UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE INDUSE (ipsc) DIN FIBROBLASTE/STEM MEZENCHIMALE ÎN PATOLOGIA OFTALMOLOGICĂ

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE Grigore T. Popa Iaşi FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ UTILIZAREA CELULELOR STEM PLURIPOTENTE INDUSE (ipsc) DIN FIBROBLASTE/STEM MEZENCHIMALE ÎN PATOLOGIA OFTALMOLOGICĂ REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Îndrumător ştiinţific, Prof. Dr. Marcel Costuleanu Doctorand, Dr. Oana Cristina Răducanu -- IAŞI,

2 CUPRINS 1.STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII Celulele stem ipsc şi derivatele acestora în oftalmologie Factorii de creştere celulară şi proliferarea celulelor progenitoare/stem Familia factorului de creştere epidermică Factorul de creştere derivat din plachete Familia factorului de creştere transformant Familia factorului de creştere fibroblastică Factorii de creştere asemănători insulinei Factorul de creştere nervoasă Alţi factori de creştere celulară Factorii moleculari executori ai apoptozei celulelor progenitoare/stem CONTRIBUŢII PERSONALE Motivaţia alegerii temei Scopul şi obiectivele Materiale şi metode Efectele ionomicinei asupra potenţialului transmembranar mitocondrial în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca Efectele CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial Efectele CnB asupra potenţialului membranar mitocondrial Efectele Citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial Efectele Tyrphostin AG 1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial Efectele Tyrphostin AG 494 asupra potenţialului membranar mitocondrial Evidenţierea morţii celulare induse de deltametrin (DMT) în celule de tip ipsc Efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial Efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial Efectele acidului 9 cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar mitocondrial Rezultate Discuţii...74 CONCLUZII FINALE BIBLIOGRAFIE

3 2. CONTRIBUŢII PERSONALE 2.1. Motivaţia alegerii temei Celulele stem sunt celule capabile să se transforme în multiple tipuri celulare, de aceea ele reprezintă candidatul ideal pentru menţinerea homeostaziei şi pentru repararea tisulară. Teoretic, celulele stem sunt avantajoase deoarece au capacitatea de a se diferenţia şi înlocui orice tip de ţesut lezat precum şi de a influenţa diferitele căi biologice prin semnalizarea paracrină. Celulele stem embrionare (CSE), celulele stem pluripotente induse (celulele ips), celulele stem mezenchimale (CSM) și celulele stem adulte sunt surse potențiale pentru terapia celulară în medicina regenerativă. După cum am menţionat deja, transplantul epiteliului pigmentat retinian (RPE) a fost dezvoltat ca şi terapie de înlocuire a celulelor pentru degenerarea maculară legată de vârstă. Celulele stem embrionare umane (hesc) şi celulele stem pluripotente induse (ipsc) - derivate RPE sunt transferate experimental din ce în ce mai mult spre folosirea clinică. Celulele stem RPE umane (hrpesc) s-au introdus ca şi sursă alternativă de RPE. S-a demonstrat că monostraturile polarizate ale hrpesc - derivate RPE, crescute pe membrane de polistiren (PET), au avut caracteristici aproape native. Fragmentul de monostrat RPE pe PET a fost transplantat subretinian (SRS) la iepure, constituind astfel un model experimental animal de ochi mare. Dar, după 4 zile din momentul intervenţiei a fost observat edem retinian deasupra implantului, detectat prin tomografie de coerenţă optică în domeniul spectral (SD-OCT) şi fundoscopie (Stanzel şi colab., 2014). După o săptămână a fost observată atrofia retinei de deasupra transplantului atât la făt cât şi la adult, fenomenul rămânând ulterior relativ stabil. Examenul histologic obținut la 4 săptămâni după implantare a confirmat existenţa unui monostrat RPE polarizat uman continuu pe PET. Luate împreună, datele obţinute demonstrează că xeno-hipsc-rpe au supravieţuit în spațiul subretinian. Aceste experimente dovedesc că hipsc-derivate RPE pot fi considerate a fi o sursă potenţială pentru terapiile care utilizează transplantul. Nu se cunoaşte însă potenţialul funcţional şi integrativ al acestor xenogrefe celulare. Încercările de a compara răspunsurile imune în stratul subretinian (SRS) cu alte modele de xenogrefă nu pot fi adecvate din cauza mediului imunologic unic de sub retină (mediu privilegiat imun). Există chiar date care arată că, în cazul alogrefelor RPE, expresia complexului major de histocompatibilitate de tip II (Zhang şi Bok, 1998), împreună cu producerea de citokine (IL-6 și interferon gama), au fost implicate în respingerea grefei (Enzmann și colab., 2000). În schimb, în cazul xenogrefelor RPE la şobolan sau iepure se observă infiltrare cu macrofage şi distrugere ulterioară (Gabrielian și colab., 1999;Carr și colab., 2009). Şi citokinele (IL-1 și IL-6) au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și colab., 1999). Infiltrarea cu limfocite (timice) nu a fost demonstrată în mai mult de 20 de studii publicate despre xenogrefe RPE, dar atât ciclosporina A (CsA) cât şi tacrolimus (TCA), care se crede că suprimă respingerea mediată de celulele T, au demonstrat o oarecare eficacitate în întârzierea rejectului xenogrefei la iepuri (Lai și colab, 2000; Wang și colab., 2002). Ciclosporina are concentrații plasmatice neregulate (necesitând astfel măsurători serice frecvente) şi nu împiedică respingerea alo- sau xenogrefei de RPE (suspensie) la şobolani sau iepuri (Carr și colab., 2009; Lai și colab., 2000), punând astfel sub semnul întrebării utilitatea sa. Tacrolimus are mecanisme similare de acțiune, dar un risc mai mare de efecte secundare toxice. Într-o încercare de a ameliora modificările negative retiniene, s-a ales să se administreze dexametazonă (DXP), deoarece suprimă previzibil toate tipurile de leucocite periferice la iepure (Jeklova și colab., 2008). Efectul advers al DXP observat asupra supraviețuirii xenogrefei a fost neaşteptat, dar probabil mediat prin receptorul glucocorticoid RPE, care promovează proliferarea RPE (He și colab., 1994). În prezent nu există un protocol ideal bazat pe dovezi privind imunosupresia pentru modelele de xenogrefă hrpe, dar datele indică faptul că administrarea TCA intravitros permite supraviețuirea hrpe timp de cel puțin 1 lună, indicând că acesta ar putea fi utilizat pentru studii pe termen lung. Cert este faptul că implantarea unor 3

4 transportatori în SRS, cu sau fără hrpe, a dus la o retină degenerată imediat deasupra implantului. Cauza nu este clară şi ar putea fi multifactorială. În ciuda rapoartelor contradictorii (Szurman și colab., 2006), se crede că este puțin probabil ca brd să determine degenerarea retinei, pentru că s-a constatat că producerea unei vezicule similare, dar fără inserţia ulterioară a unui transportor, determină leziuni minime la nivelul fotoreceptorilor şi o degenerare neglijabilă a retinei, constatare susţinută şi de alţi cercetători (Ivert și colab., 2002). Retina iepurelui este merangiotică, adică doar o parte a retinei interne este irigată de către vasele retiniene şi este, prin urmare, mai dependentă de coriocapilare pentru toate necesităţile metabolice, comparativ cu speciile holangiotice, care au o vascularizație retiniană ce irigă toată retina internă, aşa cum este la oameni şi la şobolani. Atunci când s-a introdus un dispozitiv transportator de 1 mm grosime între fotoreceptori și RPE s-au distrus legăturile intercelulare normale printr-o barieră nenaturală, proces care probabil a condus la degenerarea retinei externe. Observații similare au fost făcute folosind implanturi cu cipuri retiniene, în care variante impermeabile ale implanturilor au dus la atrofia straturilor de celule fotoreceptoare (Montezuma și colab., 2006). Activitățile de cercetare actuale s-au concentrat pe identificarea unui transportator de celule adecvat care imită mai îndeaproape relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare. Porozitatea transportatorilor de celule pare să joace un rol crucial în menținerea sănătăţii şi a stratificării neuronale retiniene, astfel încât implantarea unui transportor PET acelular cu diametrul porilor de 3 mm a dus la conservarea mai bună a straturilor retiniene exterioare comparativ cu un purtător PET cu un diametru al porilor mai mic, de 0.4 mm. Oricum, înafară de un mic studiu făcut de Lu și colab. (2012), nu au fost evaluate sistematic membranele de transport cu porozitate optimă pentru conservarea retinei şi care să permită cultura RPE. Un astfel de studiu este important, deoarece hrpe xenogrefate în SRS pe transportatori PET au indus edem retinian iniţial urmat, în decurs de o săptămână, de o atrofie dramatică a tuturor straturilor retiniene de deasupra (Stanzel şi colab., 2014), rezultate reconfirmate recent (Kashani, 2016). Un astfel de experiment a fost total diferit de controalele carrier-only, în care doar straturile retinei exterioare au degenerat. Topirea retinei indusă de transplantul RPE (Del Priore și colab., 2001; Rezai și colab., 2000) sau distrugerea fotoreceptorilor (Diniz și colab., 2013;. Zhang și Bok, 1998) a fost observată şi de alți cercetători şi rămâne o problemă nerezolvată în xenotransplanturile RPE (da Cruz și colab., 2007). Multe lucrări indică faptul că, mai sigur decât leziunile provocate prin traumatismul chirurgical, configurația implanturilor subretiniene este cea care determină degenerarea retinei. Optimizarea transportatorilor de celule RPE în sensul imitării mai bune a membranei fiziologice Bruch este un subiect important şi este în curs de cercetare de către mulți alți cercetători (Liu și colab., 2013;. Hynes și Lavik, 2010;. Kearns și colab., 2012; Subrizi și colab., 2012). Reducerea degenerării retinei după grefarea hrpe în zona subretiniană (SRS) la iepure va îmbunătăţi utilizarea iepurelui ca şi model ieftin de animal cu ochi mari. Există o serie de date experimentale, deşi puţine, care sugerează că degenerarea retinei, după grefarea RPE în zona subretiniană (SRS) la iepure şi la şobolan, s-ar datora apoptozei fotoreceptorilor, dar şi a celulelor de tip RPE (Hao şi colab., 2011). Studiile noastre au abordat administrarea de celule stem pluripotente induse din fibroblaste (ipsc) dintr-un alt unghi: utilizarea acestora ca vehicule pentru administrarea locală şi ţintită de medicamente şi nanoparticule. Din acest unghi, interesul major a fost reprezentat de apoptoza acestui tip celular şi de mecanismele moleculare care o guvernează Scopul şi obiectivele Activitățile experimentale s-au concentrat pe identificarea unui transportator celular adecvat care să nu altereze relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare. Astfel, primul obiectiv a fost reprezentat de obţinerea celulelor stem ipsc din fibroblastele gingivale de şobolan prin creştere pe o matrice 3D (Reinnervate). Acestea au fost comparate cu celule stem mezenchimale, obţinute din creasta iliacă de şobolan. 4

5 Apoptoza celor două tipuri celulare de mai sus a fost testată exhaustiv, având în vedere faptul că reprezintă o etapă deosebită în toleranţa tisulară, la nivelul retinei, dar şi o modalitate de administrare ţintită a medicamentelor şi nanoparticulelor la acest nivel, utilizând sinuciderea celulară ca modalitate terapeutică. Acesta a fost cel de al doilea obiectiv major al studiului prezent. Am utilizat fibroblastele gingivale de şobolan pentru obţinerea celulelor stem pluripotente induse pentru că sunt mai uşor de obţinut şi la îndemână, având în vedere experienţa colectivului de îndrumare. Dezvoltarea administrării celulelor modificate genetic va fi realizată în viitor tot pe şobolan ca model experimental. Toate experimentele au fost avizate în prealabil de Comisia de Etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie Grigore T. Popa din Iaşi Materiale şi metode Obţinerea fibroblastelor s-a realizat prin explant din gingia de şobolan netratat. Şobolanii ( g) în număr de 5 au fost sacrificaţi, iar probele de gingie de la fiecare şobolan au fost mărunţite şi transferate în eprubete cu ser fiziologic. Eprubetele cu gingia secţionatǎ au fost transferate în laborator pe pat de gheaţǎ. Probele de gingie au fost mǎrunţite şi spǎlate de 6 ori cu PBS (phosphat buffered saline), dupǎ care au fost puse în plăcuţe Petri cu mediu de culturǎ Mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine serum), 1% amestec antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ(0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B (Goriuc, 2011). Probele au fost lǎsate între 2 şi 7 zile la 37 C şi 5 % CO 2, dupǎ care gingia a fost îndepărtată iar fibroblastele ataşate de peretele vasului au fost lǎsate sǎ se înmulţeascǎ în continuare în mediu proaspǎt la 37 C şi 5 % CO 2 pentru încǎ de ore. Când fibroblastele au ajuns la confluenţă de 90 % vasele au fost tripsinizate cu 2 ml tripsină EDTA şi spǎlate prin centrifugare la 300xg timp de 5 minute, dupǎ care au fost resuspendate în 40 ml de mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS ( fetal bovine serum), 1% antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ(0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B. Mediul în care se aflau celulele a fost agitat şi împǎrţit în 4 flascuri de culturǎ. În acest mediu au fost lǎsate pȃnǎ au ajuns la confluenţa de 90% (aproximativ 7 zile). Dupǎ cele 7 zile toate vasele au fost tripsinizate, spǎlate prin centrifugare la 300xg timp de 5 minute şi apoi au fost resuspensionate în 1 ml de mediu şi numǎrate. Dupǎ numǎrare, celulele au fost împǎrţite în mod egal în 4 loturi (flascuri) (aproximativ de celule/flasc). În primul flasc celulele au fost puse în mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine serum), 1% antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ (0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B şi a reprezentat lotul martor. Apoi toate flascurile au fost puse la 37 C şi 5 % CO 2 pȃnǎ ajung la confluenţǎ. În acest timp celulele au fost fotografiate la 7, 14 şi 30 de zile utilizând un microscop cu contrast de fază Nikon Eclipse TE300 şi softul aferent. Fotografiile au fost realizate cu diferite obiective: 4x, 10x şi 20x. Pentru obţinerea ipsc din fibroblastele gingivale am utilizat tehnica descrisă de Long şi colab. (2015), respectiv un amestec chimic format din 10 µm 5-bromo-2 -deoxiuridină {5-Bromo-1-(2-deoxi-β-Dribofuranozil)uracil}, 10 µm CHIR99021 {6-[[2-[[4-(2,4-Dicloro-fenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2- pirimidinil]amino]ethil]amino]-3-piridincarbonitril}, 10 µm Repsox {2-[3-(6-Metil-2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-1,5- naftiridin} şi 50 µm forskolin {7β-Acetoxi-8,13-epoxi-1α,6β,9α-trihidroxilabd-14-en-11-onă}. În plus, am utilizat un agonist al receptorului acidului retinoic, AM580, în concentraţie de 100 nm, cu un randament mărit al procesului de aproximativ 20 ori, în acord cu tehnica descrisă anterior (Wang şi colab., 2011). Pentru evidenţierea transformării de tip ipsc am utilizat anticorpi specifici anti-fosfatază alcalină, anti- Nanog şi anti-ssea1 şi citometrie de flux (Long şi colab., 2015). Atât celulele ipsc, induse din fibroblastele gingivale de şobolan, cât şi celulele mezenchimale din creasta iliacă de şobolan, au fost separate înainte de experiment prin citometrie de flux selectivă, utilizând anticorpi selectivi marcaţi cu fluoresceină. În decursul dezvoltării, ambele linii celulare au prezentat caracteristici morfologice de celule embrionare în cultură, demonstrând încă odată apartenenţa la acest tip celular. Totuşi, celulele stem mezenchimale, obţinute din creasta iliacă de şobolan au fost mult mai puţin stabile, numărul de pasaje posibile fiind foarte redus. 5

6 Pentru obţinerea celulelor stem mezenchimale am utilizat măduva osoasă obţinută prin puncţia crestei iliace la şobolani Wistar de g, sub anestezie. Pe scurt, fragmentele de măduvă au fost suspendate în mediu esenţial minim α (α-mem), centrifugate şi depozitul celular resuspendat în α-mem cu 10 % FBS, Celulele nucleate au fost însămânţate pe vase Petri de 150 mm diametru şi incubate la 37 timp de 6 zile. Apoi, celulele neaderente au fost îndepărtate şi startul de celule aderente a fost reincubat în mediu complet până la atingerea unei semiconfluenţe. Celulele au fost apoi tripsinizate cu 0.25% tripsină-edta, resuspendate în mediu complet, reînsămânţate la o densitate de cells/cm 2 şi incubate pentru 3 zile. Monostraturile de celule rezultate, denumite celule stem mezenchimale de şobolan, au fost tripsinizate şi celulele rezultate îngheţate sau utilizate pentru experimente (Seo şi colab., 2009). Partea experimentală a constat în studierea şi analizarea efectelor unor diferiţi inductori ai morţii celulare asupra celulelor de tip ipsc şi stem mezenchimale, utilizând tehnici de imunofluorescenţă, reprezentate în principal de citometria de flux. Studiul experimental a fost realizat în două centre de cercetare: laboratorul din cadrul Disciplinei de Fiziopatologie, U.M.F. Grigore T. Popa Iaşi şi laboratorul din cadrul Disciplinei de Imunologie şi Alergologie, U.M.F. Grigore T. Popa Iaşi. Datele obţinute au fost prelucrate statistic utilizând metode fiabile precum testul One Way ANOVA (completată cu metoda Student-Newman-Keuls), fapt care mi-a permis o interpretare obiectivă şi o analiză pertinentă a rezultatelor Efectele ionomicinei asupra potenţialului transmembranar mitocondrial în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca 2+ Experimentele au fost realizate pe celule IPSC şi stem mezenchimale, menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 g/ml streptomicină, 10 % FBS decomplementat, în incubator, la 37 o C şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratamente. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg/ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), ionomicină 1mM (Sigma-Aldrich), CaCl mm, valinomicină 1 mm (Sigma-Aldrich), staurosporină 1mM (Sigma-Aldrich), JC1 5 mg/ml (Sigma- Aldrich), PBS (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi mezenchimale a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg /ml streptomicină, 10% FBS). Celulele au fost incubate cu ionomicină 5 µm în prezenţă de CaCl 2 2,5 mm, în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2, pe o perioadă de timp de până la 24 h. Celulele IPSC, mezenchimale şi de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Verificarea funcţionalităţii fluoroforului s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K +, care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mm timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubarea în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1, un marker selectiv pentru potenţialul membranar mitocondrial. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate la citometrul de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului BD CellQuest Pro Software Efectele Ciclosporinei A asupra potenţialului membranar mitocondrial Experimentele au fost realizate pe celule IPSC şi stem mezenchimale. Celulele au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% ser bovin fetal 6

7 inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 g/ml, FBS (Sigma-Aldrich), Ciclosporină A (CsA) 100µM, valinomicină 1 mm (Sigma- Aldrich), JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenz-imidazol-carbocyanine iodide) 5 mg/ml (Sigma-Aldrich), PBS (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 g/ml streptomicină, 10% FBS). O parte din celule au fost incubate cu CsA 1 µm în mediu complet timp de 24 h, la 37 o C şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37 o C şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea, s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mm timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37 o C cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Efectele Citosporonei B asupra potenţialului membranar mitocondrial Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 g/ml, FBS (Sigma-Aldrich), Ciclosporină B (CnB) 1mM Sigma-Aldrich, valinomicină 1 mm (Sigma-Aldrich), JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine iodide) 5 mg/ml (Sigma- Aldrich), PBS (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 g/ml streptomicină, 10% FBS). O parte din celule au fost incubate cu CnB 50 µm în mediu complet timp de 24 h, la 37 o C şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37 o C şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea, s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mm timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37 o C cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo

8 Efectele Citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), Citosporonă B 1 mm (Sigma-Aldrich), CsA 100 µm, CaCl mm, valinomicină 1 mm (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich), PBS (Sigma- Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS). Pentru a evalua efectele citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost incubate cu 1 µm CsA şi 10µM, 25 µm, respectiv 50 µm citosporonă B, în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea, o parte din celule au fost tratate doar cu citosporonă B, 10 µm, 25 µm şi respectiv 50 µm, timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură. Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mm timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h şi respectiv 48h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Efectele Tyrphostin AG 1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial Tyrphostin AG1295 este un inhibitor selectiv al tirozin-kinazei de la nivelul receptorului factorului de creştere derivat din plachete (PDGF). Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), AG 1295 (6,7-Dimethyl-2-phenylquino xaline) în concentratii 1µm/ml, respectiv 5µm/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS). Pentru a evalua efectele Tyrphostin AG1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost incubate cu 10 µl/ml AG1295 1mM, respectiv 10 µl/ml AG1295 5mM în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. 8

9 De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mm timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Efectele Tyrphostin AG 494 asupra potenţialului membranar mitocondrial AG-494 este un membru al familiei inhibitorilor de tirozin-kinază și este un inhibitor puternic al autofosforilării receptorilor EGF (IC50 = 1,2 pm) și al creșterii celulare dependentă de EGF (IC50 = 6 pm). Sinonime: N-Phenyl-3,4- dihydroxybenzylidene-cyanoacetamide, Tyrphostin B48 (Sigma-Aldrich). Celulele IPSC au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), AG 494 (Sigma Aldrich) in concentratii 1µm/ml, respectiv 5µm/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS). Pentru a evalua efectele Tyrphostin AG494 asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost incubate cu 10 µl/ml AG494 1mM, respectiv 10 µl/ml AG494 5mM în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mm timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Evidenţierea morţii celulare induse de deltametrin (DMT) în celule de tip IPSC Deltametrinul (DMT) face parte din categoria piretrinelor semisintetice de tip II care acționează ca un inhibitor puternic al calcineurinei (protein fosfataza 2B). Această acţiune inhibitoare are ca efect hiperexcitabilitatea celulară prin rămânerea canalelor de calciu deschise pentru o perioadă extinsă de timp, ceea ce permite ionilor de Ca 2+ să intre în celulă. Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. 9

10 Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), deltamethryn (Sigma Aldrich) 10 µm/ml, citosporona B 50 µl/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS). Pentru a evalua efectele Deltametrin (DMT) asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost incubate cu 10 µl/ml DMT, respectiv 10 µl/ml DMT + 50 µl/ml CsB în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mm timp de h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial Alpidem, cunoscut şi sub denumirea de 2-3-cloro-8-(4-clorofenil)-1,7-diazabiciclo[4.3.0]nona-2,4,6,8- tetraen-9-yl]-n,n-dipropil-acetamide (Sigma-Aldrich) este un antagonist puternic al receptorilor periferici de benzodiazepine (PBR), care este situat pe membrana mitocondrială exterioară și interacționează cu porii de tranziție a permeabilității mitocondriilor (MPT). Alpidem este un medicament anxiolitic din familia imidazopiridinelor. Alpidem acționează selectiv asupra receptorilor de subtip α3 și în mai mică măsură, la subtipul α1 (Kd de 0.33nM și respectiv 1.67nM), al receptorului benzodiazepinic. Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), IL-3 murină recombinantă (Sigma- Aldrich), alpidem (Sigma Aldrich) 10 µm/ml, citosporona B 50 µl/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich. După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS). Pentru a evalua efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost incubate cu 10 µl/ml ALP, respectiv 10 µl/ml ALP + 50 µl/ml CsB în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. 10

11 Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mm timp de h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial Celulele IPSC au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), DCU (Sigma Aldrich) 10 µm/ml,citosporonab 50 µl/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS). Pentru a evalua efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost incubate cu 10 µl/ml DCU, respectiv 10 µl/ml DCU + 50 µl/ml CsB în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mm timp de h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Efectele acidului 9 cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar mitocondrial Acidul 9-cis-retinoic (9-R) este un analog de vitamină A, care inhibă proliferarea celulară și induce diferențierea celulară. Acidul 9-cis-retinoic este un inhibitor al COX-2 și un activator de RAR alfa, RAR beta, RAR gamma și RXR. Am utilizat culturi celulare de tip ipsc şi stem mezenchimale care au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 10 5 /ml înainte de tratament. Reactivi: Mediu stem + 2 mm L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml + Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), acid 9-cis retinoic (Sigma-Aldrich) 10µl/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich). După centrifugare, suspensia de celule ipsc şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 10 4 celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mm L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS). 11

12 Pentru a evalua efectele acidului 9-cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar mitocondrial, am utilizat solutii de lucru de 9-R 10µL/ml. Au fost pregatite probe din fiecare solutie cu 10 µl/ml în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Celulele ipsc şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial. Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule ipsc cu KCl 137 mm timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO 2. Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux Becton Dickinson de tip FACSCalibur TM. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2-4,3%, FL2/FL1-57%, de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo Rezultate Pentru detectarea variaţiilor potenţialului electric transmembranar (ΔΨ) la nivel de celulă sau de mitocondrie am utilizat cationul lipofilic iodură de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil-carbocianină (numit simplu JC-1). Această moleculă este capabilă să pătrundă selectiv în membrana mitocondriilor şi îşi modifică reversibil culoarea de la verde la oranj, odată cu creşterea ΔΨ m peste valori de aproximativ mv. Această proprietate se datorează formării reversibile a agregatelor JC-1 în condiţiile polarizării membranei mitocondriale, care determină modificarea emisiei luminii de la 530 nm (emisia JC-1 sub formă de monomer) la 590 nm (emisia JC-1 sub formă de agregate), când fluoroforul este excitat la 490 nm. Pe măsură ce membrana mitocondrială devine mai polarizată, culoarea fluoroforului se modifică de la verde la oranj. Ambele culori pot fi detectate cu ajutorul filtrelor montate pe majoritatea citometrelor de flux, astfel că emisia verde (JC-1 monomer) poate fi analizată în canalul de fluorescenţă 1 (FL1), iar emisia oranj (JC-1 agregate), în FL2. Avantajul folosirii JC-1 este că analiza probei se poate face atât calitativ, prin observarea modificării fluorescenţei de la verde la oranj, cât şi cantitativ, considerând intensitatea fluorescenţei pure detectate atât în FL1, cât şi în FL2 (Cossarizza şi Salvioli, 2001). În cazul experimentelor prezente, imaginile obţinute la analizarea citofluorimetrică a martorului JC-1 pentru celulele ipsc, respectiv stem mezenchimale, sunt prezentate în figura 2.1. şi figura 2.2. Figura 2.1. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul JC-1 la 24 h pentru celulele ipsc 12

13 Figura 2.2. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul JC-1 la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura 2.3. Histogramele de fluorescenţă pentru martorul JC-1 la 24 h pentru celulele ipsc Figura 2.4. Histogramele de fluorescenţă pentru martorul JC-1 pentru celulele stem mezenchimale 13

14 Analiza imaginilor obţinute prin citometrie de flux a probelor martor pentru JC-1 la 24 h evidenţiază predominanţa clară a agregatelor de JC-1 faţă de forma monomerică, reflectând predominanţa celulelor cu mitocondrii polarizate. Rolul controlului pozitiv este de verificare a funcţionalităţii fluoroforului şi de asemenea de a putea stabili corect setările citometrului. Prin incubarea celulelor cu 10 µm valinomicină, un ionofor de K + care exercită un efect toxic şi determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial, am obţinut o populaţie de celule în care aproape toate mitocondriile erau depolarizate, indicând cadranul în care se vor regăsi ulterior celulele cu caracteristici similare. Figura 2.5. Control pozitiv cu valinomicină la 24 h pentru celulele ipsc Figura 2.6. Control pozitiv cu valinomicină la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Analiza imaginilor achiziţionate evidenţiază scăderea marcată a populaţiei de celule cu mitocondrii polarizate la 24 h din proba martor pozitiv comparativ cu martorul de JC-1, ca urmare a acţiunii KCl 137 mm, fiind cunoscut faptul că KCl induce reducerea potenţialului transmembranar mitocondrial, mediată prin depolarizarea membranei mitocondriale atât pentru celulele ipsc, cât şi pentru celulele stem mezenchimale. 14

15 Figura 2.7. Histogramele de fluorescenţă pentru controlul cu valinomicină la 24 h pentru celulele ipsc Figura 2.8. Histogramele de fluorescenţă pentru controlul cu valinomicină la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura 2.9. Distribuţia raportului agregate/monomer după tratarea celulelor cu KCl 137 mm la 24 h pentru celulele ipsc 15

16 Figura Distribuţia raportului agregate/monomer după tratarea celulelor cu KCl 137 mm la 24 h pentru celulele stem mezenchimale ipsc Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu KCl 137 mm la 24 h pentru celulele Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu KCl 137 mm la 24 h pentru celulele stem mezenchimale 16

17 Figura Efectele ionomicinei 5 µm asupra ΔΨ m în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca 2+ la 24 h pentru celulele ipsc Figura Efectele ionomicinei 5 µm asupra ΔΨ m în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca 2+ la 24 h pentru celulele stem mezenchimale ipsc Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu ionomicină 5 µm la 24 h pentru celulele 17

18 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu ionomicină 5 µm la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura Efectele Citosporonei B (50 µm) asupra ΔΨ m în condiţiile asocierii tratamentului cu Ciclosporină A (1 µm) la 24 h pentru celulele ipsc Figura Efectele Citosporonei B (50 µm) asupra ΔΨ m în condiţiile asocierii tratamentului cu Ciclosporină A (1 µm) la 24 h pentru celulele stem mezenchimale 18

19 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu Citosporonă B (50 µm) în prezenţa Ciclosporinei A (1 µm) la 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Citosporonă B (50 µm) în prezenţa Ciclosporinei A (1 µm) la 24 h Figura Efectele ciclosporinei A (CsA) 1 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc 19

20 Figura Efectele ciclosporinei A (CsA) 1 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu CsA 1 µm la 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu CsA 1 µm la 24 h 20

21 Figura Efectele Citosporonei B (CnB) 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc Figura Efectele Citosporonei B (CnB) 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu CnB 50 µm în prezenţa Ca 2+ la 24 21

22 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu CnB 50 µm în prezenţa Ca 2+ la 24 h Figura Efectele Tyrphostin AG µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc Figura Efectele Tyrphostin AG µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale 22

23 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu Tyrphostin AG µm 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Tyrphostin AG µm 24 h Figura Efectele Tyrphostin AG µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc 23

24 Figura Efectele Tyrphostin AG µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu Tyrphostin AG µm 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Tyrphostin AG µm 24 h 24

25 Figura Efectele DMT 1 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc Figura Efectele DMT 1 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu DMT 1 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h 25

26 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DMT 1 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h ipsc Figura Efectele DMT 1 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele Figura Efectele DMT 1 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale 26

27 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu DMT 1 µm 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DMT 1 µm 24 h Figura Efectele ALP 1 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc 27

28 Figura Efectele ALP 1 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu ALP 1 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu ALP 1 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h 28

29 Figura Efectele ALP 1 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc Figura Efectele ALP 1 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu ALP 1 µm 24 h 29

30 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu ALP 1 µm 24 h Figura Efectele DCU 1 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc Figura Efectele DCU 1 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale 30

31 Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu DCU 1 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DCU 1 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h Figura Efectele acidului 9-cis retinoic 10 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele ipsc 31

32 Figura Efectele acidului 9-cis retinoic 10 µm şi Citosporonă B 50 µm asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele ipsc tratate cu acid 9-cisretinoiuc 10 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h Figura Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu acid 9-cisretinoiuc 10 µm şi Citosporonă B 50 µm 24 h 32