MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII, TINERETULUI ŞI SPORTULUI UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE TEZĂ DE DOCTORAT

Transcription

1 MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII, TINERETULUI ŞI SPORTULUI UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE TEZĂ DE DOCTORAT IMUNOHISTOCHIMIA ÎN DIAGNOSTICUL DIFERENŢIAL DINTRE ADENOCARCINOMUL ENDOMETRIAL ŞI ADENOCARCINOMUL ENDOCERVICAL REZUMAT DOCTORAND: Dr. RADU (CRIŞAN) ADRIANA CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ. dr. MAGHIAR TEODOR TRAIAN ORADEA

2 CUPRINS Nr.cr. Denumire Pag. PARTEA 1 Introducere 1 Cap. 1. Date din literatură privind embriogeneza şi morfologia macroscopică 3 a sistemului genital 1.1. Embriogeneză Gonadele Căile genitale Morfologia macroscopică uterină Corpul uterin Colul uterin Configuraţia exterioară a uterului Configuraţia internă a uterului Structura uterului (constituţia anatomică) Vase şi nervi Mijloacele de susţinere a colului şi a vaginei Ligamentele principale Raporturi Raportul dintre uter ca întreg şi pelvis Consideraţii funcţionale Explorare şi căi de acces 22 Cap. 2. Histofiziologia uterului Histofiziologia corpului uterin Endometrul Variaţii regionale Componentele endometrului Variaţii temporale Miometrul Histofiziologia colului uterin Elemente morfologice Elemente funcţionale 40 Cap. 3. Patologia carcinoamelor uterine 3.1. Clasificarea generală a carcinoamelor uterine Clasificarea carcinoamelor corpului uterin Clasificarea carcinoamelor colului uterin Stadializarea carcinoamelor uterine Stadializarea carcinoamelor corpului uterin Stadializarea carcinoamelor colului uterin Metode de diagnostic ale carcinoamelor uterine Noţiuni de genetică moleculară Elemente de diagnostic ale carcinoamelor corpului uterin Elemente de diagnostic ale carcinoamelor colului uterin Tipuri histologice ale carcinoamelor uterine Tipuri histologice ale carcinoamelor corpului uterin Tipuri histologice ale carcinoamelor colului uterin Tratamentul carcinoamelor uterine Tratamentul carcinoamelor corpului uterin

3 Tratamentul carcinoamelor colului uterin Factori de prognostic Generalităţi Factori de prognostic ai carcinoamelor corpului uterin Factori de prognostic ai carcinoamelor colului uterin 88 PARTEA 2 Cap. 4. Scopul lucrării 89 Cap. 5. Material şi metodă Studiul statistico-epidemiologic Studiul imunohistochimic Selectarea lotului de studiu Tehnici de macroscopie Biopsia sau curetajul endometrial Histerectomia Histerectomie pentru hiperplazia endometrială 93 sau carcinomul endometrial Tehnici de microscopie Secţiuni pentru histologie Colorarea hematoxilină-eozină (HE) Metode imunohistochimice Tipuri de antigene Tehnici specifice Studiul imagistic Imagistica prin rezonanţă Instalaţia RMN Computer tomografia Ansamblul instalaţiei de TC 135 Cap. 6. Rezultate Studiul statistico- epidemiologic Studiul imunohistochimic Studiul imagistic 216 Cap. 7. Discuţii Discuţii la studiul statistico- epidemiologic Discuţii la studiul imunohistochimic Discuţii la studiul imagistic 245 Cap. 8. Concluzii 248 Cap. 9. Bibliografie 251 Anexa 274 3

4 INTRODUCERE Studiile epidemiologice actuale, la nivel mondial şi european, a organizaţiilor preocupate de implementarea programelor de screening pentru prevenirea cancerelor atestă faptul potrivit cărora cancerul uterin reprezintă aproximativ 12% din totalul cancerului femeii. Aceste studii, afirmă că, în ţările în curs de dezvoltare în care aceste programe sunt inexistente sau inadecvate, cancerul uterin constituie principala cauză de deces a populaţiei feminine, în schimb ce în ţările în care au fost implementate s-a redus semnificativ rata morbidităţii şi mortalităţii prin cancer uterin. Programul de screening presupune un sistem eficient de chemare-rechemare, diagnostic, tratament şi un sistem centralizat de baze de date. Totuşi, în multe ţări europene, aceste recomandări nu sunt îndeplinite, cancerul uterin rămânând o sursă semnificativă de decese. În plus, o proporţie de 20% dintre cazurile de cancer uterin rămân nedeterminate, în special adenocarcinoamele cervicale, care sunt mai greu de depistat chiar în condiţiile unor programe de screening bine organizate. Diagnosticul pozitiv al cancerului uterin nu este întotdeauna unul facil, cu atât mai mult cu cât pe baza cercetărilor din ultimii ani s-au conturat o serie de entităţi noi, cu criterii distincte de încadrare şi cu particularităţi clinico-evolutive şi prognostice. Sunt situaţii în care datele oferite de coloraţiile uzuale sunt insuficiente pentru diagnostic, iar metodele histochimice şi imunohistochimice permit un diagnostic morfologic mai exact şi, în conseciţă, o atitudine terapeutică mai exactă. Din aceste motive, imunohistochimia s-a dezvoltat ca o necesitate diagnostică, fiind actualmente larg aplicată în lume în scopul clarificării cazurilor problemă. Progresele făcute în dezvoltarea şi utilizarea imunohitochimiei în patologia ginecologică se regăsesc în eforturile depuse pentru încadrarea leziunilor, a elucidării etiologiei lor, a diferenţierii faţă de leziunile de graniţă şi, nu în cele din urmă, a studierii factorilor implicaţi în diagnosticul diferenţial şi în prognosticul lor. În patologia cacerului uterin imunohistochimia este utilă în special pentru diagnosticul diferenţial al leziunilor care necesită un management diferit cum ar fi: - diferenţierea adenocarcinomului endometrial de adenocarcinomul endocervical; - diferenţierea carcinomului scuamos bazaloid de carcinomul adenoid chistic; - gradarea cu exactitate a leziunilor preinvazive scuamoase - detectarea focarelor microinvazive; - diferenţierea între un carcinom primar şi unul metastatic; - precizarea originii epiteliale/menzenchimale a tuturor slab diferenţiate sau nediferenţiate; - identificarea tumorilor cu un comportament extrem de agresiv în vederea unui tratament adecvat; - evaluarea prognosticului unor tumori maligne. Nu există un marker specific 100% pentru diagnosticul leziunilor, dar folosind un panel mai larg de anticorpi cresc şansele unui diagnostic corect. Studiul efectuat în prezenta lucrare privind diagnosticul diferenţial dintre adenocarcinomul endometrial şi adenocarcinomul endocervical scoate în evidenţă importanţa unui diagnostic imunohistochimic. Imunomarcajul reprezintă o armă dicriminativă în cadrul diagnosticul diferenţial. Diagnosticul de cercitudine pe piese bioptice de mici dimensiuni reprezintă un scop al acestui studiu. Materialul studiat în această lucrare este reprezentat de un material uman, selectat de la 899 de paciente în perioada diagnosticate cu leziuni tumorale uterine maligne, cu vârsta cuprinsă înter 20 şi 84 de ani. Materialul cercetat a fost dirijat în trei direcţii de studiu: studiul statistico-epidemiologic, studiul imunohistochimic şi studiul imagistic. Studiul statistico-epidemiologic se bazează pe datele obţinute de la Serviciul de Statistică a judeţului Bihor şi a Registrului Regional de Cancer Bihor. 4

5 Studiul imunohistochimic s-a realizat pe 66 de cazuri de adenocarcinoame endometrioide provenite atât de la nivelul colului cât şi a corpului uterin. Cazurile au fost selectate din cadrul Spitalului Clinic Judeţean Oradea, Laboratorul de Anatomie-Patologică, Spitalul de Obstetrică şi Ginecologie Oradea, Laboratorul de Anatomie-Patologică şi din cadrul Laboratorului de Anatomie- Patologică a Complexului Medical Pelican. Acest studiu a urmărit diferenţierea între celulele tumorale ale endometrului faţă de celulele tumorale ale endocolului cu ajutorul markerilor Keratine AE1/AE3, CK7, CK20, CEA, EMA, Vimentina, Actina muşchiului neted, ER, PR, Ki-67,ciclina D1 şi CD34. Studiul imagistic s-a realizat pe un număr de 116 bolnave examinate în Centrul de Radiologie şi Imagistică Medicală al Spitalului Clinic Pelican din Oradea având un rol esenţial în planificarea terapeutică şi urmărirea eficacităţii tratamentului. Planul tehnic al lucrării este conceput cuprinzând I parte Partea generală (stadiul cunoaşterii) si a II-a parte, Partea personală (contribuţii proprii). Partea generală cuprinde următoarele 3 capitole: - CAP.I. Date din literatură privind embriogeneza şi morfologia macroscopică a sistemului genital. - CAP.II. Histofiziologia uterului. - CAP.III. Patologia carcinoamelor uterine În Partea generală am redat date clasice şi informaţii recente despre morfologia uterină precum si despre histofiziologia endometrului şi a mucoasei colului uteri. Totodată am prezentat noţiuni de actualitate despre morfopatologia tumorilor epiteliale maligne ale corpului uterin şi ale colului uterin. Coroborând date obţinute din diverse şi numeroase lucrări bibliografice, ale căror titluri se regăsesc menţionate în secţiunea bibliografie, am reactualizat subiectul privind histofiziologia ţi patologia carcinoamelor uterine pentru a putea susţine discuţii concludente în cea de a doua parte, personală, a acestei lucrări. Partea personală cuprinde de asemenea 3 capitole şi constă în realizarea a 3 studii studiul statistico-epidemiologic, studiul imunohistochimic şi studiul imagistic cu acelaşi desfăşurător parametric: Material şi metode, Rezultate şi Discuţii. Lucrarea se încheie cu un capitol de Concluzii generale, pertinente, obţinute din discuţiile asupra rezultatelor celor 3 studii efectuate. Bibliografia, expusă în final, cuprinde un număr de 255 titluri bibliografice, în marea lor majoritate din literatura de specialitate străină, recentă, care documentează realizarea acestei lucrări. Secţiunea bibliografică conţine o Anexă cu lucrările personale în legătură cu tema studiată, prezentate la manifestări stiinţifice. MATERIAL ŞI METODĂ A. STUDIUL STATISTICO-EPIDEMIOLOGIC Studiul statistic a folosit date provenite de la nivelul Institutului de Statistică Bihor şi a Registrului Regional de Cancer Bihor. Ca si metodă de lucru, am procedat la întocmirea pentru fiecare caz a unei fișe de urmărire (fişă personală) care a cuprins date clinice din foile de observaţie clinică curente şi arhivate (vârsta, motivele internării, antecedentele personale fiziologice şi patologice din care să reiasă eventualele perturbări hormonale, data orientativă a constatării formaţiunii tumorale, după caz, simptomele şi semnele clinice obiective examene paraclinice biopsii anterioare, tomografie computerizată, echografie, diagnostic clinic prezumtiv) precum şi din fişele de însoţire a materialului bioptic (aspectul macroscopic al leziunii si eventuala invazie) şi din registrele anatomopatologice (aspecte macroscopice detaliate şi diagnostic histopatologic). B. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC a. SELECTAREA LOTULUI DE STUDIU Din numărul total de cazuri diagnosticate cu leziuni tumorale uterine maligne în cei 5 ani, pentru studiul imunohistochimic s-au selectat 66 de cazuri de adenocarcinoame endometrioide provenite atât de la nivelul colului (29 de cazuri) cât şi a corpului uterin (37 de cazuri). 5

6 b. TEHNICI DE MACROSCOPIE Este foarte important diagnosticul macroscopic atât al pieselor operatorii uterine cât şi al pieselor bioptice, de mici dimensiuni. Ansamblul de fragmente tisulare sau de organe prelevate fie prin puncţie cu ac sau cu trocare, fie prin metode endoscopice, fie de chirurg prin intervenţii laparascopice, pentru obţinerea unui diagnostic histologic au urmat protocoale orientative de macroscopie în vederea unei standardizări a rezultatului final. Tehnicile de macroscopie au fost adaptate particularităţilor fiecărei piese în parte. c. TEHNICI DE MICROSCOPIE Tehnicile de microscopie presupun realizarea secţiunilor pentru histologie utilizând tehnica includerii la parafină. Având în vedere numărul mare de elemente care urmau să fie analizate (fibre de colagen, fibre elastice, fibre de reticulină, vase de sânge, nervi, celule epiteliale, celule conjunctive) o singură coloraţie de rutină ar fi fost insuficientă. Din această cauză s-au folosit şi tehnici de colorare specifice diferitelor elemente. Colorarea hematoxilină eozină (HE). Colorarea hematoxilină eozină este o practică standard pentru colorare cu hematoxilină în mod regresiv, adică cu o culoare suficient de puternică pe o perioadă de timp suficient de lungă pentru a asigura o oarecare o supracolorare a nucleilor şi colorarea obscură a structurilor ce se îndepărtează prin tratamentul cu acid (diferenţierea). Metoda imunohistochimică. Imunohistochimia (IHC) este o tehnică histologică de identificare a constituenţilor celulari sau tisulari, este o metodă modernă complementară în anatomia patologică care are la bază evidenţierea unor antigene specifice ţesuturilor sau celulelor normale sau tumorale. Markerii utilizaţi în studiul de faţă referitori la adenocarcinoamele uterine sunt: Citokeratinele: AE1/AE3, CK7, CK20; Markeri mezenchimali: Vimentină Vim, Actină muşchi neted SMA; Anticorpi anti-glicoproteine epiteliale: CEA, EMA; Markeri de proliferare celulară: Ki-67; Markeri ai ciclului celular: Ciclina D1; Markeri vasculari: CD34; Receptori hormonali: ER, PR. Pentru studiul imunohistochimic am utilizat metoda bazată pe complexe imunoenzimatice solubile, numită LSAB/HRP (labelled streptavidin biotin), una din metodele numite ABC (avidin-biotin complex), iar markerii utilizaţă au fost de la firma NOVOCASTRA. Pentru fiecare anticorp utilizat am efectuat atât controlul extern pozitiv cât si controlul extern negativ, folosind aceeasi tehnică de lucru. De asemenea pe secțiunile de diagnostic am urmărit existența controlului intern pozitiv. Prelucrarea corectă a materialului va duce la elimnarea reacţiilor fals pozitive şi fals negative. C. STUDIUL IMAGISTIC a. IMAGISTICA PRIN REZONAŢĂ MAGNETICĂ (IRM) Imagistica RMN (IRM) are ca scop realizarea imaginii bidimensionale dintr-o anumită secţiune a corpului din care e posibilă obţinerea unei imagini tridimensionale, pornind de la un număr mare de secţiuni ori chiar a unei înregistrări tridimensionale, a răspunsului ţesuturilor la un semnal magnetic ce induce RMN a protonilor, oferind în felul acesta informaţii privind starea fiziologică sau patologică a ţesuturilor. Parametrii măsurabili care mijlocesc aceste informaţii sunt densitatea de protoni şi timpii de relaxare (T 1 şi T 2 ). Primul parametru (densitatea de protoni) este, evident, legat de hidratarea ţesuturilor, iar timpii de relaxare depind de starea apei în ţesuturi (apă liberă, apă legată), deci de interacţiunea ei cu moleculele biologice. 6

7 b. COMPUTER TOMOGRAFIA Tomografia computerizată este o metodă de investigaţie imagistică care diferenţiază structurile anatomice între ele pe baza diferenţelor de densitate ale acestora imaginea formându-se dintr-o multitudine de nuanţe de gri, care au expresie numerică în scala Hounsfield. REZULTATE A. STUDIUL STATISTICO - EPIDEMIOLOGIC Cazuistica luată în studiu în perioada cuprinde un număr de 899 de paciente diagnosticate cu leziuni tumorale uterine maligne, cu vârsta cuprinsă între 20 şi 84 de ani. Analiza cazurilor pe 5 ani ( ), s-a făcut luând în studiu mai mulţi factori: variaţia numărului de cazuri, vârsta, mediul de provenienţă, incidenţa tumorilor uterine, mortalitatea prin tumori uterine. Analiza volumului mare de date statistice au avut drept finalitate următoarele rezultate. În analiza unitară a cancerului uterin relevă o minimă variaţie în cei cinci ani luaţi în calcul. Diferenţa dintre numărul minim 167 de cazuri (2006) şi numărul maxim de cazuri raportate 188 (2009) este nesemnificativă statistic, 21 de cazuri (tabel nr. 1) Tabel nr.1. Repartiţia pe ani a leziunii uterine maligne Repartizarea celor 899 de cazuri prezentând o patologie malignă uterină, aici se includ atât leziunile neoplazice maligne de la nivelul colului uterin cât şi a neoplaziilor maligne aparţinând corpului uterin, relevă două trenduri distincte: leziunile maligne cervicale prezintă o variaţie sinusoidală în cei cinci ani luaţi în studiu comparativ cu o descreştere uşoară a numărului de cazuri în ceea ce priveşte cazuistica neoplazică malignă a corpului uterin în perioada , urmată de o creştere semnificativă în 2009 (tabel nr. 2). ANI COL UTERIN CORP UTERIN Tabel nr. 2. Repartiţia pe ani şi localizări a leziunii uterine maligne În cazul analizei numărului de cazuri de cancer la nivelul uterului raportate la numărul total de cancere ale sexului feminin din anii corespunzători se remarcă o evoluţie sinuoasă cu un peak în anul 2009 (1126 cazuri) și cu un număr minim în anul În analiza procentuală se remarcă o variaţie sinusoidală a numărului de leziuni maligne uterine cu o descreştere în ultimii ani (tabel nr. 3). ANI NR. TOTAL NR. UTER PROCENT 19,36% 17,86% 19,04% 18,21% 16,69% Tabel nr.3. Repartiţia pe ani a leziunii uterine maligne raportate la numărul total de cazuri cancer la femei Analiza vârstelor pacientelor ce prezintă tumori uterine maligne relevă o tendinţă de scădere a vârstei de apariţie a cancerului uterin. Dacă primele două grupe de vârstă prezintă o stabilitate în cei cinci 7

8 ani studiaţi de noi, în cazul ultimelor două grupe de vârstă se vede scăderea numărului de cazuri diagnosticate după vârsta de 60 de ani. Analiza vârstei s-a realizat pentru întreaga patologie malignă a corpului uterin şi a colului uterin. Repartiţia pacientelor cu leziuni uterine maligne în funcţie de grupele de vârstă este prezentată în tabelul nr.4. Anul Grupe de vârstă > Totalul pe grupe de vârstă Total Tabel nr.4. Structura pe grupe de vârstă Repartiţia cazurilor după mediul de provenienţă (tabel nr. 5.) arată predominanţa celor proveniţi din mediul urban (631 de cazuri), faţă de cei din mediul rural (268 de cazuri). Adresabiliatatea medicală a pacientelor din mediul rural constituie şi în zilele noastre un impediment major, având drept consecinţă o scădere falsă a numărului de cazuri prin subdiagnosticare. Anul Urban Rural TOTAL Total Tabel nr. 5. Repartiţia cazuisticii după mediul de provenienţă Analiza statistico-epidemiologică a deceselor din cauza tumorilor uterine relevă situația din tabelul nr. 6. Numărul totale de decese provenite din mediul rural -133 cazuri, comparativ cu numărul de decese provenite din mediul urban -131, subliniază o egalitate a acestora. Analiza pe ani a acestor decese ne indică o constanţă a deceselor cu foarte mici variaţii anuale (2-3 cazuri). Anul Decedaţi uterin - Urban Decedaţi uterin - Rural Decedaţi uterin - U + R Decedați cu cancer col uterin Decedați cu cancer uterin TOTAL Tabel nr. 6. Situaţia comparativă pentru cazurile de deces cu cancer uterin 8

9 Cancerul de col uterin este, în mod constant şi în intervalul studiat în cadrul prezentei teze de doctorat, a doua localizare a tumorilor maligne la sexul feminin, după neoplasmul mamar. Luate individual cele două localizări uterine nu se găsesc pe primul loc în judeţul Bihor, dar dacă le sumăm remarcăm că vom avea un număr de 899 de cazuri de cancer uterin în faţă de 948 cancer mamar (tabel nr. 7). Denumire boală Total localizări TOTAL Neoplasm mamar Neoplasm col uterin Neoplasm ovar Neoplasm corp uterin Neoplasm bronhopulmonar Neoplasm de piele Tabel nr.7. Situaţie pentru primele localizări pe sex feminin în perioada Raportarea numărului de cancere uterine la populaţie feminină ne indică că 266,36 persoane din populaţia feminină a judeţului prezintă o patologie neoplazică malignă uterină la de locuitori feminini, adică un procent de 0.266% (grafic nr. 1, 2). Număr cazuri col/ de locuitori ,49 39,24 39,06 37, , Grafic nr.1. Număr de cazuri de cancer de col uterin la locuitori/feminini 9

10 Nr. cazuri corp/ locuitori feminini 25 21, ,52 18,21 16, Grafic nr.2. Număr de cazuri de cancer de corp uterin la locuitori/feminini B. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC Uterul reprezintă un oragan unde îşi au originea numeroase tumori de natură epitelială şi mezenchimală iar unele ridică probleme de diagnostic diferenţial. Imunohistochimia aduce o plus-valoare în diagnosticul diferenţial al adenocarcinoamelor endometriale faţă de adenocarcinoamele endocervicale, precum şi în identificarea leziunilor precursoare. În cadrul studiului nostru am cercetat 37 de paciente ce prezentau adenocarcinom endometrial şi 29 de paciente diagnosticate anterior cu adenocarcinom endocervical. Am încercat includerea în studiul nostru majoritar a cazurilor diagnosticate pe chiuretaje bioptice. Cazurile au fost randomizate fără a se folosi criterii de includere sau excludere. Diagnosticul iniţial de certitudine se impune din perspectiva schemei de tratament aleasă, aceasta fiind diferită în funcţie de localizarea cervicală sau la nivelul corpului uterin. Din punct de vedere microscopic atât adenocarcinomele endometriale cât şi cele endocervicale prezintă variate tipuri histologice aşa cum s-a prezentat în capitolul 3. În cadrul studiului nostru am analizat caracterele histologice şi profilele imunohistochimice ale tipului endometrioid pentru ambele localizări. Aspectul histologic al adenocarcinomului cervical şi adenocarcinomului de corp uterin, în coloraţiile de rutină (hematoxilină-eozină) sunt foarte asemănătoare. Anumite cazuri permit un diagnostic diferenţial de acurateţe, dacă se pot identifica lezini histologice premaligne (leziuni maligne in situ pentru endocol, hiperplazie glandulară cu atipii pentru endometru) (fig.1, fig. 2). Factorii prognostici clasici, gradul de diferenţiere şi stadiul tumoral, nu sunt suficienţi pentru diagnosticul diferenţial al adenocarcinoamelor endometriale şi a celor endocervicale. Folosirea de anticorpi monoclonali după algoritmuri bine stabilite constituie soluţia diagnsoticului de certitudine. Pentru confirmarea originii epiteliale majoritatea tumorilor vor exprima citokeratinele (AE1- AE3-pancitokeratina). Pancitokeratina marchează citoplasmatic celulele de origine epitelială. Pozitivitatea reacţiei este evidenţiată prin culoarea maro, datorită cromogenului folosit (DAB). 10

11 Fig. 1. Adenocarcinom endometrial, bine diferenţiat, G1, Col. HE 200x Fig. 2. Adenocarcinom de col uterin, bine diferenţiat, G1, Col. HE 200x Fig. 3. Adenocarcinom endometrial. Imunomarcaj AE1-AE3 100x 11

12 Fig. 4. Adenocarcinom endometrial. Imunomarcaj AE1-AE3 200x Fig. 5. Adenocarcinom de col uterin. Imunomarcaj AE1-AE3 200x În fig. 3 se remarcă imaginea capturată la magnitudine mai mare, expresia unui adenocarcinom de corp uterin de tip endometrioid având arii cu aspecte papilifere. Examinarea cu obiectiv mărit (fig. 4) evidenţiază şi infiltratul limfo-plasmocitar. Acesta din urmă constituie reactivitatea sistemului imun împotriva structurilor considerate non-self. În cazul adenocarcinomului de col uterin (fig 5) se remarcă exprimare citoplasmatică difuză la nivelul celulelor tumorale glandulare. Pentru o apreciere discriminativă a structurilor epiteliale se folosec markeri adiacenţi suplimentari: antigenul membranar epitelial - EMA şi citokeratinele CK7 şi CK20. În studiul nostru am observat imunomarcare intens pozitivă a citoplasmelor celulelor adenocarcinomatoase atât la nivel endometrial (fig. 6), cât şi la nivel endocervical (fig. 7). Rezultă că EMA este un marker al cărui imunomarcaj nu are expresivitate semnificativă în stabilirea diagnosticului diferenţial dintre adenocarcinoamele endometriale şi adenocarcinoamele endocervicale. Totuşi EMA este un marker util în identificarea naturii carcinomatoase a metastazelor. Citokeratinele CK7 şi CK20 marchează imunohistochimic citoplasmele celulelor. Referitor la acest tandem CK7-CK20 din studiul nostru a reieşit marcaj intens exprimat a CK7 la nivelul celulelor adenocarcinomatoase de la nivelul endometrului (fig. 8) şi marcaj moderat exprimat la nivelul celulelor adenocarcinomatoase de la nivel endocervical (fig. 9). Prin contrast citokeratina 12

13 CK20 considerăm că prezintă imunomarcaj negativ la nivelul ambelor componente glandulare ale uterului (endometru şi mucoasa endocervicală). Fig. 6. Adenocarcinom endometrial. Imunomarcaj EMA 100x Fig. 7. Adenocarcinom de col uterin. Imunomarcaj EMA 100x Fig. 8. Adenocarcinom endometrial. Imunomarcaj CK7 100x 13

14 Fig. 9. Adenocarcinom de col uterin. Imunomarcaj CK7 100x Vimentina este proteina filamentelor intermediare din celulele de origine mezenchimală. Localizarea reacţiei imunohistochimice la vimentină este difuz citoplasmatică. Fig. 10. Adenocarcinom endometrial. Imunomarcaj vimentină 200x Fig. 11. Adenocarcinom de col uterin. Imunomarcaj vimentină 100x 14

15 Iniţial, vimentina a fost considerată ca pricipalul marker al tumorilor mezenchimale. Dar în ceea ce priveşte patologia tumorală malignă valoarea ei ca marker de diferenţiere mezenchimală a scăzut după ce a fost exprimată şi de unele celule şi tumori epiteliale, printre care şi cele endometriale. În această categorie se remarcă coexpresia citokeratinei şi vimentinei. În cazul studiului nostru am constatat că adenocarcinoamele de endometru coexprimă citokeratine cu greutate moleculară scăzută CK7 (fig. 8) şi vimentina (fig.10). Adenocarcinoamele de col uterin exprimă doar citokeratine (fig. 9) imunomarcajul pentru vimentină fiind negativ la nivel de celule proliferate tumoral (fig. 11), sau foarte redus, sub 10%. Totodată pentru tumorile epiteliale glandulare ale endocolului am remarcat imunoexpresia pentru vimentină a stromei endocervicale (fig. 11). Antigenul carcino-embrionar CEA este un antigen oncofetal, o proteină membranară. Este cel mai vechi şi mai larg utilizat marker al carcinoamelor. Interpretarea imunomarcajului se realizează ţinând seamă de faptul că poate prezenta mai multe patternuri, toate considerate pozitive: citoplasmatic, luminal, precum şi pattern asociat citoplasmatic şi luminal.. Fig. 12. Adenocarcinom endometrial. Imunomarcaj CEA 400x Reactivitatea la CEA a adenocarcinoamelor endometriale uterine este de intensitate slabă, luminală, (fig.12) comparativ cu expresia de intensitate ridicată, citoplasmatică şi luminală în carcinoamele endocervicale (fig. 13). Fig. 13. Adenocarcinom de col uterin. Imunomarcaj CEA 400x 15

16 Panelul de diferenţiere folosit în studiul nostru include şi expresia receptorilor hormonali feminini (receptor estrogenic-er, receptor progesteronic-pr). Receptor estrogenic ER prezintă marcaj nuclear şi prezenţa sa se poate corela şi cu gradul de diferenţire, respectiv prognosticul tumorii. Receptor progesteronic PR se poate identifica de asemenea intranuclear. În conformitate cu FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) există o variaţie a expresivităţii în funcţie de gradul histologic: gradul 1 şi 2 ale adenocarcinomului endometrioid de corp uterin exprimă ER/PR şi vimentina, iar majoritatea adenocarcinoamelor endocervicale sunt negative pentru ER/PR. Expresia receptorilor estrogenici este generalizată în cazul adenocarcinomului uterin. Intensitatea ER este ridicată (fig. 14). Carcinoamele endometriale bine şi moderat diferenţiate prezintă pozitivitate pentru ER şi PR (fig. 14, 15), în timp ce adenocarcinoamele endocervicale de obicei sunt negative pentru receptorii hormonali în tehnicile imunohistochinice (IHC). Fig. 14. Adenocarcinom endometrial. Imunomarcaj ER 200x Fig. 15. Adenocarcinom endometrial; Imunomarcaj PR 100x Studiul nostru a relevat atât în cazul imunomarcajului ER cât şi PR o limitare la nivelul structurilor glandulare; elementele stromale endometriale nu exprimă receptori hormonali. Expresivitatea receptorilor hormonali la nivelul adenocarcinomului de endocol relevă în cadrul studiului nostru o prezenţă scăzută atât ca intensitate cât şi ca număr de nuclei pozitivi. 16

17 Analiza adenocarcinoamelor de endocol a relevat un număr mai mare de celule receptori hormonali pozitive la nivelul stromei normale, peritumorale, comparativ cu structurile glandulare neoplazice, fapt remarcat în imunomarcaj ER (fig.16). În acest caz se observă în dreapta imaginii nuclei pozitivi ai celulelor stromale având intensitate cromogenică ridicată. Imunomarcajul cu PR (fig. 17) este focal pozitiv de intensitate redusă spre moderată. Stroma desmoplazică prezintă infiltrat inflamator limfo-plasmocitar peritumoral. Fig. 16. Adenocarcinom col uterin; Imunomarcaj ER 100x Fig. 17. Adenocarcinom col uterin; Imunomarcaj PR 100x În cadrul cercetării noastre am folosit un alt marker mai puţin obişnuit la acest nivel - Ciclina D1. Aceasta este o proteină nucleră ce face parte din familia ciclineor kinazo-dependente. Reacţia pozitivă a celulelor tumorale la Ciclina D1 se evidenţiază prin reacţie cromogenică la nivelul nucleilor, în cazul adenocarcinoamelor de endometru (fig. 18). În ceea ce priveşte localizarea endocervicală a adenocarcinoamelor şi imunomarcajul lor cu Ciclina D1, acesta este extrem de discret şi doar focal pozitiv, motiv pentru care se consideră lipsit de expresie (fig. 19). 17

18 Fig. 18. Adenocarcinom endometrial; Imunomarcaj Ciclina D1 100x Fig. 19. Adenocarcinom col uterin; Imunomarcaj Ciclina D1 200x Analiza indicelui de proliferare celulară Ki-67 poate aduce informaţii utile patologului pentru a putea discerne între cele două tipuri de carcinoame. Fig. 20. Adenocarcinom endometrial; Imunomarcaj Ki x 18

19 Fig. 21. Adenocarcinom col uterin; Imunomarcaj Ki x Antigenul Ki-67 este un marker al ciclului celular şi al proliferării celulare utilizat pentru estimarea coeficientului de proliferare într-o populaţie celulară. Marcarea cu antigenul Ki-67 a evidenţiat un tablou de colorare nuclear atât intens şi difuz al întregului nucleu (fig. 20) cât şi focal/punctiform (fig. 21). Studiind expresia antigenului Ki-67 pe cazurile studiate am observat o heterogenitate a expresiei şi imunoreacţie pozitivă în toate cazurile. Datorită faptului că în adenocarcinoamele endometrial şi endocervicale datele referitoare la valoarea prognostică a indicelui Ki-67 sunt reduse, relaţia dintre rata de pozitivare Ki-67 şi prognostic rămâne neclară. În cadrul studiului am propus un algoritm matematic pentru evaluarea imunomarcajului unui panel de markeri (ER, PR, Vimentină, CEA, Ciclina D1). Algoritmul constă în acordare de valori/scoruri imunomarcajelor pentru markerii monoclonali amintiţi anterior. Am împărţit expresia anticorpilor monoclonali în 11 grade cu extremele 0 şi 10, respectiv fără expresie şi expreise maximă astfel: 0. - fără reactivitate; 1. - reactivitate slabă sub 10% din celule; 2. - reactivitate medie sub 10% din celule; 3. - reactivitate ridicată sub 10% din celule; 4. - reactivitate slabă sub 30% din celule dar mai mare de 10%; 5. - recativitate medie sub 30% din celule dar mai mare de 10%; 6. - reactivitate ridicată sub 30% din celule dar mai mare de 10%; 7. - reactivitate slabă mai mare de 30% dar mai mică de 50%; 8. - reactivitate medie mai mare de 30% dar mai mică de 50%; 9. - reactivitate ridicată mai mare de 30% dar mai mică de 50%; reactivitate ridicată mai mare de 30% indiferent de procent. Evaluarea cantitativă a rezulatelor imunomarcajelor a fost repartizată în trei grupe: prima grupă se consideră a fi marcaj de intensitate scăzută; a doua grupă se consideră a fi marcajul continuu cu intensitate medie; a treia grupă reprezintă marcajul cromogenic cu intensitate ridicată. Pentru fiecare din cele 37 de cazuri de adenocarcinoame de endometru de tip endometrioid diagnosticate în coloraţia HE am folosit panelul de markeri menţionaţi anterior. În funcţie de intensitatea exprimării am acordat scoruri prezentate în tabelul nr

20 Tabel nr. 8. Valoarea scorurilor imunomarcajelor-endometru Nr. caz ER PR VIM CEA CY D Total scor Valori medii 7,92 5,86 6,57 2,62 4,08 Pentru fiecare din cele 29 de cazuri de adenocarcinoame de col uterin de tip endometrioid diagnosticate în coloraţia HE am folosit panelul de markeri menţionaţi anterior. În funcţie de intensitatea exprimării am acordat scoruri prezentate în tabelul nr. 9. Tabel nr. 9. Valoarea scorurilor imunomarcajelor-col uterin Nr. caz ER PR VIM CEA CY D

21 Total scor Valori medii 2,34 1,31 3,83 4,59 0,45 S-a făcut evaluarea semicantitativă şi încadrarea rezultatelor imunomarcajelor în cele trei grupe amintite. Diagnosticul diferențial stabilindu-se pe baza grupei 3, făcând un paralelism între adenocacinomul endometrial și adenocarcinomul endocervical, pentru fiecare marker din panel se desprind următoarele idei: Imunomarcajul pentru receptori hormonali estrogenici ER în cazul adenocacinomului endometrial prezintă 29 de cazuri în grupa 3, adică un procent de 78,38%, cu o medie a scorurilor de 9,00 şi 8 cazuri în grupele 1 și 2, adică un procent de 21,62%. Pentru adenocarcinomul endocervical avem 4 cazuri în grupa 3, adică un procent de 13,79% cu o medie a scorurilor de 8,25 și 25 de cazuri în grupele 1 și 2 adică un procent de 86,21%. Imunomarcajul pentru receptori de progesteron PR în cazul adenocarcinomului endometrial încadrează 22 de cazuri în grupa 3, adică un procent de 59,46% cu o medie a scorurilor de 7,05 și 15 cazuri în grupele 1 și 2, adică un procent de 40,54%. Pentru adenocarcinomul endocervical avem 1 caz în grupa 3 adică un procent de 3,45% cu o medie a scorurilor de 6.00 și 28 de cazuri în grupele 1 și 2 adică un procent de 96,55%. Imunomarcajul pentru Vimentină în cazul adenocarcinomului endometrial încadrează 29 de cazuri în grupa 3, adică un procent de 78,38% cu o medie a scorurilor de 7,20 și 8 cazuri în grupele 1 și 2, adică un procent de 21,62%. Pentru adenocarcinomul endocervical avem 7 cazuri în grupa 3 adică un procent de 24,14% cu o medie a scorurilor de 7,43 și 22 de cazuri în grupele 1 și 2 adică un procent de 75,86%. Imunomarcajul pentru antigenul carcino-embrionar CEA în cazul adenocarcinomului endometrial repartizează 2 de cazuri în grupa 3, adică un procent de 5,40% cu o medie a scorurilor de 7,50 și 35 cazuri în grupele 1 și 2, adică un procent de 94,60%. Pentru adenocarcinomul endocervical avem 12 cazuri în grupa 3 adică un procent de 41,38% cu o medie a scorurilor de 6,92 și 17 de cazuri în grupele 1 și 2 adică un procent de 58,62%. Imunomarcajul pentru Ciclina D1 în cazul adenocarcinomului endometrial prezintă 14 de cazuri în grupa 3, adică un procent de 37,84% cu o medie a scorurilor de 7,86 și 23 cazuri în grupele 1 și 2, adică un procent de 62,16%. Pentru adenocarcinomul endocervical avem 0 cazuri în 21

22 grupa 3 adică un procent de 0% și 29 de cazuri în grupele 1 și 2 adică un procent de 100%. Centralizarea acestor rezultate este redată în tabelul 10. Tabel nr. 10. Expresivitatea cantitativă a markerilor pe grupe Secțiune/Marker Adenocarcinom endometrial Adenocarcinom endocervical ER Grupa 1 și 2 21,62% Grupa 1 și 2 86,21% Grupa 3 78,38% Grupa 3 13,79% PR Grupa 1 și 2 40,54% Grupa 1 și 2 96,55% Grupa 3 59,46% Grupa 3 3,45% VIMENTINA Grupa 1 și 2 21,62% Grupa 1 și 2 75,86% Grupa 3 78,38% Grupa 3 24,14% CEA Grupa 1 și 2 94,60% Grupa 1 și 2 58,62% Grupa 3 5,40% Grupa 3 41,38% CICLINA D1 Grupa 1 și 2 37,84% Grupa 1 și 2 100% Grupa 3 62,16% Grupa 3 0% Am considerat că un marker este expresiv dacă peste 75% din valoarea scorurilor prezintă marcaj cromogenic de intensitate ridicată, adică aparțin grupei 3 și nu este expresiv dacă peste 75% din valoare scorurilor prezintă marcaj cromogenic de intensitate scăzută sau este nesemnificativ, adică aparțin grupelor 1şi 2. Rezultatele acestui studiu au evidențiat faptul că din panelul de markeri utilizați, ansamblul ER-VIMENTINĂ corespunde algoritmului matematic propus în stabilirea diagnosticului diferențial dintre adenocarcinomul endometrial și adenocarcinomul endocervical, rezultat confirmart și de alte studii [145]. Cea mai importantă combinaţie de anticorpi care se dovedeşte utilă pentru tranşarea diagnosticului diferenţial este ER-Vimentină [145]. Carcinomul endometrial de tip endometrioid este pozitiv difuz şi intens pentru ER şi Vim, iar adenocarcinoamele endocervicale uzuale sunt negative pentru ER şi Vim, chiar dacă ocazional pot prezenta reacţie pozitivă slabă focală. PR şi Ciclina D1 pot prezenta reacţie pozitivă în aproximativ 50% din cazuri (tab.10) în adenocarcinomul endometrial, iar în adenocarcinoamele endocervicale expresia lor este negativă. CEA prezintă reacţie negativă în adenocarcinomul endometrial, iar în adenocarcinoamele endocervicale expresia este pozitivă în aproximativ 50% din cazuri (tab. 10). În general, în cadrul imunohistochimiei se analizează imunoprofilul celulelor tumorale. Analizând cazurile luate în studiu cu proliferări maligne adenocarcinoamatoase am constatat profiluri imunohistochimice şi la nivel stromal în cazul imunomarcajelor cu ER al adenocarcinoamelor endocervicale. De aceea am extins studiul și la nivelul stromei, abordare întâlnită în puține studii. Din considerente histologice, stroma fiind expresivă la nivelul colului, am luat în studiu cazuri de adenocarcinoame endocervicale utilizând expresia a doi markeri monoclonali (ER și actină mușchi neted SMA). Am raportat aspecte stromale tumorale maligne la aspecte stromale din leziuni benigne și la aspecte stromale normale. Analiza globală a aspectelor stromale relevă pierderea imunomarcajului față de ER și SMA cu cât transformările se asociază cu neoplazii benigne respectiv maligne. Pornind de la particularităţile morfologice ale endometrului şi endocolului am extins studiul şi asupra densităţii vasculare medii doar pentru adenocarcinoame endometriale. În cadrul studiului nostru am încercat să analizăm microdensitatea vasculară în cazul leziunilor proliferative maligne comparativ cu aspectele normale sau benigne utilizând markerii CD34 şi actina muşchi neted α- SMA. Luând ca reper densitatea vasculară medie din stroma endometrială normală evaluată semicantitativ, densitatea vasculară medie din stroma tumorală prezintă valori descrescătoare. 22

23 C. STUDIUL IMAGISTIC Studiul a fost efectuat pe un număr de 116 bolnave examinate în Centrul de Radiologie şi Imagistică Medicală al Spitalului Clinic Pelican din Oradea în perioada Acestor bolnave li s-au făcut o gamă largă de examinări imagistice şi anume: - Ecografie generală şi pelvină, aceasta din urmă pentru depistarea eventualelor surse de sângerare ; - Computer Tomografie - CT - prin care se pot pune în evidenţă dimensiunile tumorale, eventualele localizări metastatice şi prezenţa adenopatiilor; - Rezonanţă Magnetică Nucleară - RMN - care este o metodă de o mare acurateţe, care evidenţiază localizările tumorale, localizărilor metastazelor, grupele limfonodale loco-regionale. Stadializarea exactă a tumorii este esenţială pentru planificarea optimă a tratamentului şi pentru prognostic. Cu toate acestea, stadializarea clinică are deficienţe în evaluarea mai multor parametrii, care sunt critice pentru planificarea tratamentului. În prezent este acceptat pe scară largă că imagistica transversală şi, în special IRM, are un rol important de jucat în evidenţierea acestor tumori. RMN-ul este o modalitate excelentă pentru evaluarea cancerului invaziv de col uterin deoarece poate oferi măsurarea obiectivă a dimensiunilor tumorii şi oferă o mare valoare predictivă negativă pentru invazia parametrială şi stadiul IVA al bolii, ce presupune invadarea vezicii urinare şi/sau a rectului. RMN şi tomografia cu emisie de pozitroni (PET)/tomografie computerizată (CT) joacă un rol cheie în identificarea bolii recurente. PET/CT este de asemenea utilă în detectarea metastazelor limfonodale şi la distanţă, precum şi în planificarea radioterapiei. Difuzia ponderată la RMN este o tehnică imagistică emergentă, care este în prezent în curs de evaluare pentru detectarea bolii primare şi recurente şi în evaluarea răspunsului la tratament. Indicatori, cum ar fi dimensiunea tumorii sau invazia stromei cervicale, a corpului uterin, sau parametrelor, sunt folosiţi pentru deciziile de tratament. Delimitarea cât mai precisă a tumorii contribuie la stabilirea atitudinii terapeutice şi creşte precizia radioterapiei aplicate. CT deşi nu este o componentă a Federaţiei Internaţionale de Obstetrică şi Ginecologie (FIGO), se foloseşte la majoritatea pacientelor cu carcinom de col uterin, în special pentru detectarea invaziei limfonodale. CT nu s-a dovedit a fi suficient de eficient pentru evaluarea parametrelor sau a dimensiunilor tumorii din cauza contrastului insuficient dintre tumoră şi parametre. Rezultatele actuale indică faptul că imagistica prin rezonanţă magnetică (IRM) este mai eficientă decât CT pentru delimitarea graniţelor tumorale ale colului uterin şi măsurarea dimensiunilor tumorii. Imagistica prin rezonanță magnetică poate evalua amploarea reală a bolii deoarece prezintă o înaltă rezoluție spațială și de contrast pentru țesuturile și organele pelvine. Studii comparative din cele trei metode (RMN, CT și examen clinic) au demonstrat precizia de 92% pentru RMN, comparativ cu 78% examenul clinic, iar 70% pentru CT [105, 164, 172, 174, 181,194, 205, 220, 243]. CONCLUZII 1. Variaţia numărului de cazuri de carcinom uterin este minimă în cei cinci ani luaţi în studiu ( ); 2. Repartizarea pe grupe de vârstă relevă două peak-uri ani şi ani în privinţa numărului de cazuri de cancer uterin; 3. Comparând provenienţa cancerelor pe mediul rural vs urban cu numărul de decese mediul rural/urban relevă lipsa unui paralelism statistico-epidemiologic; 4. Analiza pe ani a acestor decese ne indică o constanţă a deceselor cu foarte mici variaţii anuale (2-3 cazuri); 5. Cancerul de col uterin este, în mod constant şi în intervalul studiat în cadrul prezentei teze de doctorat, a doua localizare a tumorilor maligne la sexul feminin, după neoplasmul mamar; 6. În cazul patologiei studiate, adenocarcinomul endometrial și adenocarcinomul endocervical, absența unui program de screening la scară națională precum și numărul scăzut de chiuretaje bioptice alături de alți factori (educația sanitară deficitară, nivelul economic scăzut al populației) 23

24 constituie probleme sociale ale prezentului; 7. În cadrul studiului am propus un algoritm matematic pentru evaluarea imunomarcajului unui panel de markeri (ER, PR, Vimentină, CEA, Ciclina D1); 8. Rezultatele acestui studiu au evidențiat faptul că din panelul de markeri utilizați, ansamblul ER-VIMENTINĂ corespunde algoritmului matematic propus în stabilirea diagnosticului diferențial dintre adenocacinomul endometrial și adenocarcinomul endocervical; 9. Coexpresia vimentinei este foarte importantă in diagnosticul diferenţial între carcinomul endometrioid uterin şi adenocarcinomul endocolului în special când diagnosticul este pus pe raclate bioptice; 10. Expresiei Ciclinei D1 este exclusiv exprimată la nivelul leziunilor maligne ale corpului uterin. 11. Studiul a scos în evidență profiluri imunohistochimice și la nivel stromal în cazul imunomarcajelor cu ER al adenocarcinoamelor endocervicale, stroma tumorală manifestându-se diferit din punct de vedere imunohistochimic față de cea normală; 12. Am raportat aspecte stromale tumorale maligne la aspecte stromale din leziuni benigne și din aspecte stromale normale doar pentru cazurile endocervicale utilizând expresia a doi markeri monoclonali (ER și actină mușchi neted α-sma); 13. Analiza globală a aspectelor stromale relevă pierderea imunomarcajului față de ER și SMA cu cât transformările se asociază cu neoplazii benigne respectiv maligne; 14. Aprecierea densităţii vasculare medii (MVD) s-a efectuat doar în cazul adenocarcinoamelor endometriale. Analiza marcajului CD34 şi actină muşchi neted α-sma relevă un număr mai mare de structuri vasculare în mucoasa normală comparativ cu mucoasa neoplazica malignă; 15. Analiza izolată a markerilor poate conduce la erori de diagnostic. 16. Ecografia este metoda de primă intenție în punerea în evidență a unei neoplazii de col uterin, dacă aceasta este de dimensiuni apreciabile. 17. CT a devenit o metodă de rutină pentru stabilirea diagnosticului de cancer de col uterin și a eventualelor determinări secundare. 18. Examinarea CT are o importanță deosebită în stabilirea planului de iradiere a formațiunii tumorale. 19. RMN este o metodă de mare acuratețe în evidențierea unei formațiuni tumorale a colului uterin. Este o metodă bună de tratare a imaginii în ceea ce privește precizia de evaluare a tumorilor și joacă un rol esențial în planificarea terapeutică și urmărirea eficacităţii tratamentului. 20. PET-CT este investigație greu accesibilă atât din punct de vedere financiar cât și din punct de vedere al adresabilității, în țara noastră existând doar doua centre, la Oradea și la București. 21. Examinările radioimagistice pun foarte bine în evidență extensia tumorală și determinările secundare la distanță. 22. Nici una din metodele radioimagistice nu poate stabili tipul neoplasmului de col uterin, acest lucru revenind examenului anatomopatologic. 23. Metodele imagistice atunci când sunt utilizate împreună cu metoda imunohistochimică şi tehnici moleculare asigură o eficienţă apreciabilă în managementul cancerului ginecologic. Progresele în metodele de imagistică şi în substanţe de contrast şi utilizarea combinată a celor două sunt de aşteptat să facă mai multe tehnologii de imagistică valoroase în evaluare cancerului uterin. 24

25 BIBLIOGRAFIE 1. ACS American Cancer Society: cervical cancers facts and figures. http: ZA www. cancer. org/cancerinfo American Cancer Society: Cancer Facts and Figures Atlanta, Ga: American cancer Society, Anderson J. E., Grant's atlas of anatomy. 8-th ed. Baltimore: Williams & Wilkins Ardeleanu C., Comănescu V., Zaharia B.,: Imunohistochimie, Ed. Sitech:16-40, Azumi N., Czernobilsky B.,: Immunohistochemistry, în Kurman RJ: Blaustein's Pathology of the Female Genital Tract, 5 th edition, Springer-Verlag, New York: , Baker A. C., Eltoum I., Currz R. O., et al. Mucinous expression in benign and neoplastic glandular lesion of the uterine cervix. Arch Pathol Lab Med, 2006, 130(10): Bala S., Florescu M., Simionescu C., Firoiu C., Imunoexpresia RE şi RP in hiperplazia şi carcinoamele endometriale. Al V-lea Simpozion de Morfologie microscopică, Craiova, mai, Bancroft D. J., Manual of histologycal techniques. Churchill Livingstone NY 1994, Barth P.J., Ebrahimsade S., et al: CD34+ fibrocites in invasive ductal carcinoma, ductal carcinoma in situ and benign breast lesions, Virchows Arch 440: , Barth P. J., Ramaswamy R. M.,: CD34+ fibrocites in normal cervical stroma, cervical intraepithelial neoplasia III and invasive squamous cell carcinoma of the cervix uteri, Virchows Arch 441: , 2002 a. 11. Benedet J. L., Bender H., Jones H III., et al. FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers. FIGO Committee on Gynecologic Oncology. Int J Gynaecol Obstet 70: , Boenisch T., Immunochemical Staining Methods, 3rd edition, Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA, Bogdan FI.,: Aparatul Genital, in: Histologie, Ed. Universităţii din Craiova, Craiova: , Bosch F. X., Rohan T., Schneider A., şi colab. - Papillomavirus research update: highlights of the Barcelona HPV 2000 international papillomavirus conference. J Clin Pathol; 54: , Bosch F. X. de Sanjose.Castellsague X,et al. Geographical and social patterns of cervical cancer incidece. ln: Franco E,Monsonego J (eds) New developments in cervical cancer screening and prevention. Biackwell, London, pp 23-33, Braune W., Topograpisch-anatomischer Atlas nach Durchschnitten an gefrorenen Cadavern. Leipzig: Veit, Brychova S., Brychta T., Sedlakova E. Kolar; Proto-oncogene c-myc in uterine cervix carcinogenesis. Neoplasma, 51,84-89, Buckley S. L., Fritz D. M., Van Le L., et al. Lymph node metastases and prognosis in patients with stage IA2 cervical cancer. Gynecol Oncol 63:4-9, Cahill D. R., Orland M. J., Atlas of cross-sectional anatomy. Philadelphia: Lea & Febiger, Cannistra S. A., Nillof J. M., Cancer of the uterine cervix. N. Engl. J. Med., 334: , Castrillon D. H., Lee K. R., Nucci M.R., Distinction between endometrial and endocervical adenocarcinoma: an immunohistochemical study. Int J Gynecol Pathol 21: 4-10, Cernea N., Novae L., - sub redacţia, Ginecologia, Editura Medicală Universitară Craiova,