Institute of Biochemistry Romanian Academy Hepatitis B and C viruses- a long road to understanding pathogen-host cell interactions and designing new antiviral strategies Habilitation thesis Norica Beatrice Nichita
Bucharest, 2014 Summary In January 2000 I was defending my PhD thesis at the Institute of Biochemistry of the Romanian Academy (IBRA), after 3 years of stimulating work on the role of N-glycosylation in protein folding, using tyrosinase- the key enzyme of melanogenesis, as a model protein. These studies have been greatly supported by my doctoral mentors, Drs. Stefana Petrescu and Cecilia Motas (also current and former directors of IBRA) and by Prof. Raymond Dwek, the director of the Oxford Glycobiology Institute (OGI) who was very generous to accept me in his prestigious institute at the University of Oxford, for 3 months per year during my PhD, to perform the more sophysticated experimental work. Following my PhD dissertation and the award of the doctoral degree, I have applied for a Royal Society Post-Doctoral fellowship and moved to the University of Oxford in February 2000, to study the impact of iminosugar derivatives on viral morphogenesis. The Human Hepatitis C virus (HCV) was at the core of these investigations, due to its major impact on public health, more than 140 million people being infected with this virus and at high risk to develop liver cancer, while prophylaxis was not available and treatment was expensive, inefficient and led to selection of resistance mutations. This was a great opportunity and challenge at the same time, since I could use my background in N-glycosylation and protein folding to investigate the complex process of viral envelope proteins assembly and learn new techniques and methodologies in a completely different field, that of virology. My arrival in Oxford coincided with the formation of a new research group in OGI, which was just starting a comprehensive screening of antiviral compounds in collaboration with a private USA company, United Therapeutics. These drugs were mainly iminosugar derivatives, most of them acting at the endoplasmic reticulum level, by inhibiting the α-glucosidases involved in the early steps of N-glycan trimming and hence, potentially the folding of the proteins to which they were attached. The small Virus laboratory headed by Dr. Nicole Zitzmann has nowadays become the Antiviral Unit and the major department of OGI. That was the beginning of a fascinating journey that continues today in the Viral Glycoproteins Department at IBRA. On my return to Romania, I have obtained an International Research Development Award from the Wellcome Trust (2001-2003), to advance the work on the role of α- glucosidase inhibitors on the morphogenesis of enveloped
viruses. This grant not only provided financial security for my project, but was also an excellent opportunity to start more independent work and build a team of young researchers around it. At the time, we were using the pestivirus BVDV as a surrogate, in vitro model for HCV, which could not be propagated in tissue culture, and pursued the work on antivirals screening and their mechanism of action. The scientific results obtained during this period and the excellent collaboration with my former laboratory at OGI have encouraged me to apply for a second Welcome Trust grant, to extend the investigation on iminosugars and viral protein folding to Human Hepatitis B virus (HBV). The proposal proved successful and was awarded a Collaborative Research International Grant (2004-2007). This provided the funding for a new tissue culture facility, dedicated for the work with viruses, later becoming the Viral Glycoproteins Department (VGD), which I am still heading today. The group has grown steadily since, both regarding the number of young scientists who joined in, and the international visibility and reputation. HBV and HCV infections remain our major concern and we continue to investigate their life-cycles and complex interaction with the host cell, which will ultimately help identify new antviral targets and design alternative therapeutic strategies. The work described here is a brief description of a 14-year long research journey into the lifecycles of two pathogenic viruses, with its scientific achievements and disappointments, and more importantly, a sincere look into the future.
Sumar In Ianuarie 2000, susṭineam teza de doctorat la Institutul de Biochimie al Academiei Române (IBAR), dupa 3 ani de studii stimulative asupra rolului N-glicozilării în plierea proteinelor, folosind tirozinaza, enzima cheie a procesului de melanogeneză, drept proteină model. Acest proiect şi eu personal, am beneficiat de susṭinerea extraordinară a conducătorilor mei de doctorat, Doamna Dr. Ştefana Petrescu si Doamna Dr. Cecilia Motaş (actualul si fostul director al IBAR) precum şi a Profesorului Raymond Dwek, directorul Institutului de Glicobiologie al Universităṭii din Oxford (OGI). Cu mare generozitate, acesta a acceptat să lucrez in OGI timp de 3 luni în fiecare an, unde am beneficiat de infrastructura şi tehnologiile moderne, inexistente pe atunci în IBAR, pentru efectuarea experimentelor mai dificile. Dupa susṭinerea tezei si acordarea titlului de doctor, am aplicat la Royal Society pentru o bursă post-doctorală la Universitatea Oxford, pe care am caştigat-o şi din februarie 2000 am început să studiez efectul derivaṭilor iminoglucidici asupra asamblării virusurilor anvelopate. Principala ṭintă a acestor studii era Virusul Hepatitei C umane (VHC), datorită numărului foarte mare de pacienṭi infectaṭi cu acest virus (mai mult de 140 milioane), al impactului patologic major, infecṭia evoluând către cancer hepatic. De asemenea, nu există tratament profilactic iar cel curativ este scump, ineficient si rezultă in selecṭia de mutaṭii rezistente la terapie. Acest nou proiect a însemnat o şansă deosebită, dar şi o provocare in acelaşi timp, deoarece mi-a permis să folosesc cunostinṭele accumulate în domeniul glicoproteinelor şi al plierii acestora pentru a investiga procesul complex de asamblare a proteinelor virale de anvelopă şi, de asemenea, să invăṭ tehnici si metodologii dintr-un domeniu complet nou, cel al virusologiei. Sosirea mea în Oxford a coincis cu formarea unui grup nou de cercetare în OGI, care, la acel moment, începea un program sistematic de investigare a unor compuşi cu activitate antivirală, în colaborare cu United Therapeutics, o companie privată din SUA. Aceşti compuşi erau în principal derivaṭi ai iminoglucidelor, cei mai mulṭi acṭionând la nivelul reticulului endoplasmatic, ca inhibitori ai α-glucozidazelor implicate în procesarea timpurie a glicanilor N-legaṭi la proteine, fiind foarte posibil să perturbe plierea corectă a acestora. Micul grup de Virusuri condus de Dr. Nicole Zitzmann, a devenit între timp Unitatea Antivirală şi unul dintre cele mai mari şi importante departamente din cadrul OGI.
Acesta a fost începutul unei incursiuni fascinante în lumea virusurilor, care continua si astăzi în cadrul Departamentului de Glicoproteine Virale al IBAR. Dupa încheierea studiilor post- doctorale, am obṭinut un grant de cercetare International Research Development Award (2001-2003), acordat de Wellcome Trust, pentru a continua tematica legată de rolul inhibitorilor de α- glucozidaze în asamblarea virusurilor cu anvelopă. Acest grant a însemnat nu numai sprijin financiar pentru desfăşurarea proiectului, dar şi un moment oportun pentru a forma un grup nou de cercetare în jurul acestei teme. În acea perioadă, foloseam în studiile experimentale virusul BVDV, ca un model surogat in vitro pentru HCV, care nu se putea propaga in culturi celulare, continuând testele antivirale cu diferiṭi compuşi şi de identificare a mecanismului acestora de acṭiune. Rezultatele obtinute în această perioadă şi colaborarea excelentă cu grupul de virusuri din OGI m-au încurajat să aplic la Wellcome Trust pentru un al doilea grant, propunând extinderea studiilor asupra iminoglucidelor şi a plierii proteinelor virale la Virusul Hepatitei B umane (VHB). Aplicaṭia a fost evaluată favorabil şi a primit finanṭare pentru următorii trei ani, printr-un program de tip Collaborative Research International Grant (2004-2007). Cu aceste fonduri s-a putut echipa un nou laborator de culturi celulare, dedicat exclusiv experimentelor cu virusuri, care mai târziu a devenit Departamentul de Glicoproteine Viral (DVG), pe care il conduc şi astăzi. Grupul s-a dezvoltat în timp, atât prin numărul tinerilor cercetători care i s-au alăturat, cât şi ca vizibilitate si reputaṭie internaṭionale. Studiul VHB si VHC ramâne preocuparea noastră majoră şi astăzi, proiectele noastre actuale investigând interacṭia acestora cu celula gazda în diferite etape ale ciclului viral. Identificarea factorilor celulari implicaṭi în stabilirea infecṭiei virale ar putea conduce la propunerea unor ṭinte noi în terapia antivirală. Această lucrare este o scurtă descriere a studiului asupra celor două virusuri patogene, desfaşurat pe parcursul a 14 ani de cercetare post-doctorală, a rezultatelor ştiinṭifice dar şi a neîmplinirilor, şi, cel mai important, o analiză obiectiva a planurilor de viitor.