosticul a fost de melanom. În baza examenului citologic standard, cele 90 de cazuri au fost încadrate iniţial în următoarele subtipuri histologice: carcinom mamar ductal invaziv- 76 cazuri; carcinom mamar lobular invaziv - 11 cazuri; carcinom medular - 3 cazuri. Cazurile au fost reevaluate prin aplicarea a 8 sisteme de scor de gradare nucleară, urmărindu-se analizarea utilității scorurilor în examenul citologic în diagnosticul afecțiunilor glandei mamare. Din cele 90 de cazuri încadrate diagnostic în categoria malignă, un număr de 20 de cazuri au fost 2

6 investigate prin puncție-biopsie. Încadrarea diagnostică histopatologică a fost de carcinom ductal invaziv, cu următoarele grade de diferenţiere şi valori de scor pentru grading-ul nuclear histologic, conform sistemului Nottingham: carcinom ductal invaziv bine diferențiat (G1): 2 cazuri; carcinom ductal infiltrativ moderat diferențiat (G2): 12 cazuri (8 cazuri scor 6 și 4 cazuri scor 7); carcinom ductal infiltrativ slab diferențiat (G3): 6 cazuri (4 cazuri scor 9 și 2 cazuri scor 8) Metodologia de lucru Metodologia de lucru a constat în următoarele etape: evaluarea citologică primară; gradarea cazurilor cu aspect malign, utilizând scoruri diverse; diagnosticul histopatologic cu clasificarea SBR modificată și gradarea citologică pentru cazurile care au beneficiat de puncţie biopsie; evaluarea corespondenței între cele două tipuri de examinare, respectiv citologic și histopatologic și aprecierea sistemelor de gradare nucleară citologică, din punct de vedere al gradului de concordanță cu gradarea nucleară histologică Examenul citologic Examenul citologic s-a efectuat pe produsul obținut prin biopsie aspirativă (puncţie aspirativă cu ac fin (FNA eng. fine-needle aspiration) Gradarea citologică Gradarea citologică a celor 90 de cazuri investigate s-a realizat conform morfologiei celulare. Parametrii au fost urmăriţi prin utilizarea unui micrometru ocular. Analiza citologică a implicat reevaluarea cazurilor de către doi anatomopatologi (doctorand şi, respectiv, membru în Comisia de îndrumare), în mod independent şi, în cazurile în care s-au înregistrat diferenţe de opinie, gradarea a necesitat punerea de acord a celor doi examinatori. Prezentăm în continuare scorurile utilizate, a căror aplicare este fundamentată pe aprecierea unor criterii morfologice prin valori numerice. Scorurile au valori de la 1 la 3, gradarea fiind rezultatul sumării criteriilor independente. Criteriile Hunt (Hunt et al., 1990) includ următoarele criterii:diametrul nuclear; pleomorfismul nuclear;prezența nucleolilor. În urma aplicării acestor criterii, tumorile mamare se pot clasifica în: tumori de grad citologic redus (low-grade); tumori de grad citologic înalt (high-grade). Criteriile Black (simplificate și modificate) au fost ulterior aplicate, introducându-se paternul cromatinian și mitozele drept criterii suplimentare. Sistemul Black simplificat a fost utilizat mai ales datorită criteriilor logice utilizate și a reproductibilității sale înalte, prin raportarea la doar două criterii, în loc de trei (Cajulis et al., 1997). Rezultatele gradării Black modificate sunt considerate drept golden standard deoarece se corelează în măsura cea mai mare cu sistemul de gradare histologică (Elston, Ellis, 2002). Modificările aduse de Fisher criteriilor Black ale gradării nucleare au condus la individualizarea următoarelor criterii de valuare a gradului tumoral (Black et al., 1955, Fisher et al., 1980): anizonucleoză; membrană nucleară; cromazie nucleară; nucleoli; pattern cromatinian; mitoze. Sistemul Masood al indexului citologic (Masood et al., 1991) include celulele mioepiteliale și exclude mărimea celulară și mitozele din criteriile de gradare citologică, fiind util mai ales în stabilirea diagnosticului diferențial între leziunile benigne vs. leziunile maligne mamare, astfel încât are o valoare limitată în gradarea carcinoamelor mamare. Sistemul Howell utilizează următoarele criterii: formarea de tubuli; pleomorfismul nuclear; numărul de mitoze. Sistemul Mouriquand (Mouriquand, Pasquier,1980, Mouriquand et al., 1986) este bazat pe caracteristicile celulare, aspectele nucleare, aspectul nucleolului şi figurile mitotice. Sistemul Robinson de grading include două noi criterii (disocierea celulară și marginile nucleare) (Robinson et al., 1994). Conform sistemului Robinson, gradele asociate scorurilor au fost următoarele: grad I scor 6-11; grad II scor 12-14; grad III scor Sistemul Khan (Khan et al., 2009) a urmărit gradarea parametriilor nucleari: grad I scor 6-10; grad II scor 11-14; grad III scor Sistemul Taniguchi, include 7 parametri citologici, după cum urmează (Taniguchi et al., 2000): necroza; mărimea celulară; raportul nucleo-citoplasmatic; pleomorfismul nuclear; nucleoli; granularitatea nucleară; densitatea cromatinei. Gradele asociate scorurilor au fost următoarele: grad I scor 6-19; grad II scor 10-11; grad III scor Examenul histopatologic Examenul histopatologic a fost realizat pe preparate incluse la parafină, etapele de prelucrare urmărind protocolului standard practicat în laboratoarele de anatomie patologică Analiza statistică Toate analizele statistice au fost efectuate în SPSS, versiunea20 (SPSS Inc, Chicago, IL, SUA). În cazul variabilelor categoriale s-au folosit teste specifice de corelație neparametrică, avându-se în vedere corelația Spearman Rank R şi coeficientul de acord kappa (k). Analiza a folosit scara de referință propusă de 3

7 Landis și Koch în cadrul căreia gradul de acord poate fi calificat drept "slab" (k <0), "ușor" (k =0-0,20), "bun" (k =0,21-0,40), "moderat" (k =0,41 0,60), "substanțial" (k =0,61-0,80) și"aproape perfect" (k =0,81 1,00), în funcție devaloarea coeficientului Kappa. Nivelul de semnificație al testelor a fost considerat pentru valori p<0,05 (95%CI) REZULTATE Evaluarea grading-ului citologic Aplicarea sistemelor de gradare descrise în literatura de specialitate (Hunt, Black, Fisher, Masood, Howell, Mouriquand, Robinson, Khan, Taniguchi) a condus la o evaluare comparativă a încadrării diagnosticului citologic din punctul de vedere al severităţii leziunilor. Aplicarea criteriilor Hunt a condus la identificarea a 70 cazuri high-grade, 20 cazuri low-grade. Aplicarea criteriilor Black simplificate a condus la identificarea a 5 cazuri grad I; 40 cazuri grad II; 45 cazuri grad III. Aplicarea modificărilor aduse de Fisher criteriilor Black a condus la clasificarea următoare: 7 cazuri grad I; 37 cazuri grad II; 46 cazuri grad III: Aplicarea criteriilor Masood a condus la confirmarea diagnosticului de malignitate în toate cele 90 de cazuri, gradarea acestora fiind dificilă. Aplicarea criteriilor Howell a condus la clasificarea următoare: 12 cazuri grad I; 43 cazuri grad II; 35 cazuri grad III. Aplicarea criteriilor Mouriquand a condus la clasificarea următoare: 9 cazuri grad I; 39 cazuri grad II; 42 cazuri grad III. Aplicând criteriile Robinson s-au putut grada tumorile examinate citologic în următoarele categorii: 18 cazuri gradul I; 38 cazuri gradul II; 34 cazuri gradul III. Aplicarea sistemului Khan de gradare a condus la următoarea clasificare după gradul tumoral: 20 cazuri gradul I; 41 cazuri gradul II; 29 cazuri gradul III. Aplicând criteriile sistemului Taniguchis-au putut grada tumorile examinate citologic în următoarele categorii: 21 cazuri gradul I; 49 cazuri gradul II; 20 cazuri gradul III Evaluarea grading-ului histologic Cele 20 de cazuri investigate prin biopsie și examen histopatologic au prezentat următoarea încadrare citologică, în raport de grading-ul citologic: 3 cazuri grad I; 10 cazuri grad II; 7 cazuri grad III. În urma evaluării morfologiei celulelor tumorale, conform sistemului de grading Nottingham, cazurile au fost încadrate în cele 3 categorii de scor, după cum urmează: 3 cazuri grad I (scor 3-5); 9 cazuri grad 2 (scor 6-7); 8 cazuri grad 3 (scor 8-9) Corelaţii grading citologic versus grading histologic Corespondenţa dintre grading-ul citologic şi histopatologic a relevat următoarele aspecte. Din cele 3 cazuri care au fost diagnosticate ca prezentând grad I citologic, histopatologic 2 cazuri au prezentat grad I, şi 1 caz gradul II.În consecință, concordanța între gradarea citologică și cea histopatologică a fost, pentru gradul I, de 66,67%. Din cele 10 cazuri diagnosticate citologic cu grad II, încadrarea histopatologică a avut următoarea corespondenţă: 1 caz grad I; 7 cazuri grad II; 2 cazuri grad III.În consecință, concordanța între gradarea citologică și cea histopatologică a fost de 70% pentru gradul II. Pentru cele 7 cazuri încadrate citologic corespunzător gradului III, s-a observat următoarea distribuție histopatologică: 1 caz grad II; 6 cazuri grad III.În consecință, concordanța între gradarea citologică și cea histopatologică a fost de 85,71% pentru gradul III. Rezultatele încadrării în cele 2 tipuri de sisteme de gradare sunt ilustrate în tabelul 5.6. Tabel 5.6. Corespondenţa cazurilor în raport de gradingul citologic şi histologic Grad histologic Nottingham Grad citologic Robinson Total % 66,67% 33,33% 0% % 10% 70% 20% % 0% 14,29% 85,71% Analiza statistică bazată pe teste specifice de corelație neparametrică (corelația Spearman Rank R şi coeficientul de acord kappa(k)) a indicat o asociere semnificativă a rezultatelor celor două criterii de

8 încadrare (χ 2 =15.35, p=0.0041), coeficientul kappa corespunzând unui grad moderat de acord al rezultatelor, dar semnificativ statistic (k=0.592, p<<0.01, 95%CI). Studiul a urmărit totodată corelarea gradelor de severitate a leziunilor evaluate prin cele două metode (citologic, histopatologic). Rezultatul corelaţiei neparametrice (Spearman Rank R) a indicat prezenţa corelaţiei între încadrarea citologică şi grading-ul histologic (r=0.739, p<< %CI) DISCUŢII Evaluarea importanței gradingului citologic Valoarea explorării citologice, ca și componentă a triplului test în diagnosticarea leziunilor mamare palpabile, este pe deplin susținută în investigația noastră. În perioada , cazurile investigate se caracterizează prin existența unei diferențe de aproximativ o decadă (8,79 ani) între vârsta medie a pacientelor cu patologie benignă și cea a pacientelor cu patologie malignă. Această diferență este justificată de perioada necesară cumulărilor stimulilor hormonali nebalansați cât și a altor carcinogene, în tumorigeneza mamară. În ansamblul celor 137 de cazuri am înregistrat un caz fals negativ. Diagnosticul clinic al pacientei a fost de tumoră mamară la nivelul sânului stâng, iar examenul citologic a evidenţiat prezența de țesut fibroadipos, rare placarde epiteliale coezive și rare celule individuale cu raport nucleo-citoplasmatic păstrat, aspectul fiind compatibil cu un fibroadenom mamar, indicându-se necesitatea controlului histopatologic. Examenul histopatologic a relevat, ulterior, prezența unui carcinom ductal invaziv, moderat diferențiat G2, fapt ce demonstrează superioritatea examenului histopatologic și limitele examenului citologic în diagnosticul tumorilor mamare. Examenul citologic dintr-un caz cu limfoganglion axilar a pus în evidenţă frecvente placarde epiteliale cu hipertrofii nucleare, raport nucleo-citoplasmatic peste 1, pleomorfism celular și nuclear, relative frecvente hematii și rare limfocite elemente elocvente pentru o metastază carcinomatoasă. Consecutiv, în cazul acesta, a fost demonstrată valoarea puncției limfoganglionare care, suplimentar puncției citologice din nodulul mamar suspect, devine, prin depistarea depozitelor metastatice, definitoriu pentru diagnostic și stadializare. Prin aplicarea comparativă, în cazuistica noastră, a sistemelor de scor propuse de diverși cercetători, se poate constata că există diferenţe mari între numărul de cazuri încadrate în fiecare categorie (grad I, II, respectiv III), în raport de sistemele de scor aplicate. În mod paradoxal, dacă numărul de cazuri apreciate cu un anumit grad este relativ apropiat între anumite sisteme de scor, această situaţie nu se repetă şi pentru cazurile apreciate cu celelalte două grade. Explicaţia pentru neconcordanţele care apar în încadrarea diagnostică are la bază criteriile diferite cu care acestea operează. Dintre cele 8 sisteme de gradare utilizate, doar 4 au utilizat criterii obiective de scor pentru fiecare parametru sistemele Black şi Fisher nu au sistem de scor pentru fiecare parametru, iar sistemul Mouriquand nu permite categorizarea lor (Saha et al., 2013). Sistemele Robinson, Howell, Khan si Taniguchi susţin realizarea unei gradări eficiente (Saha et al., 2013). În sistemul Taniguchi, raportul nucleo-citoplasmatic este mai puțin corelat cu gradul final (Saha et al., 2013). În sistemul Robinson, mărimea celulară și nucleolii nu prezintă o semnificație concretă în gradarea citologică finală. În sistemul Khan, mărimea nucleară nu este corelată cu gradarea citologică finală (Saha et al., 2013). În sistemul Taniguchi, 4 dintre cei 7 parametri utilizați nu au semnificație concretă în gradarea citologică finală (Saha et al., 2013). Sistemul de grading Robinson asigură cel mai înalt grad de acurateţe în evaluarea modificărilor calitative specifice celulelor maligne, conform studiilor efectuate de numeroase colective de cercetare (Bhargava et al., 2008, Sinha et al., 2009, Rekha et al., 2011, Saha et al., 2013, Vasudev et al., 2013). În baza experienţei personale, considerăm că studiul nostru accentuează valoarea scorului Robinson în evaluarea citologică a tumorilor mamare, ținând cont atât de posibilitatea realizării de categorii succesive de grading, cât și de criteriile operaționale facile de grading. Rezultatele noastre nu susţin valoarea rapoartelor de cercetare care pledează pentru introducerea în practica curentă de diagnostic a unor noi scoruri de gradare Grading citologic versus grading histopatologic Asocierea examenelor complementare, citologic (mai ales aspirativ), histopatologic (mai ales bioptic), examenului clinic și radiologic poate ridica acuratețea diagnosticului până spre 99%. Acurateţea şi precizia ridicată a examenului citologic realizat, demonstrată de corespondența cu diagnosticul histopatologic realizat pe piesele bioptice în procent de 98,88% (un singur diagnostic citologic fals negativ și un diagnostic citologic fals negativ, pe produsul obținut prin puncția - aspirație cu ac fin a nodulului tumoral, compensat prin diagnosticul pozitiv realizat dintr-un limfoganglion axilar), confirmă datele din literatură (Vasudev et al., 2013). Gradul înalt de corelație citologie - histopatologie constatat în cazuistica noastră, în concordanță cu datele din literatura de specialitate (Pandit, Parekh, 2000, Sinha et al., 2009), determină aserțiunea că gradarea citologică constituie un foarte bun factor de predicție a gradului histologic, datorită corelației 5

9 semnificative existente între acestea. Corespondența dintre grading-ul evaluat prin citologie și cel obținut prin examenul histopatologic și, concomitent, cu prognosticul, este susținută în literatura de specialitate. Totuşi, rezultatele noastre au relevat valori diferite pentru corespondenţa dintre grading-ul citologic şi cel histopatologic, suprapunerea diagnostică fiind 66,67% pentru gradul I, 70% pentru gradul II şi 85,71% pentru gradul III, comparativ cu raportările de 95% pentru gradul I, de 70% pentru gradul II și de 45% pentru gradul III (Mouriquand et al., 1986). Subliniem faptul că analiza de corelaţie neparametrică Spearman Rank R a evidenţiat o asociere semnificativă a rezultatelor celor două criterii de încadrare (χ 2 = 15,35, p = 0,0041), şi prezenţa corelaţiei între încadrarea citologică şi grading-ul histologic (r = 0,739, p<<0,01, 95%CI). Valoarea practică a gradării citologice este cu atât mai importantă cu cât în studiul nostru corespondența a fost maximă în gradul III (> 85,71%), ceea ce reprezintă un beneficiu pentru ameliorarea prognosticului, permițând instituirea terapiei cu Tamoxifen imediat după examenul citologic. Deşi rezultatele noastre au relevat, conform scalei de referinţă Landis și Koch, un un grad moderat de acord al rezultatelor, acesta a fost semnificativ statistic (k = 0,592, p<<0,01, 95%CI). Considerăm că procentul mai redus, deși consistent (66,67%), constatat în cazul gradului I se poate explica prin dificultățile legate în special de evaluarea unor atipii minore caracteristice tumorilor bine diferențiate și paucicelularității celulare relative. Analiza minuțioasă a cazurilor discordante a condus la rezultate interesante, și anume că aspectele sesizate se pot atribui, cel puțin parțial, numărului relativ redus de grupe celulare disponibile pentru examinare pe frotiurile realizate (sub 8 pe un frotiu), pe când analiza cazurilor concordante a relevat faptul că niciunul din acestea nu prezenta mai puțin de 8 grupe celulare pe fiecare frotiu. Suplimentar, s-au putut depista alte surse de eroare, cum ar fi: procent important de necroză tumorală sau o fibroză densă care împiedică obținerea și vizualizarea celulelor tumorale. În urma studiului efectuat, considerăm ca minim necesare pentru evaluarea citologică un număr de cel puțin 8 grupe celulare, deși se recomandă ca minim necesare un număr de cel puțin 6 grupe celulare, în literatura de specialitate (National Breast Cancer Centre, 2004). În caz contrar, s-au constatat discrepanțe între gradingul citologic și cel histopatologic INTRODUCERE CAPITOLUL 6. CRITERII DE GRADARE ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ Un indicator puternic al prognosticului în cancerul mamar îl constituie gradingul histopatologic, în cadrul căruia gradul nuclear a constituit mult timp criteriul de bază (Black et al., 1955). Acestui criteriu i s-au adăugat, ulterior, proporția tumorală constituită din tubuli și rata mitotică (Bloom, Richardson, 1957, Scarff, Torloni, 1968). Cele mai utilizate sisteme pentru grading-ul cancerului mamar în SUA sunt sistemul Scarff- Bloom-Richardson (SBR) și sistemul Black, pe când în Europa se preferă aplicarea modificărilor Elston-Ellis ale sistemului SBR (sistemul de gradare Nottingham), care aduc un plus de obiectivitate și rigurozitate (Elston, Ellis, 2002, Cardiff, Jensen, 2013). Astfel, se exclud nucleii hipercromi, celulele apoptotice și se cuantifică în mm 2 ariile evaluate. Îmbunătățirile aduse au determinat creșterea reproductibilității diagnosticului realizat de către anatomo-patologi și a gradului de acceptabilitate a acestuia de către clinicieni (Cardiff, Jensen, 2013). Unii cercetători consideră că utilizarea exclusivă a ratei mitotice este suficientă ca și indicator predictiv (Clayton, 1991). Progresele relativ recente ale analizei imagistice creează premisele unei contribuții din ce în ce mai eficiente în acest domeniu, astfel încât să asistăm la o mai bună orientare terapeutică și o evaluare prognostică de o mare fidelitate. În mod concret, obiectivele urmărite în cadrul studiului doctoral au constat în: - analiza criteriilor de gradare operaţionale în examenul histopatologic, urmărind aplicabilitatea lor în practica curentă de diagnostic; - evaluarea comparativă a gradului de diferenţiere tumorală şi a valorilor sistemului de gradare Nottingham, în scopul aprecierii utilităţii lor efective pentru caracterizarea agresivităţii tumorale MATERIAL ŞI METODǍ Lotul de studiu. Organizarea bazei de date Lotul de studiu a inclus un număr de 98 de cazuri de tumori mamare maligne, cu vârste cuprinse între 40 și 83 de ani, diagnosticate în perioada 1 ianuarie iulie 2013 în cadrul Serviciului de Anatomie Patologică şi Prosectură, Spitalul Judeţean Brăila. Cazurile selectate au fost reevaluate histopatologic, urmărindu-se analiza utilității gradingului în diagnosticul cancerelor glandei mamare. 6

10 Suplimentar, un număr de 44 de cazuri au fost investigate imunohistochimic pentru identificarea profilului receptorilor estrogenici (RE) și progesteronici (RP), iar 33 de cazuri pentru expresiei HER2/neu. Pentru investigaţia imunohistochimică pacientele au contactat individual diferite laboratoare de specialitate din ţară, la recomandarea patologului şi clinicianului, care au avut acces la rezultate pentru formularea diagnosticului complex şi, respectiv, stabilirea conduitei de diagnostic. Baza de date creată a inclus: date de identificare a pacientelor, vârsta la momentul diagnosticului; data diagnosticului (conform buletinului anatomo-patologic); localizarea tumorii și aspectul său clinic; prezența clinică a adenopatiei axilare; stadializarea clinică TNM; diagnosticul histopatologic; scorul Nottingham; stadializarea ptmn; expresia RE, RP, Her2/neu Metodologia de lucru Examenul histopatologic În scopul realizării examenului histopatologic, s-au realizat toate etapele necesare prelucrării histologice, prin includere la parafină, urmate de colorația de rutină (Hematoxilin-Eozină) Sistemul de gradare Nottingham În sistemul de gradare Nottingham, pentru fiecare aspect urmărit se notează un scor de la 1 la 3, în funcție de severitatea acestora (Cardiff, Jensen, 2013). Prin sumarea celor 3 componente se obține gradul. Cel mai mic scor este 1+1+1=3, acesta indicând tumorile bine diferențiate, care formează tubuli în mare parte din tumoră și au o rată mitotică scăzută. Cel mai mare scor este 3+3+3=9, indicând tumorile agresive Stadializarea ptmn Stadializarea s-a realizat după anumite norme, utilizând aceleași trei noţiuni cheie, din stadializarea clinică, la care se adaugă perfixul p (informațiile provin din examenul patologic ), astfel: pt simbolizează tumora primară, pn simbolizează nodulii limfatici, pm simbolizează metastazele REZULTATE Profilul histopatologic şi imunohistochimic Încadrarea diagnostică a cazuisticii analizate este sumarizată în tabelul 6.1. Carcinoamele mamare invazive sau infiltrative au reprezentat 98,97% din ansamblul cazurilor analizate. Carcinom ductal invaziv Carcinom papilar Tabel 6.1. Frecvenţa tipurilor histologice de carcinom mamar TIPURI HISTOLOGICE DE CARCINOAME Carcinom Carcinom Carcinom Carcinom lobular mixt ductal mixt ductal mucinos invaziv și lobular și mucinos Carcinom ductal in situ Carcinom tubular ,53% 7,14% 6,12% 4,08% 2,04% 1,02% 2,04% 1,02% 98 Rezultatele examenului imunohistochimic (realizat în alte centre medicale) pentru evaluarea pozitivității receptorilor estrogenici și progesteronici și a pozitivității HER2/neu sunt sumarizate în tabelul 6.2. Am constatat că negativitatea receptorilor hormonali a fost asociată într-o proporție semnificativă din cazuri carcinoamelor ductale moderat și slab diferențiate (75% G2 și 25% G3 din cazurile RE negative și, respectiv, 57,14% G2, 35,71% G3 din cazurile RP negative). Tabel 6.2. Expresia RE, RP şi Her2/neu MARKER NUMAR CAZURI NUMĂR CAZURI POZITIVE > 10% NEGATIVE < 10% TOTAL RE RP Her2/neu Grad de diferenţiere şi scor Nottingham Ca urmare a analizei comparative între gradul de diferenţiere şi valorile scorului Nottingham, corespondenţa obţinută este prezentată în tabelul

11 Grad diferenţiere Tabel 6.3. Corespondenţa grad de diferenţiere scor Nottingham Scor Nottingham (număr cazuri, %) Total G1 1 (50%) 1 (50%) 2 G2 28 (43,08) 28 (43,08) G3 4 (12,90) 5 (16,13) 7 (10,77) 2 (3,07) (32,27) 12 (38,70) Caracteristicile clinico-patologice - sinopsis În ansamblul lotului analizat, cele 98 de cazuri au prezentat un tablou clinico-patologic complex, principalele caracteristici clinico-patologice ale pacientelor fiind sumarizate în tabelul DISCUȚII Tabel 6.4.Caracteristicile clinico-patologice ale lotului de studiu CARACTERISTICI Cazuri (n =98) CLINICO-PATOLOGICE N (98) % Vârstă (ani) ,53 > ,47 TIPUL HISTOLOGIC Carcinom ductal invaziv 75 76,53 Carcinom lobular invaziv 4 4,08 Alte subtipuri morfologice 19 19,38 Carcinom papilar 7 7,14 Carcinom tubular 1 1,02 Carcinom mucinos 6 6,12 Carcinom ductal in situ 2 2,04 Carcinom mixt 3 11,90 STADIUL pt pi 4 5,79 pii 28 40,57 piii 14 20,29 piv 23 33,33 Nestadializat 29 29,59% STADIUL pn pnx 13 18,84 pn ,43 pn ,63 pn2+pn3+pn ,08 Nestadializat 29 29,59% STADIUL pm pmx 66 95,65 pm0 1 1,44 pm1 2 2,88 Nestadializat (margini infiltrate) 29 29,59% GRAD DE DIFERENŢIERE G1 (bine diferenţiate) 2 2,04 G2 (moderat diferenţiate) 65 66,32 G3 (slab diferenţiate) 31 31, Valoarea scorului Nottingham Studiul nostru aduce dovezi importante care susţin faptul că aplicarea sistemului de gradare Nottingham este extrem de utilă pentru evaluarea prognostică a carcinoamelor. În mod concret, atragem atenţia asupra variabilităţii cazurilor încadrate ca având grad de diferenţiere G2, al căror comportament este 31 8

12 extrem de diferit. Astfel, în această categorie, 28 cazuri (43,08%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 6, 28 cazuri (43,08%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 7, 7 cazuri (10,77%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 8, iar 2 cazuri (3,07%) - cu scorul Nottingham 9. Mai mult, şi în cadrul cazurilor încadrate ca avînd grad de diferenţiere G3, 4 cazuri (12,90%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 6, 5 cazuri (16,13%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 7, 10 cazuri (32,27%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 8, iar 12 cazuri (38,70%) - cu scorul Nottingham 9. Aceste rezultate ne permit să accentuăm valoarea scorului Nottingham, care oferă patologului şi, ulterior, clinicianului, o perspectivă suplimentară asupra agresivităţii tumorale, valorile 6 şi 7 fiind corespondente unui grad intermediar de agresivitate, iar valorile 8 şi 9 unui grad ridicat de agresivitate. În literatura de specialitate s-a lansat deja propunerea clasificării tumorilor G2 în 2 subclase, una G1- like care nu necesită terapie sistemică și una G3-like care necesită chimioterapie (Sotiriou et al., 2006). Consecutiv, tumorile G2 cu scor 7 pot fi orientate spre chimioterapie adjuvantă pe când cele G1 și G2 (cu scor 6 și RE+) pot fi monitorizate pe termen lung, în paralel cu administrarea unei terapii adjuvante endocrine, cu Tamoxifen. Limitele gradingului histopatologic constituie și motivul pentru care acesta nu a fost inclus în clasificările OMS. Acestea se referă în special la standardizarea tehnicii de prelucrare histopatologică și, în măsură mai redusă, la un grad de subiectivitate al examinatorului. Limitele pot fi depășite printr-un program de standardizare a tehnicii și de instruire continuă și perfecționare a histopatologilor implicați în domeniul patologiei mamare, ceea ce constituie un deziderat și în rândul histopatologilor din țara noastră Valoarea profilului imunohistochimic Introducerea unor markeri cu valoarea certă ca indicatori de evaluare prognostică (receptorii hormonali și HER-2) a fost urmată de formularea conceptului de clasificare moleculară (utilizând suplimentar citokeratinele CK5/6 și receptorul factorului epidermic de creștere EGFR) care introduce 5 tipuri moleculare de cancer mamar: tip luminal A, tip luminal B, tip HER-2, tip bazal-like și, respectiv, tip neclasificabil sau normal-like (Sorlie et al., 2001). Statusul RE este utilizat pentru a determina sensibilitatea la tamoxifen şi la inhibitorii de aromatază (Clemons et al., 2002). Tumorile RE pozitive conferă un prognostic mai bun comparativ cu tumorile RE negative, nivelul expresiei RE fiind util orientării terapiei endocrină (Johnston, 2010). În cazuistica noastră, un procent ridicat (81,81%) din cele 44 de cazuri investigate au prezentat expresii puternice ale RE, conferind pacientelor șansa terapiei endocrine. Cazurile negative s-au atribuit formelor mai puțin diferențiate și apartenenței la categoriile mai vîrstnice. Statusul RP este un marker important pentru răspunsul la terapia hormonală şi pentru prognostic în cancerul mamar (Cork et al., 2008). Tumorile RP negative au în general un prognostic mai rezervat decât tumorile RP pozitive (Cork et al., 2008). În cazuistica noastră, din cele 44 de cazuri investigate, un procent de 68,18% a prezentat o expresie semnificativ pozitivă a PR, 6 cazuri RE pozitive fiind RP negative și 5 cazuri RE negative fiind RP pozitive.. Her2/neu constituie nu doar un biomarker important, ci şi o ţintă pentru agenţii terapeutici, evaluarea expresiei Her2/neu fiind indicată pentru monitorizarea eficacităţii terapiei ţintă şi selectarea pacientelor cărora li se poate oferi această terapie, în cancerul metastatic (Carney et al., 2007). Supraexpresia HER-2/neu este asociată cu forme agresive de boală şi prognostic rezervat (Sorlie et al., 2001). Cele 33 cazuri investigate au prezentat un procent de 15,62% al pozitivității HER2/neu, considerându-se că majoritatea pacientelor investigate nu necesită terapie adjuvantă cu trastuzumab. Toate aceste consideraţii constituie o pledoarie pentru introducerea în practica curentă de diagnostic a evaluării imunohistochimice a RE, RP şi her2/neu, cei 3 markeri fiind esenţiali pentru caracterizarea minimală a cancerelor mamare și selectarea pacientelor care pot beneficia de terapie adjuvantă. CAPITOL 7. CRITERII OPERAŢIONALE ÎN EVALUAREA MORFOMETRICĂ A LEZIUNILOR GLANDEI MAMARE CONCEPERE ŞI DEZVOLTARE DE TEHNICĂ 7.1. INTRODUCERE Analiza şi procesarea imagistică asistată de calculator s-au constituit ca direcţie de cercetare in domeniul bio-medical abia la începutul anilor 90. După 1995 însă, prin publicarea pe piaţa software a unor produse dedicate acestui tip de cercetări de către cele mai importante firme specializate, s-au creat şi implementat noi seturi de standarde care au stat la baza conceperii şi raportării studiilor orientate pe acest subiect (Shapiro, Stockman, 2001, Pratt, 2001, Căruntu, 2002). 9

13 Cancerul mamar este considerat o boală heterogenă, motiv pentru care simpla încadrarea într-o anumită categorie de diagnostic nu oferă clinicianului informaţii suficiente pentru deciziile de tratament şi pentru formularea unui prognostic (Kronqvist et al., 2002). O potenţială modalitate de a depăşi problemele asociate cu evaluările subiective histologice este de a dezvolta tehnici analitice obiective şi reproductibile, prin introducerea unor parametri obiectivi, determinaţi morfometric, corespondenţi trăsăturilor / caracteristicilor pe care patologii le folosesc pentru a descrie caracterul histopatologic al leziunii de sân (Kronqvist et al., 2002). Cu referire strictă la componenta nucleară, în abordarea morfometrică a cancerului mamar atribuirea gradului de transformare malignă nucleară se bazează pe mai multe criterii care caracterizează morfologia nucleară şi care au fost introduse ca variabile măsurate prin contribuţia semnificativă a unor colective de cercetare axate asupra acestui subiect (Baak et al., 1982, Baak et al., 1985, Kronqvist et al., 1995, Kronqvist et al., 1997, Kronqvist et al., 1998a, Kronqvist et al., 1998b, Kronqvist et al., 2000a, Kronqvist et al., 2000b, Kronqvist et al., 2002). Studiile care au urmărit o abordare morfometrică au condus la o ierarhizarea mai corectă leziunilor în trepte de malignitate, în comparaţie cu clasificare subiectivă inclusiv prin introducerea categoriei intermediare (Kronqvist et al., 2002). În funcţie de rezultatele obţinute, investigarea morfometrică poate fi aplicată pentru utilizarea ei clinică prognostică şi de orientare a deciziilor terapeutice. În acest context, abordarea morfometrică realizată în cadrul studiului doctoral îşi justifică caracterul de noutate asociat. Trebuie menţionat faptul că studiul de morfometrie computerizată a putut fi dezvoltat în condiţiile unei experienţe solide în cadrul colectivului Laboratorului de Histologie a U.M.F. Iaşi, existând preocupări constante pentru această direcţie de cercetare. Aceste preocupări au avut, ca rezultat concret, raportări în fluxul principal de publicaţii (Căruntu, 2002, Căruntu et al., 2005), elaborarea unei monografii cu caracter de noutate absolută la nivel naţional (Căruntu, 2003), precum şi în contribuţii originale în cadrul unor studii doctorale axate patologiei tumorale orale, cervicale, digestive, mamare şi testiculare (Scutariu, 2003, Vişan, 2004, Bădescu, 2005, Stancu, 2007, Hopulele, 2007, Marinca, 2011). În contextul experienţei existente în cadrul acestui laborator, am considerat că potenţialele rezultate obţinute în cercetarea doctorală axată pe patologia tumorală mamară pot complementa viziunea morfometrică asupra transformărilor specifice procesului de transformare malignă, prin obiectivitatea datelor numerice. În mod concret, obiectivul principal urmărit a constat în dezvoltarea unei tehnici originale de citometrie computerizată, care să permită un studiu complex în citopatologia şi histopatologia mamară. Consecutiv, obiectivele specifice urmărite au fost reprezentate de: - analiza unor descriptori geometrici celulari şi nucleari aplicabili în citologia mamară, şi corelarea lor cu trăsăturile calitative, urmărind accentuarea diferenţelor existente între profilul celular benign şi malign; - analiza comparativă a unor descriptori geometrici nucleari aplicabili în histopatologia mamară, urmărind caracterizarea modificărilor populaţiei celulare în cursul transformării maligne CRITERII MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ Material şi metodă Materialul de studiu a fost reprezentat de un număr de 20 cazuri cu frotiuri mamare corespondente (Serviciul de Anatomie Patologică şi Prosectură, Spitalul Judeţean Brăila, Cytopath SRL), recoltate prin puncţie cu ac fin şi colorate Papanicolaou, încadrate, sub raportul diagnosticului, ca leziuni benigne (lotul 1: 10 cazuri) şi maligne (lotul 2: 10 cazuri - carcinom ductal). Cele 10 cazuri cu diagnostic citologic de carcinom ductal au fost evaluate şi prin prisma sistemului de grading nuclear Black modificat de Fisher (Fisher et al., 1980), având următoarea distribuţie: grad citologic 1 3 cazuri, grad citologic 2 3 cazuri, grad citologic 3 4 cazuri. Toate frotiurile au fost utilizate pentru realizarea de imagini digitizate corespunzătoare unor câmpuri reprezentative, sub raportul celularităţii. Metodologia de lucru a utilizat mediul software Zeiss KS400 (Kontron Electronik, 2002), disponibil în cadrul Disciplinei de Histologie, UMF Gr. T. Popa Iaşi şi a constat în analiza cantitativă computerizată a imaginilor digitizate, prin conceperea şi implementarea unui macrou dedicat citologiei mamare Rezultate Algoritm de evaluare prin morfometrie computerizată Conceperea şi testarea macroului MAMAR_CIT Pentru fiecare frotiu, din imaginile digitizate, considerate imagini sursă, am realizat selectarea interactivă, cu ajutorul editorului grafic, a unui număr cuprins între celule de interes. Macroul conceput şi implementat a avut ca scop aplicarea algoritmului de măsurare în dinamică, utilizând imaginile sursă individuale pentru obţinerea de imagini mască pe care au fost realizate, prin procedee automate, 10

14 măsurătorile propriu-zise. Măsurătorile au vizat următoarele trăsături geometrice definite prin intermediul macroului: aria celulară, aria nucleară, raportul nucleo-citoplasmatic, diametrul echivalent şi factorul de formă. Pentru înregistrarea datelor numerice rezultate în urma măsurătorilor a fost creată o bază de date, capabilă să permită extragerea individuală sau cumulativă a datelor şi organizarea lor sub formă de tabel. Baza de date a fost creată astfel încât să asigure sumarizarea separată a tuturor informaţiilor numerice corespondente fiecărui caz în parte în mod concret, a celulelor selectate de pe imaginile digitizate preluate de pe fiecare frotiu Textul sursă al macroului MAMAR_CIT Textul sursă al macroului MAMAR_CIT conceput şi implementat include, în maniera particulară de scriere a mediului KS400, toate instrucţiunile de programare Trăsături morfometrice în citologia benignă şi citologia malignă Pentru fiecare caz în parte, pe baza informaţiilor numerice corespunzătoare măsurătorilor realizate pe toate celulele de interes selectate, a fost calculată media SD, pentru toţi cei 5 parametri definiţi: aria celulară, aria nucleară, raport nucleo-citoplasmatic diametrul echivalent şi factorul de formă (tabelul 7.1, 7.2). Pentru lotul 1 citologie benignă, valorile medii ale trăsăturilor morfometrice determinate au fost următoarele: arie citoplasmatică 38,21 10,10 m 2, arie nucleară 53,72 7,02 m 2, raport nucleocitoplasmatic 0,58, diametru echivalent 8,24 0,53 m, factor de formă 0,84 0,05. Pentru lotul 2 citologie malignă, valorile medii ale trăsăturilor morfometrice determinate au fost următoarele: arie citoplasmatică 54,02 18,34 m 2, arie nucleară 208,97 37,00 m 2, raport nucleo-citoplasmatic 0,79, diametru echivalent 16, 23 1,43 m, factor de formă 0,87 0,03. Caz Celule (număr) Tabel 7.1. Valori numerice ale descriptorilor geometrici citologie benignă A_cit A_nucl Nc/Cit (medie) D m) F (medie SD) ,04 9,56 63,20 10,78 0,53 8,95 0,74 0,87 0, ,51 3,10 47,75 6,28 0,67 7,78 0,50 0,90 0, ,64 9,07 52,18 15,45 0,63 8,14 1,12 0,79 0, ,97 7,52 59,35 8,76 0,58 8,68 0,62 0,82 0, ,52 8,03 47,28 12,05 0,60 7,74 0,94 0,93 0, ,42 4,92 65,78 9,15 0,65 9, ,85 0, ,35 17,28 45,56 15,95 0,48 7,60 1,23 0,78 0, ,81 8,43 50,76 14,36 0,63 8,02 1,07 0,84 0, ,22 5,62 55,83 8,43 0,60 8,42 0,61 0,90 0, ,73 10,67 49,55 11,55 0,52 7,93 0,87 0,76 0, ,21 10,10 53,72 7,02 0,58 8,24 0,53 0,84 0,05 *A_cit arie citoplasmatică, A_nucl arie nucleară, Nc/Cit raport nucleo-citoplasmatic, D diametru echivalent, F factor de formă Caz Celule (număr) Tabel 7.2. Valori numerice ale descriptorilor geometrici citologie malignă A_cit A_nucl Nc/Cit (medie) D m) F (medie SD) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,02 18,34 208,97 37,00 0,79 16, 23 1,43 0,87 0,03 *A_cit arie citoplasmatică, A_nucl arie nucleară, Nc/Cit raport nucleo-citoplasmatic, D diametru echivalent, F factor de formă 11