Studii privind bioremedierea solurilor poluate cu petrol folosind microorganisme selecţionate din microflora autohtonă

Transcription

1 UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE AGRICULTURĂ ŞCOALA DOCTORALĂ Ing. Laura Gabriela Fogaraşi (căs. Doboş) Studii privind bioremedierea solurilor poluate cu petrol folosind microorganisme selecţionate din microflora autohtonă REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT Conducător ştiinţific Prof. univ. dr. Carmen PUIA CLUJ-NAPOCA 2011

2 REZUMAT Poluarea mediului înconjurător reprezintă contaminarea cu diverse materiale care interferează cu sănătatea umană, calitatea vieţii sau funcţia naturală a ecosistemelor (organismele vii şi mediul în care trăiesc). Bioremedierea solurilor contaminate cu petrol şi produse petroliere constituie procesul biologic în care hidrocarburile acestora sunt degradate prin intermediul microorganismelor. Microorganismele folosite în acest proces sunt cu preponderenţă cele indigene, dar pot fi folosite şi microorganismele izolate din altă parte şi inoculate pe solurile contaminate. În acest sens s-a observat faptul că numeroase microorganisme au capacitatea de a utiliza hidrocarburile atât în stare gazoasă cât şi în stare lichidă şi solidă din seriile alifatice, aromatice şi asfaltice, pe care le folosesc ca sursă de carbon şi energie (Zarnea, 1994). Acestea degradând hidrocarburile parţial sau complet iar rezultatul rămas în urma activităţii lor microbiene este nepoluant pentru mediu fiind alcătuit din apă, CO 2 şi substanţe netoxice. Microorganismele care participă în procesul de biodegradare a hidrocarburilor sunt: bacteriile, fungii, levurile şi algele. Cele mai importante grupe de microorganisme care participă la biodegradarea hidrocarburilor sunt bacteriile şi fungi. OBIECTIVELE TEZEI Obiectivele propuse pentru realizarea temei de cercetare au fost următoarele: Izolarea pe diferite medii de cultură a principalelor grupe de microorganisme (bacterii şi fungi) din solurile poluate cu petrol. Obţinerea de tulpini pure şi identificarea lor taxonomică. Testarea capacităţii de biodegradare a microorganismelor selectate şi izolate în cultură pură, pe medii cu petrol. Multiplicarea microorganismelor şi crearea de consorţii microbiene în vederea degradării hidrocarburilor petroliere din solurile poluate. Studiul sinergismului microorganismelor implicate în consorţii. Aplicarea şi verificarea consorţiilor microbiene în casa de vegetaţie, pe variante de sol poluate cu petrol. 241

3 MATERIALUL BIOLOGIC Materialul biologic folosit în realizarea experienţelor privind depoluarea biologică a solurilor contaminate cu petrol a fost constituit din microorganismele izolate din probele de sol poluate şi prelevate de pe două situri petroliere aflate în două zone geografice diferite: Ploieşti şi Suplacu de Barcău. Din probele de sol prelevate de pe situl petrolier Ploieşti au fost izolate 21 tulpini bacteriene (CBP) şi nouă tulpini fungice (FP) iar din probele de sol recoltate de pe situl petrolier Suplacu de Barcău au fost izolate 20 tulpini bacteriene (CBS) şi 12 tulpini fungice (FS). Pentru testarea efectului bioremediator al consorţiilor microbiene aplicate pe solul poluat artificial cu diferite concentraţii de petrol s-a folosit ca plantă indicatoare salata (Lactuca sativa var. capitata), soiul Attraktion, deoarece perioada de vegetaţie este scurtă şi este sensibilă la toxicitatea solului (Banks and Schultz, 2005; Hubálek et al., 2007). METODELE DE CERCETARE ÎN LABORATOR Metodele de cercetare folosite în experienţele din laborator au constat în: izolarea principalelor grupe de microorganisme din probele de sol; obţinerea culturilor pure; testarea capacităţii de biodegradare a microorganismelor (izolate în cultură pură); identificarea microorganismelor care au prezentat capacitate ridicată în biodegradarea hidrocarburilor petroliere; multiplicarea tulpinilor bacteriene şi a tulpinilor fungice; crearea consorţiilor microbiene. Izolarea, cuantificarea şi menţinerea tulpinilor microbiene s-a realizat în plăci Petri pe mediu nutritiv agarizat iar multiplicarea tulpinilor microbiene s-a efectuat în vase Erlenmeyer în mediu nutritiv lichid. Pentru a preveni aglomerarea celulelor microbiene s-a utilizat metoda diluţiilor decimale. 242

4 Pentru izolarea coloniilor bacteriene şi fungice s-a folosit metoda de însămânţare în profunzime. Însămânţarea, în acest caz s-a realizat cu ajutorul unei micropipete înainte de solidificarea mediului de cultură. Pentru testarea capacităţii biodegradative a hidrocarburilor petroliere, tulpinile bacteriene şi fungice izolate au fost cultivate pe mediu mineral la care s-au adăugat concentraţii diferite de ţiţei provenit de la Ploieşti şi Suplacu de Barcău. METODELE DE CERCETARE ÎN CASA DE VEGETAŢIE Efectul bioremediator al consorţiilor microbiene Pentru testarea capacităţii biodegradative a consorţiilor microbiene au fost înfiinţate trei experienţe amplasate în casa de vegetaţie a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca. Prima experienţă urmăreşte efectul bioremediator al celor trei tipuri de consorţii microbiene asupra solului poluat cu diferite cantităţi de ţiţei. Experienţa cuprinde variante de sol poluate cu diferite concentraţii de ţiţei, la care s-au adăugat consorţiile microbiene obţinute în laborator. În cadrul experienţei fiecare variantă luată în studiu a fost reprezentată de un vas de vegetaţie cu capacitatea de cinci litri. Variantele din cadrul experienţei au fost repartizate într-un număr de trei repetiţii, cu aşezare randomizată conform schemei din figura Factorii experimentali au fost: factorul A = locaţia ţiţeiului - Ploieşti (P) - Suplacu de Barcău (S) factorul B = cantitatea de ţiţei aplicată pe sol: - 1% ( mg/kg) - 3% ( mg/kg) - 5% ( mg/kg) factorul C = consorţiul microbian - Ploieşti (CMP) - Suplacu de Barcău (CMS) - combinat (CMC) În cadrul experienţei, la intervale de 60 de zile după aplicarea consorţiilor microbiene, au fost recoltate probe de sol pentru a se determina conţinutul de hidrocarburi petroliere. Prelevarea probelor s-a realizat din mai multe puncte din cadrul 243

5 fiecărui recipient pentru a se obţine un rezultat cât mai exact al conţinutul de ţiţei rămas în sol. Analiza solului privind conţinutul de hidrocarburi petroliere a fost realizată în laboratoarele Institutului de Cercetări pentru Instrumentări Analitice Cluj (ICIA Cluj). Conţinutul de hidrocarburi petroliere a fost determinat prin analiza FTIR. Analiza care are la bază metoda spectrofotometrică prin infraroşu. Eficacitatea bioremedierii pe plante de salată Pentru verificarea eficacităţii bioremedierii, cu ajutorul plantelor de salată, au fost înfiinţate două experienţe: prima experienţă s-a înfiinţat după două luni de bioremediere a solurilor contaminate; a doua experienţă a fost înfiinţată la finalizarea procesului de bioremediere (după patru luni). Înfiinţarea celor două experienţe s-a realizat simultan cu perioada în care au fost efectuate analizele biochimice ale solului cu privire la conţinutul hidrocarburilor petroliere din sol. Principalele obiective urmărite în fiecare experienţă au constat în: influenţa concentraţiilor de ţiţei asupra creşterii şi dezvoltării plantelor de salată; influenţa tipului de ţiţei folosit în experienţă asupra creşterii şi dezvoltării plantelor salată; influenţa consorţiilor microbiene asupra creşterii şi dezvoltării plantelor de salată. Observaţiile fenologice urmărite au fost creşterea şi dezvoltarea plantelor de salată precum şi numărul de frunze formate. Observaţiile şi măsurătorile asupra plantelor de salată s-au efectuat la diferite intervale de timp: la 28 zile, 43 zile şi 57 zile de la semănat. Aceste experienţe cuprind variante de sol poluate cu diferite concentraţii de ţiţei la care s-au adăugat consorţiile microbiene. Din fiecare variantă s-au prelevat câte 0,5 kg sol în trei repetiţii. Probele de sol din cele trei repetiţii au fost omogenizate obţinându-se 244

6 proba medie. Fiecare probă medie a fost repartizată în câte trei vase de vegetaţie cu diametrul de 12 cm în care au fost semănate un număr de 20 seminţe de salată. Vasele de vegetaţie s-au amplasat randomizat conform schemei din figura REZULTATE EXPERIMENTALE OBŢINUTE Degradarea hidrocarburilor petroliere Tulpinile bacteriene CBP 1, CBP 2, CBP 6, CBP 7, CBP 8, CBP 10, CBP 11, CBP 13, CBP 14, CBP 15, CBP 16, CBP 17, CBP 18, CBP 19, CBP 20, CBP 21, CBS 1, CBS 2, CBS 3, CBS 4, CBS 8, CBS 10, CBS 15, CBS 16, CBS 17, CBS 18, CBS 19, CBS 20 au folosit ca sursă de carbon hidrocarburile din ţiţei. Acestea au fost utilizate în vederea creării consorţiilor microbiene alături de fungii izolaţi din probele medii de pe siturile petroliere Ploieşti şi Suplacu de Barcău. În urma procesului de testare a tulpinilor fungice se remarcă faptul că toate tulpinile fungice au avut o foarte bună şi bună dezvoltare pe una dintre mediile minerale cu adaos de ţiţei. Identificarea şi încadrarea taxonomică a tulpinilor bacteriene şi fungice Din proba de sol de pe situl petrolier Ploieşti au fost identificate 16 tulpini bacteriene din genurile Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus (şase tulpini), Burkholderia, Pseudomonas şi speciile Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (trei tulpini), Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia şi nouă tulpini fungice din genurile Aspergillus, Fusarium, Paecylomices, Penicillium (două tulpini), Rhizopus, Scopulariopsis, Trichoderma (două tulpini). Din proba de sol de pe situl petrolier Suplacu de Barcău au fost identificate 12 tulpini bacteriene din genurile Acinetobacter, Bacillus (trei tulpini), Burkholderia şi speciile Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli (două tulpini), Enterobacter clocae (două tulpini) şi 12 tulpini fungice din genurile Aspergillus (cinci tulpini), Acremonium, Crysosporium, Mortierella (două tulpini), Paecylomices, Penicillium (două tulpini) izolate din proba de sol prelevată de pe situl petrolier Suplacu de Barcău. 245

7 Efectul bioremediator al consorţiului microbian Ploieşti În urma analizelor efectuate, la finalizarea experienţei s-a observat o scădere a conţinutului de hidrocarburi la toate variantele experimentale, cele mai evidente rezultate fiind remarcate în cazul solului contaminat cu ţiţei de pe situl petrolier Ploieşti. În cazul solurilor poluate cu 1% ţiţei se observă o reducere a conţinutului de hidrocarburi sub 5000 mg/kg începând cu intervalul 0-60 zile de la aplicarea consorţiului microbian, ceea ce indică, conform anumitor autori (Zisu şi Ianoş, 2008), pretabilitatea reintegrării acestor soluri în circuitul agricol, această cantitate de petrol favorizând creşterea şi dezvoltarea plantelor. La finalizarea experienţei, în cazul variantelor poluate cu petrol de la Ploieşti şi bioremediate, s-a observat intensitatea maximă a activităţii microbiene la varianta poluată cu 5% petrol, cu o reducere a conţinutului de hidrocarburi de 333,33 mg/kg/zi, urmată de varianta contaminată cu 3%, cu 175,83 mg/kg/zi hidrocarburi reduse/zi şi varianta poluată cu 1% la care reducerea hidrocarburilor a fost de 66,67 mg/kg/zi. După finalizarea procesului de bioremediere, în cazul variantelor contaminate cu ţiţei de la Suplacu de Barcău, s-a înregistrat cea mai intensă activitate microbiană la varianta poluată cu 5%, conţinutul de hidrocarburi fiind redus cu 300,00 mg/kg/zi, urmată de varianta contaminată cu 3%, cu 100,00 mg/kg/zi hidrocarburi reduse şi varianta poluată cu 1% la care reducerea hidrocarburilor a fost de 51,66 mg/kg/zi. Aceste aspecte indică necesitatea unei perioade de bioremediere mai lungi decât 120 zile în cazul solurilor poluate cu concentraţii de petrol mai mari de 1%. Efectul bioremediator al consorţiului microbian Suplacu de Barcău Analizând capacitatea biodegradativă a consorţiului microbian Suplacu de Barcău asupra variantelor de sol poluate cu ţiţei provenit de pe situri diferite, se constată o capacitate ridicată de biodegradare în primele 60 de zile pe solul poluat cu ţiţei de la Suplacu de Barcău. În a doua perioadă de bioremediere (120 zile) acest consorţiu microbian a fost mai eficient în biodegradarea hidrocarburile provenite din ţiţeiul de la Ploieşti, ceea ce confirmă datele din literatura de specialitate (Rodica Stănescu şi colab., 2006), adică bioremedierea solurilor poluate se poate realiza atât cu microorganismele indigene cât şi cu microorganismele izolate din altă parte şi inoculate pe sol poluat. 246

8 În cazul variantelor contaminate cu 3%, respectiv 5% petrol chiar dacă activitatea microbiană a fost foarte intensă, conţinutul de hidrocarburi rămas în sol după 120 de zile nu este favorabil creşterii şi dezvoltării plantelor, conform datelor din literatura de specialitate (Zisu şi Ianoş, 2008; Baek et al., 2004). Din acest considerent se recomandă ca procesul de bioremediere să aibe o durată mai mare de 120 zile. Efectul bioremediator al consorţiului microbian combinat În urma datelor obţinute se poate concluziona faptul că solul contaminat cu 1% ţiţei şi remediat biologic atât 60 de zile cât şi 120 de zile poate fi folosit ca şi suport pentru cultivarea plantelor, în timp ce solul poluat cu 3%, respectiv 5% ţiţei şi bioremediat 120 de zile nu este pretabil în circuitul agricol fiind necesar aplicarea unui tratament biologic cu un interval de timp mai mare de 120 zile. Înălţimea plantelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Ploieşti Solul poluat cu o concentraţie de 1% ţiţei şi bioremediat două luni poate fi folosit ca suport pentru cultivarea plantelor de salată precum şi a altor specii legumicole (figura 5.165). La variantele poluate cu 3% ţiţei şi bioremediate, plantele de salată au avut o dezvoltare foarte viguroase, înălţimile medii înregistrând valori mult mai mari în cadrul experienţelor realizate după finalizarea procesului de bioremediere - solul remediat biologic cu ajutorul consorţiilor Ploieşti şi Suplacu de Barcău timp de patru luni (figura 5.166) se poate folosi în circuitul agricol. La sfârşitul perioadei de bioremediere se remarcă creşterea plantelor pe sol contaminat cu 5% ţiţei şi bioremediat timp de patru luni, comparativ cu plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeaşi concentraţie de ţiţei dar bioremediat timp de două luni însă nu se recomandă folosirea solului pentru cultivarea plantelor, deoarece plantele au o dezvoltare slabă. Cele mai bune rezultate s-au înregistrat pe solurile contaminate cu petrol de pe situl petrolier Ploieşti şi bioremediate cu consorţiu microbian format din microorganismele izolate de pe aceleaşi sit petrolier. 247

9 Înălţimea plantelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Suplacu de Barcău Solul poluat cu concentraţia de 1% ţiţei şi remediat biologic două luni cu consorţiu Ploieşti şi consorţiu combinat (figura 5.171) este pretabil pentru cultivarea plantelor de salată sau a altor specii legumicole. Solul poluat cu concentraţia de 3% ţiţei şi bioremediat timp de patru luni cu consorţiu microbian Suplacu de Barcău poate fi folosit pentru cultivarea plantelor de salată. În urma observaţiilor şi măsurătorilor efectuate la sfârşitul perioadei de bioremediere se remarcă o bună dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu 5% şi bioremediat comparativ cu plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeaşi concentraţie de petrol dar bioremediat timp de două luni. Numărul frunzelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Ploieşti Plantele de salată au format un foliaj bogat, numărul mediu de frunze înregistrând valori mult mai mari în cadrul experienţelor realizate după finalizarea procesului de bioremediere comprativ cu variantele bioremediate timp de două luni. În urma observaţiilor şi măsurătorilor efectuate la sfârşitul perioadei de bioremediere se remarcă o bună dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu 5% ţiţei şi bioremediat timp de patru luni comparativ cu plantele care s-au ofilit pe solul contaminat cu aceeaşi concentraţie de petrol dar bioremediat timp de două luni. Numărul frunzelor de salată pe sol poluat cu ţiţei provenit de la Suplacu de Barcău Plantele de salată au format un foliaj dens, verde, frumos; numărul mediu de frunze înregistrând valori mult mai mari în cadrul variantelor bioremediate timp de patru luni faţă de variantele bioremediate timp de două luni. La sfârşitul perioadei de bioremediere se remarcă o bună dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu 5% şi inoculat cu consorţiile microbiene, comparativ cu plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeaşi concentraţie de petrol dar bioremediat timp de două luni. 248

10 CONCLUZII Au fost izolate un număr de 21 tulpini bacteriene şi 9 tulpini fungice de pe situl petrolier Ploieşti iar de pe situl petrolier Suplacu de Barcău au fost izolate un număr de 20 tulpini bacteriene şi 12 tulpini fungice. Tulpinile bacteriene din genurile Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas şi tulpinile fungice din genurile Aspergillus, Acremonium, Crysosporium, Fusarium, Mortierella, Paecilomyces, Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis, Trichoderma au fost utilizate în vederea creării consorţiilor microbiene. Identificarea bacteriilor izolate s-a efectuat pe baza caracterelor morfologice, aspectelor culturale ale coloniei şi caracterelor biochimice. Identificarea fungilor izolaţi s-a realizat pe baza caracterelor morfologice şi culturale ale fiecărei tulpini fungice. În cazul solurilor poluate cu 1% ţiţei (Ploieşti şi Suplacu de Barcău), s-a observat, o reducere a conţinutului de hidrocarburi la o valoare sub 5000 mg/kg, la 60 de zile de la aplicarea consorţiilor microbiene, ceea ce înseamnă că solurile pot fi folosite ca suport pentru cultivarea plantelor, această cantitate favorizând creşterea şi dezvoltarea lor. În cazul solului poluat cu 3%, respectiv 5% ţiţei (Ploieşti şi Suplacu de Barcău), s- a constatat, o reducere a conţinutului de hidrocarburi, însă aceste soluri bioremediate nu sunt pretabile în circuitul agricol fiind necesar aplicarea unui tratament biologic cu un interval de timp mai mare de 120 zile. Plantele de salată au fost folosite pentru a se urmări efectul bioremediator al consorţiilor microbiene create asupra solului contaminat cu ţiţei de pe siturile petroliere Ploieşti şi Suplacu de Barcău. În urma observaţiilor şi măsurătorilor efectuate la sfârşitul perioadei de bioremediere s-a observat o bună dezvoltare a plantelor dezvoltate la toate variantele contaminate şi bioremediate comparativ cu plantele dezvoltate la aceleaşi variante însă bioremediate timp de două luni 249

11 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. BAEK K.H., H.S. KIM, H.M. OH, B.D. YOON, J. KIM, I.S. LEE, 2004, Effect of crude oil, oil components and bioremediation on plant growth, Journal of environmental science and health, Part A Toxic/Hazardous Substances & environmental engineering vol. A39 (9): BANKS M.K., K.E. SCHULTZ, 2005, Comparison of plants for germination toxicity tests in petroleum - contaminated soils, Water, Air and Soil Pollution 167: HUBÁLEK T., SIMONA VOSÁHLOVA, V. MATĚJU, NORA KOVÁČOVÁ, ČENĚK NOVOTNÝ, 2007, Ecotoxicity monitoring of hydrocarbon-contaminated soil during bioremediation: A Case Study, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 52: STĂNESCU RODICA, LILIANA BOBIRICĂ, OANAMARI ORBULEŢ, 2006, Remedierea solurilor contaminate, Ed. Agir, Bucureşti, 235 pag. 5. ZARNEA G., 1994, Tratat de microbiologie generală. Bazele teoretice ale ecologiei microorganismelor. Microorganismele şi mediile lor naturale, Ed. Academiei Române, Bucureşti, ZISU I., GH. IANOŞ, 2008, Aspects regarding the pollution of agricultural lands from banat with petroleum hydrocarbons, Annals of West University of Timisoara, Series Chemistry, 17 (1):