Evaluarea efectului biologic indus de unele peptide citotoxice asupra celulelor tumorale şi normale

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GR. T. POPA IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ DEPARTAMENT FIZIOPATOLOGIE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Evaluarea efectului biologic indus de unele peptide citotoxice asupra celulelor tumorale şi normale CONDUCATOR ŞTIINŢIFIC: PROF. UNIV. DR. MAGDA BĂDESCU DOCTORAND: DR. RADU ANGHEL Iaşi

2 CUPRINS INTRODUCERE Capitolul I. PEPTIDE CITOTOXICE I. 1. Stadiul actual al cunoaşterii Structura şi proprietăţile peptidelor citotoxice Magainina II Cecropina A şi Cecropina B I. 2. Peptidele endogene cu activitate imunologică Peptidele endogene şi imunitatea înnăscută Distribuţia naturală şi implicaţiile imunologice ale unor peptide endogene Defensina HNP Capitolul II. MECANSIMELE DE ACŢIUNE ALE PEPTIDELOR CITOTOXICE LA NIVELUL MEMBRANELOR CELULARE... I.1. Membrana celulară. Structura moleculară şi funcţiile membranelor celulare Structura membranei celulare Funcţia de transport a membranelor celulare Funcţia de adeziune celulară I.2. Peretele celular I.3. Citoplasma şi componentele subcelulare I.4. Modele de acţiune a peptidelor antimicrobiene Modelul barrel stave sau al porilor clasici Modelul carpet sau modelul tip covor Modelul porilor toroidali Modelul formării canalului ionic PARTEA PERSONALĂ MOTIVAŢIA... Capitolul III. MATERIALE, METODE ŞI TEHNICI DE CERCETARE... III.1. Tehnici de cultivare a celulelor.... III.2. Peptidele, liniile celulare şi culturile de celule... III.3. Testul de viabilitate prin tehnica MTT... III.4. Evaluarea apoptozei celulare prin tehnica citometriei în flux III.5.Evaluarea proliferării celulare cu ajutorul tehnicii RTCA DP (Real-Time Cell Analyzer Dual Plate) III.6. Prelucrarea şi interpretarea statistică a rezultatelor

3 Capitolul IV. STABILIREA MODELULUI EXPERIMENTAL IN VITRO NECESAR TESTĂRII UNOR PEPTIDE NATURALE ANTIMICROBIENE ASUPRA UNOR LINII CELULARE TUMORALE Capitolul V. EVALUAREA EFECTULUI CITOTOXIC AL MAGAININEI II ASUPRA LINIILOR CELULARE TUMORALE MDA-MB-231 ŞI M14K.. Capitolul VI. DETERMINAREA EFECTULUI CITOTOXIC AL CECROPINELOR A ŞI B ASUPRA LINIILOR CELULARE TUMORALE MDA-MB-231 ŞI M14K... Capitolul VII. EVALUAREA CITOTOXICITĂŢII INDUSĂ DE MAGAININA II ŞI CECROPINELE A ŞI B ASUPRA LINIEI CELULARE TUMORALE HT-29 (ADENOCARCINOM COLORECTAL). Capitolul VIII. EVALUAREA PROLIFERĂRII CELULARE CU AJUTORUL TEHNICII RTCA DP (REAL TIME CELL ANALYZER DUAL PLATE).... Capitolul IX. EVALUAREA CITOTOXICITĂŢII INDUSĂ DE MAGAININA II ŞI CECROPINELE A ŞI B ASUPRA LINIEI CELULARE TUMORALE A-549 (CARCINOM ALVEOLAR UMAN) DISCUŢII CONCLUZII LISTA FIGURILOR LISTA TABELELOR..... BIBLIOGRAFIE

4 Motivaţia În ciuda progreselor recente în modalităţile de tratament, cancerul rămâne o sursă majoră de morbiditate şi mortalitate în întreaga lume. În plus, multe tipuri de cancer, incluzând cancerul de piele, prostată, sân şi rinichi, sunt în continuă creştere. "Cancerul" este, de fapt, un termen general care se referă la peste 100 de boli diferite ce afectează diferite ţesuturi şi tipuri de celule. Deşi unele cazuri de cancer pot fi tratate adesea cu succes prin intervenţie chirurgicală şi/sau radioterapie, chimioterapia rămâne totuşi tratamentul uzual selectat pentru cancerele în stadii avansate sau metastazice. Putem afirma însă, că pe lângă agenţii utilizaţi în chimioterapia standard, găsirea de noi agenţi cu potenţial antitumoral constituie o mare provocare. Numeroase studii au evidenţiat proprietăţile tumoricide ale unor peptide naturale cunoscute ca fiind antimicrobiene [17, 22, 23, 39, 44]. De asemenea, rezistenţa tot mai frecventă la antibioticele convenţionale este o problemă globală de sănătate publică şi nevoia de noi antibiotice a stimulat interesul în găsirea şi sinteza de noi peptide antimicrobiene care pot fi utilizate ca terapeutice [14, 27, 39, 49]. Peptidele naturale antimicrobiene au în general o masă moleculară mică adică un număr relativ redus de aminoacizi, fiind cele mai simple arme de apărare celulară, aparţinând sistemului imun nespecific [17, 44]. In ciuda cercetărilor intense, mecanismele biochimice care stau la baza procesului de inserţie membranară a peptidelor citotoxice sunt incomplet cunoscute, existând însă un interes ridicat de a găsi noi agenţi terapeutici având în vedere rezistenţa frecventă la multe dintre antibiotice utilizate în mod curent în terapia antiinfecţioasă [7, 39]. In plus, faţă de activitatea antibacteriană şi de modulare a răspunsului imun pe care o au aceste peptide, studii recente au arătat că o parte din aceste peptide cationice au o activitate citotoxică importantă asupra celulelor canceroase şi nu acţioneză asupra celulelor normale de mamifer [5,6]. Cea mai mare parte a medicamentelor anticanceroase disponibile permit un control al creşterii tumorale doar la concentraţii care influenţează şi celulele sănătoase, rezultând efecte secundare indezirabile. Astfel, este imperativă găsirea unor noi produse cu mecanisme de acţiune inovante iar una din direcţiile actuale de cercetare este reprezentată de utilizarea peptidelor antimicrobiene citototoxice [12, 23, 27, 50]. Magainina II - peptid cationic, cu o structură amfifilică de tip α-helix, ţinteşte direct anumite membrane celulare la nivelul cărora formează canale ionice permeabile care conduc la depolarizare şi citoliză ireversibilă şi în cele din urmă la moartea celulei [32, 34, 41]. Acest peptid este solubil în apă şi 1

5 nehemolitic la concentaţiile sale antimicrobiene efective şi amfifilice. La concentraţii mici inhibă creşterea de numeroase specii de bacterii, fungi şi induce liza osmotică la protozoare [33, 38]. Prin urmare, compoziţia în aminoacizi, amfifaticitatea, sarcina cationică şi dimensiunea, permit peptidelor citotoxice să se ataşeze şi să se insere în bistratul fosfolipidic al membranei celulare, cu formarea de pori trans-membranari, care vor modifica permeabilitatea membranei celulare şi vor determina evoluţia celulei respective către apoptoză [17, 28, 38, 44, 51]. Cecropinele A şi B au fost izolate pentru prima dată din hemolimfa fluturelui de mătase gigant Hyalophora cecropia, ulterior constatându-se că aceste peptide sunt prezente şi la mamifere [51]. Cecropina A şi Cecropina B sunt cele mai studiate peptide antimicrobiene din clasa cecropinelor conţinând în structura lor primară resturi de aminoacizi. Ambele cecropine au o structură secundară de tip α-helix cu capătul NH 2 -terminal intens amfifatic, în timp ce capătul COOH-terminal din α-helix este hidrofob [51]. Datorită abilităţii de a forma α-helixuri amfifatice specifice, cecropinele acţionează asupra membranelor celulare lipidice nepolare formând canale transmembranare care fac posibilă circulaţia liberă a electroliţilor, metaboliţilor şi apei prin bistraturile fosfolipidice, conducând la citoliză ireversibilă şi în final moarte celulară [32, 49, 51]. În afară de proprietăţile antimicrobiene bine cunoscute, studii recente au demonstrat activitatea specifică antitumorală atât pentru cecropina A cât şi pentru cecropina B împotriva leucemiei la mamifere, asupra limfomului şi liniilor celulare de carcinom hepatocelular dar şi pentru alte tipuri de linii celulare tumorale [22, 25, 31]. Deoarece, conform literaturii de specialitate, un număr foarte mare de peptide antimicrobiene izolate din natură (specii diferite de insecte, amfibieni, păsări, peşti şi mamifere) şi foarte multe peptide citotoxice obţinute prin sinteză, au dovedit a avea un spectru larg de activităţi antimicrobiene şi anticancerigene [23, 28, 45], în această teză ne-am propus să analizăm efectul biologic al câtorva dintre aceste peptide (magainina II, cecropinele A şi B) asupra liniilor celulare tumorale: MDA-MB231 (adenocarcinom mamar), M14K (mezoteliom uman), HT-29 (adenocarcinom colorectal) şi linia celulară A-549 (carcinom alveolar uman), precum şi asupra unei linii celulare normale de keratinocite umane (HEK). Pentru a analiza efectele produse de Magainina II, Cecropina A şi Cecropina B asupra viabilităţii, citotoxicităţii şi proliferării celulare (celule provenite din diferite linii celulare tumorale în studiul de faţă) s-au folosit următoarele tehnici: tehnici de cultivare a celulelor, testul de 2

6 viabilitate MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliu], tehnica citometriei în flux. Numeroase studii au încercat să explice mecanismul de acţiune al peptidelor citotoxice prin modele de tipul porilor transmembranari clasici, a porilor toroidali sau de inserţie membranară şi distrugere a membranelor [49], dar încă mai există neclarităţi cu privire la modalitatea exactă de acţiune al acestora asupra microorganismelor in vivo, dar şi asupra celulelor in vitro. Având în vedere toate aceste aspecte, în studiile experimentale desfăşurate în cadrul acestei teze de doctorat am dorit să verificăm ipoteza conform căreia peptidele citotoxice, cum ar fi magainina II şi cecropinele A şi B au potenţial tumoricid a căruri intensitate depinde atât de natura peptidului utilizat şi de concentraţia acestuia în mediul de viaţă al celulelor, dar şi de tipul de linie celulară utilizată experimental, in vitro. Culturile de celule sunt procese prin care celulele sunt cultivate în condiţii controlate. Liniile celulare pot creşte în culturi aderente sau în suspensie. În aceste studii experimentale in vitro, ne-am propus utilizarea a patru linii celulare aderente: linia celulară MDA-MB231 (adenocarcinom mamar) şi linia celulară M14K (mezoteliom uman), linia celulară HT-29 (adenocarcinom colorectal) şi linia celulară A-549 (carcinom alveolar uman). Linia celulară normal a fost constituită din keratinocite normale (HEK). Linia celulară MDA-MB231 este o linie celulară aderentă de adenocarcinom mamar. Celulele MDA-MB231 sunt celule umane epiteliale. Mezoteliomul uman (linia M14K) este o tumoră malignă foarte agresivă, care apare pe suprafeţele tapetate cu celule mezoteliale, cel mai des în cavităţile pleurale, dar şi în peritoneu, pericard şi ţesuturile moi paratesticulare. Având potenţial de metastazare la 75% dintre pacienţi şi răspuns sub 20% la diverse chimioterapice celulele mezoteliale reprezintă o ţintă potrivită pentru evaluarea unor noi agenţi chimioterapici. Din cele 3 subtipuri histologice de mezoteliom, în experiment s-a folosit linia M14K de celule mezoteliale de tip epitelial. Linia celulară HT-29 este o linie celulară aderentă de adenocarcinom colorectal. Celulele HT-29 produc antigen carcinoembrionar şi sunt celule umane epiteliale intestinale care produc componentă secretoare de imunoglobulină (Ig) A. Aceste celule sunt utilizate pentru studii tumorigenice. Linia celulară A-549 este o linie celulară aderentă de carcinom alveolar uman. Linia celulară HEK este o linie de keratinocite umane normale. 3

7 Pentru a investiga modul în care peptidele citotoxice menţionate acţioneză asupra celulelor normale sau tumorale, ne-am propus următoarele obiective: 1. Selectarea unor peptide citotoxice cu potenţial antitumoral şi realizarea unui model experimental in vitro de testare a citotoxicităţii acestora pe diferite tipuri de celule; 2. Selectarea liniilor celulare tumorale şi normale şi optimizarea metodelor experimetale prin stabilirea numărului optim de celule necesare evaluării citotoxicităţii peptidelor studiate. 3. Utilizarea testului de viabilitate folosind colorantul vital Trypan blue (albastru tripan) şi tehnica de citometrie în flux ( flow-cytometry) cu iodură de propidiu pentru determinarea numărului optim de celule necesar evaluării citotoxicităţii peptidelor studiate; 4. Evaluarea efectului citotoxic in vitro prin determinarea procentului de citostazie pentru diferite tipuri de celule, în funcţie de tipul şi concentraţiile de PC utilizat. 5. Monitorizarea citotoxicităţii peptidelor selectate prin: tehnica citometriei în flux, testul colorimetric de viabilitate folosind MTT [bromură de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliu] şi tehnica RTCA DP ( Real- Time Cell Analyzer Dual Plate). 6. Stabilirea efectului peptidelor studiate asupra unei linii celulare normale de keratinocite umane (HEK). Originalitatea studiului propus a constat pe de o parte în faptul că la noi în ţară nu există foarte multe studii care să evidenţeize proprietăţile tumoricide ale peptidelor citotoxice cum sunt cele menţionate în acestă teză de doctorat, iar pe de altă parte este necesară studierea şi găsirea de noi posibilităţi şi variante terapeutice mai eficiente şi mai puţin toxice de a distruge celulele tumorale comparativ cu citostaticele utilizate în mod curent. Ca şi rezultate estimate, având în vedere şi studiile din literatura de specialiate conform căreia peptidele citotoxice determină formarea de pori transmembranari care determină permeabilizarea celulei conducând la moartea acesteia, pentru studiul nostru am dorit să verificăm ipoteza de lucru conform căreia peptidele citotoxice evaluate au potenţial tumoricid a căruri intensitate depinde de atât de natura peptidului utilizat şi de concentraţia acestuia în mediul de viaţă al celulelor, cât şi de tipul de linie celulară utilizată în experimental in vitro. Ca şi finalitate practică a acestei teze de doctorat, menţionăm faptul că am dorit să găsim în funcţie de natura peptidului şi de asemnea, în funcţie de 4

8 natura celulelor tumorale utilizate în experimentele noastre noi tipuri de peptide cu potenţial tumoricid şi care sunt concentraţiile optime la care acestea sunt citotoxice pentru celulele tumorale in vitro. Capitolul III Materiale, metode şi tehnici de cercetare Etapele de realizare ale acestei teze de doctorat au fost următoarele: Testarea concentraţiei optime de lucru pentru liniile celulare tumorale aderente sau în suspensie - pentru determinarea condiţiilor optime de cultivare celulară şi găsirea tehnicilor de evaluarea a citotoxicităţii au fost utilizate două linii celulare tumorale: una aderentă M14K (mezoteliom uman) şi una în suspensie K562 (celule eritroleucemice) care a fost formată din limfoblaşti proveniţi din măduva osoasă a bolnavilor de leucemie mieloidă cronică. Ambele linii celulare au fost cultivate în mediu de cultură complet format din RPMI 1640 (RPMI-1640 Medium, Sigma Aldrich) suplimentat cu 10% SFV- ser fetal de viţel (Faetal Bovine Serum, Sigma) [37]. Testarea propriu-zisă s-a realizat în plăci de 96 de godeuri cu fundul plat, folosindu-se un volum de 200µl per godeu. S-a lucrat în triplicat folosind două variante de lucru, celulele fiind incubate în mediu RPMI simplu sau cu 2% SFV. Pentru evitarea efectului de margine şi menţinerea umidităţii în placă, în coloanele şi rândurile marginale s-a pipetat doar mediu de cultură. Studiul viabilităţii s-a efectuat după 24 de ore de incubare la 37 şc, 5% CO 2, prin două metode: microscopic, folosind colorantul vital Trypan blue (albastru tripan) şi prin citometrie în flux (flow-cytometry), cu iodură de propidiu. 1. Testul de viabilitate cu Trypan Blue (albastru tripan). Principiul metodei: Membrana celulelor vii având o permeabilitate selectivă, albastru tripan nu poate fi absorbit de către celulele vii, însă în cazul celulelor moarte o poate traversa cu uşurinţă. În consecinţă, la microscopul optic celulele moarte apar colorate în albastru, iar cele vii necolorate. Mod de lucru: S-a realizeazat un amestec de 1/1 volume între suspensia celulară şi albastru tripan. S-a pipetat 10μL în camera de numărare Bürker- Türk şi s-a numărat la microscopul optic celulele vii (necolorate) şi celulele moarte (colorate în albastru). Procentul de celule vii = celule vii x 100 / celule vii + celule moarte 5

9 Rezultate: Pentru ambele linii celulare testate, s-a stabilit care este viabilitatea optimă exprimată în celule/godeu, în condiţii de cultivare cu sau fără 2% SFV. 2. Testul de viabilitate cu iodură de propidium (PI) prin tehnica citometriei în flux. Principiul metodei: testul este folosit pentru detectarea şi măsurarea morţii celulare [8, 57]. Iodura de propidium (PI) este un colorant vital pentru ADN; aceasta pătrunde în celulele moarte şi se leagă de ADN-ul nuclear, în timp ce membrana celulelor vii nu este permeabilă pentru PI. Fluorescenţa iodurii de propidiu este citită pe canalul al doilea de fluorescenţă (FL2). Setările au fost stabilite în funcţie de granularitatea ( SSC-side scatter) şi volumul (FSC - forward scatter) celulelor nemarcate observate la flow cytometru [21, 52]. Iodura de propidiu are capacitatea de a pătrunde în nucleii celulelor şi de a se lega la ADN, astfel încât, cantitatea de acid nucleic poate fi cuantificată prin măsurarea intensităţii fluorescenţei înregistrată de către senzorul FL2 (lungimea de undă emisă de PI este de nm atunci când fluorocromul este excitat la 488 nm), intensitatea fluorescenţei fiind direct proporţională cu cantitatea de ADN din celule [20, 56]. Mod de lucru: Suspensia celulară a fost recuperată din godeuri şi distribuită în tuburi pentru flow-cytometru. Pentru celulele aderente desprinderea celulelor s-a realizat prin pipetare mai energică. După investigarea flowcytometrică a aspectului celulelor nemarcate, în fiecare tub s-au pipetat 10μl PI. Achiziţia şi interpretarea datelor s-a realizat la un flow cytometru FACS Canto II utilizând FACSDiva Software (Becton Dickinson). Rezultate: Pentru ambele linii celulare testate, s-a stabilit care este viabilitatea optimă exprimată în celule/godeu, în condiţii de cultivare cu sau fără 2% SFV. Altă etapă a constat în stabilirea modelului experimental de lucru pentru cele trei tipuri de peptide citotoxice (PC) având în vedere şi datele din literatură [13, 16, 23, 32, 51]. În scopul analizării viabilităţii, citotoxicităţii şi proliferării celulare s-a folosit testul MTT ce va permite evaluarea metabolismului oxidativ şi a răspunsului unei populaţii celulare la factori externi ce pot avea un efect pozitiv sau negativ asupra vieţii celulelor în cultură. De asemenea, viabilitatea celulară şi intrarea celulelor în diferite stadii de apoptoză a putut fi urmărită şi prin tehnica citometriei în flux. 3. Testul de viabilitate prin tehnica cu MTT (test colorimetric) MTT = [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] - metoda se bazează pe capacitatea succinat dehidrogenazei din mitocondriile 6

10 celulelor vii de a reduce sărurile de tetrazolium solubile in formazan insolubil, de culoare roşie [15, 24]. Pentru testarea viabilităţii cu ajutorul acestei metode, celulele ţintă au fost incubate 72h la 37ºC, 5% CO 2, apoi s-a adăugat în fiecare godeu cu celule câte 20 μl de MTT (Sigma, 5 mg/ml) şi s -a continuat incubarea la 37ºC timp 4h după care mediul a fost îndepărtat adăugându-se apoi câte 100 μl DMSO (dimethyl sulfoxide, Roth). S-a măsurat absorbanţa la 570 nm cu lungimea de undă de referinţă la 620 nm folosind un cititor de plăci Tecan Sunrise. Pe baza valorilor obţinute pentru absorbanţa celulelor incubate cu unul din cele trei peptide studiate ( A celule cu peptid ) şi în funcţie de valoarea absorbanţei citită pentru celulele fără peptid (A control negativ ) s-a calculat procentul de citostazie, adică procentul de celule care au intrat în apoptoză din totalul celulelor dintr-un godeu analizat. % de citostazie = (1 A celule cu peptid / A control negativ ) x100 S-a lucrat în triplicat pentru fiecare linie celulară şi pentru fiecare concentraţie de peptid. Absorbanţele utilizate în calculul citostaziei au fost reprezentate de mediile celor trei citiri pentru fiecare concentraţie de peptid şi fiecare liniie celulară analizată. Peptidele, liniile celulare şi culturile de celule Peptidele studiate, aflate sub formă liofilizată (produse SIGMA cu nr. M7402-1MG / lot nr. 060M4823 pentru magainina II; C6830-1MG / lot nr. 061M4820V pentru cecropin A şi C1796-1MG / lot n. 129K4833 pentru cecropin B) cu puritate 97% (HPLC), au fost aduse în soluţie cu RPMI 1640 (Sigma Aldrich), lucrându-se în condiţii sterile. Conform specificaţiilor date de producător, aceste peptide au fost solubile în apă distilată cu 0,1%TFA în H 2 O. Având în vedere destinaţia acestei soluţii (de a fi introdusă în mediul de cultură celular) s-a ales ca soluţia de peptid şi diluţiile corespunzătoare să fie realizate utilizând ca solvent mediul de cultură RPMI lucrându-se în condiţii sterile. S-a luat această decizie pentru a menţine ph-ul optim al mediului de cultură (7,2-7,4) atunci când a fost introdusă soluţia de peptid. Soluţia de peptid şi diluţiile au fost realizate extemporaneu (au fost utilizate în aceeaşi zi, imediat după prepararea lor). Pentru toate cele trei peptide au fost realizate diluţii succesive cu RPMI 1640 (Sigma Aldrich), iar concentraţiile de lucru au fost: 120µM, 60µM, 30µM, 15µM, 7,5µM, 3,5µM, 1,8µM, 0,9µM într-un volum final de 200µL/godeu. Soluţia de peptid şi diluţiile corespunzătoare care au fost utilizate în experiment au fost realizate utilizând ca solvent soluţia de RPMI, astfel încât soluţia finală a avut un ph egal cu Având în vedere că parametrul variabil în cadrul acestui experiment a fost concentraţia de peptid, pentru un anumit peptid şi o anumită linie celulară, pentru a evalua 7

11 corect potenţialul citotoxic în funcţie de concentraţia de peptid, a fost nevoie de un număr optim şi constant de celule în fiecare godeu într-un volum final de 200µL. Acest număr de celule a fost determinat în experimente anterioare [1], fiind de 10 5 celule tumorale/godeu. Testul de viabilitate folosind PE Annexin V şi 7-AAD (7 - Aminoactinomycin D) (reactivi proveniţi de la BD Pharmingen) - testul este folosit pentru detectarea si măsurarea procesului apoptotic. Apoptoza este caracterizată prin modificări ale morfologiei celulare, condensare nucleară, picnoza, dar si printr-o serie de evenimente biochimice care duc la degradarea membranei mitocondriale si a ADN-ului nuclear. Fosfatidil-serina prezentă în mod normal la nivelul stratului intern al bistratului lipidic din membrana celulară, este expusă la suprafaţa celulelor aflate în diferite stadii de apoptoză. Anexina V are o mare afinitate pentru reziduurile de fosfatidil serina, iar 7- AAD a fost folosit ca şi colorant vital al ADN-ului nuclear [52]. Q1 celule moarte Q2 celule in apoptoza tarzie 7AAD Q3 celule vii Q4 celule in apoptoza timpurie PE Annexin V Fig.III-21: Evaluarea viabilităţii celulare prin tehnica citometriei în flux, utilizând PE Annexin V si 7-AAD. Cadranul Q1 reprezintă celulele moarte, Q2- populaţia de celule aflată în apoptoză târzie, Q3-populaţia de celule vii, iar Q4 reprezintă populaţia de celule aflată în apoptoză timpurie Pentru acest studiu s-au folosit plăci de cultură de 96 godeuri. Prima (1) si ultima (12) coloană de godeuri au conţinut doar mediu de cultura (RPMI 1640), pentru a se evita efectul de margine. Coloanele 2 si 11 de godeuri au conţinut doar suspensia celulară fără peptid (controlul negativ). Coloanele 3-8

12 10 au continut celule ţintă si diluţii succesive din cele 2 peptide. S-a lucrat în triplicat pentru cele două linii celulare şi toate cocentraţiile de peptid utilizate. După 72h de incubare la 37ºC, 5% CO 2, celulele aderente au fost desprinse prin tripsinizare (incubare timp de 3-10 minute la 37ºC cu tripsina Eurobio). S-a distribuit suspensia celulară astfel incât fiecare tub de FACS a conţinut 1x10 5 celule fiind evaluate câte 3 tuburi de FACS: tub1 FACS conţinând celule nemarcate; tub 2 FACS: Anexina V PE; tub 3 FACS: Anexina V PE / 7- AAD. Achiziţia şi interpretarea datelor s-a realizat la un flow cytometru FACS Canto II utilizând FACSDiva Software (Becton Dickinson) ( Fig.III-21) [52, 56, 57]. S-a utilizat o soluţie de lucru de 10 µg/ml Anexină V PE respectiv 7AAD în PBS păstratate la 4 C, la întuneric. Marcarea pentru a stabili viabilitatea celulară prin tehnica citometriei în flux a fost realizată utilizând 10 µl/tub FACS (200 µl suspensie celulară 1x10 5 celule). Prin urmare concentraţia finală de fluorocrom a fost de 0.1 µg/200µl suspensie celulară [8, 20, 42]. Evaluarea proliferării celulare cu ajutorul tehnicii RTCA DP (Real-Time Cell Analyzer Dual Plate) Analizorul celular în timp real cu plăci duble permite evaluarea proceselor biologice într-o cultură de celule, în timp real prin măsurarea impedanţei electrice. Senzorii aflaţi pe fundul godeurilor de cultură, care nu sunt altceva decât nişte microelectrozi din aur, vor înregistra modificările produse de prezenţa celulelor aderente de pe suprafaţa acestora. Măsurarea proprietăţilor electronice ale suprafeţelor senzorului oferă informaţii importante despre starea biologică a celulelor (sau proteinelor) prezente pe senzori. Viabilitatea celulară, numărul de celule, morfologia celulei, şi gradul de aderenţă influenţează impedanţa electrodului. Impedanţa măsurată între microelectrozi într-un godeu individual depinde de geometria electrodului, concentraţia ionică din godeu şi dacă celulele sunt ataşate la microelectrozi. Dacă apar modificări în starea biologică a celulelor sau proteinelor, măsurătorile automate ale analizorului pentru celule corespund schimbărilor proprietăţilor electronice ale senzorilor din apropierea celulelor. Aceste semnale electronice sunt apoi convertite în semnale digitale pentru prelucrare şi analiză [40]. Probele celulare utilizate în aceste experimente au fost cultivate în plăci de cultură formate din 16 godeuri prevăzute pe fundul fiecărui godeu cu o reţea de biosenzori constituţi din microelectrozilor din aur. Plăcile de unică folosinţă au fost utilizate pentru analiza proliferării celulare. Fiecare godeu al plăcii pentru analiza celulară a avut o colecţie integrală de 9

13 electrozi senzor dispuşi în plasă, care au permis monitorizarea celulelor din godeu. Electrozii au acoperit în proporţie de 80 % suprafaţa fiecărui godeu ( (Fig.III-24). Fig.III-24: Plăcile tip E cu 16 godeuri - permit analiza proliferării celulare (stânga) cu ajutorul unei reţele de micro-electrozi (vizualizată mărit în partea dreaptă) ( Celulele aderente se ataşează la electrod, iar comportamentul acestora va fi corelat cu impedanţa electrică măsurată cu acest aparat. Dimensiunea electrodului a fost intenţionat selectată să fie mai mică deoarece semnalele corespunzătoare celulelor sunt mult mai uşor de detectat cu electrozi mai mici. Acest lucru se datorează faptului că rezistenţa soluţiei din vasul de cultură este mult mai mare decât impedanţa electrozilor [4]. Fig.III-26: Analiza impedanţei electrice pentru monostraturi de celule endoteliale [47] Microelectrozii de aur oferă o interfaţă simplă pentru monitorizarea caracteristicilor impedanţei electrice ale populaţiilor culturilor de celule pentru perioade lungi de timp. Interfaţa celulă-electrod este creată de celulele ataşate direct la structurile electrodului planar. Deoarece membranele celulare prezintă proprietăţi dielectrice, celulele cultivate pe suprafeţele electrodului duc la modificări în impedanţa electrodului. Măsurătorile impedanţei electrice 10

14 folosind tehnicile curentului alternativ (CA) sunt bazate pe faptul că celulele vii intacte sunt izolatoare electrice excelente la frecvenţe de semnal slab, prin urmare o analiză noninvazivă a proprietăţilor morfologice a celulelor cultivate (Fig.III-26). Important de remarcat este faptul că, interacţiunile celulă-celulă şi celulă-substrat sunt întotdeauna asociate cu modificările în impedanţă dependente de frecvenţă. Deoarece interacţiunile celulă-celulă şi celulăsubstrat sunt sensibile la medicamente, toxine, şi alte substanţe chimice, interacţiunile celulă-celulă şi celulă-substrat măsurate, pot fi utilizate ca indice celular la reprezentarea generală a răspunsului celular rezultat din modificările mediului celular. În plus, această tehnică în curs de dezvoltare a fost extinsă pentru monitorizarea răspunsului celular la agenţii toxici sau nocivi, cum ar fi citocalasin D, prostaglandin E 2, detergenţi, clorură de cadmiu, şi proteine bacteriene, care perturbă matricea şi citoscheletul extracelular [4, 10, 26]. III.5.3. Avantajele instrumentului RTCA DP în vederea analizei şi monitorizării unei culturi celulare: detectarea proceselor biologice pe baza impedanţei electrice; monitorizarea în timp real şi non-invazivă a celulelor; măsurarea automată; control şi operare set-up uşoare; conţinut de informaţii ridicat; acurateţe şi sensibilitate ridicate; gamă largă de aplicaţii. Acest nou sistem de detectare microelectronică reprezintă una din primele integrări al metodologiei electronice şi testării bazate pe celule. Sistemul măsoară în timp real modificările de impedanţă electrică prin intermediul unor microelectrozi senzor integraţi la baza plăcilor speciale de culturi celulare, la diferite frecvenţe de semnal. Valorile impedanţei reflectă cantitativ statutul biologic al celulelor, incluzând numărul de celule, viabilitatea şi morfologia acestora. Sistemul permite determinări de adeziune şi distribuţie celulară, proliferare şi diferenţiere celulară, citotoxicitate mediată chimic şi celular, semnalare mediată de receptori, control de calitate celular, citopatogenie mediată viral, invazie şi migrare celulară. Instrumentul RTCA DP permite măsurători cantitative cu o acurateţe şi o precizie foarte bună, fiind uşor de utilizat [55]. III.6. Prelucrarea şi interpretarea statistică a rezultatelor Pentru prelucrarea statistică a datelor s-a utilizat testul t-student folosind programul de calcul statistic SPSS 19.0 şi programul de calcul Microsoft Excel Interpretarea statistică a datelor a considerat diferenţele corespunzătoare pentru un prag de semnificaţie: p>0,05 statistic nesemnificative; p<0,05 semnificative statistic; p<0,01 puternic semnificative statistic; p<0,001 foarte puternic semnificative statistic. Având la bază o metodă adecvată cunoaşterii proceselor ce se desfăşoară aleatoriu, teoria probabilităţilor, statistica medicală reuşeşte să descifreze cu o eroare 11

15 cunoscută şi acceptabilă corelaţia multiplă dintre fenomenele studiate şi factorii determinanţi, în vederea stabilirii principalelor tendinţe ale acestora. În acest scop sunt utilizate programe dedicate pentru prelucrarea statistică a datelor, rezultatele obţinute ducând la concluzii clare asupra fenomenelor studiate [9, 19]. Metoda comparării aceluiaşi fenomen între diferite categorii de pacienţi (diferenţiaţi după anumite criterii de exemplu: grupe de vârstă, diagnostic, factori de risc etc.) constituie un aspect deosebit de important în cunoaşterea fenomenelor. Metoda se poate aplica şi în cazul loturilor experimetale animale, şi constă în studiul corelativ al fenomenelor cu factorii cunoscuţi sau presupuşi a fi cauza principală de risc în ivirea unor probleme medicale studiate [9,19]. În acest studiu au fost utilizate o serie de metode matematice implementate în soft-ul utilizat pentru prelucrarea datelor (Statistica), metode ce caracterizează valorile medii normale ale fenomenelor studiate, sau dispersia şi eroarea medie faţă de aceste valori etc [9,19]. Capitolul IV Stabilirea unui model experimental in vitro în vederea testării efectului unor peptide naturale antimicrobiene asupra unor linii celulare tumorale Unul dintre primele obiective ale acestui studiu a fost acela de a stabili care este numărul optim necesar de celule tumorale pentru a putea evalua potenţialul citotoxic al peptidelor studiate (magainina II, cecropina A şi B). A fost nevoie de o astfel de optimizare deoarece parametrul variabil a fost constituit de diluţiile succesive de peptid, iar o concentraţie neadecvată de celule ţintă nu ar fi permis o evluare corectă a potenţialului citotoxic al peptidelor studiate. Pentru determinarea condiţiilor optime de cultivare celulară şi găsirea tehnicilor de evaluarea a citotoxicităţii în aceste studii experimentale au fost utilizate două linii celulare tumorale: una aderentă M14K (mezoteliom uman) şi una în suspensie K562 formată din limfoblaşti proveniţi din măduva osoasă a bolnavilor de leucemie mieloidă cronică (Fig. IV-1 a,b). Pentru a optimiza concentraţia necesară de celule în vederea testării citotoxicităţii peptidelor studiate, ambele linii celulare selectate, au fost cultivate în mediu de cultură complet format din RPMI 1640 (RPMI Medium, Sigma Aldrich) suplimentat cu 10% SFV- ser fetal de viţel ( Faetal Bovine Serum, Sigma). Expansionarea celulelor s-a făcut în flaskuri de 250 ml pentru a obţine un număr suficient de celule (4 x 10 6 celule pentru M14K şi 12

16 1 x 10 7 celule pentru linia K562). Celulele au fost incubate la 37 C şi o atmosferă cu 5% CO 2. Celulele mezoteliale au fost desprinse prin tripsinizare (incubare timp de 3 minute la 37 C cu tripsină Eurobio). Fig.IV-1: Culturi celulare aderente (a) şi în susepnsie (b). S-a eliminat mediul din flaconul culturilor aderente, s-au spălat celulele cu mediu simplu pentru a îndepărta urmele de ser fetal de viţel, care inactivează tripsina şi apoi s-a adăugat 7mL de tripsină peste celule. S-a lăsat flaskul câteva minute în incubator pentru a acţiona această enzimă. S-a adăugat mediu cu ser fetal de viţel şi s-a centrifugat. S-au resuspensionat celulele într-un ml de mediu complet, care apoi a fost introdus în flacoanele de cultură. Celulele în suspensie nefiind celule aderente nu necesită tripsinizare. Pentru a subcultiva celulele în suspensie s-a eliminat mediul de cultură prin centrifugare. Peste peletul (sediment) de celule s-a adăugat 1mL de mediu pentru resuspensionare, apoi s-au adăugat celulele în flacoanele de cultură. S-au folosit celule cu viabilitate mai mare de 97%. Testarea propriuzisă s-a realizat în plăci de 96 de godeuri cu fundul plat, folosindu-se un volum de 200 µl per godeu (Fig.IV-5) A B x x x C x x x D x x x E x x x F x x x G x x x H Fig.IV-5: Schema de lucru utilizată pentru tatonarea concentraţiei optime a celulelor ţintă necesare evaluării citotoxicităţii peptidelor studiate. 13

17 S-a lucrat în triplicat şi s-au folosit două variante de lucru, celulele fiind incubate în mediu RPMI simplu sau cu 2% SFV, reprezentate cu verde deschis şi, respectiv, cu verde închis în figura 29. Pentru evitarea efectului de margine şi menţinerea umidităţii în placă, în coloanele şi rândurile marginale (reprezentate cu roşu în figura IV-5) s-a pipetat doar mediu de cultură. Studiul viabilităţii s-a efectuat după 24 de ore de incubare la 37 C, 5 % CO 2, prin două metode: microscopic, folosind colorantul vital albastru tripan ( Trypan blue) şi prin citometrie în flux (Flow-cytometry), cu iodură de propidiu. Au fost testate suspensii de celule cu următoarele concentraţii: 10 3 celule/godeu (coloana 8), 5x10 3 celule/godeu (coloana 7), 10 4 celule/godeu (coloana 6), 5x10 4 celule/godeu (coloana 5), 10 5 celule/godeu (coloana 4), 5x10 5 celule/godeu (coloana 3), 10 6 celule/godeu (coloana 2) (Fig.IV-5). IV.1. Evaluarea viabilităţii celulare prin testul cu albastru tripan (Trypan Blue) Pentru efectuarea acestui test, s-a realizat un amestec de 1/1 volume între suspensia celulară şi albastru tripan. Fig.IV-7: Viabilitatea celulelor M14K incubate timp de 24 de ore la 37 C, 5%CO 2 în mediu RPMI simplu (coloanele albastre) sau cu 2% SFV (coloanele verzi). S-au pipetat 10 μl în camera de numărare Bűrker-Tűrk şi s-au numărat la microscopul optic celulele vii (necolorate) şi celulele moarte (colorate în albastru). Procentul de celule vii a fsot calculat conform formulei de mai jos: Procentul de celule vii (%) = celule vii x 100 / celule vii + celule moarte Rezultate experimentale obţinute au arătat că pentru ambele linii celulare testate, viabilitatea optimă a fost de 1x10 5 celule/godeu, în condiţii de cultivare cu sau fără 2% SFV (Fig.IV-7, Fig.IV-8). În godeurile cu mai puţin de 10 4 celule nu s-a putut determina viabilitatea, în camera de numărare fiind 14

18 sub 25 de celule. Godeurile cu 10 6 celule au conţinut doar celule moarte, rezultatele nefiind reprezentate grafic. Fig.IV-8 : Viabilitatea celulelor K562 incubate timp de 24 de ore la 37 C, 5%CO 2 în mediu RPMI simplu (coloanele albastre) sau cu 2% SFV (coloanele verzi). IV.2. Evaluarea viabilităţii celulare utilizând testul de viabilitate cu iodură de propidiu (PI) Acest test este folosit pentru detectarea şi măsurarea morţii celulare. Iodura de propidiu (PI) este un colorant vital pentru ADN; aceasta pătrunde în celulele moarte şi se leagă de ADN-ul nuclear, în timp ce membrana celulelor vii nu este permeabilă pentru PI. Fluorescenţa iodurii de propidiu este citită pe canalul al doilea de fluorescenţă. Setările au fost stabilite în funcţie de granularitatea ( SSC-side scatter) şi volumul ( FSC-forward scatter) celulelor nemarcate observate la flow citometru (Fig.IV-9, Fig.IV-10). Fig.IV-9: Identificarea flow-citometrică a celulelor moarte pe baza pozitivităţii pentru iodură de propidiu. Iodura de propidiu are capacitatea de a pătrunde în nucleii celulelor şi de a se lega la ADN, astfel încât, cantitatea de acid nucleic poate fi cuantificată prin măsurarea intensităţii fluorescenţei înregistrată de către senzorul FL2 (lungimea de undă emisă de PI este de nm atunci când fluorocromul este excitat la 488 nm), intensitatea fluorescenţei fiind direct 15

19 proporţională cu cantitatea de ADN din celule. În studiul nostru, suspensia celulară a fost recuperată din godeuri şi distribuită în tuburi pentru flowcytometru. Pentru celulele aderente desprinderea celulelor s-a realizat prin pipetare mai energică. După investigarea flow-cytometrică a aspectului celulelor nemarcate, în fiecare tub s-au pipetat 10 μl PI (Consul T.S.). Fig.IV-10: Concentraţia de 10 6 celule a determinat moartea tuturor celulelor după 24 ore de la incubare. Achiziţia şi interpretarea datelor s-a realizat la un flow cytometru FACS Canto II utilizând FACSDiva Software (Becton Dickinson). Experimental, cu ajutorul citometriei în flux s-a putut determina viabilitatea şi în godeurile cu 10 4 celule. Mortalitatea în godeurile cu 10 6 celule a fost apropiată de 100% (Fig.IV-9, Fig.IV-10). Analiza datelor a confirmat observaţiile făcute la testul cu albastru tripan, potrivit cărora concentraţia optimă de lucru este de 10 5 celule/godeu (Fig.IV-11, Fig.IV-12). Fig.IV-11: Procentul de celule M14K moarte, după incubarea timp de 24 de ore în mediu RPMI simplu (coloanele albastre) sau în mediu RPMI cu 2% SFV (coloanele verzi). 16

20 Fig.IV-12: Procentul de celule K562 moarte, după incubarea timp de 24 de ore în mediu RPMI simplu (coloanele albastre) sau în mediu RPMI cu 2% SFV (coloanele verzi). Acest studiu experimental a constituit un obiectiv important al acestei teze. Astfel, pentru a stabili care este numărul optim de celule necesar pentru a urmări efectul citotoxic al peptidelor luate în studiu am evaluat două linii celulare diferite, una aderentă iar cealaltă în suspensie pentru diferite concentraţii de celule. Optimizarea numărului de celule a fost necesară deoarece parametrul variabil în studiile noastre a fost concentrația de peptide. De asemenea, numărul de celule trebuie să fie cel optim, deoarece un număr prea mare sau prea mic de celule nu ar permite monitorizarea şi evaluarea corectă a efectelor biologice urmărite. Din rezultatele experimentale obţinute am constatat că sunt suficiente un număr de 10 5 celule/godeu pentru un volum de 200 μl mediu de cultură pentru a desfăşura experimentele propuse în condiţiii optime. Capitolul V Evaluarea efectului citotoxic al magaininei II asupra liniilor celulare tumorale MDA-MB-231 şi M14K Având în vedere literatura de specialitate, în acest studiu in vitro, neam propus să evaluăm potenţialul tumoricid al peptidului citotoxic magainina II asupra unor linii celulare tumorale: MDA-MB-231 (adenocarcinom mamar) şi M14K (mezoteliom uman) [17, 32]. Pentru a analiza efectele magaininei II, asupra viabilităţii şi proliferării celulare s-au folosit următoarele tehnici de analiză: tehnici optimizate de cultivare a celulelor, testul de viabilitate MTT, tehnica citometriei în flux. Testul MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazoliu] a permis evaluarea metabolismului oxidativ şi al 17

21 răspunsului unei populaţii celulare la acţiunea unor factori externi cu efect favorabil sau nu asupra supravieţuirii acestora într-un anumit mediu de cultură. Tabel II: Valorile absorbanţelor şi calculul mediilor pentru culturile celulare realizate în triplicat pentru fiecare concentraţie de magainina II. MDA-MB231 (la 72h de incubare cu peptid) Magainina II Mediile pentru valorile absorbanţelor (referinţa - 520/620nm) utilizate în calculul citostaziei pentru linia de adenocarcinom mamar CN 120μ M 60μM 30μM 15μM 7,5μ M 18 3,5μ M 1,8μ M 0,9 μm 0,37 0,149 0,281 0,324 0,451 0,586 0,597 0,607 0,617 0,36 0,15 0,285 0,318 0,45 0,575 0,595 0,605 0,61 0,37 0,154 0,288 0,322 0,439 0,523 0,595 0,605 0,615 Media Abs. 0,37 0,151 0,284 0,321 0,446 0,561 0,595 0,605 0,614 Studiile experimentale au fost realizate pe linii celulare tumorale lucrându-se în triplicat pentru fiecare linie celulară şi pentru fiecare concentraţie de peptid testată. Astfel că, rezultatele obţinute prin diferite tehnici de studiu a viabilităţii acestor celule, au reprezentat mediile celor trei citiri. Evaluarea viabilităţii prin tehnica MTT s-a realizat calculând citostazia în funcţie de media absorbanţelor pentru celulele cu peptid raportate la celulele fără peptid (CN). Mai întâi s -a realizat determinarea absorbanţelor pentru fiecare godeu în parte în funcţie de concentraţia de peptid utilizată (ex: godeul B 3, D 3, F 3 pentru concentraţia de peptid de 120μM), apoi s-a realizat calculul statistic al mediei celor trei absobanţe, medie care a constituit valoarea interpretată ulterior prin determiunarea citostaziei procentuale ( Tabel II). Tabel III: Determinarea citostaziei (%) pentru linia tumorală MDA-MB231 prin tehnica MTT Linia celulară tumorală MDA-MB231 (adenocarcinom mamar) % de citostazie = (1 - A_celule cu peptid / Acontrol neg.) x100 Conc. peptid 120μ M 60 μm 30 μm 15 μm 7,5 μm 3,5 μm 1,8 μm 0,9 μm Magainina II 59,44 23,54 13,69-19,9-50,7-59,9-62,6-64,9 Coloanele 1 şi 12 a plăcii de cultură, respectiv rândul A şi H au conţinut în fiecare godeu mediu de cultură pentru a preîntâmpina efectul de margine al culturii, iar coloanele 2 şi 11 au conţinut mediu de cultură cu

22 celulele tumorale (plecând de la 10 5 celule/godeu/200 μl) fără peptid. Media absorbanţelor pentru aceste godeuri au constituit controlul negativ (CN). Linia celulară MDA-MB231 este o linie celulară aderentă de adenocarcinom mamar, cunoscându-se trei linii celulare tumorale de cancer mamar: MCF-7, MDA-MB-231 şi T-47D [29, 54]. Din literatura de specialitate se cunoaşte faptul că magainina II are efect citotoxic asupra liniei celulare tumorale MCF7 la concentraţii mai mari de 200µg/mL (>80µM) [15]. Tabel IV: Evaluarea apoptozei celulare prin tehnica citometriei în flux cu Anexina V şi 7-AAD MDA-MB events /godeu Control negativ (CN) Magainina II 120μM (M120) Magainina II 60μM (M60) Q1- celule moarte 7AAD+ Q2 celule in apoptoza tarzie- 7AAD+AnnexinV+ Q3 celule vii 7AAD- AnnexinV- Q4 celule in apoptoza timpurie- AnnexinV+7AAD- % % % % 1,8 3 90,5 4,7 1,4 47,5 36,3 14,8 0,8 19,6 76,2 3,4 19

23 Fig.V-2: Distribuţia populaţiilor celulare în funcţie de intensitatea de fluorescenţă a marcajelor cu 7-AAD şi Anexină V a celulelor MBA-MB-231 în absenţa (CN) şi în prezenţa peptidului citotoxic la o concentraţie de 120µM (M120). Cu ajutorul testului de viabilitate MTT s-a observat pentru linia celulară tumorală MDA-MB231 o citostazie de peste 50% pentru magainina II la o concentraţie de 120µM. Citostazia s-a menţinut până la concentraţii de 30µM pentru peptidul testat, fiind absentă la concentraţii de 15µM (Tabel III). Din punct de vedere statistic nu au existat diferenţe semnificative între cele trei citiri ale absorbanţelor. Analiza prin tehnica citometriei în flux a permis evaluarea apoptozei pentru linia celulară MDA-MB-231 incubată cu magainina II. Au fost achiziţionate câte 5000events/godeu, rezultatele obţinute fiind comparate cu viabilitatea celulelor netratate cu peptid (CN) (Tabel IV). concentratia peptidului (µm) M60 M120 CN Q4 -celule in apoptoza timpurie (AnnexinV+7AAD-) Q3 -celule vii (7AAD- AnnexinV-) Q2 - celule in apoptoza tarzie (7AAD+AnnexinV+) Q1 - celule moarte (7AAD+) % celule Fig.V-3:Evaluarea apoptozei celulelor MDA-MB-231 în prezenţa sau abesenţa peptidelor citotoxice studiat: magainina II (M) la concentraţiile de 120µM şi 60µM. Rezultatele obţinute prin această tehnică au fost confirmate de testul MTT, adică aproximativ 50% din celulele incubate cu magainina II (120µM) au intrat în apoptoză (1,4% sunt celule moarte - cadranul Q1, 14,8% în apoptoză timpurie populaţia cadranul Q4, iar 47,5% în apoptoză tardivă populaţia cadranul Q2) ( Fig. V-2, V-3, Tabel IV). Linia celulară M14K reprezintă o linie celulară aderentă de mezoteliom uman. Din cele 3 subtipuri histologice de mezoteliom, în experiment s-a folosit linia M14K de celule mezoteliale de tip epitelial. Evoluţia celulelor M14K în urma incubării 72h cu magainina II a fost asemănătoare cu cea a celulelor MDA-MB-231, cu o citostazie de peste 50% pentru magainina II la o concentraţie de 120µM 20

24 (Tabel V). La concentraţii de 30µM citotoxicitatea magaininei a fost redusă semnificativ şi absentă la concentraţii de15µm pentru cele două linii celulare tumorale testate (Tabel IV, Tabel V).Tabel V: Determinarea citostaziei (%) pentru linia tumorală M14K (tehnica MTT) Linia celulară tumorală M14K (mezoteliom) % de citostazie = (1 - A_celule cu peptid / Acontrol neg.) x100 Conc ,5 3,5 1,8 0,9 peptid μm μm μm μm μm μm μm μm Magainina 53,95 13,37 4,48-3,68-18,58-22,89-48,5-63,2 II Prin urmare viabilitatea celulară a fost la fel de scăzută în cazul incubării cu magainina II atât în cazul celulelor tumorale ale liniei MDA-MB- 231 cât şi în cazul liniei M14K. în acest studiu experimental nu s-a remarcat un comportament foarte diferit al diferitelor tipuri de celule tumorale la acţiunea aceluiaşi peptid citotoxic la aceeaşi concentraţie. Rezultatele obţinute prin tehnica citometriei în flux în care am urmărit apoptoza celulelor liniei M14K incubate timp de 72h cu magainina II în diferite concentraţii conform schemei de lucru menţionată, au fost confirmate de tehnica MTT. S-a constatat că populaţia celulară intrată în apoptoză a fost peste 50% (47,8% în apotoză tardivă cadranul Q2, 13,5% în apotoză timpurie cadranul Q4) în comparaţie cu controlul negativ pentru care viabilitatea celulară a fost de 89,6% (cadranul Q3) (Fig.V-5). M60 concentratie de peptid (µm) M120 CN Q4 -celule in apoptoza timpurie (AnnexinV+7AAD-) Q3 -celule vii (7AAD-AnnexinV-) Q2 - celule in apoptoza tarzie (7AAD+AnnexinV+) Q1 - celule moarte (7AAD+) % celule Fig.V-5: Evaluarea apoptozei celulelor M14K în prezenţa sau abesenţa peptidelor citotoxice studiate: magainina 2 (M) la concentraţia de 120µM şi 60µM. 21

25 Obiectivele acestui studiu au fost atinse prin evaluarea efectului citotoxic in vitro determinând procentul de citostazie prin tehnica MTT, pentru diferite tipuri de celule (linia celulară MDA-MB-231 şi M14K), în funcţie de tipul şi concentraţiile de peptid citotoxic utilizat. Această tehnică de urmărire a viabilităţii celulare în prezenţa unui compus presupus toxic, a fost confirmată prin tehnica citometriei în flux cu ajutorul fluorocromilor 7AAD şi PE Annexin V cu ajutorul căreia s-a stabilit şi stadiul de apotoză în care s-au aflat celulele tumorale după 72 de ore de incubare în prezenţa peptidului, rezultatele obţinute fiind întotdeauna comparate cu controlul negativ (celulele tumorale incubate în absenţa peptidului). În concluzie, efectele citotoxice al magaininei II în acest studiu, a depins în special de concentraţia acestui peptid în mediul de viaţă al celulei tumorale, fiind semnificativ la concentraţii de 120µM şi păstrându-se până la concentraţii de 60µM. La concentraţii de 30µM aceste efecte au fost nesemnificative. Efectul tumoricid nu a fost influenţat semnificativ de tipul liniei celulare tumorale studiate în acest caz. Capitolul VI Determinarea efectul citotoxic al cecropinelor A şi B asupra liniilor celulare tumorale MDA-MB-231 şi M14K Unul dintre obiectivele principale ale acestui studiu experimetal a fost acela de a evalua potenţialul citotoxic al cecropinelor A şi B asupra unor linii celulare tumorale: MDA-MB231 (adenocarcinom mamar) şi M14K (mezoteliom). De asemenea, a fost urmărit dacă citotoxicitatea acestor peptide din familia cecropinelor este influenţată de tipul sau de concentraţia de peptid din mediul de cultură al celulelor sau de tipul de linie celulară tumorală utilizat. La fel ca şi în cazul evaluării potenţialului citotoxic al magaininei II, şi în cazul peptidelor din familia cecropinelor, s-a lucrat în triplicat, adică pentru fiecare linie celulară testată au fost utilizate cîte trei godeuri cu aceeaşi cantitate de mediu de cultură, cu acelaşi număr de celule (10 5 celule/godeu) pentru fiecare concentraţie de peptid conform schemei de lucru prezentată în capitolul de materiale şi metode. Astfel, indiferent de metoda utilizată pentru evaluarea viabilităţii celulare în prezenţa unei anumite concentraţie de cecropină, au fost realizate trei determinări pentru care ulterior s-a efectuat calculul statistic al mediei mărimii măsurate. Astfel, în cazul tehnicii MTT s-a măsurat absorbanţa pentru fiecare concentraţie de peptid în triplicat apoi s-a efectuat media celor trei măsurători, iar ulterior s-a calculat procentul de 22

26 citostazie care a ţinut cont atît de media absorbanţei pentru celulele incubate cu o anumită concetraţie de peptid cât şi de media absorbanţei obţinută pentru controlul negativ (CN). Controlul negativ a fost reprezentat de celulele tumorale incubate fără peptid. Concentraţia de plecare a fost conform modelului experimental stabilit in vitro 10 5 celule/godeu. Analiza rezultatelor experimentale obţinute cu ajutorul testului de viabilitate MTT a evidenţiat pentru linia celulară MDA-MB231 la 72h de incubare cu fiecare din cele două peptide, o citostazie de 32,9% pentru cecropina A şi de 33,16% pentru cecropina B la o concentraţie a peptidului de 120µM (Tabel VIII). Tabel VIII: Determinarea citostaziei (%) pentru linia tumorală MDA-MB231. Linia celulară tumorală MDA-MB231 % de citostazie (testul MTT) Conc. peptid 120 μm 60 μm 30 μm 15 μm 7,5 μm 3,5 μm 1,8 μm 0,9 μm Cecropina A 32,92 22,50 5,73-1,6-16,0-19,7-47,1-62,4 Cecropina B 33,16 25,79 8,56-14,3-50,8-55,2-57,6-58,3 Aceste rezultate au demonstrat că în cazul celor două cecropine nu au existat diferenţe semnificative în ceea ce priveşte potenţialul citotoxic la aceeaşi concentraţie a peptidului în mediul de cultură, pentru aceeaşi linie celulară tumorală (MDA -MB231). În figura VI-2a se remarcă prezenţa a numeroşi corpi apoptotici atunci când celulele tumorale au fost incubate 72 de ore cu peptid în comparaţie cu controlul negativ (Fig.VI-2b) la care se remarcă o proliferare importantă după o incubare de 72 de ore în absenţa peptidului. Fig.VI-2: a) Linia celulară MDA-MB 231 la 72 h după incubarea cu peptid citotoxic; b)cultura de celule MDA-MB231 la 72 h de la cultivare fără peptid - controlul negativ (CN). Imaginea a fost obţinută după ce a fost adăugat MTT cu ajutorul microscopului Nikon Eclipse TE 300 (obiectiv100x). 23

27 Citostazia s-a menţinut până la concentraţii de 30µM pentru cele două peptide testate, fiind absentă la concentraţii de 15µM ( Tabel VIII). La concentraţii de 60 µm ale peptidului în mediul de cultură, citostazia s-a menţinut peste 20% pentru ambele cecropine în cazul liniei tumorale de adenocarcinom mamar, fiind nesemnificativă la concentraţii de 30µM. Absorbanţele utilizate în calculul citostaziei au fost reprezentate de mediile celor trei citiri pentru fiecare concentraţie de peptid şi fiecare liniie celulară analizată. Din punct de vedere statistic nu au existat diferenţe semnificative între cele trei citiri ale absorbanţelor. Evaluarea apoptozei prin tehnica citometriei în flux pentru linia celulară MDA-MB-231 incubată 72h cu câte una din cele două petide a fost realizată prin achiziţionarea a câte 5000 events/godeu. Rezultatele obţinute au fost comparate cu viabilitatea celulelor netratate cu peptid (controlul negativ - CN). S-a analizat distribuţia populaţiilor celulare şi s-a constatat că după 72 de ore de incubare cu peptid citotoxic, mai mult de 50% din celulele tumorale s-au găsit în cadranul Q3 (celule vii), dar semnificativ mai scăzut în comparaţie cu controlul negativ pentru care viabilitatea celulară a fost de 90,5% (Fig.IV-4). CB60 concentratia peptidului (µm) CB120 CA60 CA120 CN Q4 -celule in apoptoza timpurie (AnnexinV+7AAD-) Q3 -celule vii (7AAD- AnnexinV-) Q2 - celule in apoptoza tarzie (7AAD+AnnexinV+) Q1 - celule moarte (7AAD+) % celule Fig.VI-4: Evaluarea apoptozei celulelor MDA-MB-231 în prezenţa sau abesenţa peptidelor citotoxice studiate: magainina II (M), cecropina A (CA) şi cecropina B (CB) la concentraţiile de 120µM şi 60µM. La o concentraţie de 120 μm în cadranul Q2 s-a obsrvat că un procent semnificativ de celule tumorale au intrat în apotoză şi anume 26,8% pentru cecropina A (CA) şi 28,3% pentru ceropina B (CB). Prin urmare, la aceeaşi concentraţie de peptid şi pentru aceeaşi linie celulară tumorală nu au existat diferenţe semnificative statistic în ceea ce priveşte viabilitattea celulară 24

28 comparativ cu controlul negativ pentru care celulele aflate în apoptoză târzie (cadranul Q2) a fost doar de 3,6% (Fig.VI-4). Procentul de celule intrate în apoptoză târzie a scăzut semnificativ odată cu scăderea la jumătate a concentraţiei de peptid din mediul de cultură celular. Rezultatele obţinute prin această tehnică au fost confirmate de testul MTT. Linia celulară M14K reprezintă o linie celulară aderentă de mezoteliom uman. După 72 h de incubare a celulelor liniei M14K cu unul din cele două peptide din familia ceropinelor, la microscopul optic s-a observat intrarea în apotoză a celulelor de mezoteliom în comparaţie cu controlul negativ (CN-celulele M14K incubate fără peptid) (Fig.VI-5a,b). Fig.VI-5: a) Celulele liniei M14K la 72 h după incubarea cu peptid; b) Cultura de celule M14K la 72 h de la cultivare fără peptid CN, controlul negativ (diametrul celular de aproximativ 20μm). Imaginea a fost obţinută după ce a fost adăugat MTT peste celulele liniei M14K după ce acestea au fost incubate cu peptid cu ajutorul microscopului Nikon Eclipse TE 300 (obiectiv100x) Tabel XII: Determinarea citostaziei (%) pentru linia tumorală M14K Linia celulară tumorală M14K % de citostazie (testul MTT) Conc ,5 3,5 1,8 0,9 peptid μm μm μm μm μm μm μm μm Cecropina 26,33 17,79 5,071-11,3-31,58-41,90-51,7-63,0 A Cecropina 22,56 13,92 3,788-8,5-23,52-45,28-59,5-62,5 B Imaginile obţinute cu ajutorul microscopului optic au fost confirmate de testul de viabilitate MTT. După citirea absorbanţelor (s-a lucrat în triplicat) s-a făcut media şi s-a calculat citostazia pentru fiecare concentraţie de cecropină cu care au fost incubate celulele linie M14K.Procentul de celule 25

29 care au intrat în apoptoză în prezenţa unuia din cele două cecropine a fost mai mic decât în cazul liniei celulare MDA-MB 231, citostazia fiind de 26,3% în cazul cecropinei A şi de 22,56% în cazul cecropinei B pentru concentraţii ale peptidului de 120 μm în mediul de cultură al celulelor (Tabel XII). Procentul de citostazie a scăzut semnificativ odată cu scăderea concentraţiei de peptid, fiind absentă la concetraţii de 15 μm (Tabel XII). O altă tehnică de evaluare a citotoxicităţii celor două peptide a fost citometria în flux, care a permis evaluarea apotozei celulare în prezenţa sau absenţa peptidului la diferite concentraţii ( Fig.VI-7). Populaţiile celulare au fost delimitate cu ajutorul a patru cadrane în populţia de celule vii (Q3), populaţia de celule care a intrat în apotoză timpurie (Q4) şi tardivă (Q2) şi popula ţia de celule moarte (Q1) (Fig.VI-7). Conform acestei tehnici, evoluţia celulelor M14K la impactul acestora cu cele două tipuri de peptide citotoxice după 72 de ore de incubare, a fost diferită semnificativ de cea a celulelor MDA-MB-231 (Fig.VI-7). CB60 concentratie de peptid (µm) CB120 CA60 CA120 CN Q4 -celule in apoptoza timpurie (AnnexinV+7AAD-) Q3 -celule vii (7AAD-AnnexinV-) Q2 - celule in apoptoza tarzie (7AAD+AnnexinV+) Q1 - celule moarte (7AAD+) % celule Fig.VI-7: Evaluarea apoptozei celulelor MDA-MB-231 în prezenţa sau absenţa peptidelor citotoxice studiate: magainina II (M), cecropina A (CA) şi cecropina B (CB) la concentraţia de 120µM şi 60µM. La concentraţii de 120 μm după 72 de ore celulele tumorale ale linie M14K s-au dovedit a fi mai rezistente la acţiunea cecropinelor A şi B, deoarece s-au aflat abia în faza de apoptoză iniţială ( Q4) comparativ cu celulele liniei MDA-MB231 care se aflau deja într-un procent semnificativ în faza de apoptoză tardivă (Q2). Pe de altă parte sensibilitatea mult mai scăzută a celulelor M14K la acţiunea acestor peptide este evidenţiată şi de faptul că 26

30 procentul celulelor din cadranul Q4 a fost sub 20% (17,4% pentru cecropina A şi 18,3% pentru cecropina B). În medie, procentul celulelor tumorale din cadranul Q2 pentru linia M14K a fost sub 10% (6,6% pentru cecropina A şi 6,9 pentru cecropina B) (Fig.VI-7). Viabilitatea celulară a fost semnificativ crescută odată cu scăderea concentraţiei de peptid (la 60 μm) din mediul de cultură, apoptoza celulară fiind nesemnificativă la 30 μm şi absentă la concentraţii ale peptidului de 15 μm (Tabel XII). Rezultatele experimentale obţinute prin tehnica citometriei în flux în care am urmărit apoptoza celulelor liniei M14K incubate cu peptidele studiate în diferite concentraţii conform schemei de lucru menţionată, au fost confirmate de tehnica MTT. În concluzie, pentru cele două linii celulare MDA-MB-231 (adenocarcinom mamar) şi M14K (mezoteliom uman) s -a înregistrat un comportament diferit în ceea ce priveşte acţiunea cecropinelor A şi B, linia MDA-MB-231 fiind mai sensibilă la acţiunea acestora în compraţie cu linia M14K. Prin urmare există un comportament diferit al diferitelor tipuri de celule tumorale la acţiunea aceloraşi peptide citotoxice la aceeaşi concentraţie. Obiectivele acestui studiu au fost atinse prin evaluarea efectului citotoxic in vitro determinând procentul de citostazie prin tehnica MTT, pentru diferite tipuri de celule (linia celulară MDA-MB-231 şi M14K), în funcţie de tipul şi concentraţiile de peptid citotoxic utilizat. Această tehnică de urmărire a viabilităţii celulare în prezenţa unui compus presupus toxic, a fost confirmată prin tehnica citometriei în flux cu ajutorul fluorocromilor 7AAD şi PE Annexin V cu ajutorul căreia s-a stabilit şi stadiul de apotoză în care s-au aflat celulele tumorale după 72 de ore de incubare în prezenţa peptidului, rezultatele obţinute fiind întotdeauna comparate cu controlul negativ (celulele tumorale incubate în absenţa peptidului). În concluzie, în acest studiu experiental in vitro, am constat că efectul citotoxic al celor două peptide din familia cecropinelor a depins de concentraţia acestora în mediul de cultură al celulelor tumorale, fiind semnificativ la concentraţii de 120µM şi păstrându-se până la concentraţii de 60µM. La concentraţii de 30µM aceste efecte tumoricide au fost nesemnificative. Conform literaturii de specialitate potenţialul citotoxic depinde de tipul peptidului, toxicitatea fiind asemănătoare în cazul celor două cecropine la aceeaşi concetraţie pentru aceeaşi linie tumotală. O altă concluzie a acestui studiu ar fi faptul că efectul tumoricid depinde pe de altă parte şi de tipul liniei celulare tumorale. S-a constatat că celulele liniei MDA-MB-231 (adenocarcinom mamar) au fost mult mai sensibile la acţiunea cecropinelor A şi B comparativ cu celulele liniei tumorale M14K (mezoteliom uman). 27

31 Capitolul VII Evaluarea citotoxicităţii indusă de magainina II şi cecropinele A şi B asupra liniei celulare tumorale HT-29 (adenocarcinom colorectal) În conformitate cu literatura de specialitate, numeroase peptide naturale cunoscute ca având efect antimicrobian sau dovedit a avea proprietăţi citotoxice asupra unor celule tumorale [5, 18, 23, 48, 53]. În capitolele anteriore din cadrul acestei teze de doctorat am constatat că două peptide din familia cecropinelor (A şi B) precum şi magainina II au potenţial tumoricid asupra unor linii celulare tumorale de adenocarcinom mamar (MDA -MB231) şi mezoteliom uman (M14K). Am constatat că efectul acestor peptide depinde atât de concetraţia de peptid din mediul de cultură dar şi de tipul de peptid, precum şi de tipul de linie celulară [2, 3]. Plecând de la rezultatele obţinute în studiile anterioare ne-am propus să urmărim, în cadrul acestui capitol, dacă aceste peptide antimicrobiene au poteţial tumoricid şi asupra altor linii celulare şi anume: adenocarcinomul colorectal (HT-29) şi carcinomul alveolar uman (A549). Linia celulară HT-29 fiind o linie celulară aderentă de adenocarcinom colorectal (Fig.VII-2). Fig.VII-2: Cultura de celule HT 29 la 72h de la cultivare (diametrul celular de aproximativ 20μm). Imaginea a fost obţinută cu ajutorul microscopului Nikon Eclipse TE 300 (obiectiv 100X). Celulele HT-29 produc antigen carcinoembrionar şi sunt celule umane epiteliale intestinale care produc componentă secretoare de imunoglobulină IgA. Aceste celule sunt utilizate pentru studii tumorigenice. Pentru realizarea acestor studii experimentale au fost utilizate plăci de cultură cu 96 godeuri şi cu fundul plat. Din flaconul cu celulele de testat au fost pipetate în fiecare godeu câte 200 µl soluţie (mediu de cultură) conţinând 10 5 celule. La un interval de 24 ore a fost schimbat mediul de cultură prin răsturnarea plăcuţei 28

32 pe un tifon steril. După 72 de ore de incubare a liniei celulare HT-29, microscopic s-a constatat că celulele aderente au proliferat suficient de mult pentru a putea fi desprinse şi redistribuite în godeuri pentru a fi incubate apoi cu diferite concentraţii de peptid ( Fig.VII-2).Cunoscând masele moleculare pentru magainină II, cecropin A şi cecropin B (M magainină II = 2466,9 g/mol, M cecropin A = 4003,8 g/mol şi M cecropin B = 3835,7g/mol) au fost calculate concentraţiile pentru cele trei tipuri de peptide citotoxice (PC) aplicate liniei celulare selectate plecând de la o concentraţie de 120μM şi ajungând la o concentraţie de 0,9μM prin diluţii succesive. Celulele au fost incubate în 200μL mediu complet/godeu conţinând magainină II, cecropina A şi cecropina B în diferite concentraţii finale la 37 C şi 5% CO 2, timp de 72h. În afara faptului că experimentul pe această linie celulară pentru cele două peptide a fost realizat în triplicat, au fost utilizate următoarele controale interne: Controlul negativ care a fost constituit din celulele incubate fără peptid citotoxic, astfel încât a putut fi făcută comparaţia între evoluţia celulelor tratate cu peptid şi cele netratate. Controlul pozitiv care a fost reprezentat de clorhidrat de doxorubicină (sindroxocin 2mg/mL, pulbere pentru soluţie perfuzabilă). Concentraţia de doxorubicină folosită a fost de 20μM. În fiecare godeu s-a adăugat câte 3,48 μl doxorubicină raportat la un volum final de 200μL. Fig.VII-4: Imaginea celulelor HT-29 la microscop după ce a fost adăugat MTT. Imaginea a fost efectuată cu ajutorul microscopului Nikon Eclipse TE 300, obiectiv 100X După 72 ore de la incubare, în fiecare godeu au fost adăugaţi 20μL MTT ( 5mg/mL). Soluţia de MTT s-a preparat în tampon PBS-Dulbecco. Cantitatea de MTT s-a calculat în funcţie de numărul de godeuri utilizate. După solubilizarea completă a MTT-ului în PBS soluţia de MTT a fost sterilizată printr-un filtru de porozitate mică (0,22 μm). Celulele au fost 29

33 incubate la 37 0 C, timp de 4 h, după care mediul a fost eliminat şi înlocuit cu 100 μl DMSO (dimetilsulfoxid, Roth), pentru dizolvarea cristalelor de formazan formate prin reducerea MTT-ului (Fig.VII-4). Extincţia a fost citită la un spectrofotometru cu plăci (Tecan Sunrise ), la lungimea de undă de 570/620nm. Procentul de celule HT 29 care au intrat în apotoză, celule care au fost incubate în prezenţa unuia din cele trei petide citotoxice în diferite concentraţii, a fost comparat cu cel al celulelor care nu au fost tratate cu petid. Populaţiile celulare tratate sau netratate cu peptid (CN) au fost comparate cu un control pozitiv (CP) care a fost constituit dintr -un citotoxic cunoscut (doxorubicin). Acest citotoxic utilizat ca şi control pozitiv a fost incubat cu fiecare linie celuară în parte fiind utilizate concentraţii de şase ori mai mici (20 µm) decât concentraţia maximă de peptid utilizată în experiment (Fig.VII-4). 30

34 Fig.VII-5: Distribuţia populaţiilor celulare în funcţie de intensitatea de fluorescenţă a marcajelor cu 7-AAD şi Anexină V a celulelor HT29 în absenţa (CN) şi în prezenţa peptidului citotoxic după incubare 72h cu diferite concentraţii: 120µM (M120), 60µM (M60) şi 30µM (M30). Controlul pozitiv (CP) a fost realizat în aceleşi condiţii de lucru cu doxorubicin 20µM. Pentru a stabili care a fost efectul peptidului asupra liniei celulare utilizate în experiment, s-a scăzut procentul de celule intrat în apotoză obţinut pentru controlul negative şi care va fi considerat o moarte fiziologică a celulelor studiate, din procentul celulelor apoptotice tratate cu peptid citotoxic. Adunând procentul de celule intrate în apotoză timpurie sau târzie, dar şi pe cel al celulelor moarte s-a constatat cu ajutorul acestei tehnici că celulele tumorale aparţinând liniei celulare HT29 (adenocarcinom colorectal) că aceste celule sunt sensibile la concentraţii mari de magainină II (120µM) şi la diluţiile successive ale acesteia până la concentraţii de 30µM. Celulele liniei HT29 incubate cu magainina II la concentraţii de 120µM au înregistrat procente de aproximativ 20% apoptoză timpurie, respective apotoză târzie, adică aproximativ 40% apotoză. Acest procent de apotoză a scăzut la jumătate odată cu scăderea concentraţiei de peptid (Fig.VII-5). Imaginile microscopice obţinute pentru celulele incubate cu magainină II (120µM) confirm rezultatele obţinute prin citometrie în flux, în sensul că pot fi observate numeroase celule apoptotice (Fig.VII-6). În ceea ce priveşte activitatea biologic a celorlalte două petide citotoxice din familia cecropinelor, s-a constatat că acestea nu au avut un efect citotoxic asupra 31

35 celulelor tumorale HT29 comparativ cu magainina II sau cu controlul pozitiv constituit dintr-un citotoxic cunoscut. S-a remarcat faptul că doxorubicina care a fost utilizată ca şi control pozitiv (CP), a indus o apotoză important în urma incubării cu aceste celule tumorale, chiar la concentraţii mult mai mici decât cele de peptid cu care au fost incubate aceste celule. Fig.VII-6: Vizualizarea celulelor HT 29 (o celulă HT 29 are un diametru de aproximativ 20μm) la 72 h de la cultivare în prezenţa magaininei II (120 μm), imagine făcută cu ajutorul unui microscop Nikon Eclipse TE 300 (obiectiv 100X). Fig.VII-9: Variaţia mediilor absorbanţelor pentru culturile de celule care au conţinut peptid citotoxic în diferite concentraţii conform metodei de lucru şi controlul negativ constituit din celule fără peptid citotoxic. 32

36 Aceste rezultate experimentale obţinute ne arată faptul că are importanţă atât concentraţia de peptid citototxic utilizat dar şi natura acestuia. Astfel că dacă magainina II are un efect toxic asupra acestei linii celulare tumorale, petidele din familia cecropinelor nu au un efect citotoxic la concentraţiile experimentale utilizate. Rezultatele obţinute prin tehnica citometriei în flux au fost susţinute de rezultate experimentale asemănătoare obţinute prin tehnica MTT. Astfel, comparând valorile medii obţinute pentru absorbanţa controlului negativ (CN) care a conţinut doar celule fără peptid cu valorile medii ale absobanţelor obţinute pentru culturile de celule care au fost incubate cu diferite concetraţii de peptid, s-a constatat că valorile absorbanţelor au crescut pe măsură ce concetraţia de peptid a fost mai mică. De asemenea, s-a constatat că valorile medii ale acestor absorbanţe au fost mai mici decât cele ale CN pentru concentraţii de magainină II peste 30µM (Fig.VII-9). Tabel XVII: Variaţia citostaziei celulelor incubate 72h cu diferite concentraţii din cele trei peptide studiate: magainina II şi cecropiele A şi B HT-29 % de citostazie= (1 - A_celule cu peptid / Acontrol neg) x100 Conc. de 120μM 60 μm 30 μm 15 μm 7,5 μm 3,5 μm 1,8 μm 0,9 μm peptid Magainina 38,69 20,18 10,55-60,2-79,0-85,01-66,5-98,31 II Cecropin -70,07-89,0-78,4-66,4-63,01-85,77-92,68-86,78 A Cecropin -9,45-79,7-63,2-67,4-76,61-102,5-84, B În aceste situaţii şi procentul de citostazie, adică de celule care au intrat în apoptoză a fost semnificativ mai mare comparativ cu CN. În urma analizei rezultatelor experimentale s-a constatat că dintre cele trei peptide testate pentru linia de adenocarcinom colorectal (HT -29) doar magainina II a manifestat poetnţial citotoxic la concentraţii de peste 30µM. Astfel, la o concentraţie de 120µM efectul citotoxic al magainiei II a fost semnificativ crescut înregistrându-se un procent de citostazie de 38,69% (Fig.VII-10, Tabel XVII). Pentru fiecare peptid testat pe linia de celule tumorale HT-29, pe lângă controlul negativ (CN) constituit din celule incubate fără peptidul citotoxic, în aceste experimente a fost utilizat şi un control pozitiv (CP) care a fost constituit din celule incubate cu o substanţă cunsocută ca având toxicitate celulară pentru linia utilizată. În urma comparaţiei rezultatelor obţinute s-a remarcat că magainina II a avut o citotoxicitate asemănătoare cu doxorubicina 33

37 dar la o concentraţie triplă faţă de acesta, adică la o concetraţie de 120µM (citostazia de 38,7%) pentru magainia II faţă de doxorubicina 20µM (citostazia de 39,2%) (Fig.VII-10). Fig.VII-10: Variaţia citostaziei celulelor incubate 72h cu diferite concentraţii din cele trei peptide studiate: magainina II şi cecropiele A şi B faţă de controlul pozitiv (CP) Cele două peptide din familia cecropinelor nu au influenţat viabilitatea celulelor liniei HT-29. În concluzie, este importantă atât concentraţia de peptid citotoxic cu care incubăm o linie celulară tumorală, dar este important şi tipul de peptid. Deşi aceste peptide din familia cecropinelor s-a constatat pe parcursul experimentelor pe alte linii celulare cum ar fi MDA-MB231 (adenocarcinom mamar) şi M14K (mezoteliom uman) ca au potenţial citotoxic, totuşi pe alte linii celulare cum este în acest caz HT-29 (adenocarcinom colorectal) nu au efect toxic (Fig.VII-10, Tabel XVIII). Acest lucru ar putea fi explicat probabil pe seama activităţii unor enzime cum sunt cele din clasa ATP-azelor de tip ABC [22, 46]. Acestea se remarcă printr-un număr mare de molecule ce aparţin acestei clase, implicate în mecanisme cu semnificaţie în domeniul clinic. Dacă ABC ATP-azele bacteriene realizează importul de ioni, aminoacizi, peptide, proteine, mono- si polizaharide necesare acestor celule, ATP-azele ABC ale eucariotelor sunt specializate pentru export. O astfel de ATP-ază este proteina de multirezistenţă la medicamente (,, multidrug resistance protein" MDR) care este supraexprimată în celulele tumorale umane, determinând rezistenţa simultană la o varietate de medicamente citotoxice larg utilizate în 34

38 chemoterapie, 40% din cancerele umane având rezistenţă multimedicamentoasă [46]. Tabel XVIII: Procentul de citostazie pentru linia HT 29 în prezenţa peptidului citotoxic comparativ cu un control pozitiv constituit de doxorubicin CP (60 μm). % citostazie pentru linia HT-29 Conc. de peptid 120μM 60 μm 30 μm Concentraţia de doxorubicin CP (20 μm) Magainina II 38,7 20,2 10,6 39,2 Cecropina A 0,0 0,0 0,0 47,3 Cecropin B 0,0 0,0 0,0 40,3 În ceea ce priveşte mecanismul de acţiune al peptidelor din clasa magainelor, există studii experimentale care au arătat că dispersia (infiltrarea) lipozomală indusă de peptide este legată de natura lipidelor anionice. În cazul lipozomilor fosfatidil-serinelor prezente în membranele mamiferelor, peptida este mai puţin eficace în inducerea dispersiei. Au fost publicate mai multe studii cu privire la structura peptidelor antimicrobiene. Se cunoaşte faptul că proprietăţile biofizice şi biochimice cum ar fi: structura secundară, sarcina totală şi hidrofobicitatea influenţează interacţiunea biologică dintre peptidele antimicrobiene şi membranele celulare [33, 43, 44]. Cele mai multe peptide antimicrobiene nu au o structură bine definită atunci când se află în soluţie, în timp ce peptidele ciclice datorită prezenţei uneia sau mai multor legături disulfurice Cys-Cys au formă de β-sheet (structură secundară de tip betapilată). Mecanismul prin care îşi execută funcţia un peptid antimicrobian depinde de proprietăţile fizico-chimice ale acestuia şi anume: secvenţa de aminoacizi (structura primară), sarcina netă, amfifaticitatea, hidrofobicitatea, înfăşurarea structurii (include structura secun dară, dinamica şi orientarea lanţului peptidic) în membrane, oligomerizarea, concentraţia peptidului şi compoziţia membranei ţintă. Pentru a explica activitatea peptidelor antimicrobiene au fost propuse câteva mecanisme de acţiune şi distrugere a membranei celulare ţintă [33, 43, 44]. Acţiunea antimicrobiană a peptidelor implică stadii multiple cum ar fi adsorbţia la nivelul membranei, agregarea la interfaţa dintre mediul apos/bistratul lipidic, inserţia peptidelor în bistrat şi formarea porilor membranari [23]. Modelele utilizate pentru a explica mecanismul procesului de distrugere a membranei sunt: modelul carpet (tip covor), modelul barrel-stave (model tip inele de butoi) sau al porilor clasici, modelul porilor toroidali [30, 43, 44]. Destabilizarea membranelor prin 35

39 mecanismele enumerate anterior, poate fi urmată de procesul de translocare al anumitor peptide pe partea internă a membranei celulare, ceea ce permite interacţiunea acestora cu ţinte intracelulare, alterând anumite procese la acest nivel [36, 43]. Capitolul VIII Evaluarea proliferării celulare cu ajutorul tehnicii RTCA DP (Real Time Cell Analyzer Dual Plate) Una dintre tehnicile moderne de evaluare a viabilităţii unei culturi celulare este cea care utilizeză sisteme de monitorizare a viabilităţii celulare în timp real (în dinamică), un număr mare de zile. Un astfel de sistem este xcelligence RTCA DP (Real Time Cell Analyzer Dual Plate), care a fost utilizat pentru evaluarea efectului biologic al peptidelor studiate în cadrul acestei teze de doctorat. Cu ajutorul acestui sistem care măsoară impedanţa pe bază de semnale electrice celulare captate şi amplificate de o serie de microelectrozi cu o dispoziţie specifică pe fundul fiecărui godeu de cultură, a cuantificat în mod continuu proliferarea celulelor aderente furnizând date despre viabilitatea celulară în timp real, permiţând astfel calculul unui indice celular (IC) pe baza impedanţelor măsurate [4, 6]. Fig.VIII-1: Monitorizarea culturii celulare HT-29 după primele 15 ore de la incubare cu cele trei tipuri de peptide citotoxice (MII, CA, CB) în concentraţii de 60 μm şi 120 μm, comparativ cu celulele controlului negativ (CN). 36

40 Fig.VIII-2: Variaţia indicelu celular (IC) în funcţie de concentraţia peptidului (120 μm, 60 μm) utilizat pentru aceeaşi linie celulară (HT-29) la 15 ore de la debutul experimentului. Valorile indicelui celular au fost transmise la computer la fiecare 30 minute. Indicele celular este o unitate de măsurare arbitrară, utilizată pentru exprimarea impedanţei electrice cu ajutorul aparatului xcelligence RTCA DP, care a fost situat în interiorul incubatorului. Microelectrozii integraţi în partea de jos a plăcuţei de godeuri E-Plate, înregistrează şi măsoară modificările care pot să apară în proliferarea unei populaţii celulare aderente care se găseşte pe fundul godeului unui astfel de sistem. Datele astfel obţinute oferă informaţii cu privire la starea de proliferare a celulelor, adică cu privire la viabilitatea celulară, informaţii cantitative cu privire la numărul de celule, adeziunea celulară şi morfologia acestora. Celulele au fost cultivate în duplicat, 5000 celule/godeu/200 μl, în E- Plate 16, 2 benzi cu câte 8 godeuri. Efectul celor trei peptide (Magainin II, Cecropin A şi Cecropin B) asupra celulelor HT-29 a fost monitorizat timp de 72 ore după incubare cu două concentraţii de peptid 60 μm şi 120 μm. Controlul negativ (CN) pentru acest experiment a fost constituit din celulele incubate fără peptid. Pentru această linie celulară şi fiecare peptid evaluat s-a lucrat în duplicat. Din reprezentarea grafică se observă o creştere a proliferării celulare în cazul celulelor tumorale HT29 în prezenţa celor trei tipuri de peptid (magainină II, cecropina A şi cecropina B) comparativ cu celulele tumorale în care nu a fost adăugat peptid (CN). Se poate spune că în acest interval de timp (primele 15 ore) a avut loc o adaptare metabolică care a permis o proliferare 37

41 mai intensă pentru celulele tratate cu peptid comparativ cu cele netratate (Fig.VIII-1). Din figura VIII-2 se poate observa că în primele 15 ore nu au existat modificări semnificative în evoluţia celulelor HT-29 cu sau fără peptid. De fapt s-a constatat că modificările nu sunt semnificative în primele 24 de ore de la debutul experimentului (Fig.VIII-3). Fig.VIII-3: Variaţia indicelui celular (IC) în funcţie de concentraţia peptidului (120μM, 60μM) utilizat pentru aceeaşi linie celulară (HT-29) la 24 ore de la debutul experimentului. Fig.VIII-4: Monitorizarea culturii celulare tumorale HT-29 pe parcursul a 72 h de la incubare cu cecropină A, cecropină B şi magainină II (120μM) comparativ cu celulele fără peptid (control negativ-cn). 38

42 Adică s-a constatat că la 24 de ore de la incubarea celulelor tumorale cu peptid, a existat o inhibiţie tranzitorie care a fost înlăturată dupa 48 de ore şi respectiv 72 de ore, fiind stimulată proliferarea celulară doar în cazul peptidelor din familia cecropinelor ( Fig.VIII-4). Rezultatele experimentale obţinute prin utilizarea celor două concentraţii de peptid (120 μm şi 60μM) pentru linia tumorală HT-29, au evidenţiat o descreştere semnificativă a viabilităţii celulare în timp (51h), comparativ cu cea a controlului negativ (acelaşi tip de celule tumorale dar fără peptid citotoxic) (Fig.VIII-4). Acest lucru a putut fi observat analizând înregistrările analizorului RTCA DP până la 51h de la debutul experimentului ( Fig.VIII-4). În cazul celulelor tumorale HT-29 tratate cu cele două peptide din familia cecropinelor s-a observat o proliferare celulară medie până la aproximativ 45 de ore după care se observă o uşoară scădere a IC la 48h. Fig.VIII-5:Variaţia IC în funcţie de concentraţia peptidului (120 μm) utilizat. Acestă evoluţia a fost inregistrată şi în cazul CN şi a fost explicată prin consumul substanţelor nutritive din mediul celular. Acest aspect este foarte important fiind astfel explicată de ce este important să urmărim evoluţia în cultura celulară cel puţin 72 de ore după schimbarea mediului de cultură cu unul proaspăt. Într-adevăr, după schimbarea mediului de cultură proliferarea celulelor atât a celor incubate cu cecropina A cât şi a celor incubate cu cecropină B a fost intensă ceea ce a dovedit faptul că aceste peptide nu au un efect citotoxic la concentraţiile de lucru utilizate în cadrul acestui experiment. Prin urmare, celulele incubate cu una din cele două cecropine, au trecut de la citostazie la sincronizare, adică toate celulele au avut aceeaşi evoluţie din punct de vedere al proliferării celulare. În cazul magaininei II evoluţia 39