UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
|
|
- Aleesha Harrison
- 6 years ago
- Views:
Transcription
1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJ GAŠPER ČADEŽ DIPLMSKA NALGA UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2008
2 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJ GAŠPER ČADEŽ SINTEZA SERIJE NVIH HIDRKSIETILAMINV KT PTENCIALNIH INHIBITRJEV D-ALANIL-D-ALANIN LIGAZE SYNTHESIS F NEW HYDRXYETHYLAMINES AS PTENCIAL INHIBITRS F D-ALANYL-D-ALANINE LIGASE Ljubljana, 2008
3 Diplomsko delo sem opravljal na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Stanislava Gobca, mag. farm. in somentorstvom Mateja Sove, mag. farm. Spektroskopske in elementne analize so bile opravljene na Fakulteti za farmacijo, Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo ter Inštitutu Jožef Štefan. b tej priložnosti bi se rad zahvalil mentorju izr.prof.dr. Stanislavu Gobcu, mag. farm. in somentorju Mateju Sovi, mag. farm. za posredovano strokovno pomoč in koristne nasvete pri izdelavi diplomskega dela. Najlepša hvala tudi vsem ostalim iz Katedre za farmacevtsko kemijo, ki so mi med izdelavo diplomskega dela kakorkoli pomagali, še posebej gospe Damjani Zalar za pomoč pri laboratorijskem delu, Samu Turku za izdelane slike, Andreji Kovač za opravljena biološka testiranja, ter kolegom v laboratoriju za prijetno vzdušje. Na koncu pa bi se rad še posebej zahvalil svoji družini in prijateljem, ki so mi v času študija stali ob strani in mi nudili moralno podporo. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal samostojno pod mentorstvom izr. prof. dr. Stanislava Gobca, mag. farm. in somentorstvom Mateja Sove, mag. farm. Gašper Čadež Ljubljana, september 2008 Predsednik komisije: prof. dr. Stanko Srčič, mag. farm. Član komisije: izr. prof. dr. Marija Bogataj, mag. farm.
4 DIPLMSKA NALGA PVZETEK...IV ABSTRACT...V SEZNAM KRAJŠAV...VI 1. UVD PRTIMIKRBNE UČINKVINE RAZVJ REZISTENCE Mehanizmi, po katerih pride do rezistence na protimikrobne učinkovine: BAKTERIJSKA CELIČNA STENA IN PEPTIDGLIKAN Celična stena po Gramu pozitivnih (G+) in po Gramu negativnih (G-) bakterij G+ bakterije: G- bakterije: Zgradba peptidoglikana Biosinteza peptidoglikana Sinteza prekurzorjev v citoplazmi Prenos prekurzorjev skozi citoplazemsko membrano Vgraditev prekurzorjev v celično steno MUR ENCIMI MurC ligaza MurD ligaza D-ALANIL-D-ALANIN LIGAZA Mehanizem katalitične reakcije Ddl: Vezavna mesta za substrate na Ddl Znani inhibitorji Ddl D-cikloserin (DCS) Mimetiki prehodnega stanja kot inhibitorji Ddl Fosfonatni in fosfinatni analogi D-Ala-D-Ala Analogi (3-amino-oksoalkil) fosfonske kisline Novejši inhibitorji Ddl PEPTIDMIMETIKI IN ANALGI PREHDNEGA STANJA Peptidomimetiki Analogi prehodnega stanja NAČRT DELA: MATERIALI IN METDE MATERIALI METDE Določevanje tališča Kromatografske metode Spektroskopske metode Jedrska magnetna resonanca (NMR) I
5 DIPLMSKA NALGA Masna spektrometrija (MS) Infrardeča spektroskopija (IR) Elementna analiza HPLC analiza Nomenklatura in risanje spojin Sidranje Mikrovalovni reaktor Ugotavljanje encimske aktivnosti Ddl s kolorimetrično metodo z malahitno zelenim EKSPERIMENTALNI DEL REAKCIJSKE SHEME fosfata Reakcijska shema 1: Sinteza 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il dihidrogen Reakcijska shema 2: 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fenil hidrogen fosfata fosfata Reakcijska shema 3: Poskus sinteze dibenzil 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il Reakcijska shema 4: Poskus sinteze dietil 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2- ilfosfonata Reakcijska shema 5: Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-4-izopropilbenzenesulfonamida Reakcijska shema 6: Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-1-(2-nitrofenil)metansulfonamida Reakcijska shema 7: Sinteza malonilnih estrov hidroksietilamina KEMIJSKE SINTEZE Sinteza N-alil-4-fluorobenzensulfonamida Sinteza 4-fluoro-N-(oksiran-2-ilmetil)benzensulfonamida Sinteza 4-fluoro-N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil) benzensulfonamida Sinteza 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il difenilfosfata Sinteza 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il dihidrogen fosfata in 1-(4- fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fenil hidrogen fosfata Sinteza N-alil-4-metilbenzensulfonamida Sinteza 4-metil-N-(oksiran-2-il)metilbenzensulfonamida Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-4-metilbenzenesulfonamida Sinteza 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il difenil fosfata Sinteza 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fenil hidrogen fosfata Poskus sinteze dibenzil 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fosfata Sinteza N-(2-bromo-3-morfolinopropil)-4-fluorobenzensulfonamida Poskus sinteze dietil 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-ilfosfonata Sinteza N-(2-bromo-3-morfolinopropil)-4-metilbenzensulfonamida Poskus sinteze dietil 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-ilfosfonata Poskus sinteze 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il metil malonata Poskus sinteze 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il dihidrogen fosfata II
6 DIPLMSKA NALGA Sinteza metil 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il malonata Sinteza N-alil-4-izopropilbenzenesulfonamida Sinteza 4-izopropil-N-(oksiran-2-ilmetil)benzenesulfonamida Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-4-izopropilbenzenesulfonamida Sinteza N-alil-1-(2-nitrofenil)metansulfonamida Sinteza 1-(2-nitrofenil)-N-(oksiran-2-ilmetil)metansulfonamida Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-1-(2-nitrofenil)metansulfonamida Poskus sinteze dibenzil 1-(4-izopropilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fosfata Poskus sinteze dibenzil 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fosfata RAZPRAVA IN REZULTATI KMENTAR SINTEZNIH PSTPKV Sinteza fosfatnih analogov z uporabo difenilfosforilklorida Sinteza malonilnih estrov hidroksietilamina Poskus sinteze dietilfosfonatnih derivatov Poskus sinteze spojine 6 z uporabo PCl REZULTATI TESTIRANJA SPJIN NA RAZLIČNIH ENCIMIH ZAKLJUČEK LITERATURA III
7 DIPLMSKA NALGA PVZETEK dkritje protimikrobnih učinkovin v začetku 20. stoletja in njihova vključitev v terapijo infekcijskih bolezni je močno zmanjšala smrtnost pri tovrstnih obolenjih. Vzporedno s širjenjem uporabe protimikrobnih učinkovin se je pojavila tudi rezistenca nanje, ki v terapiji infekcijskih bolezni 21. stoletja povzroča veliko skrbi. Zaradi tega obstaja stalna potreba po razvoju novih protimikrobnih učinkovin. Razlike v zgradbi med bakterijsko in človeško celico nam omogočajo razvoj selektivno toksičnih učinkovin. Njihovo celično steno namreč gradi peptidoglikan, ki predstavlja tisti del celične stene, ki je odgovoren za njeno trdnost in zaščito bakterije pred razkrojem. Pri biosintezi peptidoglikana sodelujejo številni encimi, ki predstavljajo pomembne tarče pri razvoju novih protimikrobnih učinkovin. Z zaviranjem teh encimov spremenimo strukturo peptidoglikana in s tem vplivamo na propad bakterije. Eden izmed takih encimov je tudi D-alanil-D-alanin ligaza, ki katalizira nastanek dipeptida D- alanil-d-alanina. V diplomski nalogi smo načrtovali in sintetizirali serijo spojin s hidroksietilaminskim fragmentom, ki oponašajo tetraedrično prehodno stanje, preko katerega Ddl pretvori D-alanin v dipeptid D-Ala-D-Ala. Sintetizirali smo tudi fosforilizirane derivate hidroksietilaminov, ki še bolje posnemajo tetraedrično prehodno stanje. Kot izhodne spojine smo uporabili različno substituirane aromatske sulfonilkloride, na katere smo v naslednji stopnji pripenjali alilamin in z meta-kloroperoksibenzojsko kislino tvorili epoksidni obroč. Sledilo je odpiranje epoksidnega obroča z morfolinom ob prisotnosti kalcijevega triflata kot katalizatorja v mikrovalovnem reaktorju. Temu je sledilo pripenjanje zaščitenih derivatov fosfokloridata ter njihova odščita. Sintetiziranim spojinam smo določili inhibitorno aktivnost na encimih DdlB, VanA, MurC, MurD in MurE. Spojina 6, ki ima v svoji strukturi nesubstituirano fosfatno skupino, je pokazala najboljše rezultate pri vseh testiranih encimih. Določena je bila tudi IC 50 vrednost na encimih MurC (795 μm), DdlB (136 μm) in VanA (290 μm). Na osnovi tega sklepamo, da ima fosfatna skupina ključno vlogo pri inhibiciji omenjenih encimov. Spojina 6 (1-(4- fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il dihidrogen fosfat) tako predstavlja dobro tarčno molekulo za nadaljnjo optimizacijo njene strukture pri iskanju novih protimikrobnih učinkovin in prav tako tudi same sinteze v smislu izboljšanja izkoristkov. IV
8 DIPLMSKA NALGA ABSTRACT The discovery of antimicrobial agents at the beginning of the 20 th century and their use in treatment of infectious diseases has strongly reduced the rate of mortality. At the same time, the spreading use of antimicrobial drugs also resulted in resistance to them, which represents one of the major problems in the therapy of infectious diseases in the 21 st century. Therefore, there is a permanent need for the development of new antibacterial drugs. Structural differences between bacterial and human cells give us the opportunity for the development of selectively toxic agents. The bacterial cell wall is composed of macromolecules called peptidoglycan, the part of the cell wall responsible for cell integrity and protection of bacteria against its lysis. Peptidoglycan is synthesized by a series of enzymes that represent potential targets for the development of new antimicrobial agents. Inhibition of these enzymes will change the structure of peptidoglycan cell wall and lead to bacterial cell death. ne of these enzymes is D-alanine: D-alanine ligase (Ddl), which catalyzes the synthesis of dipeptide D-alanine-D-alanine. In the thesis, we developed and synthesized a new series of compounds with hydroxyethylamine moiety as a mimetics of tetrahedral transitional state, the intermediate of reaction mechanism that Ddl transforms D-alanine to dipeptide D-alanine-D-alanine. We also synthesized phosphorylated derivatives of hydroxyethylamines, which are good mimetics of tetrahedral transitional state. The starting compounds were differently substituted by aromatic sulfonyl chlorides, which were coupled with allylamine and then oxidized to epoxides in the presence of meta-chloroperbenzoic acid. The epoxide ring was opened with morpholine in the presence of calcium triphlate as a catalyst in the microwave reactor. This step was followed by coupling of protected derivatives of phosphochloridates and removal of the protecting group. Inhibitory activity of synthesized compounds was determined on DdlB, VanA, MurC, MurD and MurE. The compound 6, which structure contains the unsubstituted phosphate moiety, showed the best results on all tested enzymes. The IC 50 values were 136 μm for DdlB, 290 μm for VanA and 795 μm for MurC. Therefore, we can conlude that the phosphate group is essential for the inhibition of the aforementioned enzymes. Compound 6 (1-(4- fluorophenylsulfonamido)-3-morpholinopropan-2-yl dihydrogen phosphate) represents an important hit for further optimisation of the structure for development of novel antimicrobial drugs and also for the optimisation of the synthesis and yields. V
9 DIPLMSKA NALGA SEZNAM KRAJŠAV AcCoA ADP Ala Asp ATP Bn acetilkoencim A adenozindifosfat alanin asparaginska kislina adenozintrifosfat benzilna skupina Ca(Tf) 2 kalcijev trifluorometansulfonat-ca(cf 3 S 3 ) 2 CH 2 Cl 2 Cys d dd Ddl DMF DNK diklorometan cistein dublet dublet dubleta D-alanil-D-alanin ligaza N,N-dimetilformamid deoksiribonukleinska kislina E. coli Escherichia coli Et 3 N trietilamin G po Gramu negativne bakterije G+ po Gramu pozitivne bakterije GlmM GlmS fosfoglukozamin mutaza glukozamin-6-fosfat sintetaza VI
10 DIPLMSKA NALGA GlmU Gln Glu GluNAc Gly His Hz glukozamin-1fosfat acetiltransferaza in N-acetilglukozamin-1-fosfat uridiltransferaza glutamin glutaminska kislina N-acetilglukozamin glicin histidin hertz IC 50 srednja inhibitorna koncentracija IR J Lys M M m-cba m-cpba mdap Me MeH MF Mra Y MS infrardeča spektroskopija sklopitvena konstanta lizin multiplet molarnost (mol/l) meta-klorobenzojska kislina meta-kloroperoksibenzojska kislina mezo-diaminopimelinska kislina metilna skupina metanol mobilna faza UDP-N-acetilmuramoil-pentapeptid fosfotransferaza masna spektrometrija VII
11 DIPLMSKA NALGA MurA MurB MurC MurD MurE UDP-N-acetilglukozamin enolpiruviltransferaza UDP-N-acetilenolpiruvilglukozamin reduktaza UDP-N-acetilmuramat L-alanin ligaza UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin D-glutamat ligaza UDP-N-acetil muramoil-l-alanin-d-glutamat meso-diaminopimelat ligaza MurF UDP-N-acetil muramoil-l-alanin-d-glutamat-meso-diaminopimelat D- alanin-d-alanin ligaza MurG MurNAc MW NADP + NADPH nm NMR PEP Ph N-acetilglukozamin transferaza N-acetilmuraminska kislina mikrovalovi nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfathidrid nanometer nuklearna magnetna resonanca fosfoenolpiruvat fenilna skupina P i anorganski fosfat Pt Rf s t T platina retencijski faktor singlet triplet temperatura VIII
12 DIPLMSKA NALGA t ½ razpolovni čas THF Thr TLC tetrahidrofuran treonin tankoplastna kromatografija T m temperatura steklastega prehoda TMS Tt UDP UMA UMAG Van W δ λ tetrametilsilan triplet tripleta uridindifosfat UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutaminska kislina D-alanil-D-laktat ligaza wat kemijski premik valovna dolžina IX
13 DIPLMSKA NALGA 1. UVD 1.1 PRTIMIKRBNE UČINKVINE Glede na izvor ločimo dve skupini protimikrobnih učinkovin, kemoterapevtike in antibiotike. Prvi so sinteznega izvora, njihovo delovanje temelji na principu selektivne toksičnosti, t.j. lastnosti, da uničujejo celice patogenih mikroorganizmov, na gostitelja pa nimajo škodljivega vpliva. V širšem pomenu med kemoterapevtike prištevamo vse protibakterijske učinkovine. Protimikrobne učinkovine naravnega izvora in njihove polsintezne derivate uvrščamo med antibiotike (1, 2, 3). Protimikrobne učinkovine delimo na štiri skupine glede na mehanizem delovanja: 1. zaviralci sinteze proteinov (tetraciklini, makrolidi, fenilpropanoidi, aminoglikozidi, kloramfenikol), 2. zaviralci sinteze bakterijske celične stene (ß-laktami, vankomicin, fosfomicin, bacitracin, glikopeptidi, D-cikloserin), 3. zaviralci metabolizma bakterijskih nukleinskih kislin (kinoloni, sulfonamidi, trimetoprim, rifampicin), 4. učinkovine, ki spreminjajo permeabilnost celične membrane (polimiksini, amfotericin B). 1.2 RAZVJ REZISTENCE Vzporedno s širjenjem uporabe protimikrobnih učinkovin, se je pojavila tudi rezistenca ali odpornost nanje. Le ta je bila posledica neustreznega predpisovanja antibiotikov, množičnega in nepravilnega jemanja s strani pacientov ter čezmerne uporabe v profilaktične namene v veterini. Rezistenca na antibiotike je posledica evolucijskega mehanizma in naravne selekcije, kjer lahko preživijo le tisti bakterijski sevi, ki se zaradi mutacije v dednem materialu uspešno upirajo protimikrobnim učinkovinam. Razumevanje mehanizma bakterijske odpornosti je pomembno tako za pravilno uporabo antibiotikov v klinični praksi kot za razvoj novih učinkovin, ki bi preprečile nastanek odpornosti (2, 3, 4). 1
14 DIPLMSKA NALGA Mehanizmi, po katerih pride do rezistence na protimikrobne učinkovine: produkcija encimov, ki razgrajujejo antibiotik (npr. ß-laktamaze), zmanjšan privzem učinkovine zaradi zmanjšane permeabilnosti celične stene, aktivno izčrpavanje antibiotika s pomočjo membranskih črpalk, zmanjšana afiniteta receptorja za učinkovino, spremenjena količina receptorjev za učinkovino, vzpostavitev nove biosintezne poti, ki zaobide tisto, ki je bila zaradi delovanja protimikrobnih učinkovin prekinjena, razvoj alternativnega encima (5). Do spremembe v bakterijskem genomu pride zaradi pojava mutacij (insercija, delecija, inverzija, duplikacija) ali z medsebojno izmenjavo izvenkromosomskih segmentov DNK med bakterijami: konjugacija (prenos plazmidov skozi pilus (»sex pilli«)), transdukcijo (prenos z bakteriofagi), transformacijo (neposredno privzetje proste DNK, ki jo je izločila druga bakterija). bičajno zaradi mutacije povzročena genska sprememba na kromosomu ne vodi do klinično pomembne spremembe. Za prenos rezistence so pomembnejši plazmidi. To so krožne verige DNK, ki prosto plavajo v citoplazmi in se lahko neodvisno razmnožujejo. Plazmide, ki nosijo gene, odgovorne za rezistenco, imenujemo R plazmidi, gene pa podobno - R geni. Bakterije vsebujejo tudi transpozone, ki se lahko vgradijo v plazmide in tudi v bakterijsko molekulo DNA. V zadnjih nekaj letih so ugotovili, da transpozoni prenašajo rezistenco za večino znanih antibiotikov. Protimikrobno sredstvo vrši močan selektivni pritisk na razvoj tako s plazmidi kot tudi z DNA prenešene rezistence. Tako antibiotiki uničijo občutljive bakterije, rezistentne pa preživijo in se razmnožujejo naprej (6). 2
15 DIPLMSKA NALGA 1.3 BAKTERIJSKA CELIČNA STENA IN PEPTIDGLIKAN Glavna značilnost bakterijske celične stene je njena togost in izjemna mehanska trdnost. Celična stena daje bakterijam obliko, preprečuje gostiteljevim encimom razgradnjo bakterij in vzdržuje notranji osmotski tlak ter predstavlja semipermeabilno bariero in tako omogoča prehod le zaželenim snovem. Njen najpomembnejši sestavni del je heteropolimer peptidoglikan, ki je zgrajen iz mreže linearnih polisaharidnih verig, prečno povezanih s kratkimi peptidnimi verigami. Zaradi svoje specifične zgradbe, ki je značilna za prokariontske celice, predstavlja primerno tarčno mesto za protibakterijske učinkovine, saj omogoča selektivno toksičnost. d strukture celične stene je odvisna tudi dovzetnost bakterij za barvanje po Gramu, kar je najpogosteje uporabljana metoda za hitro karakterizacijo bakterij. V obarvanem preparatu modrovijolične bakterije imenujemo grampozitivne, rdeče pa gramnegativne (7, 8, 9) Celična stena po Gramu pozitivnih (G+) in po Gramu negativnih (G-) bakterij snovni gradnik celične stene G+ in G- bakterij je makromolekula peptidoglikan. Pri obeh tipih bakterije se peptidoglikan nahaja na zunanji strani citoplazemske membrane. Peptidoglikan je zgrajen iz ponavljajočih se disaharidnih enot N-acetilglukozamina (GlcNAc) in N-acetilmuraminske kisline (MurNAc), ki so med seboj premrežene s kratkimi peptidnimi verigami (10) G+ bakterije: Celična stena G+ bakterij (slika 1) je v primerjavi z G- bakterijami bolj preprosta. Zaradi višjega osmotskega pritiska v notranjosti imajo precej debelejšo mureinsko ovojnico. Sestavlja jo do 40 plasti peptidoglikana in je debela med 15 in 50 nm. Celično steno prebadajo številni anionski polimeri (tehojske, lipotehojske in teihuronske kisline), ki preko fosfatnih, hidroksilnih in aminskih skupin tvorijo ionsko-izmenjevalni sistem. Le ta uravnava koncentracijo magnezijevih ionov, ki so bistveni za delovanje številnih encimov v sintezi peptidoglikana. Kemijsko je tehojska kislina polimer glicerola in ribitol fosfatov, teihuronska kislina pa je sestavljena iz heksuronskih kislin. V plast peptidoglikana so zasidrani številni proteini, lipidi pa navadno niso prisotni. Stena dobro prepušča tudi raztopljene snovi z molsko maso ali več. 3
16 DIPLMSKA NALGA Slika 1: Bakterijska stena G+ bakterij (11) G- bakterije: Pri G- bakterijah je zgradba celične stene mnogo bolj kompleksna (slika 2). d citoplazemske membrane navzven jo sestavlja: - periplazemski prostor, ki vsebuje številne proteine in encime, - enojna ali dvojna plast peptidoglikana, debela približno 2 nm, ki predstavlja 5 % mase celične stene in je na zunanji strani povezana z lipoproteinskimi molekulami, ki so usmerjene navzven, - zunanja membrana, zgrajena iz fosfolipidnega dvosloja, ki je podobna citoplazemski membrani in vsebuje proteine in transmembranske proteinske kanalčke (porine), na notranji strani pa je z lipoproteinskimi molekulami povezana s peptidoglikanom, - kompleksni lipopolisaharidi, ki so pritrjeni na zunanjo površino celice in predstavljajo glavno antigensko determinanto, ki je odgovorna za aktivacijo imunskega odgovora pri gostitelju. Prepustnost celične stene G bakterij je zaradi zunanje membrane, ki je sestavljena iz lipopolisaharidov, fosfolipidov in proteinov, zelo zmanjšana. Membrane ne morejo prehajati hidrofilne nenabite molekule z molsko maso in lipofilne spojine, kot so barvila, maščobne kisline, detergenti in nekateri antibiotiki (vankomicin, benzilpenicilin, makrolidi, bacitracin) (2, 10). 4
17 DIPLMSKA NALGA Slika 2: Bakterijska stena G- bakterij (12) Zgradba peptidoglikana Makromolekularni peptidoglikan je zgrajen iz linearnih polisaharidnih verig (glikanskih vlaken), ki so prečno povezane s kratkimi peptidi in na ta način tvorijo premreženo strukturo. Polisaharidne verige so zgrajene iz izmenjujočih se enot N-acetilglukozamina in N- acetilmuraminske kisline, povezanih z 1,4-β glikozidno vezjo. N-acetil muraminska kislina je N-acetilglukozamin, ki ima na C-3 mestu z estersko vezjo pripeto D-laktoilno skupino. Na prosto karboksilno skupino laktata je s peptidno vezjo pripet tetrapeptid z naslednjim aminokislinskim zaporedjem: L-alanin (L-Ala), D-glutaminska kislina (D-Glu), mezodiaminopimelinska kislina (mdap), D-alanin (D-Ala). Prečna povezava je amidna vez med amino skupino tretje aminokisline (mdap) ene polisaharidne verige in karboksilno skupino četrte aminokisline (D-Ala) druge polisaharidne verige. Tako strukturo peptidoglikana ima E. coli (G-bakterija) in je v osnovi enaka tudi pri drugih bakterijah, obstajajo le različne variacije med posameznimi rodovi in vrstami. Pri G+ bakterijah je prečno povezanih okoli 90 odstotkov vseh peptidoglikanskih verig, medtem ko pri G- bakterijah le okoli 20 odstotkov. Največje razlike najdemo v aminokislinski sestavi peptidne verige, ki je pripeta na N- acetilmuraminsko kislino. G+ bakterije imajo na tretjem mestu najpogosteje L-lizin (L-Lys), pri G bakterijah pa na tem mestu prevladuje mezo-diaminopimelinska kislina (mdap). Razlike so tudi v prečnih povezavah med sosednjimi glikanskimi verigami. Večina G- in nekatere G+ bakterije tvorijo prečno povezavo neposredno med prosto ε-amino skupino tretje aminokisline ene glikanske verige in karboksilno skupino D-Ala na četrtem mestu sosednje 5
18 DIPLMSKA NALGA verige (slika 3). Pri večini G+ bakterij pa povezavo med glikanskimi vlakni tvori še dodaten peptidni most, navadno zgrajen iz petih glicinskih ostankov, ki se nahaja med L-Lys ene in D- Ala druge verige. Posebna lastnost peptidoglikana pri bakterijah je tudi ta, da vsebuje D- aminokisline. Ta stereomerna oblika je v naravi izjemno redka in jo najdemo večinoma le v bakterijski celični steni. Posledica je velika odpornost peptidoglikana na hidrolizo z gostiteljevimi peptidazami, hkrati pa je to tudi pomembna osnova za doseganje selektivne toksičnosti (3, 7, 11). Slika 3: Razlika med prečnimi povezavami peptidoglikanskih vlaken G+ in G- bakterij; z G je označen N-acetilglukozamin, z M pa N-acetilmuraminska kislina (14) Biosinteza peptidoglikana Biosintezna pot peptidoglikana je večstopenjski proces. Njegovo poznavanje je nujno potrebno za načrtovanje in sintezo novih protimikrobnih učinkovin. Razdelimo jo na tri stopnje: sinteza prekurzorjev v citoplazmi, prenos prekurzorjev skozi plazemsko membrano, vgraditev prekurzorjev v celično steno na že obstoječ peptidoglikan (7) Sinteza prekurzorjev v citoplazmi Produkta intracelularne sinteze nukleotidnih prekurzorjev peptidoglikana v citoplazmi sta UDP-N-acetilglukozamin (UDP-GluNAc) in UDP-N-acetilmuramilpentapeptid. Prvi nastane iz primarnega metabolita, fruktoze-6-fosfata, v štirih stopnjah (slika 4). V prvi stopnji pod vplivom GlmS, ki je amidotransferaza, poteče pretvorba D-fruktoza-6-fosfata v D- 6
19 DIPLMSKA NALGA glukozamin-6-fosfat, ob porabi L-glutamina kot vira dušika. V drugi stopnji GlmM povzroči intramolekularni prenos fosfata iz mesta 6 na mesto 1, pri tem nastane glukozamin-1-fosfat. V naslednji stopnji encim GlmU, ki je bifunkcionalen encim, najprej acetilira amino skupino, v naslednjem koraku pa na mestu 1 namesto fosfatne skupine pripne UDP (13). Slika 4: Potek sinteze UDP-N-acetilglukozamina. V nadaljevanju pride do pretvorbe UDP-N-acetilglukozamina v UDP-Nacetilmuraminsko kislino (UDP-MurNAc). Najprej encim MurA katalizira prenos enolpiruvata s fosfoenolpiruvata (PEP) na 3 -hidroksilno skupino UDP-N-acetilglukozamina, nato sledi redukcija enolpiruvata do D-laktata, ki jo katalizira MurB. Na karboksilno skupino D-laktata v tako nastali UDP-N-acetilmuraminski kislini se nato postopoma pripne veriga petih aminokislin: L-Ala-D-Glu-mDAP(L-Lys)-D-Ala-D-Ala. Te reakcije katalizira skupina od ATP odvisnih aminokislinskih ligaz MurC, MurD, MurE in MurF. Prve tri aminokisline se pripnejo posamično in sicer, L-Ala s pomočjo MurC, D-Glu s pomočjo MurD in mdap (G ) ali L-Lys (G+) s pomočjo MurE. Preostala dva D-alaninska ostanka se v reakciji, ki jo katalizira encim MurF, dodata kot dipeptid (D-Ala-D-Ala). Le ta nastane iz L-Ala, ki se ob prisotnosti encima alaninske racemaze pretvori v D-Ala, ki ju v dipeptid poveže encim D- alanil-d-alanin ligaza (Ddl). Z nastankom UDP-N-acetilmuramilpentapeptida je sinteza prekurzorjev v citoplazmi zaključena (slika 5) (7). 7
20 DIPLMSKA NALGA H H NHAc H NHAc L-Ala D-Glu m-dap/l-lys D-Ala D-Ala H TRANSPEPTIDACIJA D-Ala D-Ala m-dap/l-lys D-Glu L-Ala H H NHAc NHAc H D-Ala D-Ala m-dap/l-lys D-Glu TRANSGLIKZILACIJA L-Ala H H H H - - NHAc NHAc P P D-Ala D-Ala m-dap/l-lys D-Glu L-Ala H H NHAc NHAc - - P P H H L-Ala D-Glu NHAc -UDP m-dap/l-lys D-Ala D-Ala UDP-MurNAc-pentapeptid Mra Y C 55 -fosfat UMP H H NHAc - - P P L-Ala D-Glu m-dap/l-lys D-Ala D-Ala MurG UDP-GlcNAc H H H H NHAc - - NHAc P P L-Ala D-Glu m-dap/l-lys D-Ala D-Ala TRANSLKACIJA MurF ATP, D-Ala-D-Ala ATP, H H m-dap/l-lys L-Ala D-Glu m-dap/l-lys NHAc -UDP MurE H H L-Ala NHAc -UDP D-Glu UDP-MurNAc-dipeptid ATP, D-Glu MurD H H L-Ala NHAc -UDP UDP-MurNAc-L-Ala ATP, L-Ala MurC H H C - NHAc -UDP UDP-MurNAc UDP-MurNAc-tripeptid FAD, NADPH MurB 2-3 P H H H H fruktoza-6-fosfat AcCoA, H PEP H H UTP H H H H H NH 2 MurA 2- GlmU NHAc NHAc P 3 -UDP -UDP C - glukozamin-1-fosfat UDP-GlcNAc UDP-GlcNAc-enolpiruvat Slika 5: Shematski prikaz citoplazemskih in zunajceličnih stopenj v biosintezi peptidoglikana Prenos prekurzorjev skozi citoplazemsko membrano UDP-MurNAc-pentapeptid se v naslednji stopnji poveže z N-acetilglukozaminom, pri čemer se tvori osnovna gradbena enota peptidoglikana. Ta se nato prenese na zunanjo stran citoplazemske membrane. Ključna molekula, ki sodeluje pri tem prenosu je lipidni nosilec undekaprenil fosfat imenovan tudi C 55 -izoprenoid fosfat. UDP-N-acetilmuramil pentapeptid se najprej poveže s fosforiliranim lipidnim nosilcem, pri tem pa se sprosti UMP. Reakcijo 8
21 DIPLMSKA NALGA katalizira membranski encim MraY (fosfo-murnac-pentapeptid translokaza). Pripenjanje N- acetilglukozamina na nastali kompleks katalizira encim MurG, ki je prav tako kot MraY membranski encim. Nastali disaharid pentapeptid se nato prenese na zunanjo stran citoplazemske membrane. Prenešeni gradnik se vključuje v obstoječi peptidoglikan v procesu transglikolizacije, ki jo katalizira membranski encim GlcNAc-pentapeptid transglikozilaza. Ker je rastoči peptidoglikan v procesu transglikozilacije že povezan z lipidnim nosilcem, se v tej stopnji ena molekula lipidnega nosilca reciklira v obliki pirofosfata. Na koncu poteče še defosforilacija lipidnega nosilca, ki jo katalizira membranski encim undekaprenil pirofosfat fosfataza (7) Vgraditev prekurzorjev v celično steno V zadnjem delu biosinteze peptidoglikana se linearni glikani, zbrani na lipidnem nosilcu na zunanji strani citoplazemske membrane, v procesu transpeptidacije vgradijo v celično steno. V reakciji sodeluje encim transpeptidaza, ki se najprej veže na D-Ala-D-Ala enoto pentapeptidne verige. Transpeptidaza s serinsko H skupino v aktivnem mestu odcepi terminalni D-Ala, pri čemer se tvori aktiviran acilni intermediat. Ta reagira z ε-amino skupino mezo-diaminopimelinske kisline (L-lizina) ali pentaglicinskim mostom sosednje glikanske verige, tako da poteče premreženje. Stopnja prečnega premreženja peptidoglikana pri G+ in G-bakterijah je različna. Uravnavajo jo encimi karboksipeptidaze, ki katalizirajo odcep terminalnega D-alanina, odcepi pa se lahko tudi predzadnji D-alanin. Tako ti encimi preprečijo prečno povezavo, saj transpeptidaza za svoje delovanje zahteva D-alanil-D-alanin na koncu pentapeptidne verige (7, 9). 9
22 DIPLMSKA NALGA 1.4 MUR ENCIMI Encimi od MurA do MurF so esencialni za preživetje bakterije, saj bi kakršnakoli okvara na encimu preprečila sintezo peptidoglikana. Glede na splošno razširjenost peptidoglikana v bakterijskem svetu in veliko strukturno podobnost teh encimov med vrstami, lahko pričakujemo, da bi bil potencialni inhibitor širokospektralen in baktericiden. Vsako od ligaz sestavljajo tri domene: N-terminalna domena, odgovorna za vezavo substrata, centralna domena, odgovorna za vezavo ATP, C-terminalna domena, ki predvidoma veže vstopajočo aminokislino. Mur ligaze katalizirajo nastanek peptidne vezi ob prisotnosti ATP, ki aktivira karboksilno skupino UDP-prekurzorja, pri čemer nastane acilfosfat. Nato sledi nukleofilni napad amino skupine druge aminokisline, kar vodi v nastanek tetraedričnega intermediata z visoko energijo, ki zaradi svoje nestabilnosti razpade na peptid in anorganski fosfat (slika 6). Za reakcijo je nujno potreben kation, bodisi Mg 2+ bodisi Mn 2+ (13). Slika 6: Katalitični mehanizem Mur ligaz MurC ligaza MurC (UDP-N-acetilmuramat L-alanin ligaza) je od ATP odvisna ligaza in katalizira vezavo prve aminokisline na UDP-MurNAc. Pri večini bakterij je ta aminokislina L-alanin, v redkih primerih pa glicin ali L-serin. To si razlagamo s tem, da je intracelularna koncentracija L-alanina precej večja od ostalih dveh substratov. Spojine, ki so strukturno podobne L-alaninu predstavljajo dobre potencialne inhibitorje (9). 10
23 DIPLMSKA NALGA MurD ligaza Encim MurD (UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin:D-glutamat ligaza) spada v družino Mur sintetaz in katalizira pripenjanje druge aminokisline (D-glutamata) na citoplazemski prekurzor (UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin). Za svoje delovanje potrebuje Mg 2+ ione (15). Struktura MurD: Prva opisana struktura Mur sintetaz je bila struktura encima MurD iz bakterije E. coli. Encim MurD je sestavljen iz treh globularnih domen (slika 7). N-terminalna domena je sestavljena iz petih paralelnih β-struktur, ki jih obdajajo štiri α-vijačnice. Ta domena veže UDP del UDP- MurNAc-L-Alanina. Centralno domeno sestavlja šest paralelenih β-struktur, ki jih obdaja sedem α-vijačnic in tri manjše paralelne β-strukture. Naloga te domene je vezava molekule ATP. V strukturo sta vključena tudi dva magnezijeva kationa, ki sta povezana z UMA in ADP. Za vezavo substratov nista nujno potrebna, vendar omogočata ligazno aktivnost MurD. C-terminalna domena vsebuje aminokisline, ki tvorijo β-ploskev iz petih vzporednih in enega antiparalelnega traka, obdaja pa jih pet α-vijačnic. Ta domena vsebuje vezavno mesto za D- glutaminsko kislino (9, 13). Slika 7: Struktura MurD z vezanima UMA in ADP (N-terminalna domena je obarvana modro, centralna domena rdeče in C-terminalna domena zeleno. ranžna kroga predstavljata dva magnezijeva iona). 11
24 DIPLMSKA NALGA 1.5 D-alanil-D-alanin ligaza D-alanil-D-alanin ligaza (Ddl) je esencialen encim pri biosintezi peptidoglikana. V celicah sesalcev podobnega encima ne najdemo, zato predstavlja pomembno tarčo za razvoj novih protibakterijskih učinkovin. Ddl katalizira nastanek dipeptida D-alanil-D-alanina, ki predstavlja terminalni del UDP-MurNAc-pentapeptida, ki ima ključno vlogo pri premreženju peptidoglikana. Skupaj z encimoma od piridoksalfosfata odvisno alanin racemazo, ki pretvori L-Ala v D-Ala, in od ATP odvisno MurF sintetazo, ki pripne D-Ala-D-Ala dipeptid na UDP- N-acetilmuramiltripeptid, sestavlja D-alaninski segment pri biosintezi peptidoglikana (16). Encim Ddl (slika 8) so prvič detektirali v zgodnjih 60. letih 20. stoletja pri G- in tudi G+ bakterijah. Kmalu za tem je Neuhaus delno očistil Ddl iz bakterije Streptococcus faecalis. Robinson je leta 1986 kloniral in določil zaporedje gena za Ddl v E. coli. Izkazalo se je, da je ta gen, ki so ga poimenovali ddlb, pomemben za rast organizma. Pri E. coli pa obstaja tudi gen za neesencialno ligazo, to je ddla gen. Gen ddlb nosi zapis za protein s 306 aminokislinami in ima molekulsko maso 32 kda. Nativna molekulska masa proteina DdlB pa je kda, kar pomeni, da obstaja kot dimer. Pri E. coli sta torej poznani dve izomorfni obliki Ddl, to sta DdlA in DdlB. Kljub razlikam v velikosti in le 35 % homologiji aminokislinskega zaporedja, imata encima podobno katalitično učinkovitost in substratno specifičnost (in vitro kot substrat prepoznata poleg D-Ala še D-aminobutirno kislino in glicin). Inhibirajo ju tudi iste spojine (17, 18). Slika 8: 3-D struktura DdlB E. coli v kompleksu z ADP in fosforiliranim fosfinatnim inhibitorjem (slika 9). Prikazane so tri domene v zeleni, modri in rumeni barvi, ligandi so prikazani v škrlatnem, dva Mg 2+ iona sta v obliki dveh črnih kroglic (13). 12
25 DIPLMSKA NALGA Slika 9: (2R)-3-(((S)-1-aminoetil)(hidroksi)fosforil)-2-metilpropanojska kislina Mehanizem katalitične reakcije Ddl: D-alanil-D-alanin ligaza (Ddl) je od ATP odvisen encim. Mehanizem katalize je prikazan na sliki 10. Najprej poteče fosforilacija karboksilne skupine prvega D-Ala. Pri tem nastane acilfosfatni intermediat ter ADP in anorganski fosfat. Sledi nukleofilni napad amino skupine drugega D-Ala in nastane tetraedrično prehodno stanje. Po izstopu fosfata nastane dipeptid D-alanil-D-alanin. Slika 10: Katalitični mehanizem Ddl. Ddl potrebuje za svojo aktivnost kot kofaktor magnezijeve ione. Mg 2+ koordinira pravilno umeščanje substrata v aktivno mesto, ureja ustrezen naboj v aktivnem mestu in posledično stabilizira kompleks med substratom in encimom (16) Vezavna mesta za substrate na Ddl Strukturo Ddl lahko razdelimo na tri α/β domene: N-terminalno, centralno in C- terminalno. Kinetične študije so pokazale, da ima D-alanil-D-alanin ligaza dve različni vezavni mesti za D-Ala. To sta donorsko N-terminalno vezavno mesto in akceptrsko C- terminalno vezavno mesto. Prvo je strogo specifično za D-Ala, drugo je manj specifično in sprejme različne aminokisline. Vezavno mesto za ATP leži med centralno in C-terminalno domeno, za D-Ala pa med centralno in N-terminalno (19, 20). 13
26 DIPLMSKA NALGA Znani inhibitorji Ddl Veliko antibiotikov v klinični rabi (β-laktami, glikopeptidi, vankomicin, teikoplanini) zavira sintezo bakterijske celične stene. Zaradi bakterijske evolucije in prekomernega predpisovanja antibiotikov se je razvila odpornost proti le-tem. Bakterije, ki so razvile rezistenco na vankomicin imajo mutirano obliko Ddl, ki se imenuje Van, ki je D-alanil-Dlaktat ligazo. Van v peptidoglikan vgradi dipeptid D-alanil-D-laktat. Zaradi tega se za krat zmanjša afiniteta za vezavo vankomicina. Razvoj rezistence je povzročil potrebo po novih tarčah za razvoj protibakterijskih učinkovin. Encim Ddl predstavlja primerno tarčo, saj je esencialen za bakterijo, poleg tega pa je strogo ohranjen pri različnih vrstah bakterij. Potencialni inhibitorji tega encima bi zato imeli baktericidno in širokospektralno delovanje (21, 22, 23) D-cikloserin (DCS) DCS je naravni produkt iz Streptomyces orchidaceus, a se danes pridobiva le sintezno. V terapiji se uporablja kot tuberkulostatik, širokospektralni antibiotik z bakteriostatičnim ali baktericidnim delovanjem (odvisno od koncentracije). Njegova uporaba je omejena le na okužbe z rezistentnimi sevi, ker ima neželene učinke na centralni živčni sistem. Zavira delovanje dveh pomembnih encimov pri sintezi peptidoglikana, to sta alanin racemaza in Ddl. Je kompetitiven in reverzibilen inhibitor Ddl. Po strukturi je DCS petčlenski obroč, ki je skoraj planaren in zelo rigiden. Po svoji strukturi izkazuje podobnost eni izmed konformacij D-alanina (slika 11). Kot ciklični analog D-Ala tekmuje z L-Ala za vezavo v aktivno mesto alanin racemaze, z D-Ala pa za vezavo v aktivno mesto Ddl. Na ta način zavre celotno biosintezno pot, bodisi zaradi pomanjkanja D-Ala, bodisi zaradi preprečitve nastanka dipeptida D-Ala-D-Ala. Pri E. coli deluje zaviralno predvsem na Ddl. V aktivnem mestu Ddl se veže na N-terminalno vezavno mesto za D-Ala (24). Slika 11: Podobnost D-cikloserina z eno izemd konformacij D-alanina. 14
27 DIPLMSKA NALGA Mimetiki prehodnega stanja kot inhibitorji Ddl Fosfonatni in fosfinatni analogi D-Ala-D-Ala Parsons (1988) je s sodelavci pripravil številne analoge dipeptida D-Ala-D-Ala, ki imajo namesto amidne skupine fosfinatno oziroma fosfonatno skupino (slika 12) ter določil povezavo med strukturo in delovanjem (SAR). Izkazalo se je, da je optimalno, če je metilna skupina fosfino- ali fosfonoalanina v S-konfiguraciji. Če je na tem mestu R- ali RSkonfiguracija, pride do zmanjšanja inhibitorne aktivnosti. Z večanjem substituenta R se povečuje inhibitorna aktivnost. Najboljša in vitro inhibitorja Ddl sta tiometilni analog (1c) in n-heptilni analog (1a). Na tem kiralnem centru mora biti R-konfiguracija (26). Slika 12: Fosfinatni in fosfonatni inhibitorji prehodnega stanja Ddl. Fosfinodipeptidi in fosfonodipeptidi so reverzibilni in kompetitivni inhibitorji Ddl. Prilegajo se v obe vezavni mesti za D-Ala. So inhibitorji s počasno vezavo. Mehanizem inaktivacije je sestavljen iz dveh korakov. Najprej pride do hitre, reverzibilne vezave inhibitorja na Ddl, temu pa sledi fosforilacija v aktivnem mestu encima (slika 13). Fosforiliran inhibitor je mimetik tetraedričnega prehodnega stanja. menjene spojine imajo šibko protibakterijsko aktivnost. Razlog je v slabem transportu v bakterijsko celico. Barlett in sodelavci so leta 1996 prav tako pripravili fosfinatne in fosfonatne analoge D-Ala-D-Ala. Ugotavljali so delovanje teh spojin na encimih DdlA in DdlB izoliranih iz E. coli in VanA, izoliranem iz E. faecium. Aktivnost DdlA zavirajo le fosfinati, medtem ko DdlB in VanA zavirata obe seriji spojin. V splošnem pa so fosfinati boljši inhibitorji ob fosfonatov (25, 26). 15
28 DIPLMSKA NALGA Slika 13: Fosforilacija v aktivnem mestu encima Ddl Analogi (3-amino-oksoalkil) fosfonske kisline Gre za spojine, ki imajo močno inhibitorno aktivnost. Po vezavi v aktivno mesto pride do fosforilacije (tako kot pri fosfinatih). Tetraedrična struktura, ki pri tem nastane, je dober mimetik prehodnega stanja normalne reakcije. Zasedejo N-terminalno vezavno mesto za D- Ala. Najboljša inhibitorja sta (3(R)-amino-2-oksobutil)fosfonska kislina (3a) in azo analog (3b), vendar pa nimata signifikantnega protibakterijskega delovanja (27). Slika 14: Analogi (3-amino-oksoalkil) fosfonske kisline. 16
29 DIPLMSKA NALGA Novejši inhibitorji Ddl S pomočjo programa za»de novo«načrtovanje molekul (SPRUT) so Fishwick in sodelavci leta 2005 pripravili ciklopropilni derivat kot inhibitor DdlB iz E.coli. Le-ta tvori interakcije z Mg 2+ ioni ter z vsemi za katalizo pomembnimi aminokislinskimi preostanki in še dodatne hidrofobne interakcije s hidrofobnim žepkom, ki ga tvorita fenolni obroč Tyr 216 in alkilna veriga Lys 282. Kovač in sodelavci so v letu 2007 sintetizirali večje število diazendikarboksamidov kot potencialnih inhibitorjev DdlB iz E.coli. Nekateri izmed teh inhibitorjev so bili celo do 30- krat bolj učinkoviti od DCS (28, 29). Slika 15: Primer dveh novejših inhibitorjev Ddl. 17
30 DIPLMSKA NALGA 1.6 Peptidomimetiki in analogi prehodnega stanja Peptidomimetiki Peptidi nosijo izjemno biološko učinkovitost, sodelujejo v mnogih biokemičnih procesih in so zato zanimivi kot potencialne učinkovine. Njihove terapevtske koncentracije so zelo nizke. Njihovo uporabo v terapiji močno omejujejo neugodne farmakokinetske lastnosti, kot so nezadovoljiva absorpcija z mesta aplikacije, hitra metabolična inaktivacija pod vplivom peptidaz ter širok spekter učinkov, kar pri zdravilnih učinkovinah ni zaželeno. Slaba absorpcija je posledica velike molekulske mase, porazdelitvenega koeficienta in acidobazičnih lastnosti peptida. Zaradi naštetih lastnosti obstaja velika težnja k iskanju učinkovin, ki bi lahko ustrezno nadomestile peptide. Takim učinkovinam, ki nadomestijo bioaktivni peptid pri interakcijah z vezavnimi mesti in imajo poleg afinitete tudi učinkovitost, pravimo peptidomimetiki. Do peptidomimetične strukture pridemo z ustreznimi spremembami peptidne strukture. Ključna pri tem je bioizosterija. Bioizostere ali neklasične izostere so molekule ali fragmenti molekule, ki imajo poleg podobnih fizikalno-kemijskih tudi podobne biološke lastnosti. Tako spremenjen peptidomimetik, ki posnema aktivno konformacijo matičnega peptida, ima izboljšane farmakokinetične lastnosti (boljša absorpcija, večja metabolična stabilnost) in ohranjeno učinkovitost ter povečano selektivnost (7). Ker je peptidna vez podvržena encimski inaktivaciji, jo je potrebno modificirati. S tem pride do povečane odpornosti na encimsko hidrolizo, poveča se selektivnost vezave na receptorje, poveča se biološka uporabnost, podaljšan je razpolovni čas, lažji je prehod preko hematoencefalne bariere (30). 18
31 DIPLMSKA NALGA Tabela 1: Primeri bioizosternih zamenjav peptidne vezi (7). peptid N-alkilpeptid depsipeptid hidrazinopeptid retropeptid aminooksipeptid aminometilenski analog N-aminopeptid oksometilenski analog C C H H ketometilenski analog sulfonamidni analog alkilidenpeptid Analogi prehodnega stanja Encimsko katalizirane reakcije potekajo preko nestabilne strukture, ki jo imenujemo prehodno stanje. Sprva se med encimom in substratom vzpostavi določeno število vezi. Ko se kompleks encim-substrat približujeta prehodnemu stanju, se število interakcij med njima povečuje, hkrati pa se mu znižuje aktivacijska energija. V prehodnem stanju, ko je vzpostavljenih največ vezi, se sprosti energija potrebna za transformacijo že delno modificiranega substrata v produkt. Analogi prehodnega stanja so spojine, ki posnemajo strukturo substrata, ko je ta vezan na encim. 19
32 DIPLMSKA NALGA Tabela 2: Strukture nekaterih najbolj pogostih izoster, ki se uporabljajo kot mimetiki prehodnega stanja (31). R N H N hidroksietilamin H hidroksietilen difluoroketon dihidroksietilen 2-hidroksipropilamin fosfinat hidroksietilkarbonil (statin) hidroksimetilkarbonil (norstatin) V terapevtski uporabi obstajajo številne zdravilne učinkovine s hidroksietilaminskim fragmentom, ki delujejo kot inhibitorji različnih encimov. Med zdravili s tem fragmenotm najdemo inhibitorje HIV-proteaze, renina, ACE inhibitorje ter antimalarike (31). 20
33 DIPLMSKA NALGA Tabela 3: Primeri terapevtsko uporabnih inhibitorjev encimov s hidroksietilaminskim fragmentom (31). H H N H N N N N H indinavir HIV proteazni inhibitor meflokin antimalarik 21
34 DIPLMSKA NALGA 2 NAČRT DELA: Namen eksperimentalnega dela diplomske naloge je sinteza novih hidroksietilaminskih derivatov kot potencialnih inhibitorjev Ddl s protimikrobnim delovanjem. Hidroksietilaminska skupina ni klasična bioizosterna zamenjava peptidne vezi, temveč posnema tetraedrični intermediat, ki je izhodišče za načrtovanje inhibitorjev prehodnega stanja Ddl. V okviru diplomske naloge smo se odločili, da bomo sintetizirali hidroksietilaminske analoge prehodnega stanja in njihove fosforilirane derivate, ki še bolje oponašajo tetraedrično prehodno stanje. Uvedba hidroksietilaminske skupine omogoča, da se izognemo neugodnim farmakokinetskim lastnostim peptidov. Tako lahko od novo sintetiziranih spojin pričakujemo izboljšano metabolično stabilnost (predvsem na peptidaze), ohranjeno učinkovitost ter večjo selektivnost delovanja. Sulfonamidni del bomo pripravili iz ustreznih različno substituiranih aromatskih sulfonilkloridov in alilamina. Na dvojni vezi, ki jo uvedemo s pripenjanjem alilamina, bomo s pomočjo peroksi kisline tvorili epoksid, ki ga bomo odpirali z morfolinom ob prisotnosti Ca(Tf) 2 kot katalizatorja. V nadaljevanju pa bomo na hidroksilni skupini z različnimi metodami tvorili fosforilirane derivate. Hidroksilno skupino bomo zamenjali z bromom in preko te spojine bomo skušali pripraviti tudi fosfonate; s pripenjanjem malonilnega dela na hidroksilno skupino pa bomo uvedli tudi fragment, ki oponaša difosfatno skupino. 22
35 DIPLMSKA NALGA Slika 16: Načrt sinteze fosforiliranih hidroksietilaminskih derivatov. 23
36 DIPLMSKA NALGA 3 MATERIALI IN METDE 3.1 Materiali Pri eksperimentalnem delu smo uporabljali reagente in topila različnih proizvajalcev (Acros, Aldrich, Fluka, Kemika, Merck). 3.2 Metode Določevanje tališča Tališča smo določali s Kofflerjevim mikroskopom z ogrevalno mizico Leica in so nekorigirana Kromatografske metode Za izvedbo tankoplastne kromatografije (TLC) smo uporabljali plošče Kieselgel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Nemčija) z 0,20 mm nanosom silikagela na aluminijastem nosilcu z dodanim fluorescenčnim indikatorjem in različne mobilne faze. Mobilne faze za TLC so bile: MF-1: etilacetat/metanol = 4/1 MF-2: etilacetat/heksan = 2/1 MF-3: etilacetat MF-4: dietileter/petroleter = 3/1 MF-5: acetonitril/voda/metanol = 3/1/1 MF-6: etilacetat/metanol = 1/1 MF-7: kloroform/metanol = 9/1 Za detekcijo spojin na kromatografskih ploščah smo uporabljali UV svetilko (valovna dolžina = 254 nm) ter orositvena reagenta ninhidrin in bromkrezol zeleno. Za čiščenje produktov s flash kromatografijo smo kot stacionarno fazo uporabljali silikagel z velikostjo delcev 0,040-0,063 mm (Merck, Darmstadt, Nemčija) in različne mobilne faze. 24
37 DIPLMSKA NALGA Za čiščenje produktov smo uporabili tudi cirkularno kromatografijo. Pri tem smo uporabljali stekleno ploščo, na katero smo nanesli zmes vode in silikagela s sadro (Kieselgel 60 PF 254 (Merck)), jo posušili in zbrusili. Kromatografsko ločevanje smo izvajali s pomočjo kromatotrona Harrison Research Chromatotron Spektroskopske metode Jedrska magnetna resonanca (NMR) NMR spektre smo posneli na Bruker Advance DPX300 spektrometru pri 300,13 MHz, s TMS kot internim standardom v Centru za jedrsko magnetno resonanco visoke ločljivosti na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani. Kot topila smo uporabljali DMS- d6, CDCl 3 in D 2. Za reševanje NMR spektrov smo uporabili računalniški program MestReC 4.8.6, proizvajalca MESTERLAB RESEARCH SL Masna spektrometrija (MS) Masni spektri so bili posneti na spektrometru Varian-MAT 311 A z EI ali FAB tehniko na Inštitutu Jožef Stefan v Ljubljani Infrardeča spektroskopija (IR) IR spektre smo posneli na spektrofotometru Perkin Elmer 1600 FT-IR na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani Elementna analiza Elementne analize ogljika, vodika in dušika so bile opravljene z analizatorjem Perkin Elmer 240 C na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani HPLC analiza Analizo smo izvedli na inštrumentu Agilent Technologies HP 1100 z G1365B UV-vis detektorjem (254 nm). Uporabili smo kolono Luna C18 ( mm) s hitrostjo pretoka 1 ml/min. Mobilna faza je bila mešanica 0,1% trifluorocetne kisline v vodi (A) in acetonitrila (B). Gradient je bil od 10 % B do 80 % B v času 30 minut. 25
38 DIPLMSKA NALGA Nomenklatura in risanje spojin Za risanje in poimenovanje spojin smo uporabljali računalniški program ChemDraw Ultra 11.0, proizvajalca CambridgeSoft Sidranje Sidranje je opravil Samo Turk, mag. farm. s programom FlexX verzije Za MurC je bila uporabljena kristalna struktura s pdb kodo 1P3D, za MurD pa 4UAG Mikrovalovni reaktor Uporabljali smo mikrovalovni reaktor CEM Discover z IR in optičnim načinom merjenja temperature Ugotavljanje encimske aktivnosti Ddl s kolorimetrično metodo z malahitno zelenim Encim Ddl katalizira sintezo dipeptida D-Ala-D-Ala iz D-alanina ob prisotnosti ATP, ki pri tem razpade na ADP in anorganski fosfat, katerega nastanek določamo spektrofotometročno pri 650 nm posredno na podlagi tvorbe zeleno obarvanega kompleksa z malahitno zelenim. Uporabimo lahko tudi stabilnejšo obliko, modifikacijo malahitno zelenega z dodanim amonijevim molibdatom (npr. reagent Biomol Green). Katalitično aktivnost tega encima ovrednotimo na podlagi množine fosfata, ki nastane pri reakciji, pri čemer mora biti množina nastalega fosfata v linearnem območju umeritvene krivulje za fosfat. b dodatku inhibitorja se katalitična aktivnost Ddl zniža, zato je množina nastalega fosfata manjša v primerjavi s kontrolo brez inhibitorja. Učinkovitost inhibitorja izrazimo z rezidualno aktivnostjo (RA), ki predstavlja razmerje med aktivnostjo encima ob prisotnosti inhibitorja in aktivnostjo encima brez navzočnosti inhibitorja. Jakost spojin izrazimo z inhibitorno aktivnostjo (29). Meritve encimske aktivnosti je izvedla Andreja Kovač, mag. farm. 26
39 DIPLMSKA NALGA 4 EKSPERIMENTALNI DEL 4.1 Reakcijske sheme Reakcijska shema 1: Sinteza 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3- morfolinopropan-2-il dihidrogen fosfata 27
40 DIPLMSKA NALGA Reakcijska shema 2: 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan- 2-il fenil hidrogen fosfata S Cl H 2 N CH 2 Cl 2 S H N m-cpba CH 2 Cl 2 S H N HN, Ca(Tf) 2 S H N H N Ph P Cl Ph MW (120 C, 15 min) DMAP 11 S H N Ph P Ph N H 2,Pt 2 ledocet S H N H P Ph N Reakcijska shema 3: Poskus sinteze dibenzil 1-(4- fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fosfata 28
41 DIPLMSKA NALGA Reakcijska shema 4: Poskus sinteze dietil 1-(4- fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-ilfosfonata S NH H N S NH Br N CBr 4, PPh 3 CH 2 Cl 2 F 4 F 15 P(Et) C, refluks, 24 h S NH Et P Et N F Reakcijska shema 5: Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-4- izopropilbenzenesulfonamida 29
42 DIPLMSKA NALGA Reakcijska shema 6: Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-1-(2- nitrofenil)metansulfonamida S Cl H 2 N CH 2 Cl 2 N 2 N 2 25 S 26 NH m-cpba CH 2 Cl 2 HN S, Ca(Tf) 2 NH N 2 MW (120 C, 15 min) N 2 S N H H N Reakcijska shema 7: Sinteza malonilnih estrov hidroksietilamina 30
43 DIPLMSKA NALGA 4.2 Kemijske sinteze Sinteza N-alil-4-fluorobenzensulfonamida Reakcija: S Cl H 2 N S NH CH 2 Cl 2 F 1 F 2 Sintezni postopek: 4-fluorobenzensulfonilklorid (1) (5,838 g; 30,0 mmol) raztopimo v brezvodnem diklorometanu (100 ml) ter ohladimo na ledu na 0 C. Nato po kapljicah in med mešanjem dodajamo alilamin (4,71 ml; 63,0 mmol) in pustimo mešati 30 minut. Ledeno kopel odstavimo in reakcijo izvajamo pri sobni temperaturi toliko časa, dokler s tankoplastno kromatografijo ne dokažemo, da v reakcijski zmesi ni več spojine 1. Reakcijsko zmes nato uparimo pod znižanim tlakom do suhega in raztopimo v etilacetatu (75 ml). Sledi filtracija in spiranje z vodo (1 x 50 ml), 10% raztopino citronske kisline (2 x 50 ml), vodo (1 x 50 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 50 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in topilo uparimo pod znižanim tlakom. N-alil-4-fluorobenzensulfonamid M r = 215,24 Izgled beli kristali TLC R f = 0,64 (MF-2) T t C; (po literaturi (32): 53 C) Masa produkta 5,866 g Izkoristek 91 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 δ = 3,62 (tt; J = 6,1; 1,5Hz; 2H, NHCH 2 ); 4,54-4,61 (m, 1H, NH); 5,10-5,21 (m, 2H, CHCH 2 ); 5,66-5,75 (m, 1H, CH); 7,17-7,23 (m, 2H, MHz) Ar-H); 7,87-7,92 (m, 2H, Ar-H) ppm 31
44 DIPLMSKA NALGA Sinteza 4-fluoro-N-(oksiran-2-ilmetil)benzensulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: N-alil-4-fluorobenzensulfonamid (2) (5,753 g; 26,7 mmol) raztopimo v CH 2 Cl 2 (100 ml) ter ohladimo na 0 C. Reakcijski zmesi nato med mešanjem dodamo 1,25 ekvivalenta 70% m-cpba (8,236 g; 33,38 mmol). Po 30 minutah ledeno kopel odstranimo in pustimo mešati 24 ur pri sobni temperaturi. V reakcijsko zmes dodamo 75 ml 10% vodne raztopine Na 2 S 3 in 10 minut močno mešamo. Sledi ločitev faz in spiranje organske faze v liju ločniku z nasičeno raztopino NaHC 3 (5 x 50 ml), vodo (1 x 50 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 50 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in odparimo topilo pod znižanim tlakom skoraj do konca. Nato dodamo heksan in izpadejo beli kristali. Heksan in preostanek diklorometana odparimo pod znižanim tlakom. 4-fluoro-N-(oksiran-2-ilmetil)benzensulfonamid M r = 231,24 Izgled beli kristali TLC R f = 0,72 (MF-1) T t C; (po literaturi (33): C) Masa produkta 4,690 g Izkoristek 76 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 2,64 (dd, J = 4,6; 2,4Hz, 1H, CH a ); 2,76-2,79 (m, 1H, CH b ); 3,01-3,11 (m, 2H, NHCH 2 ); 3,33-3,43 (m, 1H, CHCH 2 ); 4,72-4,78 (m, 1H, NH); 7,17-7,23 (m, 2H, Ar-H); 7,85-7,92 (m, 2H, Ar-H) ppm 32
45 DIPLMSKA NALGA Sinteza 4-fluoro-N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil) benzensulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: V 10 ml epruveto za mikrovalovni reaktor natehtamo spojino 3 (0,925 g; 4,0 mmol) in jo raztopimo v brezvodnem dioksanu (5 ml). Dodamo še 0,5 ekvivalenta Ca(Tf) 2 (0,678 g; 2,0 mmol) ter 1,5 ekvivalenta morfolina (0,523 g; 6,0 mmol). Reakcijsko zmes segrevamo v mikrovalovnem reaktorju 15 minut pri 120 C. Po končani reakciji Ca(Tf) 2 odfiltriramo ter preostanek uparimo pod znižanim tlakom. Dobimo rumenkasto oljnato raztopino, ki jo čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. Končni produkt so beli kristali. 4-fluoro-N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)benzensulfonamid M r = 318,36 Izgled beli kristali TLC R f = 0,43 (MF-1) T t C; (po literaturi (33): C) Masa produkta 1,064 g Izkoristek 84 % Analiza Rezultati 1 H-NMR δ = 2,32-2,41 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,55-2,62 (m, 2H, CH 2 N); (CDCl 3, (dd, J = 12,7 5,7 Hz, 1H, NHCH a ); 3.09 (dd, J = 12,6; 3,7Hz, MHz) 1H, NHCH b ); 3,65-3,69 (m, 4H, (CH 2 ) 2 morfolin); 4,76-4,84 (m, CHH); 6,27 (razširjen singlet, 1H, NH); 7,14-7,20 (m, 2H, Ar-H); 7,83-7,88 (m, 2H, Ar-H) ppm 33
46 DIPLMSKA NALGA Sinteza 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il difenilfosfata Reakcija: S NH H N Cl P DMAP, CH 2 Cl 2 S NH P F N 4 F 5 Sintezni postopek: V bučko natehtamo 1,5 mmol (0,478 g) spojine 4. Dodamo 1,5 ekvivalenta (2,25 mmol; 0,275 g) DMAP (dimetilaminopiridina) in raztopimo v 15 ml brezvodnega diklorometana, pripravljenega z destilacijo. Raztopino prepihamo z argonom. Reakcijsko zmes ohladimo na - 10 C in pri tej temperaturi dodamo še 1,2 ekvivalenta difenilfosforil klorida (1,8 mmol; 0,382 ml). Reakcijo izvajamo 30 minut pri -10 C, nato pa še 60 minut pri sobni temperaturi. Po tem času reakcijo ustavimo z dodatkom zdrobljenega ledu in pustimo mešati še 15 minut. rgansko fazo spiramo z nasičeno raztopino NaHC 3 (2 x 20 ml) ter nasičeno raztopino NaCl (2 x 20 ml). rgansko fazo sušimo z brezvodnim Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in odparimo topilo pod znižanim tlakom. Spojino čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. Po čiščenju dobimo bele kristale. 34
47 DIPLMSKA NALGA 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il difenil fosfat M r = 550,54 Izgled beli kristali TLC R f = 0,71 (MF-1) T t C Masa produkta 0,670 g Izkoristek 81 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 2,34-2,47 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,49-2,62 (m, 2H, CH 2 N); 3,19-3,36 (m, 2H, CH 2 NH); 3,54-3,65 (m, 4H, (CH 2 ) 2 ); 4,58-4,68 (m, CHH); 5,67 (razširjen singlet, 1H, NH); 7,08-7,21 (m, 8H, Ar-H); 7,31-7,37 (m, 4H, Ar-H); 7,77-7,84 (m, 2H, Ar-H) ppm 31 P-NMR δ = -11,04 ppm MS-ESI 551 (MH + ) ESI-HRMS izračunano za C 25 H 29 FN 2 7 PS (m/z): 551,1412 (MH + ); dobljen rezultat (m/z): 551,1417 IR (KBr) 3189, 2902, 2869, 1590, 1492, 1458, 1405, 1342, 1266, 1192, 1173, 1156, 1116, 1067, 1011, 968, 866, 842, 766, 692, 551, 513 cm -1 Elementna analiza C 25 H 28 FN 2 7 PS % C % H % N Izračunana vrednost 54,54 5,13 5,09 Izmerjena vrednost 54,79 5,14 5,13 35
48 DIPLMSKA NALGA Sinteza 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il dihidrogen fosfata in 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3- morfolinopropan-2-il fenil hidrogen fosfata Reakcija: P H H S NH N F P 6 S NH H 2,Pt 2 ledocet + F N P H 5 S NH N F 7 Sintezni postopek: V bučko natehtamo 400 mg spojine 4 in raztopimo v 10 ml ledoceta. Bučko pokrijemo s septumom in prepihamo z argonom. Dodamo 200 mg Pt 2 ter raztopino prepihamo z vodikom. Reakcijo pustimo teči en teden pod nadtlakom vodika, vmes pa spremljamo njen potek s pomočjo tankoplastne kromatografije v MF-5. Po enem tednu reakcijo ustavimo, katalizator odfiltriramo z odsesavanjem ter pod znižanim tlakom odparimo topilo (ledocet). Pri reakciji dobimo zmes dveh produktov; spojini 5 in 6. Produkta smo ločili in očistili s pomočjo preparativne tankoplastne kromatografije v MF-5. 36
49 DIPLMSKA NALGA 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il dihidrogen fosfat M r = 398,07 Izgled beli kristali TLC R f = 0,36 (MF-5) T t C Masa produkta 0,110 g Izkoristek 38 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (D 2 ) δ = 2,21-2,28 (m, 2H, CH 2 N); 2,31-2,47 (m, 4H, (CH 2 ) 2 N morfolin); 2,74 (dd, J = 11,9; 8,2 Hz, 1H, NHCHa); 3,07 (dd, J = 12,2 4,1 Hz, 1H, NHCH b ); 3,60-3,67 (m, 4H, (CH 2 ) 2 morfolin); 4,09-4,13 (m, 1H, CHH); 7,18-7,24 (m, 2H, Ar-H); 7,72-7,77 (m, 2H, Ar- H) ppm 31 P-NMR δ = 3,89 ppm MS-ESI 397 (MH - ) - ESI-HRMS izračunano za C 13 H 19 FN 2 7 PS (m/z): 397,0640 (MH ); dobljen rezultat (m/z): 397,0635 IR (KBr) 1708,1569, 1415, 1297, 1157, 1091, 1018, 843, 669, 622 cm -1 HPLC čistost spojine: 97,5%; t r = 11,53 min (λ = 254 nm) 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fenil hidrogen M r = 474,10 fosfat Izgled beli kristali TLC R f = 0,76 (MF-5) T t C Masa produkta 0,161 g Izkoristek 47 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (D 2 ) δ = 2,36-2,42 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,51-2,56 (m, 2H, CH 2 N); 2,73 (dd, J = 12,3; 8,7 Hz, 1H, NHCH a ), 2,96-3,01 (m, 1H, NHCH b ), 3,57-3,59 (m, 4H, (CH 2 ) 2 morfolin); 4,25-4,29 (m, 1H, CHH); 6,96-6,99 (m, 2H, Ar-H); 7,04-7,13 (m, 3H, Ar-H), 7,22-7,27 (m, 2H, Ar-H); 7,60-7,65 (m, 2H, Ar-H) ppm 31 P-NMR δ = -4,24 ppm MS-ESI 473 (MH - ) - ESI-HRMS izračunano za C 19 H 22 FN 2 7 PS (m/z): 473,0953 (MH ); dobljen rezultat (m/z): 473,0948 IR (KBr) 3446, 1565, 1414, 1265, 1155, 1096, 896, 840, 760, 552 cm -1 HPLC čistost spojine: 95,1 %; t r = 15,68 min (λ = 254 nm) 37
50 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-alil-4-metilbenzensulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: 4-metilbenzensulfonilklorid 8 (5,720 g; 30,0 mmol) raztopimo v brezvodnem diklorometanu (100 ml) ter ohladimo na ledu na 0 C. Nato po kapljicah in med mešanjem dodajamo alilamin (4,71 ml; 63,0 mmol) in pustimo mešati 30 minut. Ledeno kopel odstavimo in pustimo mešati pri sobni temperaturi toliko časa, dokler s tankoplastno kromatografijo ne dokažemo, da v reakcijski zmesi ni več spojine 8. Reakcijsko zmes nato uparimo pod znižanim tlakom do suhega in raztopimo v etilacetatu (75 ml). Sledi filtracija in spiranje z vodo (1 x 50 ml), 10% raztopino citronske kisline (2 x 50 ml), vodo (1 x 50 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 50 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in topilo uparimo pod znižanim tlakom. N-alil-4-metilbenzensulfonamid M r = 211,28 Izgled beli kristali TLC R f = 0,75 (MF-1) T t C; (po literaturi (34): C) Masa produkta 4,234 g Izkoristek 67 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 2,43 (s, 3H, CH 3 ); 3.59 (tt, J = 6,2 1,5Hz, 2H, NHCH 2 ); 4,51-4,55 (m, 1H, NH); 5,08-5,20 (m, 2H, CHCH 2 ); 5,67-5,79 (m, 1H, CH); 7,30-7,33 (m, 2H, Ar-H); 7,74-7,77 (m, 2H, Ar-H) ppm 38
51 DIPLMSKA NALGA Sinteza 4-metil-N-(oksiran-2-il)metilbenzensulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: N-alil-4-metilbenzensulfonamid 9 (3,023 g 14,3 mmol) raztopimo v CH 2 Cl 2 (100 ml) ter ohladimo na 0 C. Reakcijski zmesi nato dodamo med mešanjem 1,25 ekvivalenta 70% m- CPBA (4,409 g; 17,9 mmol). Po 30 minutah ledeno kopel odstranimo in pustimo mešati čez noč pri sobni temperaturi. V reakcijsko zmes nato dodamo 75 ml 10% vodne raztopine Na 2 S 3 in 10 minut močno mešamo. Sledi ločitev faz in spiranje organske faze v liju ločniku z nasičeno raztopino NaHC 3 (5 x 50 ml), vodo (1 x 50 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 50 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in odparimo topilo pod znižanim tlakom skoraj do konca. Po dodatku heksana izpadejo beli kristali. Nato odparimo pod znižanim tlakom heksan in preostalo topilo. 4-metil-N-(oksiran-2-ilmetil)benzensulfonamid M r = 227,28 Izgled beli kristali TLC R f = 0,47 (MF-2) T t C; (po literaturi (35): C) Masa produkta 3,034 g Izkoristek 93 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3,300 MHz) δ = 2,41 (s, 3H, CH 3 ); 2,61 (dd, J = 4,6; 2,4Hz, 1H, CH a -); 2,73 (dd, J = 5,4; 3,2Hz, 1H, CH b -); 2,98-3,07 (m, 2H, NHCH 2 ); 3,27-3,37 (m, 1H, CHCH 2 ); 4,68-4,76 (m, 1H, NH); 7,28-7,31 (m, 2H, Ar-H); 7,71-7,74 (m, 2H, Ar-H) 39
52 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-4-metilbenzenesulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: V 10 ml epruveto za mikrovalovni reaktor natehtamo spojino 3 (0,909 g; 4,0 mmol) in jo raztopimo v brezvodnem dioksanu (5 ml). Dodamo še 0,5 ekvivalenta Ca(Tf) 2 (0,678 g; 2,0 mmol) ter 1,5 ekvivalenta morfolina (0,523 g; 6,0 mmol). Reakcijsko zmes segrevamo v mikrovalovnem reaktorju 15 minut pri 120 C. Po končani reakciji Ca(Tf) 2 odfiltriramo ter preostanek uparimo pod znižanim tlakom. Dobimo rumenkasto oljnato raztopino, ki jo čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. 4-metil-N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)benzensulfonamid M r = 314,40 Izgled beli kristali TLC R f = 0,44 (MF-1) T t C Masa produkta 1,187 g Izkoristek 78 % Analiza Rezultati 1 H-NMR δ = 2,30-2,44 (m, 7H, CH 3 in N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,57-2,63 (m, 2H, (CDCl 3, 300 CH 2 N); 2,87 (dd, J = 12,6 5,4Hz, 1H, NHCH a ), 3,10 (dd, J = 12,62; MHz) 3,4Hz, 1H, NHCH b ); 3,67-3,70 (m, 4H, (CH 2 ) 2 morfolin); 3,77-3,85 (m, 1H, CHH); 5,06 (razširjen s, 1H, H); 7,30-7,32 (m, 2H, Ar-H); 7,72-7,75 (m, 2H, Ar-H) ppm. MS-ESI 315 (MH + ) ESI-HRMS izračunano za C 14 H 23 N 2 4 S (m/z): 315,1373 (MH + ); dobljen rezultat (m/z): 315,1368 IR (KBr) 3210, 2960, 2847, 1599, 1452, 1420, 1324, 1302, 1286, 1159, 1116, 1089, 1072, 1050, 1004, 921, 902, 863, 808, 796, 706, 662, 600, 551, 530 cm -1 Elementna analiza za C 14 H 22 N 2 4 SxH 2 % C % H % N Izračunana vrednost 50,58 7,28 8,43 Izmerjena vrednost 50,35 6,91 8,36 40
53 DIPLMSKA NALGA Sinteza 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il difenil fosfata Reakcija: Sintezni postopek V bučko natehtamo 1,5 mmol (0,471 g) spojine 11. Dodamo 1,5 ekvivalenta (2,25 mmol; 0,275 g) DMAP (dimetilaminopiridina) in raztopimo v 15 ml brezvodnega diklorometana, pripravljenega z destilacijo. Raztopino prepihamo z argonom. Reakcijsko zmes ohladimo na -10 C in pri tej temperaturi dodamo še 1,2 ekvivalenta difenilfosforil klorida (1,8 mmol; 0,382 ml). Reakcijo izvajamo 30 minut pri -10 C, nato pa še 60 minut pri sobni temperaturi. Po tem času reakcijo ustavimo z dodatkom zdrobljenega ledu in pustimo mešati še 15 minut. rgansko fazo spiramo z nasičeno raztopino NaHC 3 (2 x 20 ml) ter nasičeno raztopino NaCl (2 x 20 ml). rgansko fazo sušimo z brezvodnim Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in odparimo topilo pod znižanim tlakom. Spojino čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. Po čiščenju dobimo bele kristale. 41
54 DIPLMSKA NALGA 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il difenil fosfat M r = 546,57 Izgled beli kristali TLC R f = 0,70 (MF-7) T t C Masa produkta 0,680 g Izkoristek 83 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 2,32-2,38 (m, 2H, CH 2 N); 2,41 (s, 3H CH 3 ); 2,42-2,62 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 3,24-3,30 (m, 2H, CH 2 -NH); 3,58-3,61 (m, 4H, (CH 2 ) 2 morfolin); 4,57-4,68 (m, 1H, CHH); 5,46-5,47 (m, 1H, NH); 7,16-7,28 (m, 8H, Ar-H); 7,31-7,37 (m, 4H, Ar-H); 7,67-7,70 (m, 2H, Ar-H) ppm. MS-ESI 547 (MH + ) IR (KBr) 3174, 2959, 2853, 2800, 1591, 1489, 1453, 1328, 1289, 1222, 1193, 1160, 1116, 1084, 1009, 968, 877, 814, 765, 688, 548 cm -1 Elementna analiza za C 25 H 28 FN 2 7 PS % C % H % N Izračunana vrednost 57,13 5,72 5,13 Izmerjena vrednost 57,22 5,45 5,18 42
55 DIPLMSKA NALGA Sinteza 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fenil hidrogen fosfata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo 400 mg spojine 12 in raztopimo v 10 ml ledoceta. Bučko pokrijemo s septumom in prepihamo z argonom. Nato dodamo 200 mg Pt 2 ter raztopino prepihamo z vodikom. Reakcijo pustimo teči en teden v vodikovi atmosferi, vmes pa spremljamo njen potek s pomočjo tankoplastne kromatografije v MF-5. Po enem tednu reakcijo ustavimo, katalizator odfiltriramo z odsesavanjem ter pod znižanim tlakom odparimo topilo (ledocet). Pri reakciji dobimo produkt 13; ki smo ga očistili s pomočjo preparativne tankoplastne kromatografije. 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il fenil hidrogen M r = 470,48 fosfat Izgled rahlo oranžno obarvani kristali TLC R f = 0,72 (MF-5) T t C Masa produkta 196 mg Izkoristek 57 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (D 2 ) δ = 2,28 (s, 3H, Ph-CH 3 ); 2,43-2,59 (6H, N(CH 2 ) 3 ); 2,74 (dd, J = 12,4; 8,5 Hz, 1H, CH a -NH); 3,04 (dd, J = 12,6; 3,8 Hz, 1H, CH b NH); 3,59 (t, J = 4,6Hz, 4H, (CH 2) 2 )); 4,24-4,30 (m, 1H, CH); 6,98-7,00 (m, 2H, Ar-H); 7,06-7,11 (m, 1H, Ar-H); 7,21-7,29 (m, 4H, Ar-H); 7,51-7,54 (m, 2H, Ar-H) ppm 31 P-NMR δ = -4,22 ppm MS-ESI 469 (MH - ) 43
56 DIPLMSKA NALGA ESI-HRMS izračunano za C 20 H 27 N 2 7 SP (m/z): 469,1204 (MH - ); dobljen rezultat (m/z): 469,1200 IR (KBr) 3432, 1571, 1414, 1267, 1163, 1095, 896 cm -1 44
57 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze dibenzil 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3- morfolinopropan-2-il fosfata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo spojino 4 (1,273 g; 4 mmol), dodamo 1,2 ekvivalenta trifenilfosfina (1,26 g; 4,8 mmol) in 1,2 ekvivalenta dibenzilfosfata (1,33 g; 4,8 mmol) v tetrahidrofuranu (12 ml). Reakcijsko zmes ohladimo na ledeni kopeli na 0 C ter dodamo dietilazadikarboksilat (40 % v toluenu; 2,1 ml; 4,8 mmol). Nadaljujemo z mešanjem pri sobni temperaturi. Ker po 48 urah reakcija še ni potekla smo v reakcijsko zmes dodali še 0,33 ekvivalenta trifenilfosfina (0,419 g; 1,6 mmol), dibenzilfosfata (0,445 g; 1,6 mmol) ter 0,7 ml dietilazadikarboksilata (1,6 mmol). Po sedmih dneh smo reakcijo ustavili in čistili s kolonsko kromatografijo, vendar želenega produkta nismo uspeli izolirati. 45
58 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-(2-bromo-3-morfolinopropil)-4-fluorobenzensulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo spojino 4 (2,00 g; 6,29 mmol) in 1,25 ekvivalenta tetrabromometana (2,608 g; 7,86 mmol) ter ju raztopimo v 25 ml diklorometana in na ledeni kopeli ohladimo na 0 C. Po 10 minutah dodamo še trifenilfosfin (1,4 ekvivalenta; 8,81 mmol; 2,31 g). Ledeno kopel odstranimo in pustimo mešati čez noč. Po 24 urah reakcijo ustavimo in odparimo topilo. Produkt čistimo s pomočjo cirkularne kromatografije v MF-2. N-(2-bromo-3-morfolinopropil)-4-fluorobenzensulfonamid M r = 381,26 Izgled rahlo oranžno obarvani kristali TLC R f = 0,52 (MF-2) T t C Masa produkta 1,242 g Izkoristek 52 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3,300 MHz) δ = 2,29-2,47 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,55-2,72 (m, 2H, CH 2 N); 3,08-3,17 (m, 1H, NHCH a ); 3,29-3,37 (m, 1H, NHCH b ); 3,52 (s, 4H, (CH 2 ) 2 ); 4,16-4,20 (m, 1H, CHBr); 7,43-7,50 (m, 2H, Ar-H); 7,85-7,91 (m, 2H, Ar-H); 8,00-8,04 (t, J = 5,5 Hz, 1H, NH) ppm. MS-ESI 381 (MH + ) ESI-HRMS ESI-HRMS: izračunano za C 13 H 19 FN 2 3 BrS (m/z): 381,0278 (MH + ); dobljen rezultat (m/z): 381,0284 IR (KBr) 3115, 2984, 2934, 2878, 2658, 2595, 2658, 2595, 1594, 1496, 1461, 1436, 1408, 1374, 1333, 1308, 1296, 1259, 1236, 1199, 1169, 1156, 1130, 1097, 1068, 1047, 1017, 992, 968, 928, 905, 878, 864, 834, 711, 619, 590, 564, 550, 501, 464 cm -1 Elementna analiza za 3C 13 H 18 BrFN 2 3 SxH 2 % C % H % N Izračunana vrednost 40,32 4,86 7,23 Izmerjena vrednost 40,12 4,57 7,13 46
59 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze dietil 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3- morfolinopropan-2-ilfosfonata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo 0,381 g (1,0 mmol) spojine 15, dodamo 2,4 ekvivalenta trietilfosfita (0,43 ml; 2,4 mmol). Reakcijo izvajamo 24 ur pri temperaturi 160 C pod refluksom. Po čiščenju produkta v mobilni fazi MF-7 spojine 16 nismo uspeli izolirati. 47
60 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-(2-bromo-3-morfolinopropil)-4-metilbenzensulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo spojino 11 (4-metil-N-(2-hidroksi-3- morfolinopropil)benzensulfonamid) (0,805 g; 2,56 mmol) in 1,25 ekvivalenta tetrabromometana (1,061 g; 3,20 mmol). Raztopimo ju v 25 ml diklorometana in na ledeni kopeli ohladimo na 0 C. Po 10 minutah dodamo še trifenilfosfin (1,4 ekvivalenta; 3,58 mmol; 0,940 g). Ledeno kopel odstranimo in pustimo mešati čez noč. Po 24 urah reakcijo ustavimo in odparimo topilo. Produkt čistimo s pomočjo cirkularne kromatografije v MF-2. N-(2-bromo-3-morfolinopropil)-4-metilbenzensulfonamid M r = 377,30 Izgled temno rdeče olje TLC R f = 0,32 (MF-2) Masa produkta 0,501 g Izkoristek 52 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 2,31-2,38 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,39 (s, 3H, CH 3 ); 2,57-2,73 (m, 1H, NCH a ); 3,04-3,13 (m, 1H, NCH b ); 3,26-3,30 (m, 2H, CH 2 NH) 3,45-3,55 (m, 4H, (CH 2 ) 2 ); 4,14-4,18 (m, 1H, CHBr); 7,40-7,43 (m, 2H, Ar-H); 7,68-7,71 (m, 2H, Ar-H); 7,89 (t, J = 5,6 Hz, 1H, NH) ppm MS-ESI MS-ESI: 377,1 (MH + ) IR (KBr) 3435, 1730, 1598, 1452, 1328, 1159, 1093, 816, 664, 551 cm -1 Elementna analiza za 3C 14 H 21 BrN 2 3 SxH 2 % C % H % N Izračunana vrednost 43,83 5,70 7,31 Izmerjena vrednost 44,04 6,10 6,84 48
61 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze dietil 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan- 2-ilfosfonata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo 0,377 g (1,0 mmol) spojine 17, dodamo 2,4 ekvivalenta trietilfosfita (0,43 ml; 2,4 mmol). Temu dodamo še 10 ml topila DMF (N,N-dimetilformamida). Reakcijo izvajamo 24 ur pri temperaturi 160 C pod refluksom. Ker produkta ni bilo možno izolirati, smo reakcijo ponovili z enakim ekvivalentom spojine 17, le da smo namesto topila DMF uporabili 5 ml trietilfosfita. Po 48 urah refluksa pri 160 C smo reakcijo ustavili in prebitek trietilfosfita odstranili z vakuumsko destilacijo. Produkta 18 nismo uspeli izolirati. 49
62 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il metil malonata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo spojino 4 (0,255 g; 0,80 mmol) in DMAP (0,127 g; 1,04 mmol) ter ju raztopimo v 10 ml brezvodnega diklormetana, hranjenega nad siti. Bučko postavimo na ledeno kopel in prepihamo z argonom. Dodamo 1,2 ekvivalenta metilmalonil klorida (0,131 g; 0,103 ml; 0,96 mmol). Pustimo mešati 15 minut pri temperaturi 0 C, nato pa še 24 ur pri sobni temperaturi. Po tem času odparimo topilo in raztopimo v etilacetatu. rgansko fazo spiramo z vodo (2 x 15 ml), nasičeno raztopino NaHC 3 (2 x 15 ml), vodo (15 ml) in nasičeno raztopino NaCl (15 ml). Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. Spojina 19 pri reakciji ni nastala. 50
63 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze 1-(4-fluorofenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il dihidrogen fosfata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo spojino 4 (0,422 g; 1,32 mmol). Dodamo 0,5 ml piridina in 6 ml brezvodnega diklormetana, pripravljenega z destilacijo. Vse to prepihamo z argonom in postavimo na ledeno kopel. Dodamo fosforiltriklorid (0,137 ml; 1,452 mmol) in odstranimo ledeno kopel. Po eni uri dodamo še enak ekvivalent vode in mešamo še eno uro. Po tem času reakcijo ustavimo, odfiltriramo piridinijevo sol in odparimo topilo. Glede na rezultat masne spektroskopije sklepamo, da je nastali produkt, ki prevladuje, v obliki dimera. 51
64 DIPLMSKA NALGA Sinteza metil 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il malonata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo spojino 11 (0,405 g; 1,29 mmol) in DMAP (0,032 g; 0,258 mmol) ter ju raztopimo v 10 ml brezvodnega diklormetana, pripravljenega z destilacijo. Dodamo še 1,5 ekvivalenta diizopropiletilamina (0,250; 0,319 ml; 1,93 mmol). Bučko postavimo na ledeno kopel in prepihamo z argonom. Dodamo 1,6 ekvivalenta metilmalonilklorida (0,283 g; 0,221 ml; 2,07 mmol). Pustimo mešati 15 minut pri temperaturi 0 C, nato pa še 24 ur pri sobni temperaturi. Po tem času odparimo topilo in raztopimo v etilacetatu. dparimo topilo in preostanek čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. Metil 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3-morfolinopropan-2-il malonat M r = 414,15 Izgled rumeno olje TLC R f = 0,66 Masa produkta 0,293 g Izkoristek 55 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 2,43 (s, 3H, PhCH 3 ); 2,43-2,48 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2.50 (dd, J = 6,3; 2,2 Hz, 2H, CH 2 N); 3,16-3,24 (m, 1H, CH a -NH); 3,28-3,34 (m, 1H, CH b -NH); 3,63-3,66 (m, 4H, (CH) 2 ) 2, 3,74-3,75 (m, 2H, C-CH 2 -C); 3,77 (s, 3H, -CH 3 ); 4,95-4,99 (m, 1H, - CH); 7,30-7,37 (m, 2H, Ar-H), 7,34-7,77 (m, 2H, Ar-H) ppm MS-ESI 415 (MH + ) ESI-HRMS ESI-HRMS: izračunano za C 14 H 23 N 2 4 S (m/z): 415,1533 (MH + ); dobljen rezultat (m/z): 415,1550 IR (KBr) 3258, 1736, 1598, 1441, 1378, 1325, 1160, 1093, 817, 662, 488 cm -1 52
65 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-alil-4-izopropilbenzenesulfonamida Reakcija Sintezni postopek: 4-izopropilbenzen-1-sulfonil klorid (2,169 g; 10,0 mmol) raztopimo v brezvodnem diklorometanu (50 ml) ter ohladimo na ledu na 0 C. Nato po kapljicah in med mešanjem dodajamo alilamin (1,57 ml; 21,0 mmol) in pustimo mešati 30 minut. Ledeno kopel odstavimo in pustimo mešati pri sobni temperaturi toliko časa, dokler s tankoplastno kromatografijo ne dokažemo, da v reakcijski zmesi ni več spojine 21. Reakcijsko zmes nato uparimo pod znižanim tlakom do suhega in raztopimo v etilacetatu (50 ml). Sledi filtracija in spiranje z vodo (1 x 30 ml), 5% raztopino citronske kisline (2 x 30 ml), vodo (30 ml) in nasičeno raztopino NaCl (30 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in topilo uparimo pod znižanim tlakom. N-alil-4-izopropilbenzenesulfonamid M r = 239,33 Izgled rahlo rumeno olje TLC R f = 0,69 (MF-2) Masa produkta 2,169 g Izkoristek 91 % Analiza Rezultati 1 H-NMR δ = 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH 3 ) 2 ); 2,98 (m, 1H, CHCH 3 ) 2 ); (CDCl 3, 300 3,60 (tt, J = 6,2 1,5 Hz, 2H, NHCH 2 ); 4,50-4,54 (m, 1H, NH); 5,08- MHz) 5,21 (m, 2H, CHCH 2 ); 5,68-5,81 (m, 1H, CHCH 2 ); 7,35-7,38 (m, 2H, Ar-H); 7,78-7,80 (m, 2H, Ar-H) ppm 53
66 DIPLMSKA NALGA Sinteza 4-izopropil-N-(oksiran-2-ilmetil)benzenesulfonamida Reakcija Sintezni postopek: N-alil-4-izopropilbenzenesulfonamid (22) (2,028 g; 8,5 mmol) raztopimo v CH 2 Cl 2 (50 ml) ter ohladimo na 0 C. Reakcijski zmesi nato dodamo med mešanjem 1,2 ekvivalenta 70% čiste m-cpba (8,236 g; 14,5 mmol). Po 30 minutah ledeno kopel odstranimo in pustimo mešati čez noč pri sobni temperaturi. V reakcijsko zmes nato dodamo 50 ml 10% vodne raztopine Na 2 S 3 in 10 minut močno mešamo. Sledi spiranje v liju ločniku z nasičeno raztopino NaHC 3 (5 x 30 ml), vodo (1 x 30 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 30 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in odparimo topilo pod znižanim tlakom skoraj do konca. Dodamo heksan in izpadejo beli kristali. Nato odparimo pod znižanim tlakom heksan in preostanek diklorometana. 4-izopropil-N-(oksiran-2-ilmetil)benzenesulfonamid M r = 255,33 Izgled olje TLC R f = 0,31 (MF-4) Masa produkta 1,960 Izkoristek 91 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 1.28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH 3 ) 2 ); 2.65 (dd, J = 4,7 2,5 Hz, 1H, CH a ); 2,75-2,78 (m, 1H, CH b ); 2,95-3,02 (m, 2H, CH 2 NH); 3,04-3,12 (m, 1H, CH(CH 3 ) 2 ); 3,32-3,40 (m, 1H, CH); 4,88-4,95 (m, 1H, NH); 7,36-7,39(m, 2H, Ar-H); 7,78-7,81 (m, 2H, Ar-H) ppm MS-ESI 256,1 (MH + ) IR (KBr) 3282, 2963, 1612, 1331, 1162, 1090, 1054, 835, 782, 751, 648, 565 cm -1 Elementna analiza za C 12 H 17 N 3 S % C % H % N Izračunana vrednost 56,45 6,71 5,49 Izmerjena vrednost 56,27 6,93 5,54 54
67 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-4- izopropilbenzenesulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: V 10 ml epruveto za mikrovalovni reaktor natehtamo spojino 23 (0,255 g; 1,0 mmol) in jo raztopimo v brezvodnem dioksanu (5 ml). Dodamo še 0,5 ekvivalenta Ca(Tf) 2 (0,170 g; 0,5 mmol) ter 1,5 ekvivalenta morfolina (0,383 g; 1,5 mmol). Reakcijsko zmes segrevamo v mikrovalovnem reaktorju 15 minut pri 120. Po končani reakciji Ca(Tf) 2 odfiltriramo ter preostanek uparimo pod znižanim tlakom. Dobimo rumenkasto oljnato raztopino, ki jo čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-4-izopropilbenzenesulfonamid M r = 342,45 Izgled beli kristali TLC R f = 0,50 (MF-1) T t C Masa produkta 0,262 g Izkoristek 77 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 1,27 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH 3 ) 2 ); 2,25-2,45 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,56-2,63 (m, 2H, NCH 2 ); 2,90 (dd, J = 12,7; 5,5Hz, 1H, NHCH a ); 2,96-3,03 (m, 1H, CH(CH 3 ) 2 ); 3.12 (dd, J = 12,7; 3,7 Hz, 1H, NHCH b ); 3,67-3,70 (m, 4H, (CH 2 ) 2 morfolin); 5,05 (razširjen singlet, 1H, NH); 7,35-7,37 (m, 2H, Ar-H); 7,75-7,78 (m, 2H, Ar-H) ppm MS-ESI 343 (MH + ) IR (KBr) 3246, 2960, 1598, 1457, 1331, 1160, 1107, 1051, 1002, 911, 887, 863, 827, 772, 649, 568 cm -1 Elementna analiza za 3C 16 H 26 N 2 4 Sx2H 2 % C % H % N Izračunana vrednost 54,21 7,77 7,90 Izmerjena vrednost 54,03 7,37 7,69 55
68 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-alil-1-(2-nitrofenil)metansulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: N-alil-1-(2-nitrofenil)metansulfonil klorid (25) (2,35 g; 10 mmol) raztopimo v brezvodnem diklorometanu (50 ml) ter ohladimo na ledu na 0 C. Nato po kapljicah in med mešanjem dodajamo alilamin (1,57 ml; 21 mmol) in pustimo mešati 30 minut. Ledeno kopel odstavimo in pustimo mešati pri sobni temperaturi toliko časa, dokler s tankoplastno kromatografijo ne dokažemo, da v reakcijski zmesi ni več spojine. Reakcijsko zmes nato uparimo pod znižanim tlakom do suhega in raztopimo v etilacetatu (50 ml). Sledi filtracija in spiranje z vodo (1 x 30 ml), 5% raztopino citronske kisline (2 x 30 ml), vodo (1 x 30 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 30 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in topilo uparimo pod znižanim tlakom. N-alil-1-(2-nitrofenil)metansulfonamid M r = 256,28 Izgled rjavo obarvani kristali TLC R f = 0,60 (MF-2) T t C Masa produkta 1,839 g Izkoristek 72 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 3,61 (tt, J = 6,0; 1,4 Hz, 2H, CH 2 NH); 4,31 (t, J = 5,6, 1H, NH); 4,83 (s, 2H, CH 2 S 2 ); 5,16-5,27 (m, 2H, CH 2 CH); 5,72-5,85 (m, 1H, CHCH 2 ); 7,53-7,68 (m, 3H, Ar-H); 8,03 (dd, J = 8,0, 1,2 Hz, 1H, Ar- H) ppm MS-ESI 257 (MH + ) IR (KBr) 3279, 3016, 2967, 1647, 1611, 1531, 1417, 1352, 1319, 1290, 1201, 1164, 1123, 1028, 987, 922, 865, 817, 788, 766, 696, 669, 543 cm -1 Elementna analiza za C 10 H 12 N 2 4 S % C % H % N Izračunana vrednost 46,87 4,72 10,93 Izmerjena vrednost 47,21 4,74 11,06 56
69 DIPLMSKA NALGA Sinteza 1-(2-nitrofenil)-N-(oksiran-2-ilmetil)metansulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: N-alil-1-(2-nitrofenil)metansulfonamid (26) (0,640 g; 3,3 mmol) raztopimo v CH 2 Cl 2 (50 ml) ter ohladimo na 0 C. Reakcijski zmesi nato dodamo med mešanjem 1,2 ekvivalenta 70% m-cpba (0,970 g; 3,9 mmol). Po 30 minutah ledeno kopel odstranimo in pustimo mešati čez noč pri sobni temperaturi. V reakcijsko zmes nato dodamo 50 ml 10% vodne raztopine Na 2 S 3 in 10 minut močno mešamo. Sledi spiranje v liju ločniku z nasičeno raztopino NaHC 3 (5 x 30 ml), vodo (30 ml) in nasičeno raztopino NaCl (30 ml). rgansko fazo sušimo z Na 2 S 4, sušilno sredstvo odfiltriramo in odparimo topilo pod znižanim tlakom skoraj do konca. Dodamo heksan in izpadejo beli kristali. Nato odparimo pod znižanim tlakom heksan in preostanek topila. 1-(2-nitrofenil)-N-(oksiran-2-ilmetil) metansulfonamid M r = 272,28 Izgled rumenkasti kristali TLC R f = 0,29 T t C Masa produkta 0,466 g Izkoristek 69 % Analiza Rezultati 1 H-NMR δ = 2,64 (dd, J = 4,5; 2,4 Hz, 1H, CH a ); 2,77-2,80 (m, 1H, CH b ); (CDCl 3, 300 3,01-3,10 (m, 2H, CH 2 NH); 3,34-3,43 (m, 1H,CH); 4,55-4,62 (m, MHz) 1H, NH); 4,86 (s, 2H, CH 2 S 2 ); 7,53-7,69 (m, 3H, Ar-H); 8,02-8,04 (m, 1H, Ar-H) ppm MS-ESI 273 (MH + ) IR (KBr) 3227, 3009, 1610, 1526, 1446, 1419, 1333, 1256, 1201, 1170, 1143, , 987, 918, 862, 847, 788, 702, 667, 607, 568, 549 cm - Elementna analiza za C 10 H 12 N 2 5 S % C % H % N Izračunana vrednost 44,11 4,44 10,29 Izmerjena vrednost 44,24 4,24 10,29 57
70 DIPLMSKA NALGA Sinteza N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-1-(2- nitrofenil)metansulfonamida Reakcija: Sintezni postopek: V 10 ml epruveto za mikrovalovni reaktor natehtamo spojino 27 (0,272 g; 1,0 mmol) in jo raztopimo v brezvodnem dioksanu (5 ml). Dodamo še 0,5 ekvivalenta Ca(Tf) 2 (0,170 g; 0,5 mmol) ter 1,5 ekvivalenta morfolina (0,383 g; 1,5 mmol). Reakcijsko zmes segrevamo v mikrovalovnem reaktorju 15 minut pri 120 C. Po končani reakciji Ca(Tf) 2 odfiltriramo ter preostanek uparimo pod znižanim tlakom. Dobimo rumenkasto oljnato raztopino, ki jo čistimo s kolonsko kromatografijo v MF-1. N-(2-hidroksi-3-morfolinopropil)-1-(2-nitrofenil)metansulfonamid M r = 359,40 Izgled rumeno olje TLC R f = 0,38 (MF-1) Masa produkta 0,290 Izkoristek 81 % Analiza Rezultati 1 H-NMR (CDCl 3, 300 MHz) δ = 2,34-2,44 (m, 4H, N(CH 2 ) 2 morfolin); 2,58-2,65 (m, 2H, NCH 2 ); 2,94 (dd, J = 13,2; 6,1 Hz, 1H, NH-CH a ); 3,15 (dd, J = 13,2; 3,6 Hz, 1H, NH-CH b ); 3,62-3,72 (m, 4H, (CH 2 ) 2 morfolin); 3,74-3,82 (m, 1H, CH); 4,85 (s, S 2 CH 2 ); 7,52-7,68 (m, 3H, Ar-H); 8,01-8,04 (m, 1H, Ar-H) MS-ESI 360 (MH + ) IR (KBr) 3448, 2818, 1530, 1413, 1354, 1144, 1114, 1006, 863 cm -1 Elementna analiza C 14 H 21 N 3 6 S % C % H % N Izračunana vrednost 46,79 5,89 11,69 Izmerjena vrednost 46,54 6,08 11,36 58
71 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze dibenzil 1-(4-izopropilfenilsulfonamido)-3- morfolinopropan-2-il fosfata Reakcija: S H N H N 1. (Bn) 2 PN(i-Pr) 2, N CH 2 Cl 2 2. mcpba H N N N S Bn H N P Bn N F 4 F 29 Sintezni postopek: V bučko natehtamo 0,478 g (1,5 mmol) spojine 4 in jo raztopimo v 30 ml brezvodnega diklorometana. Postavimo na ledeno kopel in prepihamo z argonom. Dodamo 10,3 ml 0,45 molarne raztopine 1H-tetrazola v acetonitrilu (4,65 mmol). Nato dodamo še N,Ndiizopropildibenzil fosforamidat (2,4 mmol; 0,86 ml). dstavimo ledeno kopel in reakcijsko zmes mešamo pri sobni temperaturi. Po eni uri reakcijsko zmes ohladimo na -40 C ter dodamo 3 ekvivalente 70% čiste m-cpba (4,5 mmol; 0,803 g). Reakcijo v nadaljevanju izvajamo 24 ur pri sobni temperaturi. Po tem času reakcijo ustavimo, dodamo 120 ml diklorometana ter spiramo z 10% raztopino Na 2 S 4 (2 x 80 ml); nasičeno raztopino NaHC 3 (2 x 60 ml); prečiščeno vodo (1 x 60 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 60 ml). Vodno fazo še enkrat spiramo s 40 ml diklorometana, le tega pa z 20 ml nasičene raztopine NaCl. rganski fazi združimo in sušimo z Na 2 S 3, ki ga odfiltriramo in uparimo organsko fazo. Produkt smo čistili s pomočjo cirkularne kromatografije v mobilni fazi MF-2, vendar pa ustrezne spojine nismo uspeli izolirati. 59
72 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze dibenzil 1-(4-metilfenilsulfonamido)-3- morfolinopropan-2-il fosfata Reakcija: Sintezni postopek: V bučko natehtamo 0,472 g (1,5 mmol) spojine 11 in jo raztopimo v 30 ml brezvodnega diklorometana. Postavimo na ledeno kopel in prepihamo z argonom. Dodamo 10,3 ml 0,45 molarne raztopine 1H-tetrazola v acetonitrilu (4,65 mmol). Nato dodamo še N,N-diizopropildibenzil fosforamidat (2,4 mmol; 0,86 ml). dstavimo ledeno kopel in reakcijsko zmes mešamo pri sobni temperaturi. Po eni uri reakcijsko zmes ohladimo na -40 C ter dodamo 3 ekvivalente 70% čiste m-cpba (4,5 mmol; 0,803 g). Reakcijo v nadaljevanju izvajamo 24 ur pri sobni temperaturi. Po tem času reakcijo ustavimo, dodamo 120 ml diklorometana ter spiramo z 10% raztopino Na 2 S 4 (2 x 80 ml); nasičeno raztopino NaHC 3 (2 x 60 ml); prečiščeno vodo (1 x 60 ml) in nasičeno raztopino NaCl (1 x 60 ml). Vodno fazo še enkrat spiramo s 40 ml diklorometana, le tega pa z 20 ml nasičene raztopine NaCl. rganski fazi združimo in sušimo z Na 2 S 3, ki ga odfiltriramo in uparimo organsko fazo. Produkt smo čistili s pomočjo cirkularne kromatografije v MF-2, vendar pa ustrezne spojine nismo uspeli izolirati. 60
73 DIPLMSKA NALGA 5 RAZPRAVA IN REZULTATI V diplomski nalogi smo sintetizirali spojine s hidroksietilaminskim fragmentom. Na hidroksilno skupino pa smo potem skušali pripeti fosfatno skupino, ki bi imela prosti oziroma substituirani hidroksilni skupini. Substituenti naj bi bili čim manjši zaradi manjših steričnih ovir in večje podobnosti s tetraedričnim prehodnim stanjem, ki nastane pri sintezi dipeptida D-Ala-D-Ala, katalizirani z encimom Ddl. 5.1 Komentar sinteznih postopkov Sinteza fosfatnih analogov z uporabo difenilfosforilklorida Pri sintezi smo izhajali iz različnih derivatov benzensulfonilkloridov. Najprej smo izvedli nukleofilno substitucijo (S N 2) sulfonil klorida z alilaminom. b tem klor z negativnim induktivnim efektom privlači elektrone, žveplov atom je posledično bolj elektrofilen, sledi nukleofilni napad primarnega amina, kar vodi v nastanek sulfonamida. Nastali sulfonamid smo spirali v etilacetatu s citronsko kislino, s katero smo iz organske v vodno fazo spravili prebitek alilamina. V naslednji stopnji na dvojni vezi tvorimo epoksid z uporabo m-cpba. Ta reakcija poteka kot sin elektofilna adicija. Reakcijo smo izvajali v brezvodnem diklorometanu in s prebitkom 1,25 ekvivalenta m-cpba. Po končani reakciji smo organsko fazo spirali z vodno raztopino Na 2 S 3 ter s tem prebitno množino m-cpba pretvorili v reducirano obliko (m- CBA). Slika 17: Mehanizem epoksidacije s peroksi kislino (36). V naslednji stopnji sledi odpiranje epoksida. Reakcija poteka po mehanizmu nukleofilne substitucije (S N 2). Nukleofilni dušik napade sterično manj oviran ogljikov atom epoksidnega obroča. Reakcija poteka v aprotičnem topilu, kjer ne more priti do tvorbe karbokationa. V našem primeru smo kot topilo uporabljali brezvodni dioksan. 61
74 DIPLMSKA NALGA R' C C H - H R' C C N R 1 H H + R' C C N H R 1 H H H H R 2 H H R 2 NH R 1 R 2 Slika 18: Mehanizem odpiranja epoksidnega obroča s sekundarnim aminom (37). Reakcije odpiranja epoksidov smo izvedli v mikrovalovnem reaktorju pri povišani temperaturi in tlaku ter ob uporabi Ca(Tf) 2 kot katalizatorja (38). Spojine, ki smo jih dobili v tej stopnji smo morali čistiti s flash kolonsko kromatografijo bodisi v MF-1 bodisi v MF-6. V naslednji stopnji smo na hidroksilno skupino skušali uvesti različne derivate fosforilkloridov. Tudi v tem primeru gre za S N 2 nukleofilno substitucijo (39). Kot najboljša metoda se je izkazala uporaba difenilfosforilklorida. Pri reakciji smo uporabili še DMAP kot katalizator in kot bazo za nevtralizacijo sproščene kisline. Produkt te reakcije smo čistili s flash kolonsko kromatografijo v MF-1. V zadnji stopnji pa smo odstranili zaščito v obliki fenilnih estrov na fosfatni skupini. Pri tem smo izvedli katalitsko hidrogeniranje z uporabo Pt 2 kot katalizatorja, ki smo ga dodali v količini, ki je bila za polovico manjša glede na količino izhodne spojine. Reakcijo smo izvajali pri nadtlaku vodika v THF-u pri sobni temperaturi. V reakcijsko zmes smo kasneje dodali še ionskoizmenjevalno smolo v topilu t-buh/h 2 v razmerju 5/1, da bi pripravili natrijevo sol na fosfatu. Po dveh tednih reakcija ni potekla, produkta nismo uspeli izolirati. Reakcijo smo potem ponovili še v topilu t-buh/h 2 = 5/1 v hidrogenatorju pod nadtlakom vodika 25 barov. Po treh dneh je v reakcijski zmesi še vedno ostajala izhodna spojina. Reakcijski zmesi smo dodali enako količino ledoceta ter jo izvajali v bučki z nadtlakom vodika v balonu. Po desetih dneh smo topilo uparili ter uspeli izolirati monofenilni ester fosforjeve kisline. Kasneje smo še enkrat ponovili reakcijo, kjer smo kot topilo uporabljali samo ledocet. Po desetih dneh smo reakcijo ustavili in s pomočjo preparativne tankoplastne kromatografije izolirali tako monofenilni ester kot tudi fosfat z obema prostima hidroksilnima skupinama. Pri odščiti fenilnih skupin pri spojini 12 smo izolirali le monofenilni derivat. V tem primeru smo poskusili še z izvedbo enake reakcije v Parrovem reaktorju. Uporabili smo ledocet kot topilo ter uporabili nadtlak 50 barov. Po petih urah smo imeli v reakcijski zmesi le izhodno spojino. 62
75 DIPLMSKA NALGA Sinteza malonilnih estrov hidroksietilamina Z uporabo metilmalonilklorida smo na hidroksilno skupino uvedli metilmalonilni fragment, ki je znan mimetik difosfatne skupine. Reakcijo smo najprej izvedli v brezvodnem diklorometanu na spojini 4 ter ob uporabi DMAP (katalizator in baza). Produkta nismo uspeli izolirati. Reakcijo smo ponovili v brezvodnem THF, kjer prav tako nismo uspeli izolirati produkta. Nato smo reakcijo izvedli še na spojini 11, kjer smo kot katalizator uporabili prav tako DMAP, dodali pa smo bazo DiPEA. Topilo v tem primeru je bil spet brezvodni diklorometan. Tokrat smo izolirali želen produkt 20. Z enakim postopkom na spojini 4 produkta 19 nismo dobili, saj tudi v masnem spektru ni bilo mogoče najti spojine z ustrezno molekulsko maso Poskus sinteze dietilfosfonatnih derivatov Izhajali smo iz spojin 4 in 11, kjer smo najprej izvedli substitucijo hidroksilne skupine z bromom. V tej stopnji gre za Appelovo reakcijo (slika 18), ki poteka po sledečem mehanizmu: V začetni stopnji pride do nastanka ionskega para (bromotrifenilfosfonijev kation). V naslednjem koraku poteče deprotonacija sekundarnega alkohola, pri tem nastane bromoform ter alkoksidni ionski par. V nadaljevanju pride do nukleofilne premestitve broma z alkoksidom, kar vodi v nastanek intermediata 5. Bromidni ion nato po S N 2 mehanizmu oblikuje ustrezen alkilbromid (6) in trifenilfosfinoksid (7). 63
76 DIPLMSKA NALGA H PPh 3 CBr 4 R 1 Br R 1 R 2 R 2 H R 1 R 2 P CBr 4 P Br Br Br Br P Br R 1 R 2 3 H 1 2 Br Br Br 4 Br Br R 1 P + P R 1 R 2 R Slika 19: Mehanizem Appelove reakcije pri sintezi alkilbromidov (40). 5 Produkt smo očistili s pomočjo cirkularne kromatografije in uporabo MF-2. Nato smo skušali izvesti substitucijo broma z dietilfosfonatno skupino. Reakcijo smo izvajali z refluktiranjem 24 ur pri temperaturi 160 C. V reakcijski zmesi smo imeli poleg izhodne spojine še trietilfosfit. Produkta nismo uspeli izolirati. Nato smo reakcijo ponovili z dodatkom topila DMF. Tudi v tem primeru produkta nismo izolirali. Nato smo reakcijo izvedli še enkrat in pri tem kot topilo uporabili sam reagent trietilfosfit (5 ml), vendar želenega produkta nismo dobili. 64
77 DIPLMSKA NALGA Poskus sinteze spojine 6 z uporabo PCl 3 Izhajali smo iz spojine 4, ki smo jo raztopili v brezvodnem diklorometanu, dodali smo PCl 3 ter piridin kot bazo. V naslednji stopnji smo izvedli še substitucijo obeh klorov s hidroksilnima skupinama z dodatkom enega ekvivalenta vode. Po dveh urah smo reakcijo ustavili in odfiltrirali piridinijevo sol. Preostanek topila smo uparili. Produkt smo čistili v mobilni fazi etilacetat/metanol = 1/2. Izoliran produkt je imel ustrezen NMR spekter. Masni spekter pa je pokazal, da je večina produkta, nastalega med reakcijo v obliki dimera (slika 20). Nastanku takega produkta bi se lahko izognili, da bi postopek spremenili tako, da bi izhodno spojino 4 postopno dodajali v reakcijsko zmes, kjer bi bil PCl 3 že prisoten. Slika 20: dimerna oblika spojine 6. 65
78 DIPLMSKA NALGA 5.2 Rezultati testiranja spojin na različnih encimih Sintetiziranim končnim spojinam smo določili inhibitorno aktivnost na Ddl in zaradi podobnega mehanizma encimske reakcije tudi na encimih MurC in MurD. Dobljeni rezultati so podani kot rezidualna aktivnost (RA) encima v prisotnosti inhibitorja. Rezidualna aktivnost je definirana kot razmerje med katalitično aktivnostjo encima v prisotnosti inhibitorja in brez njega. Močnejši je inhibitor encima, nižja je rezidualna aktivnost in obratno. Tabela 4: Rezultati biološkega testiranja spojin. ZNAKA SPJINE STRUKTURA C RA (%) (μm) Ddl MurC MurD 5 NH P S N F H P H 6 S NH N F H NH S 11 N
79 DIPLMSKA NALGA 12 S NH P N H P NH 13 S N Br NH N S F H N N S S N H N N 2 H 67
80 DIPLMSKA NALGA Iz rezultatov testiranja na encimih Ddl, MurC, MurD in MurE je razvidno, da je daleč najbolj zanimiva spojina 6, kjer imamo prosto fosfatno skupino. Nekoliko znižana RA je tudi v primeru spojine 12, kjer je fosfatna skupina zaščitena z dvema fenilnima skupinama. Spojina 7 zelo rahlo zniža rezidualno aktivnost encima, kar kaže na to, da mora biti za inhibitorno aktivnost spojine fosfatna skupina popolnoma prosta. Šibko inhibitorno aktivnost (RA = 80 %) je pokazala spojina 20, ki vsebuje malonilni fragment kot mimetik difosfatne skupine. Spojina 15 (bromo derivat) ter spojine s hidroksietilaminskim fragmentom (11, 24, 28) niso kazale nobene aktivnosti. Na podlagi tega sklepamo, da je fosfatna skupina ključna za inhibicijo testiranih encimov. Elektronakceptorske oziroma elektrondonorske skupine na benzensulfonamidu ne vplivajo na inhibitorno aktivnost spojin na navedenih encimih. Za spojino 6 smo na MurC določili še IC 50, ki znaša 795 µm, kar je slabše od pričakovanja. Razlog za to je verjetno v tem, da prihaja do hidrolize fosfatne skupine v vodni raztopini. Zaradi omenjenega razloga pride pri testiranju tudi do visokega ozadja spojine, kar zmanjša zanesljivost rezultatov. Na Univerzi v Warwicku v Angliji je bila določena tudi IC 50 vrednost na DdlB (136 µm) in VanA (290 µm). S tem smo potrdili našo hipotezo, da hidroksietilaminski mimetiki s fosfatno skupino bolje oponašajo prehodno stanje. Spojina 6 je tako dobra tarčna molekula za nadaljnjo optimizacijo njene strukture in razvoj še močnejših inhibitorjev zgoraj omenjenih encimov. Tabela 5: Rezultati biološkega testiranja spojine 6 na FFA. spojina 6 c (µm) RA % Ddl MurC MurD MurE (IC 50 = 795 µm) 38 4 Tabela 6: Rezultati biološkega testiranja spojine 6 na Univerzi v Warwicku. % inhibicije na DdlB 77 (IC 50 = 136 µm) % inhibicije na VanA 75 (IC 50 = 290 µm) 68
81 DIPLMSKA NALGA S pomočjo programa FlexX je bilo izvedeno tudi sidranje spojine 6 v aktivno mesto encimov MurC in MurD, da bi videli, kako naj bi se spojina vezala v aktivno mesto obeh encimov in kakšne so razlike v vezavi med encimoma. Pri MurC se fosfatni del spojine 6 sidra v tisti del encima, kjer se nahaja terminalni del UMA (L-Ala), kjer pride tudi do tvorbe tetraedričnega intermediata. Pri MurD pa se fosfatni del sidra v tisti del encima, kamor se veže difosfat iz UMAG-a. UMA predstavlja produkt katalitične reakcije MurC, ki nastane z vezavo L-Ala na UDP-N-acetilmuraminsko kislino. UMAG pa je produkt katalitične reakcije MurD, ki nastane z vezavo D-glutamata na UMA. Slika 21: Sidrana spojina 6 v aktivnem mestu MurC. Z rumeno je označena UMA, z modro R in z roza S konfiguracija te spojine. Slika 22: Sidrana spojina 6 v aktivnem mestu MurD. Z rumeno je označena UMAG, z modro R in z roza S konfiguracija te spojine. 69
TRAJNOSTNI PAPIR IN KARTON PP1
TRAJNOSTNI PAPIR IN KARTON PP1 Trajnostni papir in karton PP1 je sestavljen iz beljenih celuloznih sulfatnih listavcev in iglavcev, je nevtralno klejen, z dodatkom kalcijevega karbonatnega polnila in brez
More informationQbiss_One BIM tool!! for Archicad 16!! Instructions (how to use)! EN
Qbiss_One BIM tool!! for Archicad 16!! Instructions (how to use)! EN Instructions Qbiss_One BIM tool is a list of elements working inside the Curtain Wall tool in Archicad. With this tool, two schedule
More informationantibakterijski program higiena čistoča zdravje ljudi Antibacterial program Hygiene Cleanliness Health
antibakterijski Antibacterial higiena čistoča zdravje ljudi Hygiene Cleanliness Health ANTIBACTERIAL PROGRAM Antibacterial switches and sockets are daily touched by many people, so this is a common place
More informationPrimerjalna študija fizikalno mehanskih lastnosti tkanin v vezavah keper in atlas Izvirni znanstveni članek
Primerjalna študija fizikalno mehanskih lastnosti tkanin v vezavah keper in atlas 33 Comparative Analysis of Physical and Mechanical Properties of Fabrics Woven in Twill and Sateen Weaves January 2010
More informationvas vabi na dogodek ki bo 5. in 6. septembra 2018 v prostorih rektorata Univerze v Mariboru Slomškov trg 15, 2000 Maribor, Slovenija.
Služba za prenos znanja in tehnologij vas vabi na dogodek»dnevi internacionalizacije in razvoja mednarodnih projektov«ki bo 5. in 6. septembra 2018 v prostorih rektorata Univerze v Mariboru Slomškov trg
More informationTHZ IMAGING SYSTEM FOR HIDDEN OBJECTS DETECTIONS. THZ vizijski sistem za odkrivanje skritih predmetov
UDK621.3:(53+54+621+66), ISSN0352-9045 Informacije MIDEM 41(2011)2, Ljubljana THZ IMAGING SYSTEM FOR HIDDEN OBJECTS DETECTIONS Andrej Švigelj, Janez Trontelj University of Ljubljana, Faculty of electrical
More informationEvaluation of piezoresistive ceramic pressure sensors using noise measurements
Original paper Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials Vol. 42, No. 2 (2012), 109 114 Evaluation of piezoresistive ceramic pressure sensors using noise measurements Vlasta Sedlakova
More informationOn the number of non-overlapping channels in the IEEE WLANs operating in the 2.4 GHz band
ELEKTROTEHNIŠKI VESTNIK 81(3): 148 152, 214 REVIEW SCIENTIFIC PAPER On the number of non-overlapping channels in the IEEE 82.11 WLANs operating in the 2.4 GHz band Peter Miklavčič Faculty of Electrical
More informationPomanjkljivosti klasične metode navijanja predilniških navitkov Izvirni znanstveni članek
Pomanjkljivosti klasične metode navijanja predilniških navitkov 79 1 2 1 2 Imperfection of the classical winding method of the bobbins February 2009 April 2009 Abstract The classical method of winding
More informationSynthesis of Novel Peptide Linkers: Simultaneous Cyclization and Labeling
UPPRTING INFRMATIN ynthesis of Novel Peptide Linkers: imultaneous Cyclization and Labeling Gajanan K. Dewkar, Pedro B. Carneiro, Matthew C. T. Hartman* Department of Chemistry and Massey Cancer Center,
More informationFast MOS transistor mismatch optimization a comparison between. different approaches
Fast MOS transistor mismatch optimization a comparison between different approaches Gregor Cijan 1, Tadej Tuma 2, Sašo Tomažič 3, Árpád Bűrmen 4 1 Regional Development Agency of Northern Primorska, Mednarodni
More informationSynthesis and spectroscopic properties of β meso directly linked porphyrin corrole hybrid compounds
Supporting Information for Synthesis and spectroscopic properties of β meso directly linked porphyrin corrole hybrid compounds Baris Temelli * and Hilal Kalkan Address: Hacettepe University, Department
More informationSupporting Information
Highly diastereoselective cyclopropanation of -methylstyrene catalyzed by a C 2 -symmetrical chiral iron porphyrin complex Daniela Intrieri, Stéphane Le Gac, Alessandro Caselli, Eric Rose, Bernard Boitrel,
More informationstructurally reduced cadpr analogue with calciummobilizing
Supporting Information for Synthesis of cyclic N 1 -pentylinosine phosphate, a new structurally reduced cadpr analogue with calciummobilizing activity on PC12 cells Ahmed Mahal,1, Stefano D Errico,1, Nicola
More informationDESIGN GUIDELINES FOR A ROBUST ELECTROMAGNETIC COMPATIBILITY OPERATION OF APLICATION SPECIFIC MICROELECTRONIC SYSTEMS
UDK621.3:(53+54+621+66), ISSN0352-9045 Informacije MIDEM 38(2008)3, Ljubljana DESIGN GUIDELINES FOR A ROBUST ELECTROMAGNETIC COMPATIBILITY OPERATION OF APLICATION SPECIFIC MICROELECTRONIC SYSTEMS Janez
More informationElectronic Supporting Information. General Experimental Details. Jack Li-Yang Chen and Margaret A. Brimble*
Electronic Supporting Information Synthesis of the Bis-spiroacetal C 2 C 40 Moiety of the Antimitotic Agent Spirastrellolide B using a Bis-dithiane Deprotection / Spiroacetalisation Sequence Jack Li-Yang
More informationSupplementary Information
Supplementary Information SYNTHESIS AND EVALUATION OF COUMARIN-RESVERATOL HYBRIDS AS SOYBEAN 15-LIPOXYGENAZE INHIBITORS Samira Rahmani-Nezhad, Leila Khosravani, Mina Saeedi, Kouros Divsalar, Loghman Firoozpour,
More informationSupporting Information
Momiyama, Kanan, Liu page S1 Synthesis of Acyclic!,"-Unsaturated Ketones via Pd(II)-Catalyzed Intermolecular Reaction of Alkynamides and Alkenes Norie Momiyama, Matthew W. Kanan and David R. Liu* Department
More informationNavidezno resnični sistem za interakcijo z molekulskimi strukturami na osnovi Oculus Rift očal in globinskih senzorjev
Univerza v Ljubljani Fakulteta za računalništvo in informatiko Tadej Podlesnik Navidezno resnični sistem za interakcijo z molekulskimi strukturami na osnovi Oculus Rift očal in globinskih senzorjev DIPLOMSKO
More informationA General Strategy for the Preparation of C-Terminal Peptide α-ketoacids by Solid Phase Peptide Synthesis. Lei Ju and Jeffrey W.
A General Strategy for the Preparation of C-Terminal Peptide α-ketoacids by Solid Phase Peptide Synthesis Lei Ju and Jeffrey W. Bode* Roy and Diana Vagelos Laboratories, Department of Chemistry, University
More informationSupporting Information
Supporting Information A Rational Design, Synthesis, Biological Evaluation and Structure-Activity Relationship Study of Novel Inhibitors against Cyanobacterial Fructose-1,6-Bisphosphate Aldolase Xinya
More informationPresenter SNP6000. Register your product and get support at Uporabniški priročnik
Register your product and get support at www.philips.com/welcome Presenter SNP6000 SL Uporabniški priročnik 1 a b c d e 2 3 4 Federal Communication Commission Interference Statement This equipment has
More informationMAGNETIC MICROSYSTEMS FOR POSITION MEASUREMENT. Magnetni mikrosistemi za merjenje absolutne pozicije
UDK621.3:(53+54+621+66), ISSN0352-9045 Informacije 40(2010)1, Ljubljana MAGNETIC MICROSYSTEMS FOR POSITION MEASUREMENT Blaž Šmid University of Ljubljana, Faculty of electrical Engineering, Ljubljana, Slovenia
More informationSupporting Information
Supporting Information A New Generation of Radiofluorinated Pyrimidine-2,4,6-triones as MMP-targeted Radiotracers for Positron Emission Tomography Daniela Schrigten,, Hans-Jörg Breyholz, Stefan Wagner,
More informationUse of electronic initiation systems in mining industry. Uporaba elektronskih inicialnih sistemov v rudarstvu
RMZ Materials and Geoenvironment, Vol. 57, No. 3, pp. 403 414, 2010 403 Use of electronic initiation systems in mining industry Uporaba elektronskih inicialnih sistemov v rudarstvu Jože Kortnik 1, *, Julijan
More informationPreskušanje materialov v PO Odpornostne lastnosti 2
Preskušanje materialov v PO Odpornostne lastnosti 2 Matjaž Pavlič 2 Določanje odpornosti površine proti suhi in vlažni toploti SIST EN 12722:1997 - Pohištvo - Ugotavljanje odpornosti površine proti suhi
More informationZmogljivostna analiza prenosa podatkov po standardu n
Univerza v Ljubljani Fakulteta za računalništvo in informatiko Jernej Oblak Zmogljivostna analiza prenosa podatkov po standardu 802.11n DIPLOMSKO DELO UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM PRVE STOPNJE RAČUNALNIŠTVO
More informationSynthesis of Esters of Substituted 6-Aminohexanoic Acid as Potential Transdermal Penetration Enhancers
Synthesis of Esters of Substituted 6-Aminohexanoic Acid as Potential Transdermal Penetration Enhancers Katerina Brychtova, ldrich Farsa, Jozef Csollei Department of Chemical Drugs, Faculty of Pharmacy,
More informationUM FERI laboratorij za energetiko Jože VORŠIČ Kakovost električne energije
Kakovost električne energije Kakovost oskrbe z električno energijo je temelj za gospodarski razvoj predvsem panog z veliko dodano vrednostjo in velikim deležem znanja. Primer za to so visoko avtomatizirani
More informationPublikacija bo izšla v elektronski obliki in bo objavljena na spletni strani Kmetijskega inštituta Slovenije
Izdal in založil KMETIJSKI INŠTITUT SLOVENIJE Ljubljana, Hacquetova ulica 17 Uredila Andreja ŽABJEK, univ. dipl. inž. zoot. Urednica zbirke Lili MARINČEK, univ. dipl. inž. zoot. Fotografija na naslovnici
More informationDetekcija nasičenja železnega jedra enofaznega transformatorja
Elektrotehniški vestnik 76(4): 99-24, 29 Electrotechnical Review: Ljubljana, Slovenija Detekcija nasičenja železnega jedra enofaznega transformatorja Klemen Deželak, Beno Klopčič 2, Gorazd Štumberger,
More informationSupporting information
Electronic Supplementary Material (ESI) for MedChemComm. This journal is The Royal Society of Chemistry 2015 Supporting information Ionic liquid promoted one-pot synthesis of thiazole-imidazo[2,1-b] [1,3,4]thiadiazole
More informationKatja LOZAR MANFREDA, Vasja VEHOVAR, Zenel BATAGELJ*
Katja LOZAR MANFREDA, Vasja VEHOVAR, Zenel BATAGELJ* IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK VELJAVNOST INTERNETA KOT ANKETNEGA ORODJA Povzetek: Internet se, kljub problemu nepokritja, v anketnem raziskovanju uveljavlja
More informationSISTEM ZA NAVIGACIJO ZNOTRAJ STAVB
Univerza v Ljubljani Fakulteta za elektrotehniko, Fakulteta za računalništvo in informatiko MATEJ KOPLAN SISTEM ZA NAVIGACIJO ZNOTRAJ STAVB Diplomsko delo Mentor: doc. dr. Jože Guna Somentor: izr. prof.
More informationSATELITSKA GEODEZIJA IN NAVIGACIJA DOLOČANJE POLOŽAJA V OMREŽJU MOBILNE TELEFONIJE. Mentor: prof. dr. Bojan Stopar Avtorica: Benja Režonja
Fakulteta za matematiko in fiziko Univerza v Ljubljani SATELITSKA GEODEZIJA IN NAVIGACIJA DOLOČANJE POLOŽAJA V OMREŽJU MOBILNE TELEFONIJE Mentor: prof. dr. Bojan Stopar Avtorica: Benja Režonja Ljubljana,
More informationMobilna omrežja. Zdenek Becvar, Pavel Mach, Ivan Pravda
Mobilna omrežja Zdenek Becvar, Pavel Mach, Ivan Pravda Avtorji: Zdenek Becvar, Pavel Mach, Ivan Pravda Naslov: Mobilna omrežja Prevedel: Žarko Čučej Izdan: České vysoké učení technické v Praze Preveden:
More informationComputer-based estimation of the difficulty of chess tactical problems
University of Ljubljana Faculty of computer and information science Simon Stoiljkovikj Computer-based estimation of the difficulty of chess tactical problems BACHELOR S THESIS UNDERGRADUATE UNIVERSITY
More informationPregled tehnologije za izvedbo 1000 MW HVDC povezave med Slovenijo in Italijo
Pregled tehnologije za izvedbo 1000 MW HVDC povezave med Slovenijo in Italijo Urban Rudež 1, Jurij Klančnik 2, Rafael Mihalič 1 1 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko 2 Elektro-Slovenija,
More informationRast, razvoj in zorenje možganov pri dojenčku
Rast, razvoj in zorenje možganov pri dojenčku avtorica: dr. Tina Bregant, dr. med., spec. pediatrije Uvod Nevroznanost ponuja uvid v delovanje možganov. Z razumevanjem tako kompleksnih procesov, kot se
More informationSAMPLE KYRIE. Dm (Em) Dm (Bm) (Bm) (G) (Em) (Bm) (D) Chri ste. ri e e. son. ri e e lé. Gm7 F (G) Gm7. (Bm) (Em7) (D) (Em7) (D) son. Chri ste.
KYRIE Capo 3: () m () m () m () m () m () () B e e (7) m7 lé () m () m lé son. Ky r e e () son. Chr ste SMPLE Text: raduale Romanum, 1974. Musc: Chant Mass; raduale Romanum, 1974; gutar acc. 1995, OCP.
More informationMacrocyclic Scaffolds Derived from para-aminobenzoic acid. Electronic Supplementary material
Macrocyclic Scaffolds Derived from para-aminobenzoic acid Electronic Supplementary material Fred Campbell a, Jeffrey Plante, a Christopher Carruthers, a Michaele J. Hardie, a Timothy Prior b and Andrew
More informationUNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA DRUŽBENE VEDE. Andraž Petrovčič
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA DRUŽBENE VEDE Andraž Petrovčič Nove komunikacijske tehnologije in preoblikovanje družbenosti v pozni moderni New communication technologies and the transformation of sociality
More informationROTACIJA DELOVNIH MEST
Univerza v Ljubljani Filozofska fakulteta Oddelek za psihologijo ROTACIJA DELOVNIH MEST Seminar pri predmetu Karierni razvoj Avtorica: Maruša Cvek Mentorica: dr. Eva Boštjančič, izredna profesorica za
More informationSupporting Information
Supporting Information Development of Photostable Near-Infrared Cyanine Dyes Animesh Samanta, Marc Vendrell, Rajkumar Das and Young-Tae Chang. List of contents: 1. Synthetic procedures and characterization
More informationImpact of the system parameters on the ferroresonant modes
ELEKTROTEHNIŠKI VESTNIK (1-2): 8-12, 13 ORIGINAL SCIENTIFIC PAPER Impact of the system parameters on the ferroresonant modes Marina Pejić, Amir Tokić University of Tuzla, Faculty of Electrical Engineering,
More informationSPECTROSCOPIC TERAHERTZ IMAGING
University of Ljubljana Faculty of Electrical Engineering Uroš Puc SPECTROSCOPIC TERAHERTZ IMAGING DOCTORAL DISSERTATION Supervisor: Prof. Dr. Anton Jeglič Co-Supervisor: Prof. Dr. Gintaras Valušis Ljubljana,
More informationA Passive Load Identification System for the Switched-Mode Power Supply
ELEKTROTEHNIŠKI VESTNIK 84(4): 189-194, 2017 ORIGINAL SCIENTIFIC PAPER A Passive Load Identification System for the Switched-Mode Power Supply Jan Marjanovič 1, Andrej Trost 2 1 CAEN ELS s.r.l., SS14,
More informationHigh-efficiency DC/DC converter for low-voltage applications
Elektrotehniški vestnik 77(23): 109113, 2010 Electrotechnical Review: Ljubljana, Slovenija Highefficiency DC/DC converter for lowvoltage applications Peter Kosmatin, Marko Petkovšek, Danijel Vončina Univerza
More informationKeywords: Social responsibility, social capital, institutional theory, Non-Governmental Organizations (NGOs), IRDO
DISCOURSES OF SOCIAL RESPONSIBILITY IN SLOVENIA: THE CASE OF IRDO Manca Kodermac, mag. dr. Urša Golob Univerza v Ljubljani Fakulteta za družbene vede Kardeljeva pl. 5, Ljubljana m.kodermac@gmail.com ursa.golob@fdv.uni-lj.si
More informationRaziskovanje prakse; raziskovanje skozi oblikovanje
AR 2016.1 Ljubljana Kaj sproža preobrazbe kreativnih umetniških praks in kaj vodi njihovo delovanje v javnosti? Transformative triggers and public behaviours of creative practices Ključne besede Raziskovanje
More informationLinear Incremental Displacement Measurement System with Microtransformers
Original scientific paper Linear Incremental Displacement Measurement System with Microtransformers Matija Podhraški 1, Janez Trontelj 2 Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials
More informationSupporting Information for. First Practical Cross-Alkylation of Primary Alcohols with a New and Recyclable Impregnated. Iridium on Magnetite Catalyst
Supporting Information for First Practical Cross-Alkylation of Primary Alcohols with a New and Recyclable Impregnated Iridium on Magnetite Catalyst Rafael Cano,Miguel Yus and Diego J. Ramón* Instituto
More informationSupporting Information
Supporting Information rganocatalytic Mitsunobu Reactions Tracy Yuen Sze But and Patrick H. Toy * Department of Chemistry, The University of Hong Kong, Pokfulam Road, Hong Kong, People s Republic of China
More informationFAULT-CURRENT LIMITATION IN SLOVENIAN ELECTRIC- POWER TRANSMISSION SYSTEM
23. posvetovanje "KOMUNALNA ENERGETIKA / POWER ENGINEERING", Maribor, 2014 1 FAULT-CURRENT LIMITATION IN SLOVENIAN ELECTRIC- POWER TRANSMISSION SYSTEM Valentin AŽBE, Rafael MIHALIČ POVZETEK Graditev novih
More informationCaution: For Laboratory Use. A product for research purposes only. YSi (2 5 μm) Copper His-Tag SPA Beads. Product Numbers: RPNQ0096
TECHNICAL DATA SHEET SPA Beads Caution: For Laboratory Use. A product for research purposes only. YSi (2 5 μm) Copper His-Tag SPA Beads Product Numbers: RPNQ0096 WARNING For research use only. Not recommended
More informationLow-Kickback-Noise Preamplifier-Latched Comparators Designed for High-Speed & Accurate ADCs
Original scientific paper Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials Vol. 44, No. 4 (2014), 312 320 Low-Kickback-Noise Preamplifier-Latched Comparators Designed for High-Speed & Accurate
More information0.18 µm CMOS power amplifier architecture comparison for a wideband Doherty configuration
Original scientific paper 0.18 µm CMOS power amplifier architecture comparison for a wideband Doherty configuration Aleksandr Vasjanov, Vaidotas Barzdenas Department of Computer Engineering, Vilnius Gediminas
More informationLetnik 11 / Številka SCC Novice
Letnik 11 / Številka 1 18.02.2007 SCC Novice Radioamaterji, tekmovanja, SCC + Rezultati CQ 160 m 06 + Single operator two radios + Izdajatelj: Slovenia Contest Club Saveljska 50 1113 Ljubljana E naslov
More informationDTU DANCHIP an open access micro/nanofabrication facility bridging academic research and small scale production
DTU DANCHIP an open access micro/nanofabrication facility bridging academic research and small scale production DTU Danchip National Center for Micro- and Nanofabrication DTU Danchip DTU Danchip is Denmark
More informationElectronic Supplementary Information for Macroscopic Motion of Supramolecular Assemblies Actuated by Photoisomerization of Azobenzene Derivatives
Electronic Supplementary Information for Macroscopic Motion of Supramolecular Assemblies Actuated by Photoisomerization of Azobenzene Derivatives Yoshiyuki Kageyama, aruho Tanigake, Yuta Kurokome, Sachiko
More informationRAZISKOVALNA NALOGA. Tematsko področje: BIOLOGIJA. Avtorica: Anja Trupej, 9. razred. Mentorici: mag. Anita Povše, prof. Suzana Pustinek, prof.
OSNOVNA ŠOLA GUSTAVA ŠILIHA VELENJE VODNIKOVA 3, 3320 VELENJE MLADI RAZISKOVALCI ZA RAZVOJ ŠALEŠKE DOLINE RAZISKOVALNA NALOGA BOJ PROTI AKNAM V OBDOBJU PUBERTETE Tematsko področje: BIOLOGIJA Avtorica:
More informationS1 TITAN Alloy LE Calibrations (P/N: )
S1 TITAN 600-800 Alloy LE Calibrations () Low Alloy Si P S Ti V Cr Mn Fe Co Ni Cu Nb Mo W Pb Analysis range, % LLD-2 LLD-0.15 LLD-0.3 LLD - 0.1 0.05-1.8 LLD - 9 0.1-2.0 75-100 LLD - 8 LLD - 5 LLD - 5 LLD-
More informationSupporting Information
Electronic Supplementary Material (ESI) for CrystEngComm. This journal is The Royal Society of Chemistry 2016 Supporting Information Structural and insights into the coordination chemistry and reactivity
More informationComparative Assesment of Ground Plane and Strained based FDSOI MOSFET
Professional paper Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials Vol. 45, No. 1 (2015), 73 79 Comparative Assesment of Ground Plane and Strained based FDSOI MOSFET Avtar Singh 1,Sarosij
More informationThermochromic Solid-State Emission of Dipyridyl Sulfoxide Cu(I) Complexes
Supporting Information Thermochromic Solid-State Emission of Dipyridyl Sulfoxide Cu(I) Complexes Christopher M. Brown, Veronica Carta and Michael O. Wolf* Department of Chemistry, University of British
More informationHigh-Efficiency Negative Charge-Pump Circuit for WLED Backlights. Visoko učinkovito vezje negativne črpalke naboja za WLED osvetljevanje ozadja
Original scientific paper High-Efficiency Negative Charge-Pump Circuit for WLED Backlights Yuwen Bao 1, XiaoLin Wu 2, Xiaohong Xia 1, Yun Gao 1 Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials
More informationDimethoxide-Catalyzed Condensation of Aldehydes with Alkenyl Trichloroacetates
S1 Supporting information: Selective Synthesis of a,b-unsaturated Ketones by Dibutyltin Dimethoxide-Catalyzed Condensation of Aldehydes with Alkenyl Trichloroacetates Akira Yanagisawa, * Riku Goudu, and
More informationInvestigation of a Compact Dual-band Handheld RFID Reader Antenna
Professional paper Investigation of a Compact Dual-band Handheld RFID Reader Antenna Ahmed Toaha Mobashsher Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials Vol. 43, No. 1(2013), 74 80
More informationMultifunctional poly[n-(2-hydroxypropyl)methacrylamide] copolymers via post-polymerization modification and sequential thiol ene chemistry
Electronic Supplementary Information for: Multifunctional poly[n-(2-hydroxypropyl)methacrylamide] copolymers via post-polymerization modification and sequential thiol ene chemistry Nora Francini, Laura
More informationSPLETNO OSNOVAN MEDICINSKI PODATKOVNI SISTEM ZA KLINIČNE POSKUSE
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA ELEKTROTEHNIKO PODIPLOMSKI ŠTUDIJ MAGISTRSKA NALOGA SPLETNO OSNOVAN MEDICINSKI PODATKOVNI SISTEM ZA KLINIČNE POSKUSE Ivan Pavlović mentor: prof. dr. Damijan Miklavčič
More informationwrite-nanocircuits Direct-write Jaebum Joo and Joseph M. Jacobson Molecular Machines, Media Lab Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA
Fab-in in-a-box: Direct-write write-nanocircuits Jaebum Joo and Joseph M. Jacobson Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA April 17, 2008 Avogadro Scale Computing / 1 Avogadro number s? Intel
More informationPoker program Rembrant
ELEKTROTEHNIŠKI VESTNIK 79(1-2): 13 18, 2012 EXISTING SEPARATE ENGLISH EDITION Poker program Rembrant Gregor Vohl, Borko Bošković, Janez Brest Univerza v Mariboru, Fakulteta za elektrotehniko, računalništvo
More informationCENOVNO UGODNA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE VEČPREDSTAVNOSTNIH VSEBIN
UNIVERZA NA PRIMORSKEM Fakulteta za matematiko, naravoslovje in informacijske tehnologije, Koper Računalništvo 1. stopnja ALEKSANDAR TOŠIĆ CENOVNO UGODNA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE VEČPREDSTAVNOSTNIH VSEBIN
More informationUNIVERZA V LJUBLJANI EKONOMSKA FAKULTETA MAGISTRSKO DELO SEGMENTACIJA GOSTUJOČIH MOBILNIH UPORABNIKOV V OMREŽJU SI.
UNIVERZA V LJUBLJANI EKONOMSKA FAKULTETA MAGISTRSKO DELO SEGMENTACIJA GOSTUJOČIH MOBILNIH UPORABNIKOV V OMREŽJU SI.MOBIL - VODAFONA LJUBLJANA, APRIL 2007 RASTO ðukić IZJAVA: Študent Rasto ðukić izjavljam,
More informationAnaliza uporabe tehnologij RFID za sledenje inventarja
Univerza v Ljubljani Fakulteta za elektrotehniko Jaka Tonkli Analiza uporabe tehnologij RFID za sledenje inventarja Diplomsko delo Mentor: prof. dr. Andrej Kos Ljubljana, 2015 Zahvala Zahvaljujem se dr.
More informationDržavni izpitni center. Osnovna raven. Izpitna pola 1. A) Bralno razumevanje B) Poznavanje in raba jezika. Sobota, 1. junij 2013 / 60 minut ( )
Š i f r a k a n d i d a t a : Državni izpitni center *M13124111* Osnovna raven SPOMLADANSKI IZPITNI ROK Izpitna pola 1 A) Bralno razumevanje B) Poznavanje in raba jezika Sobota, 1. junij 2013 / 60 minut
More informationVODENJE Z UPORABO MERITEV MOŽGANSKIH VALOV
UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA STROJNIŠTVO Aljaž KRAMBERGER VODENJE Z UPORABO MERITEV MOŽGANSKIH VALOV študijskega programa 2. stopnje Mehatronika Maribor, september 2013 VODENJE Z UPORABO MERITEV MOŽGANSKIH
More informationSupporting Information. 8. Real-time qpcr using a Ds-containing primer and fluorophor-dpxtps (Figures S1-S3).
Electronic Supplementary Material (ESI) for rganic & Biomolecular Chemistry Supporting Information 1. Chemical syntheses of Cy3- and Cy5-dPxTPs. 2. 1 MR spectrum of Cy3-dPxTP. 3. 31 P MR spectrum of Cy3-dPxTP.
More informationSistem za brezžičen zajem podatkov z zmožnostjo nadzora preko spleta
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA RAČUNALNIŠTVO IN INFORMATIKO Luka Šepetavc Sistem za brezžičen zajem podatkov z zmožnostjo nadzora preko spleta DIPLOMSKO DELO NA UNIVERZITETNEM ŠTUDIJU Mentor: prof.
More informationSISTEM ZA RAČUNALNIŠKO KRMILJENJE STRUŽNICE
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA RAČUNALNIŠTVO IN INFORMATIKO Blaž Hostnik SISTEM ZA RAČUNALNIŠKO KRMILJENJE STRUŽNICE Diplomska naloga na univerzitetnem študiju Mentor: prof. dr. Dušan Kodek Ljubljana,
More informationNanomaterials 2016, 6, 54
S of S26 Supplementary Materials: Reduction of Nitroarenes into Aryl Amines and N-Aryl hydroxylamines via Activation of NaBH4 and Ammonia-Borane Complexes by Ag/TiO2 Catalyst Dimitrios Andreou, Domna Iordanidou,
More informationConvenient photooxidation of alcohols using dye sensitised zinc oxide in combination with silver nitrate and TEMPO
Convenient photooxidation of alcohols using dye sensitised zinc oxide in combination with silver nitrate and TEMP Vineet Jeena and Ross S. Robinson* Department of Chemistry, University of KwaZulu-Natal,
More informationMerilnik magnetnih lastnosti mehkomagnetnih toroidnih jeder
Elektrotehniški vestnik 69(3-4): 186 190, 2002 Electrotechnical Review, Ljubljana, Slovenija Merilnik magnetnih lastnosti mehkomagnetnih toroidnih jeder Marko Petkovšek, Peter Zajec, Danijel Vončina, Janez
More informationNPN SILICON HIGH FREQUENCY TRANSISTOR 2.0 ± ± 0.1
FEATURES SMALL PACKAGE STYLE: NE686 Die in a mm x 1.5 mm package LOW NOISE FIGURE: NF = 1.5 db TYP at GHz HIGH GAIN: S1E = 9 db TYP at GHz HIGH GAIN BANDWIDTH: ft = 13 GHz LOW CURRENT OPERATION DESCRIPTION
More informationCalibration of a reference field coil by means of the NMR magnetometer and induction coils
Elektrotehniški vestnik 68(5): 294 299, 2001 Electrotechnical Review, Ljubljana, Slovenija Calibration of a reference field coil by means of the NMR magnetometer and induction coils Gregor Geršak, Janez
More informationSynthesis and in vivo PET Imaging of Hyaluronan Conjugates of Oligonucleotides
Supporting information to: Synthesis and in vivo PET Imaging of Hyaluronan Conjugates of ligonucleotides Satish Jadhav, a Meeri Käkelä, b Jussi Mäkilä, b,c Max Kiugel, b Heidi Liljenbäck, b,d Jenni Virta,
More informationbvparm2006.cif bvparm2006.cif Printed by Ram Seshadri
Jan 19, 09 9:48 Page 1/26 ACCUMULATED TABLE OF BOND VALENCE PARAMETERS Data_BOND_VALENCE_PARAMETERS_2006 05 02 bvparm2006.cif BVPARM.CIF _audit_conform_dict_name cif_core.dic _audit_conform_dict_version
More informationJoze Bavcon COMMON SNOWDROP (GALANTHUS NIVALIS L.) IN SLOVENIA e es, 9 de c e b e de 0
Joze Bavcon COMMON SNOWDROP (GALANTHUS NIVALIS L.) IN SLOVENIA e es, 9 de c e b e de 0 JOZE BAVCON, FAMED SLOVENIAN GALANTHUS EXPERT TO GUEST SPEAK IN BELLEFIELD HOUSE SPRING 2016 DATE TO BE ANNOUNCED
More informationlmmunoassay Antibody Purification In vitro Diagnostics, etc.
20151110 Ver. 1.0 (EN) AccuNanoBead TM Next Generation Magnetic Bead Applications Nucleic Acid Purification Cell Purification Peptide Preparation lmmunoassay Antibody Purification In vitro Diagnostics,
More informationQuality Factor G/T Direct Measurement Method of 7m - 13m Parabolic Reflector Antenna System With Moon as an RF Source
University of Ljubljana Faculty of Electrical Engineering Darko Šekuljica Quality Factor G/T Direct Measurement Method of 7m - 13m Parabolic Reflector Antenna System With Moon as an RF Source Master s
More informationAnaliza primernosti RF pasov pod 15 GHz za širokopasovno povezavo infrastrukture LTE Različica: 1.0
Analiza primernosti RF pasov pod 15 GHz za širokopasovno povezavo infrastrukture LTE Različica: 1.0 Analysis of the suitability of RF spectrum below 15 GHz for broadband interconnection of the LTE infrastructure
More informationCIDOC CRM. CIDOC: International Committee for Documentation V sklopu ICOM (International Council for Museums)
CIDOC CRM in FRBRoo CIDOC CRM CIDOC: International Committee for Documentation V sklopu ICOM (International Council for Museums) CRM: Conceptual Reference Model (http://cidoc.ics.forth.gr/) ISO 21127:2006
More informationUporaba odprtokodnih sistemov za izdelavo spletnih trgovin
Matej Koren Uporaba odprtokodnih sistemov za izdelavo spletnih trgovin Diplomsko delo Maribor, avgust 2016 Uporaba odprtokodnih sistemov za izdelavo spletnih trgovin Diplomsko delo Študent: Študijski program:
More informationDepartment of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
Electronic Supplementary Material (ESI) for RSC Advances. This journal is The Royal Society of Chemistry 2015 A green one pot three component synthesis of tetrahydrobenzo [b]pyran and 3,4 dihydropyrano[c]chromene
More informationRobustni, visoko občutljivi senzor za THz-območje
Prosojnost [%] ELEKTROTEHNIŠKI VESTNIK 83(4): 149-154, 2016 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Robustni, visoko občutljivi senzor za THz-območje Aleksander Sešek, Janez Trontelj Univerza v Ljubljani, Fakulteta
More informationEffect of MJS Spinning Variables on Yarn Quality Vpliv nastavitve procesnih parametrov MJS curkovnega predilnika na kakovost preje
124 Sukhvir Singh Amity University, Amity School of Fashion Design and Technology, Gurgaon, Haryana - 122413, India Vpliv nastavitve procesnih parametrov MJS curkovnega predilnika na kakovost preje Original
More informationA Novel Dual Ports Antenna for Handheld RFID Reader Applications. Nova dvovhodna antenna za ročne RFID bralnike. 1 Introduction
Original scientific paper A Novel Dual Ports Antenna for Handheld RFID Reader Applications Bo Wang, Yiqi Zhuang and Xiaoming Li Xidian University, Xi an 710071, China Abstract: A compact antenna utilizes
More informationSensors and actuators at NXP: bringing more than Moore to CMOS
Sensors and actuators at NXP: bringing more than Moore to CMOS Joost van Beek Senior Principal Scientist Corporate R&D, NXP Semiconductors Presented at the International Symposium on Advanced Hybrid Nano
More informationDESIGN AND DEVELOPMENT OF COMPACT MICROSTRIP ANTENNAS FOR PORTABLE DEVICE APPLICATIONS
UDK621.3:(53+54+621+66), ISSN0352-9045 Informacije MIDEM 41(2011)2, Ljubljana DESIGN AND DEVELOPMENT OF COMPACT MICROSTRIP ANTENNAS FOR PORTABLE DEVICE APPLICATIONS 1 Ahmed Toaha Mobashsher, 2 Mohammad
More informationSynthesizable 2D Vernier TDC based on gated ring oscillators. Sestavljivi 2D Vernier TDC na osnovi obročnih oscilatorjev.
Original scientific paper Synthesizable 2D Vernier TDC based on gated ring oscillators Marijan Jurgo, Romualdas Navickas Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials Vol. 47, No. 4(2017),
More information