UNIVERSITATEA DE MEDICINǍ ŞI FARMACIE CRAIOVA ŞCOALA DOCTORALĂ TEZǍ DE DOCTORAT EVALUAREA ACTIVITĂŢII CELULELOR STELATE HEPATICE ÎN PROGRESIA BOLII CRONICE HEPATICE VIRALE C ~ REZUMAT ~ Conducǎtor de doctorat: Prof. Univ. Dr. ROGOVEANU Ion Student-Doctorand: IONESCU Alin Gabriel CRAIOVA 2013 1
CUPRINS LISTA FIGURILOR... 7 1 VIRUSUL HEPATITIC C... 11 2 BOALA CRONICĂ HEPATICĂ VIRALĂ C... 19 2.1 HEPATITA CRONICĂ VIRALĂ C... 19 2.2 CIROZA HEPATICĂ... 25 3 CARCINOMUL HEPATOCELULAR... 32 4 CELULELE STELATE HEPATICE... 38 5 IMPLICAREA CELULELOR STELATE HEPATICE ÎN PATOLOGIA HEPATICĂ... 46 6 PLANUL TEZEI DE DOCTORAT... 60 7 EVALUAREA ACTIVITĂŢII CELULELOR STELATE HEPATICE LA PACIENŢII CU BOALĂ CRONICĂ HEPATICĂ VIRALĂ C... 63 7.1 Material şi metodă... 63 7.2 Rezultate... 83 7.3 Discuţii... 119 7.4 Concluzii... 123 8 EVALUAREA ACTIVITĂŢII CELULELOR STELATE HEPATICE LA PACIENŢII CU CARCINOM HEPATOCELULAR... 124 8.1 Material şi metodă... 124 8.2 Rezultate... 132 8.3 Discuţii... 152 8.4 Concluzii... 162 9 CONCLUZII GENERALE... 163 10 BIBLIOGRAFIE... 166 11 ANEXE... 181 Cuvinte cheie: hepatită cronică virală C, ciroză hepatică virală C, carcinom hepatocelular, celule stelate hepatice 2
STADIUL CUNOAŞTERII Hepatita cronică virală C este o afecţiune cu un impact global major la nivel mondial. Potrivit datelor Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, aproximativ 3% din populaţie este infectată cu virusul hepatitic C [1]. În România, prevalenţa hepatitei cronice virale C este de 3,2% din populaţia adultă [2]. Dintre aceştia, aproximativ 20% evoluează de-a lungul a 10-20 de ani spre ciroză hepatică şi carcinom hepatocelular (CHC). Fibroza hepatică şi ciroza apar ca urmare a agresiunii hepatice generate de virusul hepatitic C. Acumularea excesivă a matrixului extracelular (MEC) este caracteristică bolii cronice hepatice. În ficatul lezat, celulele stelate hepatice (CSH) activate reprezintă principalele celule producătoare de colagen. Ca urmare a leziunii hepatice, CSH inactive se activează şi transdiferenţiază în celule miofibroblast-like proliferative, fibrogenice şi contractile [3,4]. Steatoza hepatică poate genera indirect fibroză hepatică prin amplificarea susceptibilităţii hepatocitelor atât la stresul oxidativ cât şi la agresiunea virală, fiind responsabile de acumularea de MEC prin declanşarea activării CSH [5]. Conform Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, incidenţa CHC este de peste 600.000 de noi cazuri diagnosticate anual, aflându-se în continuă creştere atât în Europa cât şi în Statele Unite ale Americii. Raportat la localizarea tumorii, CHC deţine locul trei la nivel mondial în ceea ce priveşte cauzele de morbiditate şi mortalitate datorate afecţiunilor maligne [6,7]. Ciroza hepatică de etiologie virală reprezintă o cauză importantă de apariţie a CHC. Din totalul pacienţilor infectaţi cu virusul hepatitic C, 20% până la 30% vor evolua spre ciroză hepatică, iar anual 3-5% dintre aceştia vor dezvolta CHC. Putem astfel estima că, în decurs de 10 ani, aproximativ o treime dintre pacienţii cirotici infectaţi cu virusul hepatitic C, vor dezvolta CHC. Procesul de carcinogeneză hepatică este iniţiat de efectul combinat al mai multor factori de creştere sintetizaţi de către CSH activate. Acestea, prin amplificarea activităţii căilor de semnalizare mediate de NF-kB şi de ERK, intervin în progresia CHC pe de o parte prin prin stimularea proliferării celulelor tumorale şi, pe de altă parte, prin inhibarea apoptozei acestora [8]. Studii anterioare efectuate in vitro şi in vivo, au demonstrat că CSH pot fi activate de către celulele CHC şi contribuie, prin intermediul factorilor de creştere, atât în progresia cât şi în intensificarea agresivităţii CHC [9], stimulând dezvoltarea stromei intratumorale şi peritumorale a CHC [10]. 3
EVALUAREA ACTIVITĂŢII CELULELOR STELATE HEPATICE LA PACIENŢII CU BOALĂ CRONICĂ HEPATICĂ VIRALĂ C MATERIAL ŞI METODĂ Studiul prospectiv s-a desfăşurat în cadrul Clinicii Medicală I din Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova, fiind efectuat pe o perioadă de 2 ani (1 ianuarie 2010 31 decembrie 2011), pe un lot de 41 de pacienţi cu vârste cuprinse între 27 şi 64 de ani, având media de vârstă 53,61 +/- 9,86 şi sex ratio F/B=2,15/1. Studiul a urmărit evaluarea numărului de CSH activate din patru zone hepatice specifice (perivenulară, intermediară, periportală şi a septurilor fibroase), la pacienţi cu boală cronică hepatică virală C genotipul 1. Diagnosticul de boală hepatică cronică a fost stabilit atât pe baza evaluării histopatologice realizate în Laboratorul de Tehnici Histologice, Histopatologice şi Imunohistochimice din Centrul de Cercetare în Morfologie Microscopică şi Imunologie al UMF Craiova, cât şi pe baza testelor biochimice şi virusologice, conform criteriilor de includere în tratamentul antiviral. Similar, criteriile de excludere din studiu au fost cele de excludere pentru tratamentul antiviral. Grupul de control a fost reprezentat de şapte probe de ţesut hepatic prelevat de la embrioni cu vârsta între 10 şi 38 de săptămâni. Am ales ca lot martor embrioni deoarece la embrioni majoritatea CSH sunt inactive, iar α-sma imunomarchează un număr redus de celule. Protocol de prelucrare histopatologică a fragmentelor a fost cel utilizat în cadrul laboratorului de Tehnici Histologice, Histopatologice şi Imunohistochimice din Centrul de Cercetare în Morfologie Microscopică şi Imunologie al UMF Craiova [11]. După includere, din blocurile de parafină au fost tăiate, cu ajutorul microtomului, secţiuni fine de 4-5 microni ce au fost ulterior colorate prin tehnicile hematoxilină-eozină, tricromica Masson şi van Gieson. Pentru evaluarea imunohistochimică a numărului de CSH activate din ţesutul obţinut prin biopsie, acesta a fost imunomarcat cu un anticorp anti-sma DAKO, Carpinteria, CA. Ca anticorp primar a fost utilizată clona HHF35, şoarece anti-uman, în diluţie de 1:200, iar ca anticorp secundar IgG cal anti-şoarece, în diluţie de 1:500. Pentru lotul de pacienţi cu hepatită cronică virală C şi ciroză, evaluarea zonelor imunomarcate a fost efectuată printr-o metodă semicantitativă ce a vizat determinarea procentului de celule α-sma imunomarcate din zone specifice ale materialului prelevat prin biopsie hepatică: 1 = zona perivenulară; 2 = zona intermediară; 3 = zona periportală; 4 = zona tracturilor portale şi a septurilor fibroase. Procentual, numărul de celule imunomarcate a fost 4
încadrat astfel: absent = până la 3%; uşor = 3-33%; moderat = 34-66%; sever = mai mare de 66%. Am stadializat steatoza macroveziculară de la 0 la 3, în funcţie de procentul hepatocitelor cu nucleu distorsionat de veziculele lipidice, prezente în materialul biopsic: 0 = < 1% (absent); 1 = 1-33% (uşor); 2 = 34-66% (moderat); 3 = > 66% (sever) [5]. În ambele studii, pentru evidenţierea aspectelor histopatologice şi imunohistochimice, a fost folosit ocularul cu putere de mărire 4x şi obiective corectate optic cu putere de mărire de 10x, 20x, 40x ale microscopului Nikon Eclipse E200. Preluarea imaginilor s-a realizat cu o cameră foto digitală Nikon DS-Fi1, acestea fiind ulterior transferate în calculator cu ajutorul programului LUCIA NET versiunea 1.16.5. Pentru analiza statistică a datelor am utilizat suita de extensii XLSTAT pentru Microsoft Excel. Corelaţiile dintre activitatea necroinflamatorie, stadiul fibrozei, steatoza, modificările arhitecturale ale dispoziţei fibrozei şi nodulilor cirotici, precum şi analiza semicantitativă a celulelor α-sma pozitive, au fost evaluate folosind testul de corelaţie Kendall, cu o valoare p < 0.05 considerată ca fiind semnificativă din punct de vedere statistic. REZULTATE Din lotul total de pacienţi incluşi în studiu, am remarcat o predominanţă a numărului de femei, atât în mediul urban (ratio F/B = 1,33/1), cât şi în mediul rural (ratio F/B = 12/1). Din totalitatea pacienţilor incluşi în studiu, am observat că majoritatea au avut vârste cuprinse în intervalul 51 65 de ani. În lotul de studiu, majoritatea femeilor, atât din mediul urban (ratio F/B = 1,57/1), cât şi din mediul rural (ratio F/B = 7/1), au prezentat valori ale IMC-ului peste limitele normale. Pentru evaluarea biopsiilor obţinute prin puncţie hepatică au fost utilizate cele mai bune metode de evaluare a gravităţii hepatitelor, respectiv scorurile HAI [12] şi Metavir [13], pe baza acestora lotul de pacienţi a fost împărţit în subgrupe, conform gradului de activitate, astfel: 9 pacienţi au prezentat hepatită cronică cu activitate minimă, 17 pacienţi hepatită cronică cu activitate moderată, 11 pacienţi hepatită cronică cu activitate severă şi 4 pacienţi ciroză. În subgrupa pacienţilor cu hepatită cu activitate minimă, analiza semicantitativă a procentului de CSH activate a evidenţiat un imunomarcaj predominant uşor în zonele perivenulară şi intermediară, absent în zona periportală, şi uşor în zona tracturilor portale şi a septurilor fibroase. La pacienţii cu hepatită cu activitate moderată imunomarcajul a fost în cele mai multe cazuri uşor în zonele perivenulară, intermediară şi periportală, şi predominant moderat în zona tracturilor portale şi a septurilor fibroase. În cazul pacienţilor cu hepatită cu 5
activitate severă, a fost observat un imunomarcaj în special moderat în zonele perivenulară, intermediară şi periportală, şi sever în zona tracturilor portale şi a septurilor fibroase. Subgrupa pacienţilor cu ciroză a prezentat un imunomarcaj predominat moderat şi sever în toate zonele examinate. Analiza statistică a legăturii dintre activitatea necroinflamatorie şi numărul de CSH activate a identificat o corelaţie semnificativă în zonele perivenulară (p = 0,014) şi intermediară (p = 0,018), precum şi o corelaţie puternic semnificativă în zona periportală şi a septurilor fibroase (p < 0,0001). Privind relaţia dintre numărul de CSH activate şi fibroza hepatică, am identificat o corelaţie puternic semnificativă în toate cele 4 zone examinate (p < 0,0001). Aceste rezultate au evidenţiat existenţa unei corelaţii semnificative între numărul de CSH activate cu activitatea necroinflamatorie şi gradul de fibroză, la pacienţii cu hepatită cronică virală C. Nu am identificat o corelaţie statistică între numărul de CSH activate şi steatoză, în zonele perivenulară (p = 0,250), intermediară (p = 0,166) şi periportală (p = 0,154); în schimb în zona septurilor fibroase analiza statistică a relevat o corelaţie semnificativă (p = 0,022), ceea ce demonstrează rolul jucat de steatoza hepatică în progresia fibrozei hepatice. Pe acelaşi lot de pacienţi, am efectuat de asemenea o analiză statistică pentru identificarea eventualelor corelaţii dintre numărul de CSH activate imunomarcate cu α-sma din cele 4 zone studiate şi funcţia hepatică, exprimată prin parametrii specifici sindroamelor de hepatocitoliză, insuficienţă hepatică, de activare mezenchimală şi sindromul bilio-excretor. În zonele perivenulară şi intermediară, am identificat o corelaţie statistic semnificativă între numărul de CSH activate şi o serie de parametri cuantificaţi în cadrul sindroamelor de insuficienţă hepatică (albumină, indice de protrombină), de activare mezenchimală (γglobuline, IgG) şi bilio-excretor (bilirubina totală). În zona periportală, am observat o corelaţie statistic semnificativă între numărul de CSH activate şi câţiva parametri cuantificaţi în cadrul sindroamelor de hepatocitoliză (ALT), de activare mezenchimală (γ-globuline, IgG) şi bilio-excretor (bilirubina totală, fosfataza alcalină). Numărul de CSH activate din zona tracturilor portale şi a septurilor fibroase s-a corelat cu aproape toţi parametrii studiaţi în cadrul sindroamelor de hepatocitoliză (ALT, AST), de insuficienţă hepatică (proteine totale, indice de protrombină), de activare mezenchimală (γglobuline, IgG) şi sindromul bilio-excretor (bilirubina totală, fosfataza alcalină), fapt ce pledează pentru o interdependenţă între CSH activate şi progresia bolii cronice hepatice. Terapiile antifibrotice eficiente nu pot fi dezvoltate fără o bună înţelegere a fenomenelor fundamentale pe care se bazează mecanismele fiziopatologice care sunt 6
implicate, pe de o parte în stadiile iniţiale ale leziunii hepatice şi, pe de altă parte, în activarea CSH şi implicit în iniţierea şi progresia fibrozei hepatice. Activarea CSH declanşată de leziunea cronică şi inflamaţia hepatică reprezintă fenomenul principal în iniţierea şi progresia fibrozei hepatice, factorul de risc major în apariţia CHC. EVALUAREA ACTIVITĂŢII CELULELOR STELATE HEPATICE LA PACIENŢII CU CARCINOM HEPATOCELULAR MATERIAL ŞI METODĂ Cel de-al doilea studiu prospectiv s-a desfăşurat pe o perioadă de 2 ani (1 ianuarie 2010 31 decembrie 2011), pe eşantioane prelevate la necropsie de la 20 de pacienţi cu CHC de etiologie virală C aflaţi în evidenţa Clinicii Medicale I din Spitalul Judeţean de Urgenţă Craiova, cu vârste cuprinse între 39 şi 78 de ani (vârsta medie 64,95 +/- 9,89 ani). Rezultatele studiului au relevat o incidenţă a CHC mai mare în rândul bărbaţilor (sex ratio B/F=2,33/1), fapt ce confirmă datele din literatura de specialitate. Pentru lotul de pacienţi cu carcinom hepatocelular, evaluarea zonelor imunomarcate a fost efectuată, de asemenea, printr-o metodă semicantitativă ce a urmărit identificarea procentului de celule α-sma (celule stelate hepatice), CD20 (limfocite B), CD45RO (limfocite T) şi NK1 (celule natural killer) imunomarcate din regiuni specifice ale materialului prelevat la necropsie: tumoră, grosimea capsulei tumorale la pacienţii cu tumori încapsulate şi zona de tranziţie la cei cu tumori neîncapsulate, precum şi ţesutul de vecinătate (2-5 mm). Procentual, numărul de celule imunomarcate a fost încadrat astfel: absent = până la 3%; uşor = 3-33%; moderat = 34-66%; sever = mai mare de 66%. REZULTATE În lotul de 20 de pacienţi cu carcinom hepatocelular incluşi în studiu, am observat o predominanţă a bărbaţilor, atât în mediul urban (ratio B/F = 1,33/1), cât şi în mediul rural (ratio B/F = 3,33/1). De asemenea, am remarcat că majoritatea pacienţilor au avut vârste cuprinse în intervalul 61 80 de ani. Totodată, numărul de bărbaţi din acelaşi interval de vârstă a fost mai mare decât numărul de femei (ratio B/F = 1,8/1). În tumoră, numărul de CSH imunomarcate a fost predominant moderat şi sever; numărul de limfocite T imunomarcate a fost predominant uşor şi moderat; numărul de celule 7
natural killer a fost preponderent uşor şi absent; imunomarcajul limfocitelor B a fost uşor la majoritatea pacienţilor. În zona de tranziţie (capsula tumorală), imunomarcajul CSH a fost predominant sever şi moderat (cei trei pacienţi cu tumori încapsulate au prezentat un imunomarcaj sever), fapt demonstrat şi de alte studii din literatura de specialitate. Imunomarcajul limfocitelor T a fost uşor la majoritatea pacienţilor; al celulelor natural killer a fost preponderent uşor şi absent, iar în cazul limfocitelor B a fost predominant uşor. În ţesutul de vecinătate, numărul de CSH imunomarcate a fost uşor şi moderat. În cazul limfocitelor T, imunomarcajul a fost moderat şi sever, celulele natural killer şi limfocitele B au prezentat un imunomarcaj moderat şi uşor. Analiza statistică efectuată între numărul de CSH activate din cele trei zone examinate şi numărul de limfocite T (în tumoră p = 0,0036, în zona de tranziţie p = 0,0345, în ţesutul de vecinătate p = 0,0473) şi celule NK (în tumoră p = 0,0007, în zona de tranziţie p = 0,0247, în ţesutul de vecinătate p = 0,0388), a identificat o corelaţie inversă între acestea, fapt ce demonstrează efectul inhibitor exercitat de CSH asupra limfocitelor T şi a celulelor natural killer, contribuind la progresia şi invazia CHC. Nu am identificat o legătură între numărul de CSH activate şi limfocitele B în cele trei zone examinate (în tumoră p = 0,1683, în zona de tranziţie p = 0,2031, în ţesutul de vecinătate p = 0,8760). Deşi hepatita cronică virală activă este asociată cu o creştere semnificativă a numărului de limfocite T activate, la nivel hepatic este prezentă imunosupresia. Activarea CSH reprezintă o cauză principală a imunosupresiei hepatice, prin inducerea apoptozei limfocitelor T activate, ceea ce favorizează invazia şi migrarea CHC. Celulele natural killer protejează ficatul de proliferarea celulară tumorală şi inhibă fibroza hepatică prin inducerea directă a apoptozei CSH activate. Acestea stimulează apoptoza CSH aflate fie în stadiul timpuriu de activare sau senescente, dar nu şi a CSH inactive sau deja activate, care sunt rezistente la acţiunea acestora. CSH activate intratumoral inhibă răspunsul limfocitelor T. Cuantificarea numărului de CSH activate peritumoral ar putea avea un rol prognostic, ceea ce ar permite aprecierea evoluţiei pacienţilor cu CHC, precum şi posibilitatea apariţiei metastazelor intrahepatice şi a recidivei tumorale post rezecţie chirurgicală. Printr-o mai bună înţelegere a mecanismelor fiziopatologice prin care CSH activate intervin în carcinogeneză, se pot elabora pe viitor noi ţinte terapeutice care să vizeze inhibarea acestora. 8
CONCLUZII GENERALE Numărul de CSH activate s-a corelat semnificativ cu activitatea necroinflamatorie în zonele perivenulară şi intermediară, şi puternic semnificativ în zona periportală şi a septurilor fibroase. Steatoza hepatică nu s-a corelat cu numărul de CSH activate, în zonele perivenulară, intermediară şi periportală; în schimb, a fost identificată o corelaţie semnificativă în zona septurilor fibroase. În zonele perivenulară şi intermediară, am identificat o corelaţie statistic semnificativă între numărul de CSH activate şi sindroamele de insuficienţă hepatică, de activare mezenchimală şi bilio-excretor. În zona periportală, am găsit o corelaţie statistic semnificativă între numărul de CSH activate şi sindroamele de hepatocitoliză, de activare mezenchimală şi bilio-excretor. Numărul de CSH activate din zona tracturilor portale şi a septurilor fibroase s-a corelat cu sindroamele de hepatocitoliză, de insuficienţă hepatică, de activare mezenchimală şi sindromul bilio-excretor. În tumoră, numărul de CSH imunomarcate a fost în special moderat şi sever; numărul de limfocite T imunomarcate a fost predominant uşor şi moderat; numărul de celule NK a fost preponderent uşor şi absent; imunomarcajul limfocitelor B a fost uşor la majoritatea pacienţilor. În zona de tranziţie (capsula tumorală), imunomarcajul CSH a fost predominant sever şi moderat (toţi cei trei pacienţi cu tumori încapsulate au prezentat un imunomarcaj sever). Imunomarcajul limfocitelor T a fost uşor la majoritatea pacienţilor; al celulelor NK a fost preponderent uşor şi absent, iar în cazul limfocitelor B a fost predominant uşor. În ţesutul de vecinătate, numărul de CSH imunomarcate a fost uşor şi moderat. În cazul limfocitelor T, imunomarcajul a fost moderat şi sever, celulele NK şi limfocitele B au prezentat un imunomarcaj moderat şi uşor. Analiza statistică efectuată între numărul de CSH activate şi numărul de limfocite T şi celule NK în cele trei zone examinate, a identificat o corelaţie inversă între acestea. Nu am identificat o legătură între numărul de CSH activate şi limfocitele B în cele trei zone examinate. 9
BIBLIOGRAFIE 1. Wasley A, Grytdal S, Gallagher K. Surveillance for acute viral hepatitis--united States, 2006. MMWR Surveill Summ 2008;57(2):1. 2. Gheorghe L., Iacob S. Prevalence of hepatitis C in Romania: different from European rates? J Hepatol. 2008; 49: 661-2. 3. Mengshol JA, Golden-Mason L, Rosen HR. Mechanisms of disease: HCV-induced liver injury. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2007;4:622-634. 4. Seengler U, Nattermann J. Immunopathogenesis in hepatitis C virus cirrhosis. Clin Sci (Lond) 2007;112:141-155. 5. Rubbia-Brandt L, Leandro G, et al. Liver steatosis in chronic hepatitis C: a morphological sign suggesting infection with hepatită cronică virală C genotype 3. Histopathology.2001;39,119-24. 6. The British Society of Gastroenterology Guidelines on the use of liver biopsy in clinical practice. Gut 1999;45(4):1-11. 7. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 2005;55:74-108. 8. Amann T., Bataille F., Spruss T., et al. Activated hepatic stellate cells promote tumorigenicity of hepatocellular carcinoma. Cancer Sci. 2009 Apr; 100(4):646-53. 9. Mikula M., Proell V., Fischer A.N., et al. Activated hepatic stellate cells induce tumor progression of neoplastic hepatocytes in a TGF-beta dependent fashion. J Cell Physiol. 2006;209:560-7. 10. Enzan H., Himeno H., Iwamura S., et al. Alpha-smooth muscle actin-positive perisinusoidal stromal cells in human hepatocellular carcinoma. Hepatology. 1994;19:895-903. 11. Mogoantă L, Popescu CF, Georgescu CV, Ghid de tehnici de histologie, citologie şi imunohistochimie, Craiova: Editura Medicală Universitară, 2007. 12. Ishak K, Baptista A, Bianchi L, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol.1995;22:696-9 13. The French METAVIR Cooperative Study Group. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis C. Hepatology.1994;20:15-20. 10