UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE GR. T. POPA IAȘI FACULTATEA DE MEDICINĂ TEZĂ DE DOCTORAT REZUMAT

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE GR. T. POPA IAȘI FACULTATEA DE MEDICINĂ TEZĂ DE DOCTORAT REZUMAT EVALUAREA PARAMETRILOR HISTOPATOLOGICI ȘI CORELAȚIILE CU CELULELE SISTEMULUI IMUN LA NIVELUL FRONTULUI DE INVAZIE TUMORALĂ ÎN CANCERUL DE COLON CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC, PROFESOR UNIVERSITAR DOCTOR VIOREL SCRIPCARIU DOCTORAND, ANA-MARIA TODOSI IAȘI 2014

Scopul final al medicinei nu este numai să vindece sau să prevină boalele, ci chiar să perfecționeze pe oameni și să -i facă mai fericiți, facându-i mai buni. Teza de doctorat cuprinde: O parte generală organizată în 5 capitole însumând 43 pagini O parte personală organizată în 6 capitole însumând 128 pagini Partea de referințe cuprinde 308 referințe bibliografice O secțiune de 4 anexe Au fost inserate 72 tabele și 135 figuri 4 articole B+ ca și prim autor publicate sau în curs de publicare 3 articole ISI coautor Hippocrate Notă: prezentul rezumat redă selectiv bibliografia şi iconografia în text, respectând numerotarea şi cuprinsul din teză. Cuvinte cheie: cancerul de colon, infiltrat inflamator, scor imun, status ganglionar, markeri hematologici, index nutrițional Investeşte în oameni! Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013 AXA PRIORITARĂ 1 Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere DOMENIUL MAJOR DE INTERVENŢIE 1.5 Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării Titlu Proiect: PARTENERIAT INTERUNIVERSITAR PENTRU CREȘTEREA CALITĂȚII ȘI INTERDISCIPLINARITĂȚII CERCETĂRII DOCTORALE MEDICALE PRIN ACORDAREA DE BURSE DOCTORALE DocMed.net Cod Contract: POSDRU/107/1.5/S/78702 Beneficiar: UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE IULIU HAȚIEGANU CLUJ- NAPOCA Partener 1: UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE "GR. T. POPA" IAȘI

Cuprinsul tezei de doctorat A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN CANCERUL DE COLON...6 CAPITOLUL 1. DATE DEMOGRAFICE PENTRU CANCERUL DE COLON......6 1.1 Epidemiologia cancerului colorectal...6 1.2 Factorii de risc în cancerul de colon...7 CAPITOLUL 2. DIAGNOSTICUL ȘI STADIALIZAREA CANCERULUI DE COLON...9 2.1 Clasificarea histopatologică şi stadializarea cancerului de colon...9 2.2 Manifestări clinice în cancerul de colon...15 2.3 Explorări imagistice de stadializare în cancerul de colon...16 CAPITOLUL 3. PRINCIPII ALE TRATAMENTULUI MULTIMODAL ÎN CANCERUL DE COLON...18 3.1 Anatomia chirurgicală a colonului...18 3.2 Rolul tratamentului chirurgical în cancerul de colon...20 3.2.1 Rolul chirurgiei deschise în tratamentul cancerului de colon...20 3.2.2 Rolul chirurgiei minim-invazive în tratamentul cancerului de colon...22 3.2.2.1.Avantajele chirurgiei laparoscopice în cancerul de colon...22 3.2.2.2 Principiile chirurgiei laparoscopice...24 3.2.2.3 Clasificarea tehnicilor laparoscopice...25 3.2.2.4 Laparoscopia prin orificii anatomice...26 3.2.2.5 Chirurgia robotică...26 3.2.2.6 Posibile complicații în chirurgia laparoscopică...27 3.2.3 Laparoscopia versus chirurgia clasică...28 3.3 Rolul tratamentului adjuvant în cancerul de colon...30 3.4 Recomandările ghidurilor internaționale NCCN și ESMO în tratamentul cancerului de colon......30 3.4.1 Managementul cancerului de colon nonmetastatic...30 CAPITOLUL 4. FACTORII DE PROGNOSTIC ÎN CANCERUL DE COLON...35 4.1 Evaluarea markerilor tumorali în cancerul de colon...35 4.2 Evaluarea markerilor hematologici ca și factori de prognostic în cancerul de colon.....35 4.3 Evaluarea statusului ganglionar ca și factor de prognostic în cancerul de colon...37 1

4.4 Evaluarea statusului nutrițional ca și factor de prognostic în cancerul de colon...40 4.5 Evaluarea tranziției epitelial-mezenchimale (EMT) ca și factor de prognostic în cancerul de colon......43 CAPITOLUL 5. ROLUL SISTEMULUI IMUN ÎN NEOPLAZIA COLONICĂ......45 5.1 Relația dintre sistemul imun și cancerul de colon......45 5.2 Rolul micromediului și a infiltratului imunitar la nivel tumoral...46 5.3. Importanța scorului imun în cancerul de colon......47 B. CONTRIBUȚII PERSONALE ÎN STUDIUL CANCERULUI DE COLON...49 CAPITOLUL 6. MOTIVAȚIA STUDIULUI DOCTORAL...49 CAPITOLUL 7. EVALUAREA INFILTRATULUI IMUNITAR LA NIVEL TUMORAL CA ȘI POSIBIL FACTOR DE PROGNOSTIC LA PACIENȚII CU NEOPLASM DE COLON...52 7.1 INTRODUCERE...52 7.2 MATERIAL ȘI METODE...52 7.2.1 Centre participante...52 7.2.2 Studiul de cohortă:...52 7.2.3 Criterii de includere și excludere:...53 7.2.4 Selecția blocurilor tumorale...53 7.2.5 Pregătirea probelor...53 7.2.6 Prelucrarea imunohistochimică (IHC)...53 7.2.7 Scanarea imunomarcajelor şi stocajul...54 7.2.8 Analiza imaginilor digitale a lamelor IHC a pacienţilor din cohortă...54 7.2.9 Determinarea Imunoscorului...54 7.2.10 Metode statistice ce vor fi aplicate...54 7.2.11 Figuri asociate cu sectiunea Material și Metode...55 7.3 REZULTATE...60 7.3.1 TESTAREA PERORMANȚEI METODEI IMUNOSCORULUI...60 7.3.1.1 Performanța marcajului de a detecta celule CD3 și CD8 pozitive...60 7.3.1.2 Controlul extern al calității pentru marcaj...61 7.3.1.3 Standardizarea centrelor pentru studiul multicentric...62 7.3.1.4 Stabilitatea marcajului în relație cu vârsta blocului tumoral...63 2

7.3.1.5 Capacitatea Modulului Imunoscor de a număra celulele marcate...64 7.3.1.5 Repeatabilitatea numărării de către modulul Imunoscor...65 7.3.1.5 Variabilitatea numărării modulului Imunoscor indusă de către operator...66 7.3.1.6 Proba de țesut tumoral: rezultatele sunt influențate de selecția blocului tumoral...67 7.3.1.7 Proba de țesut tumoral: rezultatele sunt influențate de nivelul de tăiere în blocul tumoral...68 7.3.2 EVALUAREA SCORULUI IMUN LA PACIENȚII UICC I-III, COHORTA HEGP...68 7.3.2.1 Caracteristici generale pentru cohorta SITC...68 7.3.2.2 Evaluarea Scorului Imun...72 7.3 DISCUȚII...77 CAPITOLUL 8. EVALUAREA DIMENSIUNILOR TUMORALE CA ȘI POTENȚIAL FACTOR DE AGRESIVITATE TUMORALĂ...81 8.1. INTRODUCERE...81 8.2. MATERIAL ȘI METODE...81 8.2.1. Criterii de selecție a pacienților...81 8.2.2 Crearea bazei de date cu evaluarea parametrilor histopatologici.82 8.2.3 Prelucrarea statistică a datelor...82 8.3. REZULTATE...83 8.3.1 Caracteristici generale și evaluarea categoriilor T, N, M, VELIPI în lotul de studiu...83 8.3.4 Evaluarea gradului de predicţie a parametrilor tumorali în supraviețuirea globală a pacienților...101 CAPITOLUL 9. EVALUAREA STATUSULUI GANGLIONAR LA PACIENȚII CU NEOPLASM DE COLON...107 9.1. INTRODUCERE...107 9.2. MATERIAL ŞI METODE...107 9.2.1 Criterii de selecție a pacienților...107 9.2.2 Crearea bazei de date cu evaluarea parametrilor histopatologici...107 9.2.3 Prelucrarea statistică a datelor...108 9.3 REZULTATE...108 9.3.1 Caracteristici generale ale lotului de studiu...108 9.3.2 Evaluarea numărului de ganglioni totali în funcție de parametrii clinic-histopatologici în lotul de studiu...111 3

9.3.5 Evaluarea rapoartelor ganglionare în lotul de studiu......115 9.3.6 Evaluarea gradului de predicție a parametrilor histopatologici în supraviețuirea pacienților...119 9.3.7 Evaluarea gradului de predicție a parametrilor histopatologici în supraviețuirea pacienților stadiul UICC1-3...124 9.4 DISCUȚII...125 CAPITOLUL 10. ANALIZA DIFERENȚELOR CLINICO- HISTOPATOLOGICE ÎN FUNCȚIE DE TOPOGRAFIA TUMORALĂ ÎN CANCERUL DE COLON...131 10.1 INTRODUCERE...131 10.2 MATERIAL ŞI METODE...131 10.2.1 Criterii de selecție a pacienților...131 10.2.2 Crearea bazei de date cu evaluarea parametrilor histopatologici...131 10.2.3 Prelucrarea statistică a datelor...131 10.3 REZULTATE...132 10.4.2 Aspecte corelaționale privind caracteristicile macroscopice tumorale și clinice...134 10.3.3 Aspecte corelaționale privind mortalitatea intraspitalicească și postoperatorie...135 10.3.4 Evaluarea gradului de predicție a parametrilor clinicohistpatologici în supraviețuirea globală a pacienților...137 10.4 DISCUȚII...139 CAPITOLUL 11. CORELAȚII CLINICO-PATOLOGICE ÎN FUNCȚIE DE CARACTERUL ELECTIV SAU URGENȚĂ ÎN CANCERUL DE COLON...142 11.1 INTRODUCERE...142 11.2 MATERIAL ŞI METODE...142 11.2.1 Criterii de selecție a pacienților...142 11.2.2 Crearea bazei de date cu evaluarea parametrilor clinicohistopatologici...142 11.2.3 Prelucrarea statistică a datelor...142 11.3 REZULTATE...142 11.3.1 Aspecte corelaționale pentru întregul lot de pacienți...142 11.3.2 Aspecte corelaționale pentru Cohorta 2007-2009...148 11.3.3 Aspecte corelaționale pentru Cohorta 2010-2011...149 11.3.4 Aspecte corelaționale pentru Cohorta 2012-2013...149 4

11.3.5 Analiza curbelor de supraviețuire Kaplan-Meier în funcție de momentul operator...150 11.4 DISCUȚII...151 CAPITOLUL 12. EVALUAREA ROLULUI PROGNOSTIC AL MARKERILOR HEMATOLOGICI ȘI TUMORALI ÎN CANCERUL DE COLON...154 12.1 INTRODUCERE...154 12.2 MATERIAL ŞI METODE...154 12.2.1 Criterii de selecție a pacienților...154 12.2.2 Crearea bazei de date cu evaluarea parametrilor hematologici154 12.2.3 Prelucrarea statistică a datelor...154 12.3 REZULTATE...154 12.3.1 Evaluarea raportului NLR (raportul neutrofile/limfocite) la pacienții cu neoplasm de colon...154 12.3.2 Evaluarea raportului MNM (multiplicarea monocitară) la pacienții cu...155 12.3.3 Evaluarea raportului PLR (raportul trombocite/limfocite) la pacienții cu...155 12.3.4 Evaluarea dnlr (raport neutrofile/limfocite derivat) la pacienții cu...155 12.3.5 Evaluarea markerilor tumorali (CEA și CA19.9) în cancerul de colon...155 12.3.6 Evaluarea gradului de predicție a markerilor hematologici și tumorali în supraviețuirea pacienților cu neoplasm de colon...156 12.3.7 Evaluarea markerilor hematologici și tumorali pentru pacienții cu neoplasm de colon stadiile UICC 1-3...159 12.3.7.1 Rolul prognostic al markerilor tumorali și hematologici în supraviețuirea pacienților cu neoplasm de colon stadiile UICC1-3...160 12.3.7.2 Evaluarea gradului de predicţie a valorilor NLR pentru prezenţa ganglionilor pozitivi în stadiul UICC 1-3 cancer de colon...161 12.3.7.3 Evaluarea gradului de predicţie a valorilor MNM pentru prezenţa ganglionilor pozitivi în stadiul UICC 1-3 cancer de colon...162 12.3.7.4 Evaluarea gradului de predicţie a valorilor PLR pentru prezenţa ganglionilor pozitivi în stadiul UICC 1-3 cancer de colon...162 12.4 DISCUȚII...162 CAPITOLUL 13. ROLUL INDEXURILOR NUTRIȚIONALI ÎN EVALUAREA PACIENȚILOR CU NEOPLASM DE COLON...166 13.1 INTRODUCERE...166 5

13.2 MATERIAL ŞI METODE...166 13.2.1 Criterii de selecție a pacienților...166 13.2.2 Crearea bazei de date cu evaluarea indexurilor nutriționali...166 13.2.3 Prelucrarea statistică a datelor...167 13.3. REZULTATE...167 13.4 DISCUȚII...171 CAPITOLUL14. DISCUȚII ȘI CONCLUZII FINALE...173 REFERINȚE BIBLIOGRAFICE...178 ANEXE...194 ANEXA I- LISTA ABREVIERILOR FOLOSITE ÎN TEXT...194 ANEXA II- Avizul Comisiei de Etică a Univesității de Medicină și Farmacie Gr.T.Popa Iași...195 ANEXA III- ACTIVITATEA ȘTIINȚIFICĂ ÎN PERIOADA STUDIILOR DOCTORALE...196 PARTEA GENERALĂ Această teză de doctorat include o parte generală în care am prezentat epidemiologia cancerului de colon și factorii determinanți în această neoplazie, metodele de diagnostic, stadializare și tratament chirurgical cu prezentarea tehnicilor chirurgicale minim-invazive de actualitate, precum și protocoalele de tratament și urmărire postoperatorie recomandate de ghidurile internaționale. În Capitolul 1- Date demografice pentru cancerul de colon am prezentat epidemiologia neoplaziei colonice, precum și factorii determinanți în apariția celor două tipuri histopatologice predominante: adenocarcinomul și adenocarcinomul mucinos. Cancerul colorectal este o importantă problemă de sănătate publică la nivel mondial, reprezentând o cauză majoră de mortalitate şi morbiditate. Este al treilea cel mai răspandit tip de cancer şi a patra cauză de deces la nivel mondial (2). La nivel mondial, cancerul colorectal este al treilea cel mai frecvent tip de cancer la bărbaţi şi al doilea cel mai frecvent la femei (5). În Capitolul 2- Diagnosticul și stadializarea cancerului de colon am redat clasificarea histopatologică și stadializările ultilizate pentru încadrarea pacienților cu neoplasm de colon (Clasificarea Dukes, Asler Coller modificată) și prezentarea detaliată a ultimei stadializări TNM- UICC (ediția a 7a) recomandată de AJCC (The American Joint 6

Committee on Cancer) fiind identică cu cea dată de UICC Union for International Cancer Control, care se bazează pe premisa că neoplasmele cu aceeaşi localizare anatomică şi aceeaşi histologie au acelaşi model de creştere şi acelaşi prognostic și este utilizată în prezent în practica clinică. În Capitolul 3-Principii ale tratamentului multimodal în cancerul de colon sunt redate elementele de anatomie chirurgicală, atât de necesară chirurgului atunci când abordează neoplazia colonică, cu enunțarea principiilor oncologice și a grupelor ganglionare colice, numărul ganglionilor identificați e piesa operatorie, reprezentând un element de evaluare a acurateței actului chirurgical, cu rol în stadializare. Sunt redate tehnicile de chirurgie deschisă și rolul chirurgiei minim-invazive în tratamentul cancerului de colon prin prezentarea principiilor și a tehnicilor laparoscopice utilizate, precum și avantajele chirurgiei laparoscpice versus chirurgia clasică. Chirurgia laparoscopică are o serie de beneficii, cum ar fi durere postoperatorie mai redusă, complicații pulmonare și la nivelul plăgii postoperatorii mai puține, scăderea necesarului de transfuzii de sânge, reluarea rapidă a tranzitului intestinal (72, 73) și scăderea perioadei de spitalizare, cu rezultate oncologice similare pentru cele două tehnici (63). Rolul tratamentului adjuvant este prezentat prin descrierea regimurilor chimioterapie folosite în funcție de stadializarea pacienților. Recomandările ghidurilor internaționale NCCN și ESMO sunt prezentate în cadrul managementului cancerului de colon nonmetastatic și metastatic, ce descriu regimurile chimioterapice folosite, indicațiile terapeutice și urmărirea pacienților în funcție de stadializarea acestora. În Capitolul 4- Factorii de prognostic în cancerul de colon sunt evaluați markerii tumorali și hematologici cu valoare prognostică. Dintre markerii hematologici sunt descriși raportul neutrofile/limfocite (NLR), trombocite/limfocite (PLR), raportul derivat neutrofile/limfocite (dnlr) și multiplicarea monocitară (MNM) (134, 143, 145). NLR și PRL s-au dovedit a fi biomarkeri de prognostic bun a supraviețuirii globale (143). Pacienții cu o valoare crescută a PLR au avut o supraviețuire la 5 ani, semnificativ mai scăzută decât pacienții cu o valoare scăzută a PLR (71.4% vs 51.5%, p=0.045). Valoarea preoperativă a PLR poate fi un factor clinic semnificativ pentru evaluarea prognosticului în cancerul colorectal rezecabil (145). 7

Multiplicarea neutrofilelor și a monocitelor (MNM) este un alt marker utilizat în neoplazie. Acest marker este determinat prin multiplicarea valorilor monocitelor și neutofilelor evaluate preoperator, împărțite la 10.000 (147, 148). Statusul ganglionar este extrem de important în corecta stadializare a pacienților cu rol în prezicerea evluției clinice. Sistemul TNM este cel mai bun factor de prognostic care există în momentul de față pentru CRC cu o supraviețuire medie de 93%, 78%, 60% și 8% pentru stadiul I, II, III și respectiv IV. Comitetul AJCC recomandă să se recolteze cel puțin 12 ganglioni limfatici (150). Datorită incertitudinii în ceea ce privește numărul absolut de ganglioni limfatici necesari pentru o stadializare corectă a cancerului de colon au fost imaginate diverse modele matematice de evaluare a ganglionilor limfatici, găsindu-se astfel alte alternative de a corela prognosticul pacienților cu numărul de ganglioni limfatici găsiți și statusul lor pozitiv sau negativ. (154). Evaluarea statusului nutrițional poate avea valoare prognostică la pacienții neoplazici, malnutriția fiind un factor de prognostic negativ (166). Prin definirea aspectelor morfo-funcţionale ale tranziţiei epitelial-mezenchimale în neoplasmul de colon apare posibilitatea de identificarea unor relaţii ale acestora cu o serie de markeri prognostici (182). Capitolul 5- Rolul sistemului imun în neoplazia colonică descrie relația dintre sistemul imun și cancerul de colon, fiind redate publicațiile ce au la bază ideea că un prognostic favorabil în neoplazia colorectală este asociată cu un infiltrat imun bogat la nivelul frontului de invazie tumorală (193). Astfel, progresia tumorală trebuie considerată a fi rezultatul echilibrului între procesul tumoral invaziv şi sistemul imun de apărare a cărui component major este reprezentat de răspunsul imun al gazdei (197). Prognosticul acestui tip de cancer nu a fost semnificativ îmbunătăţit de-a lungul timpului. Stadiul TNM este cel mai important marker prognostic şi markerii imunohistochimici sunt rar utilizaţi în practica clinică (60, 61). Secundar rezecţiei chirurgicale, evoluţia clinică a pacienţilor pare să fie puternic dependentă de reacţia imună la nivelul situsului tumoral (212). Comportamentul la nivelul tumorilor umane este influenţat de răspunsul imun adaptativ. În tratamentul cancerului colorectal, analiza in situ a celulelor imune infiltrante la 8

nivel tumoral poate fi considerată un instrument de prognostic util (214). S-a demonstrat că tipul, densitatea şi localizarea celulelor imune au avut o valoare prognostică ce a fost superioară şi independentă stadializării TNM. Pentru a identifica pacienţii cu risc ridicat care ar beneficia cel mai mult de terapie adjuvantă, criteriul immunologic ar putea fi util (214). PARTEA PERSONALĂ Motivația studiului doctoral Cancerul de colon este o importantă problemă de sănătate publică și împreună cu neoplasmul rectal reprezintă principala cauză de deces prin cancer la ambele sexe. Această patologie reprezintă o continuă și prezentă problemă pentru medicii chirurgi, oncologi, radiologi, anatomopatologi și în ultima perioadă pentru imunologi. Neoplasmul de colon este o patologie frecvent întâlnită la noi în țară, iar datorită simptomatologiei tardive, care de multe ori este ignorată de către pacient, prezentarea la medic se face în stadii destul de avansate. Prognosticul pacienților cu neoplasm colorectal nu a arătat nici o îmbunătățire semnificativă. În prezent, tratamentul acestui tip de neoplazie este bazat în primul rând pe rezecția chirurgicală a tumorii iar managementul terapeutic postrezecțional este ghidat în principal de rezultatele examenului histopatologic de la nivelul piesei de exereză. Riscul de recidivă tumorală este mereu prezent pentru un pacient cu astfel de patologie, și de aceea se fac eforturi intense pentru identificarea de noi markeri care să prezică recidiva bolii. Identificarea unor markeri de prognostic care să schimbe percepția asupra severității acestei boli reprezintă o problemă majoră în zilele noastre. Pentru ca un marker de predicţie să fi încorporat în stadializare necesită să aibă un impact puternic şi reproductibil asupra evoluţiei pacientului, independent de invazia tumorală. Markerii pot fi obţinuţi prin analiza probelor tumorale obţinute prin chirurgie sau prin biopsiile practicate cu scop diagnostic. Cu toate acestea nu există nici un marker de prognostic, independent de stadializarea TNM, care să prezică evoluția pacienților și care să identifice grupul acestora cu risc crescut de recidivă, astfel încât să beneficieze de o terapie intensă. Bazându-mă pe aceste tendințe și interesată fiind de noile noutăți în ceea ce privește markerii de prognostic în cancerul de colon, care ar trebui să reprezinte 9

o preocupare pentru orice medic, mi-am propus ca și obiective pentru teza mea de doctorat următoarele: - Evaluarea infiltratului imunitar tumoral prin aplicarea tehnicii imunoscorului și rolul prognostic al acestuia, la pacienții cu neoplasm de colon - Evaluarea dimensiunilor tumorale histopatologice ca și potențial factor de agresivitate tumorală în neoplazia colonică - Evaluarea statusului ganglionar și a factorilor ce influențează numărul de ganglioni totali și pozitivi, precum și rolul lor prognostic - Identificarea diferențelor histopatologice, chirurgicale și clinice ce pot apărea la pacienții cu același diagnostic, neoplasmul de colon dar cu localizarea tumorii diferită: colon drept versus colon stâng. - Evaluarea diferențelor clinico-histopatologice în funcție de momentul actului operator (electiv versus urgență) și acuratețea actului chirurgical evaluată în funcție de numărul de ganglioni totali recoltați la nivelul piesei de exereză chirurgicală la pacienții cu neoplasm de colon - Analiza markerilor hematologici ca și potențiali factori de agresivitate tumorală și rolul lor prognostic - Evaluarea statusului nutrițional la pacienții cu cancer colorectal și influența în evoluția clinică a pacienților Pentru îndeplinirea obiectivelor tezei de doctorat, am utilizat loturi diferite de pacienți care au fost selectați în funcție de parametrii urmăriți în fiecare studiu în parte și care au fost supuși analizei statistice. Baza de date a cuprins pacienți operați în trei clinici: Clinica de Chirurgie Digestivă a Spitalului European Georges Pompidou, Paris, Franța în perioada 1991-2004, Clinica aiiia Chirurgie Generală din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgență Sf. Spiridon Iași perioada 2004-2007 și pacienți cu neoplasm de colon operați în cadrul Clincii I Chirurgie Oncologică, a Institutului Regional de Oncologie Iași în perioada mai 2012- septembrie 2013. Am ales două clinici întrucât activitatea mea ca și medic rezident s-a desfășurat în cele două clinici de la începutul rezidențiatului și până în prezent. 10

CAPITOLUL 7. EVALUAREA INFILTRATULUI IMUNITAR LA NIVEL TUMORAL CA ȘI POSIBIL FACTOR DE PROGNOSTIC LA PACIENȚII CU NEOPLASM DE COLON În colaborare cu Profesorul Franck Pagès și echipa din cadrul Platformei Imunomonitoring de la Spitalul European Georges Pompidou (HEGP), Paris Franța, am participat la studiul internațional multicentric care se desfășoară sub egida Societății pentru Imunoterapie în Cancer (SITC) și care are ca scop principal validarea tehnicii imunoscorului în practica clinică pentru pacienții cu neoplasm de colon. Pe durata mobilității internaționale, am participat integral la desfășurarea acestui studiu, pe o perioadă de 7 luni de zile. Munca mea a constat în selecția lamelor colorate cu hematoxilin-eozină cu tumori colonice ce conțin un infiltrat imunitar bogat, selecția si dezarhivarea blocurilor tumorale, imunomarcajul lamelor tumorale prin tehnici de imunohistochimie automată, scanarea imaginilor cu prelucrarea lor și analiza digitală computerizată a imaginilor. Obiectivele studiului: 1) Validarea imunoscorului ca și marker de prognostic pentru pacienții cu stadiile I/II/III cancer de colon 2) Testarea puterii de predicție a tehnicii imunoscorului și identificarea pacienților cu risc crescut de recidivă aflați în stadiul II cancer de colon. MATERIAL ȘI METODE Am efectuat un studiu retrospctiv dintr-o bază de date colectată prospectiv ce a inclus pacienți diagnosticați și tratatați pentru neoplasm de colon în Clinica de Chirurgie Digestivă a Spitalului European Georges Pompidou, Paris, Franța în perioada 1991-2004. Cohorta retrospectivă de pacienți consecutiv neselectați (460 pacienți în total), formată din: - 300 pacienți cu stadiul UICC-TNM I/II/III Analiza imaginilor digitale a lamelor IHC a pacienţilor din cohortă Software-ul Definiens Developer XD cu modulul Imunoscore este utilizat pentru cuantificarea densităţii celulelor CD3+ şi CD8+ la nivelul centrului tumoral (CT) şi a frontului de invazie (IM). Determinarea Imunoscorului Fiecare tumoră a pacientului este analizată cu scopul de a evalua infiltrarea cu celule imune CD3 în ambele regiuni tumorale (CT 11

și IM). Densități crescute (Hi) sau scăzute (Lo) pentru fiecare marker sunt determinate în fiecare regiune tumorală în funcție de valorile cutoff. Valoarea cut-off pentru fiecare maker în fiecare regiune este calculată cu scopul de a avea o discriminare optimă între grupele de pacienți (Hi versus Lo) în ceea ce privește intervalul liber de boală. Pacienții sunt clasificați folosind Imunoscorul de la I0 la I4. Evaluarea supraviețuirii pacienților se face cu ajutorul curbelor Kaplan Meier. Curbele sunt calculate în funcție de distribuția markerilor imuni (CD3 sau CD8) la nivelul CT sau IM, cu scopul de a identifica diferențele în ceea ce privește intervalul liber de boală și supraviețuirea globală a pacienților în funcție de acești parametrii. REZULTATE Protocoalele pentru marcajul CD3 și CD8 au fost optimizate de către Platforma Imunomonitoring HEGP, Paris, în vederea obținerii marcajului optim specific însoțit de minime interferențe. Stabilitatea marcajului în relație cu vârsta blocului tumoral S-a testat dacă intensitatea marcajului, a fost influențată de vechimea blocului tumoral, deoarece cohorta retrospectivă de cancere colonice a fost compusă din cazuri vechi din 1991 până în 2004. Apoi s-a analizat media și mediana intensităților pentru CD3 și CD8 pentru grupurile de blocuri tumorale clasificate în funcție de data recoltării. Rezultate indică faptul că marcajul este stabil, indiferent de vechimea blocului tumoral. Capacitatea Modulului Imunoscor de a număra celulele marcate Modulul Imunoscor, folosește un algoritm specific de identificare și numărare a celulelor imunomarcate. Pentru a testa capacitatea și acuratețea modulului de a număra celule marcate, am comparat rezultatele obținute cu ajutorul progamului cu rezultatul obținut cu ajutorul numărării optice pe 50 de câmpuri și corelația a fost bună (r=0.82 și r=0.80) Repeatabilitatea numărării de către modulul Imunoscor O secţiune de ţesut dintr-un bloc TMA (Tissue-Micro-Array) pentru cancer colorectal a fost imunomarcată cu anticorpi anti CD3 și CD8. Imunomarcajul a fost cuantificat de 24 ori de acelaşi operator în runde diferite. CV între parametrii pentru cuantificările pentru CD3 și CD8 a fost foarte scăzut (<1%). Această valoare indică absența variabilității induse de modulul Imunoscor în numărarea celulelor imunomarcate. 12

Variabilitatea numărării modulului Imunoscor indusă de către operator O probă de țesut imunomarcată pentru CD3 a fost cuantificată de 10 ori de către același operator folosind modulul Imunoscor oferit de Definiens. Coeficientul de variație (CV) (variație/ medie x 100) pentru cuantificarea densităților CD3 în regiunile tumorale a fost scăzut. Proba de țesut tumoral: rezultatele sunt influențate de selecția blocului tumoral Am testat dacă rezultatul pentru densitățile celulelor imune pentru CD3 și CD8 au fost influențate de blocul tumoral selectat într-o cohortă de 289 pacienți cu cancer colonic. Nu au fost înregistrate diferențe pentru densitățile imune între blocurile selectate și cele alese la întâmplare. Proba de țesut tumoral: rezultatele sunt influențate de nivelul de tăiere în blocul tumoral Am testat dacă rezultatul pentru densitățile celulelor imune pentru CD3 și CD8 au fost influențate de nivelul de tăiere în blocul tumoral. Rezultatele cuantificării pentru CD3 și CD8 în fiecare regiune tumorală (CT și IM) au fost comparate cu secțiunile tumorale adiacente. Diferențele au fost date de (i) variația infiltrației imune între secțiunile tumorale și (ii) variabilitatea tehnicii. Evaluarea scorului scorului imun la pacienții UICC I-III, cohorta HEGP Au fost incluși un număr de 300 pacienți cu cancer de colon operați în perioada 1991-2004. A existat o predominanță a pacienților de sex feminin (n=165, 55%) comparativ cu sexul masculin (n=135, 45%), însă cele două grupuri au fost similare ca timp de supraviețuire și risc de deces. Repartiția pe stadii UICC a arătat diferențe între cele trei stadii, cu o predominanță a pacienților în stadiul II. Analiza supraviețuirii globale (OS) a arătat diferențe semnificative între stadii, atât stadiul I cât și stadiul II având o supraviețuire semnificativ mai bună decât stadiul III. Analiza intervalului liber de boală (DFS) a arătat că pacienții din stadiul III au avut un risc de recidivă semnificativ mai mare decât pacienții din celelalte stadii. Evaluarea stadiului Dukes, a arătat o predominanță a stadiului B2. Repartiția în funcție de stadiul T a arătat o predominanță a pacienților cu tumori în stadiul T3. Pacienții cu tumori T4 au avut cea 13

mai scurtă perioadă până la apariția recidivei comparativ cu celelalte stadia. Au predominat stadiile N+ comparativ cu N0, care asociat cu stadiul M, a arătat că atât intervalul liber de boală cât și supraviețuirea globală a fost semnificativ mai redusă. Evaluarea Scorului Imun Rezultatele au arătat că pacienții cu infiltrat imunitar crescut au avut un risc de recidivă semnificativ mai redus decât pacienții cu infiltrate imunitar scăzut. DISCUȚII Stadializarea TNM este de mare importanță dar oferă informații prognostice limitate și nu oferă nici o informație legată de predicția terapiei alese (220, 221). Markerii de prognostic și predicție suplimentari sunt necesari (222). Un marker prognostic este un parametru clinic sau biologic care permite prezicerea evoluției clinice a unui pacient, și care ghidează deasemenea clinicianul în alegerea unei strategii terapeutice. Markerii prognostici în cencerologie sunt constituiți, pe de o parte de clasificarea TNM, ce rezumă extensia tumorală în organele primare (stadiul T), ganglionii limfatici de drenaj tumoral (stadiul N) și în organele la distanță (stadiul M), și pe de altă parte de parametrii biologici serici (markeri tumorali) și moleculari care iau în calcul modificările moleculare în celula tumorală și modificările micromediului tumoral (205, 218, 223). Așadar, informația prognostică a clasificării TNM este limitată, și nu prezice de altfel răspunsul la tratamentul ce va fi instituit. O posibilă explicație pentru valoarea prognostică limitată, o reprezintă presupunerea până nu de mult, că progresia tumorală este un proces celular autonom ce nu este influențat de micromediul tumoral (224). Datele în ceea ce privește evoluția pacienților cu tumori solide, demonstează că infiltratul imun in situ, influențează puternic evoluția pacienților (225). Imunoscorul combină informația legată de densitatea CD3 și CD8 în ambele regiuni tumorale, CT și IM. CAPITOLUL 8. EVALUAREA DIMENSIUNILOR TUMORALE CA ȘI POTENȚIAL FACTOR DE AGRESIVITATE TUMORALĂ Obiectivele studiului au fost: 14

- Identificarea diferențelor clinico-histopatologice la pacienții cu metastaze la distanță comparativ cu pacienții fără metastaze prezente la momentul diagnosticului. - Evaluarea diametrului tumoral maxim și corelațiile cu parametrii histopatologici cu rol în agresivitatea tumorală. - Evaluarea volumului și a ratei volum tumoral/ganglioni limfatici ca și posibili factori de agresivitate tumorală. - Evaluarea parametrilor tumorali și rolul lor în supraviețuirea pacienților din lotul de studiu evaluată cu ajutorul curbelor de supraviețuire generală Kaplan-Meier. MATERIAL ȘI METODE Am efectuat un studiu retrospectiv dintr-o bază de date realizată prospectiv ce a inclus toți pacienții diagnosticați cu neoplasm de colon (CC) în perioada mai 2012-septembrie 2013 în cadrul Clinicii I Chirurgie Oncologică a Institutului Regional de Oncologie Iași. Diametrul tumoral maxim a fost considerat ca fiind cea mai mare dimensiune tumorală raportată de anatomopatolog. Volumul tumoral a fost calculat înmulțind două dimensiuni cele mai mari raportate pentru fiecare tumoră. Volumul tumoral a fost raportat la procentul de ganglioni pozitivi (tumour node ratio). Procentul de ganglioni pozitivi a fost calculat împărțind numărul de ganglioni pozitivi la numărul total de ganglioni identificați pe piesa operatorie, înmulțit cu 100. În funcție de prezența sau absența metastazelor la distanță am identificat două grupuri de pacienți care au fost supuși analizei statistice comparativ. REZULTATE Lotul de studiu a fost format din 138 de pacienți, din care 38 pacienți (27.54%) au avut una sau mai multe metastaze în momentul diagnosticului cu tumoră manifestă clinic. La cei 100 (72.46%) de pacienți investigațiile efectuate preoperator și explorarea intraoperatorie nu au obiectivat prezența de metastaze. Numărul de pacienți de sex masculin a fost sensibil egal cu cel de sex feminin (47.1% sex masculin, 52.9% sex feminin). Analiza lotului a evidenţiat o frecvenţă crescută a cazurilor din mediul rural 74.64%. Pentru întreaga cohortă, ganglionii limfatici regionali nu au fost sub 12 ganglioni totali în două cazuri, iar în 44.93% din cazuri nu au fost identificate metastaze ganglionare. Afectarea progresivă a ganglionilor limfatici a fost identificată în 53.62% din cazuri din care N1 la 32.61% (n=45) cazuri şi N2 la 21.01% din cazuri (n=29) (Tabel 8.7). 15

Prezenţa metastazelor M0 M1 Total Tabel 8.7. Stadiul tumoral - categoria N în cele două loturi STADIUL TUMORAL Categoria N 0 1 2 X 55 32 12 1 55.00% 32.00% 12.00% 1.00% 7 13 17 1 18.42% 34.21% 44.74% 2.63% 62 45 29 2 44.93% 32.61% 21.01% 1.45% Absenţa metastazelor s-a asociat semnificativ cu absenţa invaziei în ganglionii regionali (55%), iar prezenţa metastazelor cu afectarea progresivă a ganglionilor limfatici 78.95% N1: 34.21% (n=13), N2: 44.74% (n=12)) (χ2=22.79, p=0.00004, 95%CI) (Fig. 8.3). Rezultatele analizei au demonstrat corelaţia semnificativă dintre prezenţa metastazelor la distanţă şi invazia ganglionilor limfatici (r=0.641, p<<0.01, 95%CI) (Tabel 8.8). Total 100 38 138 Fig. 8.3. Stadiul tumoral - categoria N în cele două loturi Din cohorta întreagă de pacienți supusă analizei au fost identificați 38 de pacienți care au prezentat una sau mai multe metastaze la distanță în momentul diagnosticului. Repartiția metastazelor a identificat o predominanță a localizărilor hepatice (n=23, 16.67%), urmată de localizările peritoneale (n=13, 9.42%). Cele mai rare au fost localizările osoase (n=1, 0.72%) (Fig 8.4). Fig 8.4. Localizarea metastazelor și proporția în lotul de studiu 16

În ceea ce privește localizarea tumorii, au predominat localizările la nivelul colonului stâng (n=80, 57.97%) comparativ cu localizările la nivelul colonului drept (n=59, 42.75%), frecvență întâlnită și la fiecare lot în parte, fără diferențe semnificative între cele două loturi (Tabel 8.20). Studiul a demonstrat faptul că pentru o localizare a tumorii la nivelul colonului stâng frecvenţa cazurilor ce prezintă metastaze este uşor mai ridicată însă nesemnificativ statistic (63.16% - lotul M1 vs. 56% - lotul M0). Localizarea pe segmente anatomice, a arătat o frecvenă crescută, semnificativ statistic a tumorilor localizate la nivelul joncțiunii recto-sigmoidiene (n=11, 28.95%) în lotul cu metastaze, comparativ cu celelalte localizări (χ 2 =10.17, p=0.00142, r=0.64, 95%CI) (Tabel 8.21). Tabel 8.20. Localizarea tumorii pe topografia colonului Prezenţa metastazelor M0 M1 Total Localizare tumoră Colon Colon stg. dr. Ascendent Transvers Descendent Sigmoid Joncţiune 56 45 40 7 18 31 8 56.00% 45.00% 40.00% 7.00% 18.00% 31.00% 8.00% 24 14 12 2 3 10 11 63.16% 36.84% 31.58% 5.26% 7.89% 26.32% 28.95% 80 59 52 9 21 41 19 57.97% 42.75% 37.68% 6.52% 15.22% 29.71% 13.77% Tabel 8.21. Parametrii estimaţi în testarea asocierii localizării tumorale vs. prezenţa metastazelor Localizare tumoră Pearson Chi-pătrat - p 95%CI Coeficient de corelaţie (Spearman Rank R) ascendent 0.8315601 0.36182-0.077626 0.36182 transvers 0.1362546 071203-0.031422 0.71447 descendent 2.179479 0.13986-0.438356 0.14191 sigmoid 0.2893210 0.59066-0.045788 0.59384 joncţiune 10.17703 0.00142 0.6482084 0.00127 Colon dr. 0.7487550 0.38687 0-.073660 0.39056 Colon stg. 0.5790490 0.44669 0.0647766 0.45035 În cohorta analizată cel mai frecvent tip de intervenţie chirurgicală a fost hemicolectomia dreaptă (n=52, 37.68%) şi colectomia stângă joasă (n=38, 27.54%). Analiza comparativă a intervenţiei chirurgicale la cele două loturi a evidenţiat uşoare diferenţe în cazul hemicolectomiei drepte aceasta fiind mai frecventă în lotul fără metastaze M0 (n=41, 41% vs. n=11, 28.95%) şi în cazul colectomiei segmentare stângi înalte de asemeni cu o frevență crescută în lotul fără metastaze (metastaze absente n=12, 12% vs. metastaze prezente n=2, 5.26%). Diferenţe semnificative au fost înregistrate în cazul operaţiei Hartmann, care a fost frecvent efectuată în cazul pacienţilor din lotul M1 (n=11, 29.95%) comparativ cu pacienţii din lotul M0 (n=6, 6%) (χ 2 =13.42, p=0.00025, r=0.72, 95%CI) (Tabel 8.22, Fig8.9, Tabel 8.23). 17 Total 100 38 138 p 95% interval de încredere

Prezenţ a Metast a- zelor M0 M1 Total Tabel 8.22. Tipul intervenţiei chirurgicale în lotul de studiu Colectomi e totala Colectomi e subtotala Tipul de intervenţie chirurgicală Hemicolectom ie dreapta Hemicolectom ie stanga 18 Colectomi e segmentar a Colectomi e stanga inalta Colectomi e stanga joasa Op. Hartman n 4 3 41 3 4 12 28 6 4.00% 3.00% 41.00% 3.03% 4.04% 12.00% 28.00% 6.00% 0 1 11 0 2 2 10 11 0.00% 2.63% 28.95% 0.00% 5.26% 5.26% 26.32% 28.95% 4 4 52 3 6 14 38 17 2.90% 2.90% 37.68% 2.17% 4.35% 10.14% 27.54% 12.32% Evaluarea diametrului tumoral maxim în cancerul de colon Diametrul tumoral maxim a variat între 0.7 cm și 17 cm cu o medie de 5.24 cm. Diametrul tumoral maxim nu a prezentat diferenţe semnificative la pacienţii cu metastaze comparativ cu pacienţii fără metastaze (F=2.57, p=0.11068, 95%CI) (Fig 8.10). Metastaze Tabel 8.24. Indicatorii statistici ai diametrului tumoral maxim vs. metastaze Media diam.max Media Dev.std Er.std Min Max Q25 Mediana Q75-95% -95% M0 5.43 4.95 5.91 2.41 0.24 1.20 17.00 4.00 5.00 7.00 M1 4.72 4.06 5.38 1.98 0.32 0.70 12.00 4.00 4.50 6.00 Total 5.24 4.84 5.63 2.32 0.20 0.70 17.00 4.00 5.00 6.00 Pe baza rezultatelor se poate aprecia faptul că tipul histologic (r=0.26, p=0.043), prezența VELIPI (r=-0.249, p=0.0253, 95%CI) şi numărul ganglionilor pozitivi analizaţi (r=0.26, p=0.0339) sunt factori predictivi importanţi ce influenţează valorile diametrului tumoral maxim (Tabel 8.37, Fig 8.19). Tabel 8.37. Analiza multivariată cu factorii ce influențează valorile diametrului tumoral maxim Corelaţie parţială Diametrul tumoral maxim vs. Coeficient de corelaţie (Beta) Std.Err. (Beta) B Std.Err. B t p 95% interval de confidenţă Intercept 89.08250 51.43991 1.73178 0.087216 Sex -0.176004 0.104997-0.85114 0.50776-1.67628 0.097637 Varsta 0.134893 0.106154 0.03010 0.02369 1.27073 0.207553 Localizare tumoră -0.056894 0.112793-0.08928 0.17701-0.50441 0.615374 Tip metastaze -0.152753 0.134320-0.39881 0.35069-1.13724 0.258878 Invazie seroasă 0.060732 0.112899 0.30465 0.56634 0.53793 0.592135 Tip histopatologic 0.260249 0.126908 1.78960 0.87268 2.05069 0.043613 Grad diferentiere 0.051800 0.131532 0.14340 0.36413 0.39382 0.694775 Invazie -0.249692 0.109532-0.90779 0.39822-2.27961 0.025329 Nr. GGL totali analizati -0.080577 0.116721-0.01679 0.02432-0.69034 0.492002 Nr. GGL pozitivi 0.267161 0.123800 0.15277 0.07079 2.15799 0.033966 Rezultatele analizei multivariate sunt prezentate sugestiv în graficul următor: Evaluarea volumului tumoral și rata tumoră/ganglioni în cancerul de colon Volumul tumoral analizat a variat între 2.1 cm 3 și 221 cm 3 cu o medie de 21.22 cm 3. Raportul tumoră/ganglioni limfatici a variat între 0 și 11.16 cu o medie de 0.88. Tota l 100 38 138

În urma analizei multivariate a factorilor de predicţie se poate aprecia faptul că sexul masculin (r=-0.25, p=0.0404), tipul invaziei (r=- 0.309, p=0.0159, 95%CI) şi stadiul tumoral (r=-0.445, p=0.0192) sunt factori importanţi ce influenţează valorile volumului tumoral (Tabel 8.39). Prezenţa metastazelor tumorale la distanță nu a influenţat valorile volumului tumoral în studiul meu. Tabel 8.39. Analiza multivariată cu factorii predictivi ce influențează volumul T Corelaţie parţială volumul tumoral vs. Coeficient de corelaţie (Beta) Std.Err. (Beta) B Std.Err. B t p 95% interval de confidenţă Intercept 1847.305 839.5475 2.20036 0.030779 Sex (masculin) -0.253602 0.121655-17.073 8.1902-2.08459 0.040422 Varsta 0.023868 0.112017 0.075 0.3507 0.21307 0.831834 Localizare tumoră 0.108551 0.135290 2.322 2.8937 0.80235 0.424817 Tip metastaze 0.217274 0.299630 7.809 10.7695 0.72514 0.470563 Invazie seroasă 0.116858 0.124782 7.968 8.5087 0.93649 0.351947 Tip histopatologic 0.011582 0.171134 1.203 17.7742 0.06768 0.946217 Grad diferentiere -0.134776 0.158139-5.682 6.6665-0.85226 0.396712 Invazie -0.309076 0.125412-15.608 6.3332-2.46449 0.015949 Metastaze -0.015926 0.324795-1.123 22.8998-0.04904 0.961018 Stadiul tumoral -0.445870 0.186545-22.280 9.3217-2.39014 0.019287 Nr. GGL totali analizati -0.122549 0.133194-0.356 0.3867-0.92008 0.360405 Nr. GGL pozitivi 0.035428 0.134180 0.391 1.4816 0.26403 0.792460 Rezultatele analizei multivariate sunt prezentate sugestiv în graficul următor: Pareto Chart of t-values for Coefficients; df=77 Variable: VOLUMUL TUMORAL [CM 3 ] Sigma-restricted parameterization Invazie Stadiul tumoral Sex masculin 2.084592 2.464485 2.390142 Invazie seroasa Nr.GL totali analizati Gr.diferentiere Localizare tumora Tip metastaze.9364947.9200786.8522623.8023545.7251414 Nr. GGL pozitivi Varsta Tip histopatologic Metastaze.2640323.2130716.067678.0490354 Fig.8.21. Valoare absolută a statisticii t în evaluarea analizei multivariate Analiza parametrilor predictivi asupra raportului tumoră/ganglioni limfatici pe baza corelaţiei multiple demonstrează prezenţa unei asocieri semnificative între parametrii şi rata volumul tumoral/ganglioni. În urma analiza multivariate a factorilor de predicţie se poate aprecia faptul că stadiul tumoral (r=0.621, p=0.0005, 95%CI), prezenţa metastazelor (r=-0588, p=0.0404), numărul ganglionilor totali analizaţi (r=0.37, p=0.0017) şi sexul masculin (r=-0.334, p=0.0026) sunt factori importanţi ce influenţează valorile raportului tumoră/ganglioni limfatici (Tabel 8.41). Tabel 8.41. Analiza multivariată cu factorii predictivi ce influențează rata tumoră/ganglioni 19 p=.05 t-value (for Coefficient;Absolute Value)

Corelaţie parţială TUMOUR NODE RATIO vs. Coeficient de corelaţie (Beta) Std.Err. (Beta) B Std.Err. B t p 95% interval de confidenţă Intercept 165.2587 56.31138 2.93473 0.004428 Sex (masculin) -0.334327 0.107629-1.7067 0.54945-3.10629 0.002674 Varsta 0.127048 0.099303 0.0300 0.02349 1.27940 0.204700 Localizare tumoră -0.138471 0.118694-0.2264 0.19404-1.16662 0.247058 Tip metastaze 0.210288 0.262369 0.5716 0.71317 0.80150 0.425377 Invazie seroasă -0.208406 0.114110-1.0929 0.59839-1.82636 0.071775 Tip histopatologic 0.031358 0.159139 0.2456 1.24642 0.19705 0.844324 Grad diferentiere 0.173672 0.155220 0.5738 0.51280 1.11887 0.266766 Invazie -0.057983 0.121984-0.2209 0.46477-0.47534 0.635929 Metastaze -0.588524 0.296060-3.1408 1.58001-1.98785 0.040478 Stadiul tumoral 0.621194 0.172402 2.4218 0.67214 3.60316 0.000563 Nr. GGL totali analizati 0.379671 0.117210 0.0835 0.02577 3.23924 0.001787 Nr. GGL pozitivi -0.231502 0.117758-0.1944 0.09886-1.96591 0.053011 Rezultatele analizei multivariate sunt prezentate sugestiv în graficul următor: Pareto Chart of t-values for Coefficients; df=75 Variable: (Volumul TUMOUR/PROCENT NODE) RATIO Sigma-restricted parameterization Stadiul tumoral Nr. GGL total analizati Sex masculin 3.239235 3.106295 3.60316 Metastaze Nr. GGL pozitivi Invazie seroasa 1.965907 1.826364 2.1987852 Varsta Localizare tumora Gr. diferentiere Tip metastaze Invazie Tip histopatologic 1.279401 1.166624 1.118871 0.8014954 0.4753361 0.1970464 Fig.8.22. Valoare absolută a statisticii t în evaluarea analizei multivariate Evaluarea gradului de predicţie a parametrilor tumorali în supraviețuirea globală a pacienților Diametrul tumoral nu a influențat supraviețuirea pacienților incluși în studiu, având o slabă putere discriminatorie asupra grupurilor de pacienți (HR=1.009(0.614 1.66); p=0.372), astfel încât valoarea diametrului tumoral nu a fost factor determinant în supraviețuire (Fig. 8.26). p=.05 t-value (for Coefficient;Absolute Value) Fig.8.26. Curbele de supraviețuire în funcție de valorile diametrului tumoral maxim Atât valorile volumului tumoral cât și rata volum tumoral/ganglioni limfatici au determinat o evoluție similară a grupurilor de pacienți supuse analizei, fără a se înregistra diferențe 20

semnificative statistic (p=0.914 și respectiv p=0.687) în ceea ce privește supraviețuirea generală (Fig. 8.27). Fig.8.27. Curbele de supraviețuire în funcție de volumul tumoral și rata tumoră/ganglioni limfatici DISCUȚII Stadializarea TNM ia în considerare penetrarea tumorală la nivelul peretelui colonic, statusul ganglionar, prezența invaziei limfatice, vasculare, perineurale și a metastazelor la distanță. Dimensiunile tumorale și volumul tumoral nu și-au găsit utilitatea în această stadializare și în prezicerea evoluției clinice a pacienților. Deși stadializarea TNM este singurul marker cu suficientă putere prognostică, ce poate identifica pacienții cu risc crescut de recidivă, cu toate acestea nu se poate face discriminarea pacienților aflați în același stadiu de boală (60, 61). Categoria N, din clasificarea TNM, pare să aibă cea mai mare putere prognostică, fiind bine știut faptul că prezența invaziei vasculo-limfo-ganglionare, este factor de prognostic negativ (150). Dimensiunea tumorală și penetrarea în profunzime sunt corelate cu metastazele ganglionare în cancerele colorectale mici. Cu toate acestea o tumoră de mici dimensiuni este posibil să nu reprezinte tot timpul un parametru eligibil pentru estimarea riscului de metastaze ganglionare. O dimensiune a tumorii redusă nu este echivalentul unui stadiu timpuriu de boală (237). Deși există studii care susțin că dimensiunea tumorală s-a asociat semnificativ statistic cu intervalul liber de boală și supraviețuirea specifică în cancer la pacienții cu neoplasm de colon, dar nu și la cei cu neoplasm de rect (238) în lotul nostru diametrul tumoral, volumul tumoral și rata volum tumoral/gangloni limfatici au determinat o evoluție similară a grupurilor de pacienți supuse analizei, fără a se înregistra diferențe în ceea ce privește supraviețuirea. 21

CAPITOLUL 9. EVALUAREA STATUSULUI GANGLIONAR LA PACIENȚII CU NEOPLASM DE COLON Obiective Scopul principal al acestui studiu este reprezentat de evaluarea limfo-ganglionară la pacienții cu neoplasm de colon și rolul acestora în corecta stadializare a pacienților. Obiectivele acestui studiu au fost: - evaluarea statusului ganglionar la pacienții cu neoplasm de colon - evaluarea potențialilor factori cu rol în determinarea numărului de ganglioni totali, negativi și pozitivi identificați pe piesa se exereză chirurgicală - evaluarea parametrilor clinici și histopatologici în funcție de numărul de ganglioni totali analizați - evaluarea prognosticului pacienților în funcție de stadializarea TNM și rolul statusului ganglionar în supraviețuirea pacienților MATERIAL ŞI METODE Am efectuat un studiu retrospectiv efectuat în perioada 2007-2013 desfășurat în Clinica a III-a Chirurgie a Spitalului Clinic Județean de Urgență Sfântul Spiridon Iași și în Clinica I Chirurgie Oncologică a Institutului Regional de Oncologie Iași. În funcție de numărul de ganglioni totali identificați pe piesa operatorie pacienții au fost împărțiți în două grupuri: un grup ce a inclus pacienții la care s-au identificat 12 sau mai mulți ganglioni și un grup la care s-au identificat mai puțin de 12 ganglioni totali pe piesa de exereză chirurgicală. Nivelul de semnificaţie a fost considerat 0,05 (5%) cu probabilitatea de 95%. Analiza supraviețuirii a fost efectuată cu ajutorul curbei Kaplan Meier. REZULTATE Am identificat un număr total de 415 pacienți care au fost supuși analizei statistice. Pacienții au fost împărțiți în două loturi de pacienți, în funcție de numărul de ganglioni totali analizați: un lot cu peste 12 ganglioni analizați (Lotul 1-329 pacienți) și un lot cu mai puțin sau egal de 12 ganglioni totali analizați (Lotul 2-86 pacienți), ce au fost analizați comparativ. Pentru a investiga impactul numărului de ganglioni s-a realizat o a doua clasificare ce împarte lotul 1 în categorii având între 12-20 ganglioni totali (n=119, 36.17%), 20-30 ganglioni (n=114, 34.65%) și peste 30 de ganglioni (n=96, 29.17%). În paralel, pacienții au fost clasificați pe baza absenței sau prezenței ganglionilor pozitivi, cu 22

categorii de pacienți având 1 sau 2 ganglioni (n=87) și peste 2 ganglioni pozitivi (n=125, 37.99%). Evaluarea numărului de ganglioni totali în funcție de parametrii clinic-histopatologici în lotul de studiu Numărul de ganglioni totali recoltați a variat în funcție de localizarea tumorii la nivelul colonului drept sau stâng (p<0.001). Tabel 9.3. Caracteristici generale în funcțíe de caracteristicile clinico- histopatologice Sex pv Mean Median pts number pv Mean Median pts number pv Mean Median pts number B 0.7364 8.82 9 49 0.7153 26.15 22 182 0.6775 22.47 19 231 F 1.0 (reference) 8.57 10 37 1.0 (reference) 26.73 24 147 1.0 (reference) 23.08 21 184 Varsta (ani) <60 1.0 (reference) 7.73 8.5 30 1.0 (reference) 28.26 24 95 1.0 (reference) 23.34 21 125 60-70 0.0952 9.22 10 23 0.4565 26.51 22 119 0.8570 23.71 20 142 >70 0.0223 9.24 11 33 0.1052 24.69 21 114 0.2756 21.22 18 147 Localizare Colon Drept 1.0 (reference) 8.93 10 27 1.0 (reference) 27.22 24 173 1.0 (reference) 24.75 22 200 Colon Drept-Stang NA 6.00 6 1 0.4881 35.40 21 10 0.4684 32.73 18 11 Colon Stang 0.7345 8.66 9 58 0.1145 24.83 21.5 146 0.0001 20.23 17 204 Localizare regiuni Ascendent 1.0 (reference) 9.65 11 20 1.0 (reference) 26.73 23 141 1.0 (reference) 24.61 22 161 Descendent 0.7550 9.30 9.5 10 0.5280 28.26 25 46 0.9079 24.88 22 56 Jonctiune 0.2044 7.50 7.5 8 0.5816 25.07 23 15 0.0366 18.96 18 23 Sigmoid 0.3292 8.79 10 39 0.0061 22.67 19 84 <0.0001 18.27 16 123 Transvers 0.0375 6.86 7 7 0.2874 30.29 27.5 24 0.9033 25.00 21 31 Două regiuni NA 6.00 6 2 0.3965 32.21 24 19 0.4016 29.71 23 21 Tip histopatologic Adenocarcinom 1.0 (reference) 8.74 10 82 1.0 (reference) 25.58 22 290 1.0 (reference) 21.87 19 372 Adenocarcinom Mucin NA NA NA NA NA 23.00 23 2 NA 23.00 23 2 Mucinos 0.6749 8.00 8.5 4 0.0036 33.08 27 37 0.0006 30.63 26 41 Grad de diferentiere Lotul 2 < 12 ganglioni (n=86) Lotul 1 >12 ganglioni (n=329) Toti pacientii (n=415) Nediferentiat NA NA NA NA 0.3494 27.60 29 5 0.0961 27.60 29 5 Slab Differentiat 0.2862 8.89 10 18 0.1241 27.77 24 73 0.1408 24.03 21 91 Moderat Differentiat 0.1469 9.14 10 50 0.3262 25.99 22 157 0.5161 21.92 19 207 Bine Differentiat 1.0 (reference) 7.50 9 16 1.0 (reference) 24.08 21 64 1.0 (reference) 20.76 18 80 Mix NA NA NA NA 0.9892 24.00 18 5 0.5816 24.00 18 5 Pacienții cu tumori ale colonului drept au avut un număr mediu de ganglioni totali analizați (24.75) semnificativ crescut comparativ cu pacienții cu tumori localizate la nivelul colonului stâng (20.23) (p<0.0001). În schimb lotul 1 a avut un număr de ganglioni totali recoltați semnificativ mai mare pentru tumorile localizat la nivelul colonului drept (27.22) comparativ cu lotul 2 (8.93) (p<0.0001). Evaluarea numărului de ganglioni pozitivi în funcție de parametrii clinic-histopatologici în lotul de studiu Pacienții cu peste 12 ganglioni totali analizați și în special cei din categoria cu peste 30 ganglioni totali, au avut un număr de ganglioni pozitivi identificați mai mare decât pacienții cu sub 12 ganglioni totali. Numărul de ganglioni pozitivi a fost semnificativ mai mare la pacienții din categoria cu mai puțin de 20 de ganglioni negativi (p<0.001). Tumorile ce au prezentat invazia seroasei au avut un număr de ganglioni pozitivi semnificativ mai mare (p<0.001) comparativ cu 23

tumorile fără invazie în seroasă, rezultate similare în ambele loturi (ambele p<0.01). Evaluarea numărului de ganglioni negativi în funcție de parametrii clinic-histopatologici în lotul de studiu Numărul de ganglioni negativi a fost influențat de numărul de ganglioni totali analizați (p<0.001). În lotul 1 numărul de ganglioni negativi a fost semnificativ mai mare comparativ cu lotul 2 (p<0.001, χ 2 =0.001) (Fig 9.5). Numărul de ganglioni negativi a fost influențat atât de numărul de ganglioni totali cât și de numărul de ganglioni pozitivi la lotul 1 (ambele p<0.001). Evaluarea gradului de predicție a parametrilor histopatologici în supraviețuirea pacienților Curbele de supraviețuire a pacienților clasificați după stadiul T au arătat că riscul de a deceda crește semnificativ odată cu stadiul tumorii, de la T1 spre T4 (HR=1.94(1.39 2.71), p<0.005). Pacienții aflați în stadii avansate, T3-T4 au un risc de deces semnificativ mai ridicat decât pacienții T1-T2 (HR=5.89(1.46-23.9), p<0.005). Pacienții cu tumori T4 au avut cea mai scurtă supraviețuire comparativ cu celelalte stadii T (Fig. 9.15). Fig.9.15. Curbele de supraviețuire în funcție de stadiul T pentru cohorta de studiu Stadiul N a fost direct corelat cu supraviețuirea cu diferențe semnificative între stadii (HR=1.388(1.16 1.67), p<0.0001). Astfel pacienții din stadiul N2 au avut cea mai scurtă supraviețuire comparativ cu celelalte categorii. Atunci când combinăm categoria N0 cu Nx, diferența între stadiile N0-x și N2 devine și mai semnificativă (HR=1.94(1.55 2.43), p<0.0001) (Fig. 9.17). Fig.9.17. Curbele de supraviețuire în funcție de stadiul N pentru cohorta de studiu Pacienții N0-x au avut o supraviețuire mai bună decât ceilalți pacienți, în timp ce pacienții din grupa N1 au avut un risc de deces mai mare decât N0-x dar mai mic decât pacienții cu stadiul N2 (Fig. 9.17). 24

Numărul de ganglioni pozitivi este un factor determinant în supraviețuirea pacienților. Astfel pacienții cu peste 3 ganglioni pozitivi au o supraviețuire globală mai scurtă comparativ cu pacienții cu 1-2 ganglioni pozitivi sau fără metastaze ganglionare (HR=1.917(1.55 2.38), p<0.0001). DISCUȚII Cunoștințele din ziua de astăzi susțin faptul că relația dintre numărul de ganglioni evaluați, stadializare și supraviețuire este mult mai compleză decât a anticipat Dukes (149). Utima ediție a clasificării TNM recomandă minim 12 ganglioni limfatici, pentru o corectă integrare a pacienților din punct de vedere a categoriei N în stadiile tumorale I-IV (239-241). Ediția a 7a a clasificării TNM, prin evaluarea tumorii, ganglionilor limfatici și a metastazelor și-a dovedit superioritatea față de ediția a 6 a, printr-o acuratețe superioară în ceea ce privește stadializarea pacienților (242). Cu toate acestea există unele studii care recomandă ca un număr cuprins între 20-23 ganglioni să fie analizați pentru o corectă stadializare (243, 244). Scopul acestui studiu a fost de a evalua statusul ganglionar al pacienților diagnosticați cu neoplasm de colon, supuși unei intervenții chirurgicale pentru această patologie și corelarea acestuia cu diverși factori histopatologici. Numărul de ganglioni limfatici pozitivi joacă un rol important în sistemul TNM dar stadiul N este ușor influențat de o serie de factori. Markerii pentru evaluarea calității ganglionilor limfatici sunt reprezentați de recolta de ganglioni limfatici ca și indicator pentru chirurg, anatomopatolog și chiar performanța spitalului, în timp ce markerii pentru evaluarea cantității ganglionilor sunt reprezentați de balanța dintre numărul total de ganglioni și modele aplicate pentru evaluarea relației dintre ganglionii pozitivi și negativi (limph nodes ratio) (154). Printre factorii care influențează numărul de ganglioni recoltați se numără și dimensiunea spitalului în care se realizează intervenția chirurgicală, existând studii care susțin că volumul spitalului redus în ceea ce privește patologia colonică poate determina o substadializare a cazurilor, comparativ cu spitalele cu un volum mult crescut, în care intervențiile chirurgicale pentru patologia colorectală neoplazică se practică de rutină (152). Tehnica chirurgicală aplicată de chirurg sau practica uilizată de anatomopatolog în căutarea numărului de ganglioni pe piesa operatorie se răsfrâng asupra numărului de 25

ganglioni totali astfel încât migrarea între stadii se poate produce datorită acestor factori (251). Numărul de ganglioni totali este influențat și de factori operatori independenți, care includ: localizarea tumorii, stadiul bolii, mărimea tumorii, răspunsul imun al gazdei, și aspecte moleculare precum instabilitatea microsatelitară (252, 253). CAPITOLUL 10. ANALIZA DIFERENȚELOR CLINICO- HISTOPATOLOGICE ÎN FUNCȚIE DE TOPOGRAFIA TUMORALĂ ÎN CANCERUL DE COLON Scopul studiului a fost reprezentat de identificarea diferențelor histopatologice, chirurgicale și clinice ce pot apărea la pacienții cu același diagnostic, neoplasmul de colon dar cu localizarea tumorii diferită: colon drept versus colon stâng. MATERIAL ŞI METODE Am efectuat un studiu retrospectiv desfășurat în perioada 2007-2013 în Clinica a III-a Chirurgie a Spitalului Clinic Județean de Urgență Sfântul Spiridon Iași și în Clinica I Chirurgie Oncologică a Institutului Regional de Oncologie Iași, ce a inclus pacienții ce au fost diagnosticați cu neoplasm de colon. Localizarea la nivelul colonului drept a fost definită drept localizarea tumorii de la nivelul cecului până la nivelul colonului transvers inclusiv. Localizarea la nivelul colonului stâng a fost definită drept localizarea tumorii de la nivelul colonului descendent până la nivelul joncțiunii rectosigmoidiene. Nivelul de semnificaţie a fost considerat 0,05 (5%) cu probabilitatea de 95%. Analiza supraviețuirii a fost efectuată cu ajutorul curbelor Kaplan Meier. REZULTATE În funcție de localizarea tumorii pe topografia tumorii, pacienții au fost grupați în două loturi: 1. Lotul 1- pacienții ce au prezentat localizarea tumorii la nivelul colonului drept (200 pacienți) 2. Lotul 2- pacienții ce au prezentat localizarea tumorii la nivelul colonului stâng (215 pacienți) Aspecte corelaționale privind parametrii demografici și histopatologici Repartiția pe grupe de vârstă nu a arătat diferențe semnificative între cele două loturi (p=0.0852, χ 2 =0.086), media de vârstă fiind similară (65.48 colon drept versus 64.15 colon stâng) (Tabel 10.1). În 26

lotul cu tumori localizate la nivelul colonului drept, există o predominanță a pacienților cu vârsta de peste 70 ani (n=82), comparativ cu lotul cu tumori localizate la nivelul colonului stâng (n=63), semnificativă statistic (p=0.0371). Localizare colon Tabel 10.1. Indicatorii statistici ai vârstei vs. localizarea tumorii (colon drept/stâng) Media vârstă Media Dev.std Er.std Min Max Q25 Mediana Q75-95% -95% Drept 65.48 63.91 67.06 11.22 0.80 32.00 88.00 59.00 67.00 75.00 Stâng 64.15 62.74 65.55 10.41 0.71 29.00 87.00 57.00 64.00 72.00 Total 64.79 63.74 65.84 10.82 0.53 29.00 88.00 58.00 65.00 73.00 La nivelul colonului drept au predominat tumorile în stadiul UICC-3 (n=87, 43.50%), în timp ce pe colonul stâng au predominat tumorile UICC-2 (n=78, 36.28%) (Tabel 10.3). Pacienții cu tumori pe colonul stâng, au avut o fecvență mai mare a cazurilor cu tumori în stadiul UICC-4 (n=47, 21.86%) comparativ cu tumorile pe colonul drept (n=31, 15.50%). Tabel 10.3. Parametrii estimaţi în testarea asocierii localizării tumorii vs. stadiul tumoral Localiz. colon Carcimon in situ STADIUL TNM - 1 STADIUL TNM - 2 STADIUL TNM - 3 STADIUL TNM - 4 drept 1 6 75 87 31 200 0.50% 3.00% 37.50% 43.50% 15.50% stâng 4 10 78 76 47 215 1.86% 4.65% 36.28% 35.35% 21.86% Total 5 16 153 163 78 415 Evaluarea numărului de ganglioni totali analizați a arătat diferențe semnificative între cele două loturi cu un număr de ganglioni totali semnificativ mai mare pentru colonul drept (p<0.001) comparativ cu colonul stâng. Media numărului de ganglioni totali pentru tumorile localizate pe colonul drept a fost de 24.77 comparativ cu 21.07 media numărului de ganglioni totali pentru tumorile localizate pe colonul stâng (p<0.001) (Tabel 10.4). În mod similar, tumorile localizate pe colonul drept, au avut un diametru tumoral mai mare și s-au asociat cu un număr de ganglioni pozitivi mai mare decât localizările pe colonul stâng, dar fără diferențe semnificative. Frecvența pacienților cu diferite tipuri histopatologice a variat semnificativ statistic între cele două loturi (p=0.0381, χ 2 =0.0559). Adenocarcinomul mucinos a fost mai frecvent în localizările pe colonul drept (n=17, 8.5%) comparativ cu localizările pe colonul stâng ( n=1, 0.46%) (p=0.0319). Total 27

Aspecte corelaționale privind caracteristicile macroscopice tumorale și clinice Evaluarea aspectelor macroscopice ale tumorii a arătat diferențe între cele două loturi de pacienți în funcție de diverși parametrii. Analiza dimensiunii tumorale a arătat o predominanță a diametrului tumoral maxim de peste 5 cm pe colonul drept (n=99, p=0.1621, χ 2 =0.1672) comparativ cu localizările pe colonul stâng unde am întâlnit o frecvență mai mare a tumorilor sub 5 cm (n=116), dar nesemnificativă statistic (p=0.1627, χ 2 =0.1672). Tumorile pe colonul drept au fost ulcerate (n=180, p=0.0306, χ 2 =0.0375) și vegetante (n=167, p=0.006, χ 2 =0.0082), comparativ cu localizările pe colonul stâng. În schimb tumorile de pe colonul stâng au fost stenozante (n=127, p=0.0699, χ 2 =0.0748). Tumorile pe colonul stâng au prezentat fenomene de stenoză (n=125, p=0.0275, χ 2 =0.0292) manifestându-se prin ocluzie intestinală la momentul internării (n=47, p=0.0146, χ 2 =0.0188), în schimb tumorile pe colonul drept au avut mai frecvent ca primă manifestare hemoragia digestivă (n=50, 25%). Aspecte corelaționale privind mortalitatea intraspitalicească și postoperatorie Din lotul analizat, 8 pacienți au decedat pe durata spitalizării. Evaluarea parametrilor histopatologici ce ar putea influența decesul intraspitalicesc a arătat că stadiul tumoral UICC nu influențeaza semnificativ statistic mortalitatea pe durata spitalizării (p=0.5904). Stadiul T4 a predominant la pacienții la care s-a înregistrat decesul intraspitalicesc (n=5, p=0.0385). Numărul zilelor de spitalizare în funcție de localizarea tumorală a variat pentru pacienții decedați pe durata internării. Astfel pentru localizările pe colonul drept a existat o medie a zilelor de spitalizare de 8 zile, comparativ cu localizările pe colonul stâng unde media a fost de 5.17 zile. Corelația statistică a fost semnificativă între numărul de zile de spitalizare și decesul intraspitalicesc al pacienților (p=0.035). Mortalitatea intraspitalicească nu a fost influențată de stadiul N (p=0.576), prezența sau absența metastazelor ganglionare (p=0.7244) sau la distanță (p=0.1962). 28

Evaluarea gradului de predicție a parametrilor clinicohistpatologici în supraviețuirea globală a pacienților Supraviețuirea globală a pacienților a fost similară, independent de localizarea tumorii la nivelul colonului drept sau stâng (HR=1.195(0.822 1.74), p=0.35). În funcție de stadiul tumoral UICC, analiza curbei de supraviețuire a arătat faptul că pacienții cu tumori în stadiul 4 au avut cea mai scurtă supraviețuire (p<0.0001), cu un risc de deces de aproximativ 3 ori mai mare decât celelalte stadii. Tumorile localizate pe colonul drept UICC-4 (p=0.0182) au avut cea mai scurtă supraviețuire comparativ cu tumorile UICC-4 localizate pe colonul stâng (p=0.062). Cea mai bună supraviețuire au avut pacienții UICC1 localizate pe colonul stâng (HR=1.059(0.973 1.15), p<0.0001). Atunci când am grupat stadiile, rezultatele au arătat că pacienții cu localizări pe colonul drept stadiile 3-4 au avut cea mai scurtă supraviețuire comparativ cu localizările pe colonul stâng (HR=1.085(0.921 1.28), p <0.0001) (Fig. 10.6). Fig.10.6. Curbele de supraviețuire Kaplan-Meier pentru lotul de studiu în funcție de localizarea tumorii și stadiul UICC/TNM Analiza multivariată, după modelul Cox a arătat că stadiul N (p<0.0001), stadiul M (p<0.0001) și hemoragia digestivă inferioară (p<0.05) sunt factori importanți ce influențează supraviețuirea pacienților. 29

10.4 DISCUȚII Există studii care susțin că neoplasmul de colon drept este diferit de neoplasmul de colon stâng sau cancerul rectal. Cancerul de colon drept este frecvent asociat cu anemia, vârstă înaintată și un stadiu mult avansat (275, 276). Cancerul de colon drept se asociază cu vârsta înaintată a pacienților, prezentarea în urgență, anemie, stadiu tumoral T avansat, tumori slab diferențiate comparativ cu tumorile localizate la nivelul colonului stâng sau rect (277). Numărul de ganglioni totali variază în funcție de topografia tumorii. Astfel numărul de ganglioni recoltați este semnificativ mai mare pentru tumorile de pe colonul drept comparativ cu localizările la nivelul colonului stâng (278), cu o creștere progresivă a numărului de ganglioni totali identificați de la o perioadă la alta pentru această localizare (153). LNR în cancerul de colon drept se asociază cu un număr de ganglioni pozitivi crescuți simultan cu un număr de ganglioni totali scăzuți (163). Adenocarcinomul mucinos este considerat a fi mai frecvent în localizările la nivelul colonului drept (279, 280). Totodată tumorile de pe colonul drept au dimensiuni mai mari decât tumorile de pe colonul stâng, cu o predominanță a tumorilor polipoide și circumferențiale pe această parte (279). Tabel 10.8. Analiza multivariată după modelul COX în supraviețuirea pacienților incluși în studiu Model cu toti parametri inainte de analiza stepwise (stepaic) sectiunea 1a Categoria HR (95% CI) p-value Varsta (ani) 1.27 (1.03-1.57) 0.02636 Localizare (Colon Stang/Colon Drept) 1.41 (0.92-2.16) 0.11210 Stadiul tumor (T) 1.57 (0.95-2.6) 0.07989 Stadiul N 1.7 (1.27-2.28) 0.00042 Stadiul M 2.93 (1.83-4.69) 0.00001 Ocluzie 0.45 (0.3-0.69) 0.00024 Perforatie 0.71 (0.24-2.09) 0.53550 Hemoragie 1.91 (1.18-3.1) 0.00846 Histologie 0.62 (0.28-1.36) 0.22960 VELIPI+ 0.71 (0.38-1.31) 0.27470 Invazie seroasa 0.86 (0.5-1.48) 0.59000 Gradul de diferentiere 0.81 (0.59-1.1) 0.17120 Model cu toti parametri dupa analiza de reducere a parametrilor sectiunea 1b Categoria HR (95% CI) p-value Varsta (ani) 1.33 (1.09-1.63) 0.00525 Stadiul N 1.6 (1.25-2.05) 0.00021 30

Stadiul M 2.65 (1.73-4.07) 0.00001 Ocluzie 0.45 (0.31-0.67) 0.00006 Hemoragie 1.67 (1.06-2.64) 0.02655 Model cu toti parametri dupa analiza de reducere a param (stepaic) sectiunea 1c stratificat dupa varsta si ocluzie Categoria HR (95% CI) p-value Stadiul N 1.64 (1.29-2.09) 0.00007 Stadiul M 2.87 (1.88-4.38) 0.00000 Hemoragie 1.62 (1.03-2.55) 0.03697 CAPITOLUL 11. CORELAȚII CLINICO-PATOLOGICE ÎN FUNCȚIE DE CARACTERUL ELECTIV SAU URGENȚĂ ÎN CANCERUL DE COLON INTRODUCERE Am dorit evaluarea parametrilor ce ar putea influența tehnica chirurgicală rezecțională aplicată pacienților cu această patologie. Evaluarea caracterului de urgență sau electiv al bolii a fost raportat la parametrii clinico-histopatologici pentru pacienții incluși în studiu. Am evaluat acuratețea actului chirurgical în funcție de numărul de ganglioni totali recoltați identificați pe piesa operatorie. MATERIAL ŞI METODE Am efectuat un studiu retrospectiv ce s-a desfășurat în clinica aiiia Chirugie Generală a Spitalului Sf. Spiridon, Iași și Institutul Regional de Oncologie Iași, Clinica I Chirurgie Oncologică, ce a inclus toți pacienții ce au beneficiat de chirurgie rezecțională. Pacienții incluși în studiu au fost împărțiți în funcție de caracterul electiv sau în urgență a momentului operator. REZULTATE Au fost incluși în studiu 415 pacienți. În funcție de caracterul de urgență sau electiv al intervenției chirurgicale, pacienții au fost împărțiți în două loturi: electiv (n=303, 73.01%) versus urgență (n=112, 26.99%). Analiza repartiției pe grupe de vârstă a lotului de studiu a arătat diferențe semnificative între cele două categorii de pacienți (p<0.0001), cu o predominanță a pacienților cu grupa de vârstă peste 80 ani și 60-79 ani în lotul operat electiv (p<0.0001) (Tabel 11.1). Repartiția pe sexe a arătat o predominanță a pacienților de sex masculin (n=229, 55.18%) comparativ cu pacienții de sex feminin (n=186, 44.82%), cu o predominanță a bărbaților la cele două loturi, fără diferențe semnificative (p=0.0842). Tabel 11.1. Repartiţia cazurilor pe grupe de vârstă vs. electiv/urgenţă 31

Vârsta pacienţilor sub 40 ani 40-59ani 60-79ani Peste 80ani Total Urgenţă 3 31 75 3 2.68% 27.68% 66.96% 2.68% 112 Electiv 6 83 193 21 1.98% 27.39% 63.70% 6.93% 303 Total 9 114 268 24 415 Fig. 11.1. Repartiţia cazurilor pe grupe de vârstă vs. electiv/urgenţă Se remarcă faptul că în perioada 2007-2009 frecvenţa maximă a fost întâlnită pentru vârste mai mici de 59 ani (n=58, 35.80%), însă după 2010 a crescut semnificativ frecvenţa cazurilor cu vârste peste 60 ani (2010-2011: n=85, 73.91%; 2012-2013: n=92, 66.67%) (Tabel 12.1). Am identificat o creștere semnificativă a numărului de ganglioni totali analizați pentru cazurile operate în regim de urgență (p<0.05) cu o frecvență mai mare a cazurilor cu peste 12 ganglioni totali recoltați în urgență. În urgență au fost analizați o medie de 26.40 ganglioni totali, comparativ cu 21.10 ganglioni totali identificați la lotul operat în urgență (Tabel 11.3). Tabel 11.2. Repartiţia anuală a cazurilor pe grupe de vârstă 2007-2009 2010-2011 2012-2013 Total Vârsta pacienţilor sub 40 ani 40-59ani 60-79ani Peste 80ani 3 58 91 10 1.85% 35.80% 56.17% 6.17% 3 23 85 4 2.61% 20.00% 73.91% 3.48% 3 33 92 10 2.17% 23.91% 66.67% 7.25% 9 114 268 24 2.17% 27.47% 64.58% 5.78% Total 162 115 138 415 32

Fig. 11.2. Repartiţia anuală a cazurilor pe grupe de vârstă Fig. 11.3. Diametrul tumoral maxim, nr ganglioni totali și pozitivi analizați electiv/urgență În mod similar, numărul de ganglioni pozitivi a fost mai mare la pacienții operați în urgență comparativ cu lotul operat electiv, dar fără diferențe semnificative. Diametrul tumoral maxim a fost similar între cele două loturi. Cazurile cu sub 12 ganglioni totali recoltați au fost mai numeroase la lotul operat electiv (n=69, 82.14%) comparativ cu lotul operat în urgență (n=15, 17.86%) (Tabel 11.4) Tabel 11.3. Momentul intervenţiei chirurgicale vs. nr. ganglionilor analizaţi <12 GGL >12 GGL Total 2007-2009 urgenţă 10 61 71 14.08% 85.92% 63.39% electiv 26 65 91 28.57% 71.43% 30.03% Total 36 126 162 22.22% 77.78% 2010-2011 urgenţă 5 36 41 12.20% 87.80% 36.61% electiv 15 59 74 20.27% 79.73% 24.42% Total 20 95 115 17.39% 82.61% 2012-2013 urgenţă 0 10 10 0 10% 10.00% electiv 18 110 128 13.04% 79.71% 42.24% Total 28 110 138 20.29% 79.71% Analiza stadiului tumoral nu a arătat diferențe între cele două loturi (p=0.50). Pacienții aflați în stadiul tumoral UICC-2 și UICC-3, au 33

fost cei mai frecvenți în ambele loturi, dar fără diferențe semnificative (Electiv: UICC-2 n=112, 36.96%; UICC-3 n=109, 35.71%; Urgență: UICC-2 n=40, 35.71%; UICC-3 n=53, 47.32%). Pacienții în stadiul 4 au fost mai numeroși în lotul operat electiv (n=51, 16.83%), comparativ cu lotul operat în urgență (n=27, 24.10%), dar fără diferențe semnificative. Au predominat tumorile T3 în cele două loturi (Electiv: n=192, 63.36% și Urgență: n=84, 75%), urmate de tumorile T4 (Electiv: n=72, 23.76% și Urgență: n=33, 29.46%), fără diferențe semnificative între loturi. Aproximativ 45.2% (n=157) au prezentat metastaze ganglionare la momentul diagnosticului din lotul operat electiv în timp ce în lotul operat în urgență proporția a fost mai mare 66.07% (n=74), diferență semnificativă (p=0.0243). (Tabel 11.5). Peste 50 % (n=67) din pacienții operați în urgență au avut ca manifestare clinică principală ocluzia intestinală comparativ cu lotul electiv (n=8, 2.64%) (p<0.0001). În mod similar și pacienții cu perforație colonică au fost mai frecvenți în lotul operat în urgență (n=13, 11.60%) comparativ cu lotul electiv (n=1, 0.33%) (p<0.0001). Manifestările de hemoragie digestivă inferioară au fost de asemenea crescute în lotul operat în urgență, cu valori semnificative comparativ cu lotul operat electiv (Electiv: n=50, 16.50% și Urgență: n=47, 41.965) (p<0.0001). În ceea ce privește intervenția chirurgicală, analiza statistică a arătat o predominanță operațiilor tip Hartmann (n=23, 20.53%) practicate în urgență (p=0.0002, χ 2 =0.0001) cu o frecvență crescută a colostomelor (n=30, 26.78%) (p=0.0001, χ 2 =0.0001). În regim electiv au fost practicate mai multe anastomoze intestinale (n=263, 86.79%) (p<0.0001, χ 2 =0.0000), cu diferențe semnificative între numărul de anastomoze și cel de colostome între cele două loturi de pacienți (p<0.0001). Analiza curbelor de supraviețuire Kaplan-Meier în funcție de momentul operator Pacienții operați în regim electiv au avut o durată de supraviețuire semnificativ mai mare comparativ cu pacienții operați în urgență (HR=1.718(1.19 2.49), p=0.00368). Pacienții internați în urgență au avut un risc de deces de aproximativ 2 ori mai mare decât pacienții internați în regim electiv (Fig. 11.10). 34

Fig. 11.10. Curbele Kaplan-Meier pentru supraviețuirea globală electiv vs urgență DISCUȚII Aproximativ 15-30% dintre cancerele colorectale se prezintă în urgență, cu manifestări de obstrucție (78%), perforație (10%) sau hemoragie (4%). Colonul stâng și sigmoidul sunt zonele cele mai predispuse pentru obstrucție, cu un risc maxim la nivelul flexurii splenice. Sigmoidul și cecumul sunt cele mai predispuse pentru perforație, care se poate produce fie la nivelul zonei tumorale sau proximal de aceasta, cu apariția peritonitei sau abcesului (282, 283). Cazurile care se prezintă în urgență sunt asociate cu o mortalitate postoperatorie cuprinsă între 8.2-22%, cu o rată de supraviețuire la 5 ani de 40% (284). Pacienții care beneficiază de chirurgie de urgență sunt în general mai în vârstă decât cazurile elective. Atât pacienții cu vârsta sub 40 ani, cât și cei peste 80 ani, se prezintă adeseori în urgență și sunt considerate grupuri cu risc (283). Evoluția la pacienții vârstnici, care au beneficiat de chirurgie de urgență pentru cancerul colorectal complicat, a fost nefavorabilă comparativ cu pacienți tinerii (285). În studiul meu, au fost operați în urgență 26.98% din cazurile analizate, rezultate ce sunt în concordanță cu datele din literatură. În grupul operat în urgență, a existat o frecvență semnificativ mai mare a pacienților cu grupa de vârstă peste 80 ani, semnificativ mai mare comparativ cu grupul operat electiv. O excepție în lotul meu o reprezintă o supraviețuire mai bună și un risc de deces mai mic al pacienților peste 80 ani operați în urgență comparativ cu acceași categorie de pacienți operați electiv. Aceasta este explicată printr-un număr redus de pacienți cu vârsta peste 80 ani în lotul operat în urgență (3 pacienți). Pacienții în urgență au un stadiu tumoral, stadiu T și N mai avansat decât cazurile operate electiv (286). 35

CAPITOLUL 12. EVALUAREA ROLULUI PROGNOSTIC AL MARKERILOR HEMATOLOGICI ȘI TUMORALI ÎN CANCERUL DE COLON Scopul acestui studiu a fost acela de a evalua rolul prognostic al markerilor tumorali și hematologici în cancerul de colon. MATERIAL ŞI METODE Am efectuat un studiu retrospectiv ce a inclus pacienții diagnosticați cu neoplasm de colon, operați în Clinica a III-a a Spitalului Sf. Spiridon, Iași și Clinica I Chirurgie Oncologică a Institutului Regional de Oncologie, Iași. Am urmărit formula leucocitară și valorile markerilor tumorali. Pe baza acestora am creat diverse rapoarte hematologice. Astfel raportul neutrofile/limfocite (NLR) a fost obținut din valoarea absolută a neutrofilelor împărțită la valoarea absolută a limfocitelor. Raportul trombocite/limfocite (PLR) a fost calculat prin împărțirea valorii absolute a trombocitelor la valoarea absolută a limfocitelor. Raportul neutrofile/limfocite derivat a fost obținut prin aplicarea următoarei formule matematice: neutrofile (valoare absolută) raportat la numărul total de globule albe (leucocite) minus neutrofile (valoare absolută) (dnlr). Multiplicarea monocitară a fost obținută prin înmulțirea valorii absolute a neutrofilelor și a monocitelor (MNM). Studiul a inclus 415 pacienți cu neoplasm de colon stadiile UICC 1-4. REZULTATE Evaluarea raportului NLR (raportul neutrofile/limfocite) la pacienții cu neoplasm de colon Numărul de neutrofile s-a asociat semnificativ cu tumorile T3- T4 în lotul supus analizei (p<0.05). Tumorile cu diametrul maxim de peste 5 cm și prezența VELIPI au avut un număr de neutrofile semnificativ mai mare comparativ cu celelalte categorii (p<0.001).. Evaluarea raportului MNM (multiplicarea monocitară) la pacienții cu neoplasm de colon O valoare a MNM semnificativ mai crescută s-a observat la sexul masculin (p<0.001). Tumorile în stadiul T3-T4 cu diametrul tumoral de peste 5 cm s-au asociat cu o creștere semnificativă a raportului MNM (p<0.01). Evaluarea raportului PLR (raportul trombocite/limfocite) la pacienții cu neoplasm de colon 36

Numărul de trombocite s-a asociat semnificativ statistic cu tumorile de peste 5 cm diametru, slab diferențiate (p<0.001). Pacienții cu tumori în stadiul tumoral UICC-3 și stadiile T3-T4 au avut o valoare a numărului de plachete semnificativ mai mare cu celelalte stadii (p<0.001). Pacienții cu tumori localizate la nivelul colonului drept au avut un număr de trombocite semnificativ mai mare decât pacienții cu tumori în alte segmente colice (p<0.001). Un număr crescut de trombocite s-a înregistrat la pacienții cu peste 20 de ganglioni totli analizați (p<0.001). Evaluarea dnlr (raport neutrofile/limfocite derivat) la pacienții cu cancerul de colon Pacienții de sex masculin au asociat o valoarea crescută a raportului dnlr semnificativă statistic (p<0.01). Tumorile în stadiul T3 (p<0.05) și diametrul maxim de peste 5 cm (p<0.001) au avut o corelație semnificativă cu valoarea dnlr crescută, comparativ cu celelalte stadii. Evaluarea markerilor tumorali (CEA și CA19.9) în cancerul de colon Pacienții de sex masculin au avut o valoare semnificativ mai mare a markerilor CEA și CA19.9 (ambele p<0.001) comparativ cu pacienții de sex feminin. Testul wilcoxon a arătat o asociere semnificativă cu prezența VELIPI și dintre acesta, a invaziei perineurale atât în cazul CEA cât și CA19.9 (ambele p<0.05). Evaluarea gradului de predicție a markerilor hematologici și tumorali în supraviețuirea pacienților cu neoplasm de colon Supraviețuirea pacienților a fost evaluată în funcție de valoarea markerilor hematologici corelați cu diverși parametrii histopatologici. Fig. 12.1. Curbele Kaplan-Meier pentru supraviețuirea globală a pacienților în funcție de valoarea NLR și valoarea NLR corelat cu stadiul N Pentru NLR a fost calculată ca și valoare medie valoarea de 3.62. În funcție de această valoare pacienții au fost împărțiți în grupul High (Hi) 37

(n=154) cu valori mai mari decât media și grupul Low (Lo) (n=151), cu valori mai mici decât media. La o valoare optimă a NLR de 2.35, pacienții Hi (n=241) au avut o frecvență crescută a metastazelor ganglionare, stadiul T3-T4 și VELIPI prezentă, comparativ cu pacienții Lo (n=64). Pacienții cu valori crescute ale NLR au avut un risc de deces de aprox 2 ori mai mare decât pacienții Lo, cu o supraviețuire semnificativ mai scurtă decât aceștia (HR=1.778 (1.1 2.87), p<0.05) (Fig 12.1). La valoarea medie a MNM în grupul de pacienți analizați a fost de 300.18 și în funcție de aceasta pacienții au fost împărțiți în Lo și Hi. În funcție de valoarea optimă a MNM de 434.09 lotul de studiu a fost împărțiți în Hi (n=126) versus Lo (n=222). Fig. 12.3. Curbele Kaplan-Meier pentru supraviețuirea globală a pacienților în funcție de valoarea MNM și MNM corelat cu stadiul N Analiza combinată a stadiului N cu valoarea raportului MNM a arătat că pacienții NplusLo au avut o supraviețuire mai bună decât categoria NplusHi atât din punct de vedere a valorii medii a MNM (HR=1.27(1.05 1.54), p<0.01) cât și din punct de vedere a valorii optime (HR=1.219(1 1.48), p corectat<0.01) (Fig 12.3). Fig. 12.5. Curbele Kaplan-Meier pentru supraviețuirea globală a pacienților în funcție de valoarea PLR și PLR corelat cu stadiul N Considerând valoarea optimă a PLR de 358.095 în grupul de pacienți analizați, aceștia au fost împărțiți în Hi (n=48) și Lo (n=261). 38

Similar, împărțirea s-a făcut și în funcție de valoarea media a PLR de 212.698, în Hi (n=155) și Lo (n=154). Supraviețuirea globală a lotului de studiu a arătat că pacienții cu Lo supraviețuiesc mai mult decât pacienții cu Hi. Analiza combinând valoarea PLR și categoria N a arătat o supraviețuie semnificativ mai mare pentru pacienții NplusLo comparativ cu pacienții NplusHi (HR=1.294(1.06 1.58), p<0.01) cu rezultate similare și pentru categoria N0. Rezultatele au fost aplicabile atât la median cât și la valoarea optimă a PLR cu stadiul N (HR=1.322(1.07 1.63), p corectat<0.05). Fig. 12.6. CurbeleKaplan-Meier pentru supraviețuirea globală a pacienților în funcție de valoarea PLR corelat cu stadiul T și VELIPI DISCUȚII În prezent există un interest crescut în elucidarea markerilor prognostici și predictivi, care vor îmbunătății evoluția clinică, a pacienților cu stadiul II și III cancer de colon. Un stadiu tumoral crescut și gradul histologic, numărul de ganglioni limfatici recoltați, invazia venoasă, limfatică sau perineurală, chirurgia de urgență (în cazul obstrucției sau perforației), o valoare crescută a antigenului carcinoembrionar, sunt considerați a fi markeri de prognostic nefavorabili (137). Evaluarea markerilor hematologici ce include numărul de limfocite, neutrofile sau plachete, reflectă răspunsul imun al gazdei (137). Raportul neutrofile limfocite (NLR) și raportul plachete limfocite (PLR) au fost identificate ca și markeri sistemici inflamatori la pacienții cu cancer. O valoare crescută a NLR și PLR pot contribui la progresia neoplaziei și o supraviețuire scăzută (138). Valoarea crescută a limfocitelor circulante, ca și markeri ai răspunsului imun al gazdei la neoplazie, s-a asociat cu un răspuns complet la radioterapie la pacienții cu neoplasm rectal local avansat (141, 142). În carcinoamele colorectale, infiltrarea cu limfocite T la nivel tumoral a fost asociată cu 39