Centrul de Imunogeneticæ øi Virusologie 2. Centrul de Chirurgie Urologicæ, Dializæ øi Transplant Renal, Institutul Clinic Fundeni, Bucureøti, România

Apariflia de novo a anticorpilor anti-hla factor predictiv pentru disfuncflia alogrefei renale la primitorii cu potrivire sau nepotrivire la nivelul alelelor HLA-A, B, DRB Ileana Constantinescu 1, D. Vasile 1, F.D. Nedelcu 1, M.A. Toader 1, M. Magazin 1, M. Zaharia 1, A. Iordache 2, B. Øerbænescu 2, B. Øtefan 2, M. Manu 2, M. Hârza 2, I. Sinescu 2 1 Centrul de Imunogeneticæ øi Virusologie 2 Centrul de Chirurgie Urologicæ, Dializæ øi Transplant Renal, Institutul Clinic Fundeni, Bucureøti, România Abstract Introduction. The finding that HLA antibodies precede kidney allograft rejection by a long period of time was well documented in several studies. Therefore alloantibodies are ideal markers for impending renal graft failure providing enough time for intervention. Recently introduced solid phase techniques, such as ELISA or luminex bead methodology which utilize solubilized or recombinant HLA molecules instead of lymphocytes are able to detect significantly more antibodies in sera of kidney graft recipients than the traditional CDC assay. Serum HLA antibody is the product of all HLA directed plasma cells combined, but antibody productivity may vary from cell to cell and from one individual to another. Patients and Methods. We have selected 253 kidney recipients to be screened for class I and class II aloantibodies in the posttransplantation period. Only kidney transplant recipients who were not presensitized before transplantation were considered for this analysis. HLA antibody positive samples were then identified. The method used for antibody detection and identification was ELISA (GTI Diagnostics). For the detection of IgG antibodies to HLA class I antigens, we have used QUICKSCREEN and for identification, Quik-ID Class I. For the detection of IgG antibodies to HLA class II antigens, we have used B-SCREEN and for identification Quik-ID Class II. Serum TNF alpha, IL 2R and neopterin were also measured using enhanced chemiluminiscene (Immulite). Results. Among the selected HLA A, B, DR matched, nonsensitized patients 13% developed de novo class I anti HLA antibodies post kidney transplantation. Significant high levels of serum TNF alpha, IL 2R and neopterin joined these antibodies after a variable period of time.we found class I anti HLA antibodies in 27 % of the permissible HLA mismatched recipients. Conclusions. In our study both HLA matched and mismatched recipients developed de novo HLA antibodies, which predicted acute rejection episodes and kidney graft failure. It is essential for the histocompatibility and immunogenetics laboratories to develop a comprehensive program for HLA antibody detection and identification posttransplantation in order to prevent kidney alograft losses. Key words: acute rejection, anti-hla antibodies, chronic rejection, cytotoxic antibodies, cytokine, kidney transplantation, neopterin Corespondenflæ: Conf. Dr. Ileana Constantinescu Centrul de Imunogeneticæ øi Virusologie Institutul Clinic Fundeni, Øos. Fundeni Nr. 258, Sector 2 022328 Bucureøti 39

Introducere Recipienflii pre-transplant renal nesensibilizafli pot dezvolta, de novo, anticorpi anti-hla donor specifici (DS), anticorpi anti-hla non-donor specifici(nds) sau anticorpi non-hla donor specifici, consecutiv transplantului renal. Dezvoltarea anticorpilor de novo poate creøte riscul rejecfliei acute øi cronice øi scade supraviefluirea alogrefei [1-4]. Frecvenfla detecfliei anticorpilor anti-hla posttransplant renal este extrem de variabilæ, respectiv între 1.6 øi 60% [5-23]. Aceastæ variabilitate este generatæ de factori multipli, inclusiv tipul de tehnicæ utilizatæ utilizarea unor tehnici mai putin sensitive ca øi CDC (complement-dependent cytotoxicity) cross-match, comparativ cu tehnici mult mai sensibile ca Flow PRA (One Lambda, Canoga Park, CA), regimul de imunosupresie instituit, tipul pacienflilor selectafli (de ex. pacienfli selectafli aleatoriu vs. grupuri selectate de pacienfli cu rejecflie acutæ sau cronicæ) sau momentele variabile de prelevare a probelor. Apariflia recentæ a tehnicilor în faza solidæ (ELISA, Flow Specific Beads, FlowPRA) alæturi de flow-citometrie (FC) în cadrul laboratoarelor de tipizare HLA a amplificat capacitatea de detecflie a anticorpilor anti-hla. Aceste metode pot depista anticorpi anti-hla care se sustrægeau detecfliei prin metoda clasicæ CDC [25]. Pentru a defini cât mai exact anticorpii anti-hla de novo, statusul pre-transplant al unui pacient, în ceea ce priveøte aloanticorpii, trebuie documentat prin cele mai sensibile metode. Un numær semnificativ de studii utilizeazæ teste cross-match FC retrospective care relevæ un risc crescut pentru episoade de rejet acut, disfuncflie primaræ øi/sau scæderea ratei de supraviefluire a grefei la pacienflii care prezentau pre-transplant crossmatch CDC negativ, dar cross-match FC pozitiv. Pentru detecflia anticorpilor IgG anti-hla clasa II, am utilizat B-SCREEN, iar pentru identificare QUICK-ID CLASS II. De asemenea, au fost detectate cantitativ, utilizând chemiluminiscenfla amplificatæ (Immulite), TNFα, Il2R øi Neopterinul. Rezultate În cadrul pacienflilor nesensibilizafli, selectafli în condiflii de match HLA-A, B, DR, 13% au dezvoltat anticorpi de novo anti-hla clasa I post transplant renal. Fig. 1. Valorile serice ale TNF alfa la pacienfli transplantafli Nivele semnificativ crescute ale TNFα, Il2R øi Neopterin au anturat aceøti anticorpi dupæ o perioadæ variabilæ de timp. Pacienfli øi Metode Am selectat 253 de primitori de grefæ renalæ, urmând ca aceøtia sæ fie supuøi unui screening pentru aloanticorpii anti-hla clasa I, respectiv clasa II post transplant renal. Numai primitorii de grefæ renalæ, care nu erau presensibilizafli anterior transplantului renal, au fost selectafli pentru acest studiu. Tehnicile utilizate pentru detecflia øi identificarea anticorpilor anti-hla au fost ELISA (GTI DIAGNOSTICS). Pentru detecflia anticorpilor IgG anti-hla clasa I, am utilizat QUICCKSCREEN, iar pentru identificare, QUICK- ID CLASS I. Fig. 2. Concentrafliile serice ale IL2R la pacienfli transplantafli Fig. 3. Concentrafliile serice ale neopterin-ului la pacienfli transplantafli 40

S-au detectat anticorpi anti-hla clasa I la 27% din primitorii în condiflii de mismatch permisiv HLA. Fig. 4 Anticorpi anti-hla serici la pacienfli cu transplant renal cu mismatch alelic HLA permisiv Influenfla terapiei imunosupresoare Pacienflii în regim de imunosupresie cu Prograf øi MMF (Mycofenolat Mofetil) au avut, în timp, o ratæ semnificativ mai micæ a producfliei de anticorpi anti- HLA, comparativ cu cei sub regim de imunosupresie cu CsA øi MMF. De asemenea, pacienflii în regim de imunosupresie combinat cu Rapamune øi MMF, au avut o ratæ semnificativ crescutæ de dezvoltare a anticorpilor anti-hla. Discuflii Tipul anticorpilor de novo anti-hla (clasa I sau clasa II) øi implicarea lor în rejetul acut sau cronic au fost studiate în cadrul mai multor analize. Anumite studii subliniazæ cæ aceøti aloanticorpi donor-specifici, dezvoltafli post-transplant, sunt asociafli cu rejecflia. Prezenfla acestor anticorpi traduce un status imunosupresiv inadecvat al recipientului. La anumifli pacienfli, anticorpii donor-specifici apar ca urmare a expansiunii clonale limfocitare, direcflionate împotriva unor epitopi publici, prezenfli la nivelul moleculelor HLA alogene ale grefei. Ocazional, dezvoltarea anticorpilor anti-hla NDS (færæ DS) poate fi observatæ, dar semnificaflia acestui fenomen nu este complet înteleasæ. Anumifli autori sugereazæ prezenfla, în astfel de cazuri, a ambelor grupe de anticorpi, atât DS, cât øi NDS, dar, în timp ce anticorpii DS sunt absorbifli øi cuplafli la nivelul alogrefei, anticorpii NDS ræmân liberi în ser [2,17,26,27]. Semnificaflia clinicæ a anticorpilor anti-hla de tip IgM, în conjuncflie cu rejecflia alogrefei, nu este înca claræ. Spre deosebire de studiile inifliale, realizate prin CDC øi FC, care sugerau cæ anticorpii anti-hla IgM nu aduc prejudicii alogrefei renale [28], un studiu recent a relevat faptul cæ un cross-match pozitiv pentru IgM, în momentul transplantærii, poate fi un factor de risc pentru rejetul alogrefei [29]. Un studiu prospectiv, pe receptori de alogrefæ renalæ de la cadavru, realizat prin FC, a demonstrat cæ, 40% din pacienflii cu rejecflie acutæ, aveau anticorpi anti-hla IgG, iar 9% din cei care nu au prezentat rejet de alogrefæ au prezentat anticorpi anti-hla, exclusiv de tip IgM [6]. În ciuda acestor aspecte, majoritatea Centrelor de Imunogeneticæ, respectiv de tipizare HLA, sunt în acord în ceea ce priveøte irelevanfla anticorpilor anti- HLA de tip IgM în pre-transplant, ca factori de risc pentru rejetul acut, øi acest lucru se pare cæ este valabil øi post-transplant. Antigenele A øi B, similare structural cu MHC clasai MICA (MHC clasa I chain -related antigen A) øi MICB, sunt localizate în strânsæ proximitate cu locusul HLA-B øi codificæ glicoproteine de suprafaflæ la nivelul monocitelor, celulelor endoteliale, fibroblastilor, epiteliului intestinal, dar nu øi la nivelul limfocitelor[30]. Expresia acestor antigene MICA, MICB, s-a demonstrat la pacienflii cu alogrefe renale øi pancreatice care prezentau rejet acut øi cronic respectiv necrozæ tubularæ [31]. Incidenfla anticorpilor anti-hla IgG plus prezenfla anticorpilor MICA a fost crescutæ la pacienflii care prezentau rejet de alogrefæ, comparativ cu pacienflii în status stabil (77) vs.42%. Când au fost incluøi în aceastæ analizæ øi pacienfli cu prezenfla anticorpilor anti-hla IgM, 95% dintre cei cu insuficienflæ de alogrefæ renalæ prezentau asociat anticorpi MICA, comparativ cu 58% pacienfli cu prezenfla acestor anticorpi, dar cu grefa funcflionalæ renalæ. S-a propus ca, datoritæ înaltului polimorfism al antigenelor MICA øi MICB, cât øi datoritæ prezenflei acestor antigene la nivelul celulelor endoteliale, ele reprezintæ potenfliale flinte importante pentru rejecflia alogrefei asociat anticorpilor anti-hla. Mai puflin frecvent, episoadele de rejet umoral au survenit la recipienflii færæ anticorpi anti-hla DS în ser. Acest fenomen poate fi rezultatul unei insuficienfle în sensibilitatea tehnicilor de detecflie, care pot eøua în condifliile prezenflei unui nivel scæzut al anticorpilor anti-hla, dar poate fi øi rezultatul acfliunii unor anticorpi non-hla, direcflionafli împotriva celulelor endoteliale, monocitelor sau receptorului pentru angiotensina II. Concluzii În cadrul studiului nostru, atât recipienflii în condiflii de match, cât øi cei în condiflii de mismatch, au dezvol- 41

tat anticorpi anti-hla de novo, predictori al episoadelor de rejet acut øi al insuficienflei grefei renale. Introducerea unor metode mai sensibile øi mai specifice pentru detecflia anticorpilor anti-hla pre-transplant pot realiza diferenflierea între recipienflii cu risc imunologic scazut, respectiv crescut de grefæ renalæ. Monitorizarea secvenflialæ a anticorpilor anti-hla în ser la fiecare 3 luni post-transplant în primul an øi ulterior anual, sunt utile pentru identificarea pacienflilor cu risc crescut de insuficienflæ a alogrefei renale. Controlul ræspunsului imun aloumoral cu regimuri de imunosupresie adecvate joacæ, færæ nici un dubiu, un rol important, în particular în aceasta eræ de strategii de minimizare a imunosupresiei. Astfel de strategii, urmærind sæ minimizeze efectele adverse, pot creøte riscul sensibilizærii post-transplant la recipienflii cu status stabil al alogrefei. Studii prospective viitoare, asociate cu biopsii seriate øi monitorizarea anticorpilor anti-hla, vor specifica mai precis impactul dezvoltærii anticorpilor ant-hla în afectarea respectiv supraviefluirea alogrefei. Este esenflialæ, pentru laboratoarele de histocompatibilitate øi imunogeneticæ, elaborarea unor programe comprehensive pentru detecflia øi identificarea anticorpilor anti-hla post-transplant, pentru a preveni pierderea grefei renale. Bibliografie 1. McKenna RM, Takemoto SK, Terasaki PI: Anti-HLA antibodies after solid organ transplantation. Transplantation 69:319-326, 2000 2. Terasaki PI: Humoral theory of transplantation. Am J Transplant 3: 665 673, 2003 3. Gebel HM, Bray RA, Nickerson P: Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: Contraindication vs. risk. Am J Transplant 3:1488-1500, 2003 4. Moll S, Pascual M: Humoral rejection of organ allografts. Am J Transplant 5: 2611 2618, 2005 5. Martin S, Dyer PA, Mallick NP, Gokal R, Harris R, Johnson RW: Posttransplant antidonor lymphocytotoxic antibody production in relation to graft outcome. Transplantation 44: 50 53, 1987 6. Scornik JC, Salomon DR, Lim PB, Howard RJ, Pfaff WW: Posttransplant antidonor antibodies and graft rejection. Evaluation by two-color flow cytometry. Transplantation 47: 287-290, 1989 7. Suciu-Foca N, Reed E, D Agati VD et al: Soluble HLA antigens, anti-hla antibodies, and antiidiotypic antibodies in the circulation of renal transplant recipients. Transplantation 51:593-601, 1991 8. Halloran PF, Schlaut J, Solez K, Srinivasa NS: The significance of the anti-class I response. II. Clinical and pathologic features of renal transplants with anti-class I-like antibody. Transplantation 53:550 555, 1992 9. Davenport A, Younie ME, Parsons JE, Klouda PT: Development of cytotoxic antibodies following renal allograft transplantation is associated with reduced graft survival due to chronic vascular rejection. Nephrol Dial Transplant 9:1315-1319, 1994 10. Lobo PI, Spencer CE, Stevenson WC, Pruett TL: Evidence demonstrating poor kidney graft survival when acute rejections are associated with IgG donor-specific lymphocytotoxin. Transplantation 59: 357 360, 1995 11. Crespo M, Pascual M, Tolkoff-Rubin N et al: Acute humoral rejection in renal allograft recipients: I. Incidence, serology and clinical characteristics. Transplantation 71: 652 658, 2001 12. Christiaans MH, Overhof-de Roos R, Nieman F, van Hooff JP, van den Berg-Loonen EM: Donor-specific antibodies after transplantation by flow cytometry: Relative change in fluorescence ratio most sensitive risk factor for graft survival. Transplantation 65: 427 433, 1998 13. Muller-Steinhardt M, Fricke L, Kirchner H, Hoyer J, Kluter H: Monitoring of anti-hla class I and II antibodies by flow cytometry in patients after first cadaveric kidney transplantation. Clin Transplant 14: 85 89, 2000 14. Supon P, Constantino D, Hao P et al: Prevalence of donorspecific anti-hla antibodies during episodes of renal allograft rejection. Transplantation 71: 577 580, 2001 15. Piazza A, Poggi E, Borrelli L et al: Impact of donor-specific antibodies on chronic rejection occurrence and graft loss in renal transplantation: Posttransplant analysis using flow cytometric techniques. Transplantation 71: 1106 1112, 2001 16. Pelletier RP, Hennessy PK, Adams PW, VanBuskirk AM, Ferguson RM, Orosz CG: Clinical significance of MHCreactive alloantibodies that develop after kidney or kidneypancreas transplantation. Am J Transplant 2: 134 141, 2002 17. Lee PC, Terasaki PI, Takemoto SK et al: All chronic rejection failures of kidney transplants were preceded by the development of HLA antibodies. Transplantation 74: 1192 1194, 2002 18. Worthington JE, Martin S, Al-Husseini DM, Dyer PA, John- 438 Clinical Journal of the American Society of Nephrology Clin J Am Soc Nephrol 1: 433 440, 2006 son RW: Posttransplantation production of donor HLAspecific antibodies as a predictor of renal transplant outcome. Transplantation 75: 1034 1040, 2003 19. Terasaki PI, Ozawa M: Predicting kidney graft failure by HLA antibodies: A prospective trial. Am J Transplant 4:438 443, 2004 20. Zhang Q, Liang LW, Gjertson DW et al: Development of posttransplant antidonor HLA antibodies is associated with acute humoral rejection and early graft dysfunction. Transplantation 79: 591 598, 2005 21. Hourmant M, Cesbron-Gautier A, Terasaki PI et al: Frequency and clinical implications of development of donor- specific and non-donor-specific HLA antibodies after kidney transplantation. J Am Soc Nephrol 16: 2804 2812, 2005 22. Mizutani K, Terasaki P, Rosen A, Esquenazi V, Miller J, Shih RN, Pei R, Ozawa M, Lee J: Serial ten-year follow-up of HLA and MICA antibody production prior to kidney graft failure. Am J Transplant 5: 2265 2272, 2005 23. Cardarelli F, Pascual M, Tolkoff-Rubin N et al: Prevalence and significance of anti-hla and donorspecific antibodies longterm after renal transplantation. Transpl Int 18: 532 540, 2005 24. Gebel HM, Harris SB, Zibari G, Bray RA: Conundrums with FlowPRA beads. Clin Transplant 16: 24 29, 2002 25. Gebel HM, Bray RA: Sensitization and sensitivity. Transplantation 69: 1370 1374, 2000 26. Martin L, Guignier F, Mousson C, Rageot D, Justrabo E, Rifle G: Detection of donor-specific anti-hla antibodies with flow cytometry in eluates and sera from renal transplant recipients with chronic allograft nephropathy. Transplantation 76: 395 400, 2003 42

27. Adeyi OA, Girnita AL, Howe J et al: Serum analysis after transplant nephrectomy reveals restricted antibody specificity patterns against structurally defined HLA class I mismatches. Transpl Immunol 14: 53 62, 2005 28. Roelen DL, van Bree J, Witvliet MD et al: IgG antibodies against an HLA antigen are associated with activated cytotoxic T cells against this antigen, IgM are not. Transplantation 57: 1388 1392, 1994 29. Matinlauri IH, Kyllonen LE, Eklund BH, Koskimies SA, Salmela KT: Weak humoral posttransplant alloresponse after a well- HLA-matched cadaveric kidney transplantation. Transplantation 78: 198 204, 2004 30. Sumitran-Holgersson S, Wilczek HE, Holgersson J, Soderstrom K: Identification of the nonclassical HLA molecules, mica, as targets for humoral immunity associated with irreversible rejection of kidney allografts. Transplantation 74: 268 277, 2002 31. Hankey KG, Drachenberg CB, Papadimitriou JC et al: MIC expression in renal and pancreatic allografts. Transplantation 73: 304 306, 2002 32. Opelz G: Non-HLA transplantation immunity revealed by lymphocytotoxic antibodies. Lancet 365: 1570 1576, 2005 33. Rodriguez PC, Arroyave IH, Mejia G, Garcia LF: Detection of alloantibodies against non-hla antigens in kidney transplantation by flow cytometry. Clin Transplant 14: 472 478, 2000 34. Ferry BL, Welsh KI, Dunn MJ et al: Anti-cell surface endothelial antibodies in sera from cardiac and kidney transplant recipients: Association with chronic rejection. Transpl Immunol 5:17 24, 1997 35. Perrey C, Brenchley PE, Johnson RW, Martin S: An association between antibodies specific for endothelial cells and renal transplant failure. Transpl Immunol 6: 101 106, 1998 36. Dragun D, Muller DN, Brasen JH et al: Angiotensin II type 1- receptor activating antibodies in renal-allograft rejection. N Engl J Med 352: 558 569, 2005 Rezumat Introducere. Faptul, cæ apariflia anticorpilor anti-hla precede o lungæ perioadæ de timp rejetul alogrefei renale, este bine ducumentat, ca rezultat al mai multor studii. În consecinflæ, aloanticorpii reprezintæ markeri ideali pentru prevenirea insuficienflei grefei renale, furnizând suficient timp pentru intervenflia terapeuticæ. Tehnicile în faza solidæ, recent introduse, cum ar fi ELISA sau metodologia LUMINEX care utilizeazæ molecule HLA solubilizate sau recombinante în locul limfocitelor, sunt capabile sæ detecteze, cu o sensibilitate semnificativ crescutæ, anticorpii anti- HLA în serul primitorilor de alogrefæ renalæ, decât analiza traditionalæ CDC. Anticorpii anti-hla sunt produsul mai multor clone limfocitare, dar intensitatea sintezei anticorpilor variazæ de la celulæ la celulæ øi de la un pacient la altul. Pacienfli øi Metode. Am selectat 253 de primitori de grefæ renalæ, urmând ca aceøtia sæ fie supuøi unui screening pentru aloanticorpii anti-hla clasa I, respectiv clasa II, post-transplant renal. Numai primitorii de grefæ renalæ care nu erau presensibilizafli anterior transplantului renal au fost selectafli pentru acest studiu. Tehnicile utilizate pentru detecflia øi identificarea anticorpilor anti-hla au fost ELISA (GTI DIAGNOSTICS). Pentru detecflia anticorpilor IgG anti- HLA clasa I, am utilizat QUICCKSCREEN, iar pentru identificare, QUICK-ID CLASA I. Pentru detecflia anticorpilor IgG anti-hla clasa II, am utilizat B-SCREEN, iar pentru identificare QUICK-ID CLASA II. De asemenea au fost detectate cantitativ utilizând chemiluminiscenfla amplificatæ (Immulite), TNFá, IL2R øi Neopterinul. Rezultate. În cadrul pacienflilor nesensibilizafli, selectafli în condiflii de match HLA-A, B, DR, 13% au dezvoltat anticorpi de novo anti-hla clasa I post-transplant renal. Nivele semnificativ crescute ale TNFá, IL2R øi Neopterin au anturat aceøti anticorpi dupæ o perioadæ variabilæ de timp. S-au detectat anticorpi anti-hla clasa I la 27% din primitorii în condiflii de mismatch permisiv HLA. Pacienflii în regim de imunosupresie cu Prograf øi MMF (Mycofenolat Mofetil) au avut în timp o ratæ semnificativ mai micæ a producfliei de anticorpi anti-hla comparativ cu cei sub regim de imunosupresie cu CsA øi MMF. De asemenea, pacienflii în regim de imunosupresie combinat Rapamune øi MMF au avut o ratæ semnificativ crescutæ de dezvoltare a anticorpilor anti-hla. Discuflii. Anumite studii relevæ faptul cæ anticorpii donator specifici post transplant renal sunt asociafli cu rejecflia alogrefei. Prezenfla acestor anticorpi reflectæ un recipient imunosupresat inadecvat. La anumifli pacienfli anticorpii donor specifici pot apare post transplant renal consecutiv expansiunii aloreactivitæflii direcflionate împotriva unor epitopi publici care sunt prezenfli la nivelul moleculelor HLA alogene ale grefei. Concluzii. În cadrul studiului nostru atât primitorii în condiflii de match cât øi cei în condiflii de mismatch au dezvoltat anticorpi anti-hla de novo, care au un rol predictiv al episoadelor de rejet acut øi de insuficienflæ a grefei renale. Este esenflial pentru toate laboratoarele de histocompatibilitate øi imunogeneticæ sæ dezvolte un program comprehensiv pentru detecflia øi identificarea anticorpilor anti-hla post-transplant în scopul prevenirii pierderii grefei renale. Cuvinte cheie: anticorpi anti-hla, anticorpi citotoxici, citokine, neopterin, rejet acut, rejet cronic, transplant renal 43