EVALUAREA CALITĂŢII PROPOLISULUI DIN TRANSILVANIA ÎN VEDEREA STANDARDIZĂRII

UNIVERSITATEA DE ŞTIINTE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII Ing. Cristina Manuela MIHAI EVALUAREA CALITĂŢII PROPOLISULUI DIN TRANSILVANIA ÎN VEDEREA STANDARDIZĂRII (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT) CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Univ. Dr. Ing. Liviu Alexandru MĂRGHITAŞ CLUJ-NAPOCA 2011

CUPRINS Pag. Pag. teză rezumat Introducere 11 5 Obiective 13 6 PARTEA ÎNTÂI: STUDIU DE LITERATURĂ 14 7 CAPITOLUL I. PROPOLISUL GENERALITĂŢI 15 7 1.1. Importanţa propolisului 15 7 1.2. Compoziţia chimică 17 1.3. Aspecte privind standardizarea 19 CAPITOLUL II. COMPUŞI BIOLOGIC ACTIVI DIN PROPOLIS: POLIFENOLII 24 2.1. Acizii fenolici 27 2.2. Flavonoidele 27 2.3. Metode de determinare ale compuşilor polifenolici 29 2.3.1. Metode spectrofotometrice 30 2.3.2. Metode cromatografice 32 CAPITOLUL III. EFECTELE TERAPEUTICE ALE PROPOLISULUI 34 7 3.1. Capacitatea antioxidantă 35 3.2. Capacitatea antimicrobiană 39 3.3. Alte efecte 40 CAPITOLUL IV. METODE DE DETERMINARE ALE CAPACITĂŢILOR ANTIOXIDANTE ŞI ANTIMICROBIENE ALE PROPOLISULUI 42 4.1. Metode de determinare a capacităţii antioxidante 42 4.1.1. Metode de captare a radicalilor liberi 43 4.1.2. Metoda potenţialului antioxidant total (FRAP) 44 4.2. Metode de determinare a capacităţii antimicrobiene 44 4.2.1. Metoda difuzimetrică 45 4.2.2. Metoda diluţiilor succesive 46 PARTEA A DOUA: CERCETĂRI PROPRII 48 CAPITOLUL V. MATERIAL ŞI METODĂ 49 8 5.1. Materialul biologic 49 8 5.2. Metode experimentale aplicate 52 9 5.2.1. Prepararea extractelor alcoolice din propolis 52 5.2.2. Analize fizico chimice 54 5.2.2.1. Determinarea umidităţii 54 5.2.2.2. Determinarea conţinutului de ceară metoda Soxhlet 55 2

5.2.2.3. Determinarea reziduului sec 56 5.2.5. Analize spectrofotometrice UV-Vis 57 5.2.5.1. Determinarea conţinutului de polifenoli totali 57 5.2.5.2. Determinarea conţinutului de flavonoide totale 58 5.2.5.3. Determinarea capacităţii antioxidante prin metoda DPPH 62 5.2.5.4. Determinarea potenţialului antioxidant total prin metoda FRAP 64 5.2.6. Analize de cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC PDA) 65 5.2.6.1. Prepararea extractelor pentru analiza HPLC PDA 65 5.2.6.2. Analiza cromatografică HPLC PDA 66 5.2.7. Analize microbiologice 72 5.2.7.1. Determinarea activităţii antimicrobiene 72 5.2.7.2. Determinarea concentraţiei minime inhibitorii (MIC) 73 5.3. Analiza statistică 74 CAPITOLUL VI. REZULTATE PRIVIND PARAMETRII FIZICO CHIMICI AI PROPOLISULUI 76 9 6.1. Rezultate privind conţinutul de apă (umiditatea) al probelor de propolis 76 6.2. Rezultate privind conţinutul de ceară al probelor de propolis 78 6.3. Rezultate privind reziduul sec al extractelor alcoolice de propolis 80 6.4. Discuţii 81 6.5. Concluzii preliminare 93 CAPITOLUL VII. REZULTATE PRIVIND CONŢINUTUL DE POLIFENOLI, FLAVONOIDE ŞI CAPACITATEA ANTIOXIDANTĂ DOZATE SPECTROFOTOMETRIC 95 11 7.1. Rezultate privind conţinutul de polifenoli totali din propolis 95 7.2. Rezultate privind conţinutul de flavonoide totale din propolis 97 7.3. Rezultate privind capacitatea antioxidantă a propolisului determinată prin metoda DPPH 102 7.4. Rezultate privind potenţialul antioxidant total al propolisului determinat prin metoda FRAP 104 7.5.Discuţii 106 7.6.Corelaţii dintre analizele fizico-chimice şi spectrofotometrice 136 7.7.Concluzii preliminare 142 CAPITOLUL VIII. REZULTATE PRIVIND COMPUŞII FENOLICI AI PROPOLISULUI 144 16 8.1. Rezultate privind analiza HPLC PDA a compuşilor de referinţă 144 8.2. Rezultate privind analiza HPLC PDA a probelor de propolis 147 3

8.3. Discuţii 162 8.4. Concluzii preliminare 170 CAPITOLUL IX. REZULTATE PRIVIND CAPACITATEA ANTIMICROBIANĂ A PROPOLISULUI 172 17 9.1. Rezultate privind activitatea antimicrobiană 172 9.2. Rezultate privind concentraţia minimă inhibitorie (MIC) 180 9.3. Discuţii 181 9.4. Corelaţii dintre analizele microbiologice şi analizele fizico-chimice şi spectrofotometrice 9.5. Concluzii preliminare 196 CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE 199 20 ELEMENTE DE ORIGINALITATE 201 22 RECOMANDĂRI ŞI PERSPECTIVE 201 22 LISTA LUCRĂRILOR PUBLICATE 202 REFERINŢE BIBLIOGRAFICE 204 23 ANEXE 221 Anexa 1 Lista abrevierilor 221 Anexa 2 Curbele de calibrare şi spectrele UV-Vis ale compuşilor de referinţă privind analiza HPLC PDA 222 Anexa 3 Cromatogramele HPLC PDA a probelor de propolis 226 Anexa 4 Activitatea antimicrobiană fotografii originale 251 Rezumat română 257 Rezumat engleză 24 4

INTRODUCERE În ultima perioadă interesul în ceea ce priveşte alternativa naturală în schimbul a tot ceea ce este obţinut prin sinteză chimică este tot mai mare. Numeroase studii efectuate pe propolis arată că acest produs natural obţinut exclusiv de către albine şi recoltat de către om din stup prezintă numeroase efecte terapeutice dovedite prin studii de cercetare actuale. Printre aceste efecte se numără: capacitatea antioxidantă, capacitatea antimicrobiană, efectul hepatoprotector, activitatea antifungică, efectul de anestezic local, efectul antiinflamator, dar şi altele. Propolisul este probabil cel mai complex produs al stupului, având popularitate încă din cele mai vechi timpuri. Fără a avea o bază ştiinţifică, strămoşii noştri l-au utilizat ca şi remediu pentru tratarea diferitelor afecţiuni. Însăşi albinele utilizează propolisul ca şi produs antimicrobian. Cu atât mai mult în zilele noastre, când se cunoaşte compoziţia chimică a acestuia şi efectele sale terapeutice, putem apela cu încredere la acest produs minunat. Se face adesea referire la antioxidanţi naturali. Propolisul este unul din cele mai bogate produse naturale cu conţinut ridicat de antioxidanţi (flavonoide, acizi fenolici şi esteri ai acestora). Pe lângă aceasta capacitate antioxidantă, acelaşi produs, propolisul, prezintă şi o deosebită capacitate antimicrobiană, susţinută ştiinţific de studii de cercetare de actualitate. Datorită acestor proprietăţi, nu peste mult timp propolisul va ajunge un înlocuitor al antibioticelor, care în zilele noastre par a avea tot mai multe efecte secundare care trebuie evitate. În prezenta teză de doctorat se doreşte să se aducă o contibuţie importantă în ceea ce priveşte studiul propolisului prin analize chimice de actualitate, cu scopul de a se investiga calitatea propolisului din Transilvania. De asemenea se doreşte propunerea parametrilor de calitate ai propolisului care trebuie verificaţi în cazul când acesta este utilizat în scop terapeutic. Calitatea propolisului este determinată de conţinutul în compuşi biologic activi (acizi fenolici şi flavonoide), capacitatea antioxidantă şi capacitatea antimicrobiană, precum şi profilul polifenolic al probelor studiate. Toate analizele prezentate au fost realizate in vitro în condiţii de laborator controlate. Partea experimentală s-a desfăşurat în cadrul Laboratorului de Controlul Calităţii Produselor 5

Apicole (APHIS) al Disciplinei de Apicultură şi Sericicultură, exceptând analizele microbiologice care au fost efectuate în cadrul Laboratorului de Microbiologie (Facultatea de Medicină Veterinară) ambele aparţinând Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca, în perioada octombrie 2008 septembrie 2011. Lucrarea de faţă Evaluarea calităţii propolisului din Transilvania în vederea standardizării este structurată în două părţi majore. În prima parte, intitulată Studiu de literatură (Capitolele I IV) este prezentat stadiul actual al cunoaşterii privind obiectivele propuse, şi anume aspecte legate de compoziţia chimică a propolisului, capacităţile antioxidantă şi antimicrobiană, metode de analiză, precum şi aspecte legate de problema standardizării. În cea de a doua parte Cercetări proprii (Capitolele V X) sunt prezentate materialul biologic utilizat (53 probe de propolis provenind din Transilvania), metodele experimentale aplicate (fizico-chimice, spectrofotometrice, cromatografice şi microbiologice), rezultatele obţinute, precum şi concluziile studiului efectuat. OBIECTIVE Obiectivele urmărite în teza de doctorat sunt următoarele: Cercetări privind compoziţia propolisului din Transilvania, prin determinarea conţinutului total de compuşi biologic activi (acizi fenolici şi flavonoide) prin metode spectofotometrice clasice, dar şi a conţinutului de ceară prin metoda Soxhlet automată; Cercetări privind capacitatea antioxidantă a propolisului din Transilvania (metoda DPPH şi metoda FRAP) evaluată in vitro prin metode spectrofotometrice clasice; Cercetări privind capacitatea antimicrobiană a propolisului din Transilvania prin testarea acestuia pe tulpini bacteriene de referinţă internaţională: Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus cereus ATCC 14579, Listeria monocitogenes ATCC 7644, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 90028; 6

Cercetări privind profilul polifenolic al propolisului din Transilvania prin tehnica de cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC PDA) în vederea identificării şi cuantificării compuşilor polifenolici specifici; Cercetări privind corelaţiile dintre compoziţia chimică şi efectele terapeutice reprezentate de capacităţile antioxidantă şi antimicrobiană a probelor de propolis luate în studiu. Indicarea parametrilor de calitate ai propolisului care trebuie incluşi la propunerea unui standard. CAPITOLUL I. PROPOLISUL GENERALITĂŢI 1.1. IMPORTANŢA PROPOLISULUI Întreaga gamă a produselor apicole (mierea de albine, propolisul, polenul şi lăptişorul de matcă) prezintă interes în cadrul echipelor de cercetare, fiind produse în compoziţia cărora omul nu îşi poate aduce aportul şi prezentând efecte terapeutice recunoscute la nivel mondial. 1.2. COMPOZIŢIA CHIMICĂ Compoziţia chimică a propolisului este foarte variată şi depinde în mare măsură de sursa vegetală disponibilă albinelor în momentul colectării (Marcucci, 1995; Bankova şi colab., 2000; Ahn şi colab., 2007). Interesul multor echipe de cercetare a fost şi este de a elucida pe deplin compoziţia chimică a propolisului. Până în prezent se cunosc peste 300 de compuşi chimici prezenţi în compoziţia propolisului, făcând parte din categoriile: răşini, ceruri, uleiuri esenţiale, minerale şi alte substanţe (Burdock, 1998; Kosalec şi colab., 2003; Cunha şi colab., 2004; Mărghitaş, 2005). CAPITOLUL II. COMPUŞI BIOLOGIC ACTIVI DIN PROPOLIS: POLIFENOLII Polifenolii sunt antioxidanţi importanţi datorită potenţialului redox pronunţat. Activitatea lor antioxidantă este considerată a fi mult mai mare decât a vitaminelor 7

esenţiale, contribuind astfel semnificativ la efectele manifestate de produsele naturale care îi conţin (Tsao şi Deng, 2004). Pe lângă rolul de antioxidanţi, polifenolii (cu precădere flavonoidele) prezintă şi capacitate antimicrobiană (Boyanova şi colab., 2006). Datorită efectelor terapeutice ale polifenolilor, deja demonstrate de studii de specialitate, interesul pentru disponibilitatea acestora este tot mai crescut; sursele naturale fiind cele preferate. CAPITOLUL V. MATERIAL ŞI METODĂ 5.1. MATERIALUL BIOLOGIC Materialul biologic supus studiului de faţă a fost constituit din 53 de probe de propolis provenind din Transilvania (figura 1). Aceste probe au fost obţinute direct de la apicultori în perioada martie 2009 martie 2010. Probele astfel prelevate au fost depozitate în congelator la temperatura de -20 C până în momentul începerii analizelor. Toate probele au fost prelevate prin răzuire cu dalta apicolă conform celor menţionate de către apicultori. Figura 1. Probele de propolis PS1-PS53 (fotografie originală) 8

5.2. METODE EXPERIMENTALE APLICATE Partea experimentală a constat în efectuarea a patru tipuri de analize: analize fizico-chimice, analize spectrofotometrice, analize cromatografice şi analize microbiologice. CAPITOLUL VI. REZULTATE PRIVIND PARAMETRII FIZICO CHIMICI AI PROPOLISULUI Cu ajutorul analizelor fizico-chimice efectuate pe probele de propolis s-a realizat caracterizarea primară a acestora din punct de vedere al umidităţii, conţinutului de ceară, precum şi a reziduului sec. În ceea ce priveşte conţinutul de apă al probelor de propolis (umiditatea) sau pierderea prin încălzire, nivelul acestui parametru a fost înregistrat aproximativ în jurul aceleaşi valori de 2.39±0.44%. Cea mai mică valoare a conţinutului de apă a fost determinată pentru proba PS 45 de 1.46±0.09%, în timp ce pentru proba PS 2 s-a înregistrat cea mai mare valoare de 3.39±0.11%. Distribuţia probelor de propolis conform conţinutului de apă al acestora este prezentată în histograma din figura 2. Din punct de vedere al acestui parametru, probele urmează o distribuţie normală. Figura 2. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform conţinutului de apă 9

Conţinutul de ceară al probelor de propolis studiate a variat între limite foarte largi 13.49±0.50% (PS 46) şi 70.89±1.08% (PS 39), media fiind de 34.20%. În ceea ce priveşte distribuţia probelor de propolis conform conţinutului de ceară aceasta este una normală, dacă se face excepţie de cele trei probe pentru care s-a înregistrat cel mai mare conţinut de ceară (PS 9, PS 30 şi PS 39) (figura 3). Figura 3. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform conţinutului de ceară Conţinutul în reziduu sec al propolisului studiat a prezentat valori cuprinse între 37.11±0.35% (PS 30) şi 98.06±0.35% (PS 19), media fiind de 69.50%. din punct de vedere al acestui parametru fizico-chimice două probe se remarcă cu valori neaşteptat de mari: PS 19 (98.06±0.35%) şi PS 13 (97.82±1.41). Reziduul sec este un parametru fizico-chimic care prezintă interes datorită faptului că acesta conţine principiile active extrase din propolis cu ajutorul solventului de extracţie utilizat. Distribuţia probelor de propolis din punct de vedere al acestui parametru este una normală şi este prezentată în histograma din figura 4. 10

Figura 4. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform conţinutului de reziduu sec CAPITOLUL VII. REZULTATE PRIVIND CONŢINUTUL DE POLIFENOLI, FLAVONOIDE ŞI CAPACITATEA ANTIOXIDANTĂ DOZATE SPECTROFOTOMETRIC Conţinutul de polifenoli totali al celor 53 de probe de propolis studiate urmează o distribuţie normală prezentată în histograma din figura 5. Figura 5. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform conţinutului de polifenoli totali 11

Domeniul valorilor obţinute pentru conţinutul de polifenoli totali din cele 53 de probe de propolis studiate a variat în limite foarte largi 23.25±3.20% (PS 12) şi 63.23±2.44% (PS 41), media lor aflându-se la valoarea 43.01%. Compararea rezultatelor obţinute prin cele două metode de determinare a conţinutului de flavonoide totale din probele de propolis studiate este prezentată în figurile 6 şi 7. Figura 6. Conţinutul de flavonoide totale obţinut prin cele două metode aplicate (probele PS 1 PS 25) 12

Figura 7. Conţinutul de flavonoide totale obţinut prin cele două metode aplicate (probele PS 26 PS 53) Capacitatea antioxidantă evaluată prin intermediul metodei de captare a radicalilor liberi din soluţie (DPPH) s-a încadrat între limitele 0.29±0.10 mmoli Trolox / g propolis 13

(PS 30) şi 1.40±0.10 mmoli Trolox / g propolis (PS 19). Valorile FRAP obţinute pentru potenţialul antioxidant total au fost între 0.57±0.04 mmoli FeSO 4 / g propolis (PS 17) şi 2.55±0.10 mmoli FeSO 4 / g propolis (PS 29) (figurile 8 şi 9). Figura 8. Studiu comparativ dintre cele două metode aplicate privind activitatea antioxidantă (probele PS 1 PS 25) 14

Figura 9. Studiu comparativ dintre cele două metode aplicate privind activitatea antioxidantă (probele PS 26 PS 53) 15

CAPITOLUL VIII. REZULTATE PRIVIND COMPUŞII FENOLICI AI PROPOLISULUI Fiecare probă de proplis a fost supusă analizei HPLC PDA, cromatogramele fiind înregistrate la 280 nm şi 340 nm, lungimi de undă specifice acizilor fenolici şi flavonoidelor. Spectrele UV-Vis corespunzătoare fiecărui semnal au fost înregistrate în domeniul 190-650 nm. Două probe de propolis s-au remarcat datorită identificării a 10 compuşi de referinţă din compoziţia acestora (figurile 10 şi 11). Absorbanta [mau] Absorbance [mau] 1200000 800000 400000 PS 22 Acid siringic/13,613 Acid cafeic/14,963 Vanilina/16,585 Acid p-cumaric/20,214 Acid ferulic/22,019 Acid t-cinamic/32,960 Pinocembrina/42,176 Crisina/43,907 Galangina/44,930 Pinostrobina/47,980 0 10 20 30 40 50 Timp de retentie [min] Retention time [min] Figura 10. Cromatograma HPLC PDA a probei de propolis PS 22 Cele două probe de propolis, ambele provenind din judeţul Mureş (PS 22 şi PS 24), sunt singurele în care s-a identificat prezenţa acidului t-cinamic, acesta fiind cuantificat în concentraţii relativ apropiate de 0.64 şi respectiv 0.71 mg acid t-cinamic / g propolis. Dintre compuşii de referinţă identificaţi în propolis, trei (acidul cafeic, acidul p- cumaric şi acidul ferulic) au fost prezenţi în toate probele studiate. 16

Absorbanta [mau] Absorbance [mau] 1200000 800000 400000 PS 24 Acid siringic/13,656 Acid cafeic/15,023 Vanilina/16,448 Acid p-cumaric/20,286 Acid ferulic/22,076 Acid t-cinamic/33,008 Pinocembrina/41,945 Crisina/43,949 Galangina/44,987 Pinostrobina/48,002 0 10 20 30 40 50 Timp de retentie [min] Retention time [min] Figura 11. Cromatograma HPLC PDA a probei de propolis PS 24 Flavonoidele utilizate la cuantificarea cantităţile totale ale principiilor active din propolis au rezultat a fi adecvat selectate conform analizei HPLC PDA. Pinocembrina, flavanona cu ajutorul căreia s-a cuantificat conţinutul de flavanone/ dihidroflavoli din propolis a fost identificată şi cuantificată în 39 dintre probele studiate, în concentraţie de 0.03 2.85 mg / g propolis, cu o medie de 1.05 mg / g propolis. Dintre flavonoidele identificate în propolis, crisina este flavona cel mai des întâlnită. Domeniul de concentraţie în care aceasta a fost identificată în propolis este 0.07 3.91 mg crisină / g propolis, cu o medie de 1.59 mg / g propolis.în ceea ce priveşte flavonolul galangină, acesta a fost cuantificat în 34 probe propolis în concentraţie de 0.31 3.20 mg / g propolis, cu o medie de 1.39 mg / g propolis. CAPITOLUL IX. REZULTATE PRIVIND CAPACITATEA ANTIMICROBIANĂ A PROPOLISULUI Distribuţia probelor de propolis conform rezultatelor obţinute privind activitatea antimicrobiană asupra celor 5 tipuri de bacterii (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, 17

Listeria monocitogenes, Escherichia coli şi Candida albicans) este prezentată în histogramele din figurile 12 16. În ceea ce priveşte bacteria Gram-negativă Pseudomonas aeruginosa, prezentarea distribuţiei probelor lipseşte datorită rezistenţei pe care aceasta a manifestat-o faţă de extractele de propolis. Figura 12. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform activităţii antimicrobiene asupra bacteriei Staphylococcus aureus Figura 13. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform activităţii antimicrobiene asupra bacteriei Bacillus cereus 18

Figura 14. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform activităţii antimicrobiene asupra bacteriei Listeria monocitogenes Figura 15. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform activităţii antimicrobiene asupra bacteriei Escherichia coli 19

Figura 16. Histograma distribuţiei probelor de propolis conform activităţii antimicrobiene asupra levurii Candida albicans CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE În raport cu obiectivele generale ale tezei privind evaluarea calităţii propolisului din Transilvania în vederea standardizării se desprind următoarele concluzii: 1. S-a determinat compoziţia chimică a propolisului din Transilvania, prin evaluarea conţinutului total de compuşi biologic activi (polifenoli şi flavonoide), al conţinutului de ceară, al conţinutului de apă şi al conţinutului de reziduu sec. 2. S-a determinat capacitatea antioxidantă a propolisului prin utilizarea a două metode spectrofotometrice: metoda captării radicalilor liberi din soluţie (DPPH) şi metoda potenţialului antioxidant total (FRAP). Metodele utilizate confirmă capacitatea antioxidantă a propolisului. 3. S-a determinat capacitatea antimicrobiană a propolisului asupra a şase tulpini de referinţă internaţională: Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus cereus ATCC 14579, Listeria monocitogenes ATCC 7644, Escherichia coli ATCC 20

10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 90028. Toate probele de propolis studiate au prezentat activitate antimicrobiană in vitro asupra bacteriilor Gram-pozitive selectate şi activitate antimicrobiană selectivă asupra tulpinilor Gram-negative. 4. S-a determinat profilul polifenolic al propolisului prin tehnica cromatografică HPLC PDA, acesta fiind reprezentat de următorii compuşi fenolici: acidul siringic, acidul cafeic, vanilina, acidul p-cumaric, acidul ferulic, acidul t-cinamic, pinocembrina, crisina, galangina şi pinostrobina. Prezenţa pinocembrinei, crisinei, galanginei şi a acidului cafeic în profilul polifenolic al propolisului din Transilvania studiat a permis clasificarea acestuia în categoria propolisului de plop. 5. S-au determinat corelaţiile dintre compoziţia chimică a propolisului şi efectele terapeutice studiate ale acestuia. Componenta flavonoidică a propolisului s-a corelat în cea mai mare măsură cu activitatea antioxidantă. Categoria flavonoidelor de tipul flavone/ flavonoli şi flavanone/ dihidroflavonoli sunt responsabile în cea mai mare măsură de capacitatea antimicrobiană evaluată in vitro. Aportul acestor flavonoide la capacitatea antimicrobiană a propolisului s-a stabilit prin coeficienţi de corelaţie de regresie liniară şi coeficienţi de corelaţie Pearson. Conţinutul de polifenoli totali nu poate fi considerat un criteriu major pentru estimarea capacităţilor antioxidante şi antimicrobiene a propolisului datorită corelaţiilor slabe între aceşti parametri. Un conţinut mare de ceară se corelează cu un conţinut scăzut al principiilor active cu rol terapeutic (flavonoide şi acizi fenolici). 6. Parametrii propuşi a fi consideraţi în standardul de calitate al propolisului sunt: a. Conţinutul de apă maxim 10%; b. Conţinutul de reziduu uscat minim 35%; c. Conţinutul de ceară maxim 35%; d. Conţinutul de flavonoide totale minim 10%; e. Conţinutul de polifenoli totali minim 20%; f. Capacitate antioxidantă g. Capacitate antimicrobiană 21

ELEMENTE DE ORIGINALITATE 1. Caracterizarea profilului polifenolic al propolisului din Transilvania prin utilizarea tehnicii cromatografice de analiză (HPLC PDA) şi încadrarea acestuia în tipul propolisului de plop. 2. Evaluarea capacităţii antimicrobiene a propolisului din Transilvania utilizând 6 tulpini de referinţă internaţională. 3. Indicarea parametrilor de calitate ai propolisului (conţinut de apă, conţinut de ceară, conţinut de reziduu sec, flavonoide totale, polifenoli totali, activitate antimicrobiană şi antioxidantă) necesari a fi verificaţi înaintea utilizării acestuia în scopuri terapeutice. RECOMANDĂRI ŞI PERSPECTIVE 1. Extinderea studiului la nivelul întregii ţări şi propunerea unui standard care să solicite parametrii de calitate ai propolisului înaintea utilizării acestuia în industria farmaceutică şi cosmetică. 2. Conţinutul de ceară şi al componenta flavonoidică a propolisului sunt parametrii primari care trebuie verificaţi din punc de vedere cantitativ, fiind direct sau indirect responsabili de efectele manifestate de propolis. 3. Utilizarea propolisului în scop terapeutic doar după verificarea calităţii acestuia. 22

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE 1. Ahn, M. R., S. Kumazawa, Y. Usui, J. Nakamura, M. Matsuka, F. Zhu, T. Nakayama, 2007, Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various areas of China, Food Chemistry, 101, 1383-1392. 2. Bankova Vassya, S. L. De Castro, M. C. Marcucci, 2000, Propolis: recent advances in chemistry and plant origin, Apidologie, 31, 3-15. 3. Boyanova Lyudmila, R. Kolarov, Galina Gergova, I. Mitov, 2006, In vitro activity of Bulgarian propolis against 94 clinical isolates of anaerobic bacteria, Anaerobe, 12, 173-177. 4. Burdock, G. A., 1998, Review of the biological properties and toxicity of bee propolis (propolis), Food and Chemical Toxicology 36, 347-363. 5. Cunha, I. B. S., A. C. H. F. Sawaya, F. M. Caetano, M. T. Shimiziu, M. C. Marcucci, F. T. Drezza, G. S. Povia, P. O. Carvalho, 2004, Factors that Influence the Yield and Composition of Brazilian Propolis Extracts, Journal of Brazilian Chemical Society, 15:6, 1-xxx. 6. Kosalec, I., Marina Bakmaz, S. Pepeljnjak, 2003, Analysis of propolis from the continental and Adriatic regions of Croatia, Acta Pharmaceutica, 53, 275-285. 7. Marcucci, M., 1995, Propolis, chemical composition, biological properties and therapeutic activity, Apidologie 26, 83-99. 8. Mărghitaş, L. Al., 2005, Albinele şi produsele lor, ediţia 2, Ed. Ceres, Bucureşti. 9. Tsao, R., Z. Deng, 2004, Separation procedures for naturally occurring antioxidant phytochemicals. Journal of Chromatography B, 812, 85-99. 23