GIÁ TRỊ CÁC MẪU BỆNH PHẨM VÀ MẬT ĐỘ VI RÚT TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 94 GIÁ TRỊ CÁC MẪU BỆNH PHẨM VÀ MẬT ĐỘ VI RÚT TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG TÓM TẮT Tăng Chí Thượng*, Nguyễn Thanh Hùng*, Lê Quốc Thịnh*, Trương Hữu Khanh*, Đỗ Văn Niệm*, Lê Anh Tuấn*, Nguyễn Thị Ngọc Dung*, Nguyễn Ngọc Hạnh * Mục tiêu: 1) So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 ở các mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng nước (PBN), phết trực tràng (PTT) và dịch não tủy (DNT); 2) Phân tích sự thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM; 3) Phân tích tương quan giữa nồng độ vi rút (NĐVR) trong các mẫu bệnh phẩm với biến chứng. Phương pháp: Nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR và Real-time RT-PCR trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm như phết họng, phết trực tràng và dịch não tủy ở bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bệnh tay chân miệng, theo qui trình chuẩn và đoạn mồi do Viện nghiên cứu sức khỏe quốc gia Đài Loan Trung Quốc cung cấp. Kết quả: Phản ứng có độ lập lại tốt và độ chính xác cao. Mật độ vi rút trong bệnh phẩm có tương quan tuyến tính nằm trong giới hạn từ 10 2-10 5 copies/ml. Trong các loại bệnh phẩm, mẫu phết họng có tỉ lệ dương tính cao nhất (84,5%), kế đến là phết trực tràng (55,2%) và dịch não tủy (40,2%). Phân tích giá trị trung bình của mật độ vi rút trong các mẫu phết họng, phết trực tràng và dịch não tủy cho thấy không có sự khác biệt giữa 2 nhóm có và không có biến chứng. Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo các mốc thời gian trong năm có liên quan không rõ với cao điểm của BTCM trong năm và không tương quan với tỉ lệ biến chứng. Kết luận: Qui trình chẩn đoán EV71 3 bước đã thiết lập có khả năng phát hiện EV và EV71 cao với tỉ lệ tương ứng là 84,5% và 36,7% trên mẫu bệnh phẩm phết họng. Đây là mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ dương tính cao nhất, lấy mẫu đơn giản nên có thể áp dụng thường qui trên lâm sàng. Chưa thấy mối tương quan rõ giữa NĐVR với khả năng gây biến chứng của EV71 và chưa xác định được sự tương quan giữa sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV với những cao điểm của BTCM. Từ khóa: enterovirus 71, bệnh tay chân miệng, Real-time RT-PCR. ABSTRACT THE VALUE OF SPECIMENS AND VIRAL LOAD IN DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF HAND- FOOT-MOUTH DISEASE Tang Chi Thuong, Nguyen Thanh Hung, Le Quoc Thinh, Truong Huu Khanh, Do Van Niem, Le Anh Tuan, Nguyen Thi Ngoc Dung, Nguyen Ngoc Hanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 3-2011: 94-101 Study objectives: 1) Determine EV and EV71- positive rates in various specimens: pharyngeal swab, vesicle swab, rectal swab abd cerebrospinal fluid; 2) Determine the correlation between EV71 infection and HFMD outbreak based on the the increased proportion of EV71 infections among all EV infections; 3) Analyze the correlation between virus load and the occurance of complications. Method: Detection EV71-RNA directed from clinical samples as pharyngeal swab, rectal swab and CSF in patients with HFMD by RT-PCR and Real-time RT-PCR, following standard protocol and primer of Taiwan National Health Research Institute. * Bệnh viện Nhi Đồng 1 Tác giả liên lạc: ThS.BS Lê Quốc Thịnh ĐT: 0903645557 Email: thinhlequoc@yahoo.com Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học Results: the test has been proved with good iterativeness and high accuracy. Virus load has linear correlation in range 10 2-10 5 copies/ml. The means of virus load in pharyngeal swab, rectal swab and CSF are not statistically different between non-complication and complicated group. The increase of EV71 infection proportion among all EV infections by time is unclearly related with HFMD outbreaks annually and not related with the occurance of complications. Conclusions: the three-step diagnosis process for EV71 has been proved valid to detect EV and EV71 infections with the positive rate of 84.5% and 36.7% respectively in pharyngeal swab. Pharyngeal swab is the specimen with highest positive rate and easy to take so it is applicable routinely in clinical setting. The correlation between virus load and EV71-induced complications is not clear and it is the same with the correlation between the increase of EV71 infections among all EV infections with the outbreak of HFMD. Key words: enterovirus 71, hand-foot-mouth disease, Real-time RT-PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Enteroviruses (EVs) là một giống thuộc họ Picornaviridae. Đây là những vi rút có một chuỗi đơn RNA chia thành 68 týp huyết thanh, gồm các nhóm echoviruses, coxsackie virus, polioviruses, và các enterovirus (EV) từ týp huyết thanh 68 đến 71 (3). Trong đó coxackie A16 (CA16) và enterovirus 71 (EV71) là hai tác nhân chính gây bệnh tay chân miệng (BTCM) ở trẻ em (5,7). BTCM do EV71 có thể gây biến chứng nguy hiểm như viêm thân não, viêm cơ tim, phù phổi cấp; diễn tiến bệnh nặng rất nhanh và tử vong cao. Từ năm 2002 2003, tại Bệnh Viện Nhi Đồng 1 (BVNĐ1) đã phát hiện nhiều ca viêm não tối cấp, gây tử vong rất nhanh ở trẻ nhỏ hơn 3 tuổi có liên quan đến BTCM (13,4).Qua nghiên cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh (TP.HCM), lần đầu tiên đã phân lập được EV71 trong phân trẻ BTCM có biến chứng viêm não tại Việt nam vào ngày 04 tháng 8 năm 2003 (4). Số ca mắc BTCM gia tăng hàng năm, với trên vài nghìn trường hợp nhập viện mỗi năm. Nghiên cứu về tác nhân BTCM phối hợp giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TP.HCM năm 2005 bằng phương pháp nuôi cấy đã xác định được 2 tác nhân chính là CA16 và EV71, trong đó EV71 chiếm tỉ lệ 46% (9). Phương pháp nuôi cấy vi rút cần 1-2 tuần để thực hiện, với chi phí cao nên chỉ thực hiện trong nghiên cứu và ít có giá trị ứng dụng trên lâm sàng, khả năng dự báo dịch chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chẩn đoán với độ chính xác cao của phương pháp khuếch đại chuỗi gen (Polymerase Chain Reation: PCR) trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm khi so sánh với phương pháp nuôi cấy (1,8,10,11,12). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng chẩn đoán của phương pháp PCR trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm, giúp chẩn đoán nhanh góp phần dự báo dịch và xác định mối tương quan giữa nồng độ vi rút với biến chứng. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 ở các mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng nước (PBN), phết trực tràng (PTT) và dịch não tủy (DNT). Phân tích sự thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM. Phân tích tương quan giữa nồng độ vi rút (NĐVR) trong các mẫu bệnh phẩm với biến chứng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Bệnh phẩm Các mẫu bệnh phẩm DNT, phết họng, PTT lấy ở ngày thứ 2-4 của bệnh, được tách chiết theo qui trình, lưu giữ ở nhiệt độ âm 70 O C cho tới khi thực hiện phản ứng. Hệ thống chuẩn và chứng dương Hệ thống chuẩn dựa vào chuẩn gốc do Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan- Trung Quốc (National Health Research Institute: NHRI) cung cấp dưới dạng dung dịch có nồng Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 95

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 độ 10 10 copies/ml. Dùng chuẩn này pha loãng thành các nồng độ chuẩn cho phép định lượng EVs-RNA và làm chứng dương cho phản ứng Revere transcriptase PCR (RT-PCR) định tính. Để có mẫu chuẩn, chúng tôi dùng bệnh phẩm có phản ứng PCR dương tính mạnh với EV (băng điện di sáng và rõ nét) trộn lẫn với nhau (khoảng 5ml) và bảo quản ở -70 o C. Sau đó ly trích RNA-EV trong bệnh phẩm theo phương pháp Boom (QIAmpMinElute Virus Kit), phân chia RNA đã ly trích được thành nhiều tube 30 l, lưu giữ ở -70 o C. Lấy một tube chạy RealTime- PCR với chứng gốc pha loãng và tìm được nồng độ của mẫu chuẩn. Pha loãng các mẫu chuẩn và chọn các độ pha loãng có nồng độ tương ứng từ 10 2 đến 10 7 copies/ml làm các nồng độ chuẩn để thực hiện gam chuẩn và chứng dương cho phản ứng Realtime-PCR. Ly trích EVs-RNA Dựa trên nguyên tắc trong điều kiện biến tính cao khi nhiệt độ được nâng lên, dưới tác động của QIAGEN Protease và dung dịch đệm AL cùng với sự bất hoạt của men RNAse sẽ làm màng tế bào vi rút bị phá vỡ để phóng thích RNA. Các RNA sẽ gắn kết tối đa vào màng silica khi cho thêm ethanol vào phản ứng. Các protein và các chất khác (làm ức chế các phản ứng men trong chuỗi phản ứng PCR) không bám được trên màng silica và sẽ bị loại bỏ sau khi rửa và ly tâm hai lần. Cuối cùng RNA tinh sạch sẽ được thu giữ bằng dung dịch đệm thích hợp. Cách thực hiện Cho vào 1 tube Eppendorf nắp khóa 1,5ml: 200 l bệnh phẩm, 25 l Protease, 200 l dung dịch đệm AL (chứa RNA carrier). Vortex kỹ trong 15 giây, sau đó ủ ở 56 O C trong 15 phút. Ly tâm nhẹ, cho thêm vào 250 l ethanol nồng độ từ 96-100%. Vortex kỹ trong 15 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút. Ly tâm nhẹ, chuyển tất cả dung dịch vào MinElute Column (QIAgen), ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 2, cho thêm vào 500 l AW1, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 3, cho thêm vào 500 l AW2, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 4, cho thêm vào 500 l ethanol (96-100%), ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 5, ly tâm 14.000 rpm trong 3 phút. Sau đó chuyển MinElute Column qua một tube Eppendorf 1.5ml mới, mở nắp và ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút. Thêm 30 l AE (nước cất không có RNAse), ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10 phút. Sau đó ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút, cẩn thận hút 30 l vào tube Eppendorf 1.5ml mới. Dùng 10 l dung dịch nổi này cho phản ứng Realtime-PCR. Chứng âm Sử dụng môi trường vận chuyển làm chứng âm ly trích và dung dịch TE1X làm chứng âm cho phản ứng Realtime-PCR. Định tính EV-RNA và EV71-RNA bằng kỹ thuật RT-PCR Hai cặp mồi đặc hiệu cho EV (EV-F và EV-R) và EV71 (F-primer1705 và R-primer 2036) được thiết kế nằm trong vùng VP1 của EV và EV71 genome cho sản phẩm khuếch đại theo thứ tự lần lượt là 148bp và 331bp do NHRI cung cấp. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu cụ thể như sau: EV-F: 5'-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3' EV-R: 5'-GATTGTCACCATAAGCAGC-3' F-primer1705: GTGGCAGATGTGATTGAGAG-3' R-primer 2036: 5'- GTTATGTCTATGTCCCAGTT-3' Sử dụng cặp mồi EV-F và EV-R trong phản ứng RT-PCR đầu tiên bằng bộ thuốc thử One- Step RT-PCT (Qiagen, USA). Phương pháp khuếch đại định tính EV được thực hiện trong những tube PCR 0.2ml với thể tích dung dịch 25µl chứa 5µl MgCl2, 1µl EV-R, 1µl EV-F, 1µl enzymes, 5µl RNA ly trích. Phản ứng RT-PCR sẽ được thực hiện trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước như sau 50 o C/30 giây trong một chu kỳ, 95 o C/5 phút trong một chu kỳ; tiếp theo là 40 chu kỳ với 5'- 96 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học 94 o C/30 giây, 58 o C/30 giây, 72 o C/01 phút; và cuối cùng là 72 o C/10 phút trong một chu kỳ. Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE. Các mẫu dương tính sẽ được thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR với cặp mồi F-primer 1705 và R- primer 2036 trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước như sau 50 o C/30 giây trong một chu kỳ, 95 o C/5phút trong một chu kỳ; tiếp theo là 40 chu kỳ với 94 o C/30 giây, 50 o C/30 giây, 72 o C/01 phút; và cuối cùng là 72 o C/10 phút trong một chu kỳ. Tương tự như trên, sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE. Mỗi lần thực hiện phản ứng RT-PCR đều chạy kèm theo một chứng dương và hai chứng âm (một chứng âm ly trích và một chứng âm phản ứng PCR). Định lượng EV71-RNA bằng kỹ thuật REAL-TIME PCR với đoạn dò TAQMAN Thử nghiệm Realtime-PCR được phân tích trên máy LightCyler (Roche Diagnostics). Bộ thuốc thử LightCycler RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche Diagnostics) đã được sử dụng trong phản ứng này. Đây là bộ thuốc thử cho phép sử dụng một bước Realtime-PCR trên ống mao quản 10µl có chứa 0.4µl MgCl2, 0.5µl EV-F, 0.5µl EV-R, 0.1µl TaqMan Hybprobe, 0.2 µl enzymes, 2 µl RNA ly trích. Phản ứng Realtime- PCR được thực hiện với các bước sau: 55 o C/20 phút trong một chu kỳ, 95 o C/30 giây trong một chu kỳ; tiếp theo là 45 chu kỳ với 95 o C/5 giây, 57 o C/15 giây, 72 o C/6 giây; và cuối cùng là 40 o C/30 giây trong một chu kỳ. Để tiêu chuẩn hóa phản ứng, mỗi lần thực hiện Realtime-PCR EV71 đều kèm theo bốn nồng độ chuẩn có nồng độ từ 10 2 đến 10 5 cùng một chứng âm là TE1X. Phân tích dữ liệu nhờ vào phần mềm của hệ thống máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics). Dữ liệu được thu nhận ở giai đoạn bắt cặp và kéo dài (57 o C) của mỗi chu kỳ; và chu kỳ ngưỡng (threshold cycle) của các mẫu thử được xác định tại điểm mà ánh sáng huỳnh quang phát ra vượt quá giới hạn nền. Đường cong chuẩn được vẽ tự động dựa vào các giá trị Ct của mỗi một nồng độ chuẩn đã biết. Hệ số tương quan của mỗi lần chạy Realtime-PCR phải đạt trên 0.98 và hiệu suất PCR từ 90 đến 100%. Số bản copies của RNA trong mẫu thử được tính dựa vào phép nội suy từ đường cong chuẩn. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chuẩn hóa qui trình xét nghiệm Realtime RT-PCR Qui trình chẩn đoán EV71 ba bước gồm 2 phản ứng RT-PCR kết hợp với 1 phản ứng Realtime PCR đã được nghiên cứu chứng minh về độ nhạy cảm và độ đặc hiệu. Chúng tôi chỉ áp dụng qui trình được chuyển giao từ NHRI nên không cần thiết lập lại các bước xác định độ nhạy cảm và độ đặc hiệu của phản ứng, mà chỉ thực hiện chuẩn hóa xét nghiệm trong điều kiện cụ thể của phòng xét nghiệm BVNĐ1 thông qua việc xác định độ lập lại của kết quả xét nghiệm và mức độ biến thiên. Với hệ thống mẫu chuẩn được thiết kế dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thực hiện phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes với hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ EV-RNA từ 10 2 copies cho tới 10 5 copies/phản ứng. Hình 1: Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ từ 10 2 copies cho tới 10 5 copies/phản Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 97

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 ứng trong phản ứng Realtime-PCR với Taqman probes trong định lượng EV-RNA Hình 2: Đường cong chuẩn của Real-Time PCR với Taqman Probes định lượng EV-RNA Từ kết quả phản ứng Real-time PCR dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thiết lập đường cong chuẩn cho phản ứng. Kết quả (hình 2) cho thấy đường cong chuẩn của phản ứng có tương quan tuyến tính khi nồng độ EV-RNA của mẫu chuẩn nằm trong giới hạn từ 10 2 đến 10 5 copies/ml. Bảng 1: Độ lập lại của Ct ứng với các nồng độ chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp của phản ứng Realtime- PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71 Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 5 26,24 26,50 26,79 10 4 30,02 30,26 30,16 10 3 33,39 33,66 33,76 10 2 37,73 37,97 37,16 Bảng 2: Dữ liệu của đường cong chuẩn với FAM- 490 (Ct) Nồng độ TB SD CV (%) 10 5 26,5 0,22 1 10 4 30,15 0,10 0,5 10 3 33,60 0,16 0,47 10 2 37,62 0,39 1,04 Để đánh giá mức độ tin cậy của phản ứng Real-time PCR thực hiện tại phòng thí nghiệm BVNĐ1, chúng tôi nghiên cứu về độ lập lại của kết quả phản ứng cho một mẫu chuẩn được thực hiện phản ứng trên nhiều ống nghiệm khác nhau trong cùng một lần chạy phản ứng, cũng như những lần thực hiện phản ứng khác nhau. Bảng 1 và 2 trình bày độ lập lại của kết quả xét nghiệm trên gam chuẩn có nồng độ vi rút thay đổi từ 10 2 đến 10 5 copies/ml. Độ lập lại của phản ứng là khả năng lập lại kết quả xét nghiệm của cùng một mẫu thử, khi phản ứng được thực hiện nhiều lần khác nhau. Bảng 3: Sự biến thiên trong một lần phản ứng của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71 Mẫu số 1 2 3 EV71-RNA (Copies/ml) Lần 1: 2,4 x 10 5 Lần 2: 2,4 x 10 5 Lần 3: 2,6 x 10 5 Lần 4: 2,3 x 10 5 Lân1: 8,9 x 10 3 Lần 2: 8,9 x 10 3 Lần 3: 8,9 x 10 3 Lần 4: 8,4 x 10 3 Lần 1: 7,4 x 10 7 Lần 2: 7,9 x 10 7 Lần 3: 7,4 x 10 7 Lần 4: 8,4 x 10 7 Mean SD CV (%) 2,42 x 10 5 0,11 4,5 8,77 x 10 3 0,22 2,5 7,77 x 10 7 0,41 5,2 Bảng 4: Sự biến thiên giữa các lần khác nhau của phản ứng Real-Time PCR Taqman phát hiện và định lượng EV71 Mẫu số 1 2 3 EV71-RNA (copies/ml)/ngày N1: 2,42 x 10 5 N2: 2,7 x 10 5 2,64 x 10 N3: 2,8 x 10 5 N1: 8,77 x 10 3 N2: 8,3 x 10 3 8,39 x 10 N3: 8, 1 x 10 3 N1: 7,77 x 10 7 N2: 8,1 x 10 7 7,79 x 10 N3: 7,5 x 10 7 Mean SD CV (%) 5 3 7 0,16 6,1 0,28 3,34 0,25 3,1 Để khảo sát độ lập lại của các mẫu thử lâm sàng, chúng tôi sử dụng 3 mẫu ly trích có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 trên xét nghiệm PCR định tính, mỗi mẫu lập lại 4 lần trong cùng một lần chạy phản ứng real-time PCR, và chạy như vậy trong 3 lần khác nhau. Kết quả trong bảng 3 và 4 cho các giá trị về nồng 98 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học độ của mẫu mỗi lần lập lại trong một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau. 5 mẫu âm tính. Kết quả của phản ứng Realtime- PCR Taqman Probes định lượng EV71 phù hợp với phản ứng RT-PCR. Các mẫu dương lặp lại đều có chu kỳ ngưỡng gần giống nhau với hệ số biến thiên < 5% và mẫu âm thì đường biểu diễn nằm dưới ngưỡng phát hiện. Kết quả của các mẫu lâm sàng cũng có tương quan tuyến tính với hệ số góc tương tự với mẫu chuẩn (hai đường cong chuẩn trùng khớp nhau) (hình 5). Hình 3: Độ lập lại của 4 lần chạy của cùng một mẫu trong cùng một plate Hình 4:Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA trong các mẫu thử khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes Phản ứng Real-time RT-PCR được xem là chính xác khi có sự tương đồng với kết quả của phản ứng RT-PCR định tính đối với EV71. Phản ứng Real-time RT-PCR sử dụng đoạn mồi EV có độ chính xác tốt bắt buộc phải dương tính nếu phản ứng RT-PCR trên mẫu thử trước đó dương tính với EV71 và ngược lại. Để nghiên cứu độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện EV71, chúng tôi thực hiện phản ứng định lượng này trên 100 mẫu bệnh phẩm phết họng gồm 90 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính với EV/EV71 bằng phương pháp RT-PCR. Có 10 mẫu lập lại với 5 mẫu dương và Hình 5: Đường cong chuẩn của Realtime-PCR Taqman Probe định lượng EV71-RNA Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes với ưu điểm sử dụng các mồi đặc hiệu và đoạn dò đặc hiệu giúp tạo ra các sản phẩm đặc hiệu sẽ làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Chu kỳ ngưỡng được ghi nhận khi mà tín hiệu huỳnh quang của mẫu phát ra cao hơn tín hiệu nền. Dựa trên chu kỳ ngưỡng của các chất chuẩn và số bản sao của các chuẩn đã biết mà từ đó người ta có thể định lượng được số bản sao RNA có trong mẫu bệnh phẩm (6,8,12). Hệ thống mẫu chuẩn được chúng tôi sử dụng dựa trên chuẩn gốc do NHRI cung cấp, từ đó chúng tôi có gam chuẩn với nồng độ từ 10 2 copies cho tới 10 7 copies/phản ứng. Khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes, chúng tôi có kết quả phản ứng với hệ số tương quan là 1, độ cong là -3,478, hiệu suất PCR là 93,9 và phương trình Y= -3,478X + 44,151. Các giá trị chu kỳ nguỡng Ct của các chuẩn này ổn định trong các lần chạy định lượng khác nhau (CV< 10%) (bảng Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 99

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 1), cho thấy mức độ ổn định của định lượng EV71 bằng Taqman Probes. Ngoài ra với 4 nồng độ này cách nhau 10 độ pha loãng thì chu kỳ ngưỡng của chúng đi từ chuẩn có nồng độ cao nhất cho đến nồng độ kế tiếp cách nhau 3, 3 cho đến 3,7. Điều này nói lên tính chất tuyến tính của phản ứng. Về độ lập lại của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, kết quả các số liệu trong bảng 2 cho thấy các giá trị số lượng bản sao của các mẫu mỗi lần lặp lại trong một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau có hệ số biến thiên CV<10%, chứng tỏ không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong một lần chạy và giữa các lần chạy khác nhau, điều đó cho thấy phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes định lượng EV71-RNA có tính đồng nhất, không thay đổi trong các tube phản ứng khác nhau có cùng nồng độ mẫu thử. Về độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, khi tiến hành thử nghiệm trên 90 mẫu phết họng dương tính và 10 mẫu phết họng âm tính với EV/EV71 bằng phương pháp RT-PCR, chúng tôi thu được các kết quả của những lần chạy Realtime-PCR này với hệ số tương quan và hiệu quả cũng như các Ct của các nồng độ chuẩn tương đối ổn định so với nghiên cứu ban đầu. Các mẫu phết họng dương tính có Ct chạy từ 20 đến 40, với các mẫu có Ct xuất hiện sớm (trước chu kỳ 15), chúng tôi sẽ tiến hành pha loãng mẫu EV-RNA đã được ly trích, sau đó kết quả sẽ nhân với hệ số pha loãng. Các chứng âm và mẫu âm có đường biểu diễn nằm dưới ngưỡng phát hiện phù hợp với kết quả âm tính với EV bằng phương pháp RT-PCR. Thực hiện xét nghiệm PCR trên các mẫu bệnh phẩm Sau 12 tháng chúng tôi đã chọn được 449 bệnh nhân vào khảo sát. Tất cả các bệnh nhân được lấy ít nhất 1 mẫu bệnh phẩm bao gồm phết họng, PBN, PTT, và DNT khi có biến chứng thần kinh. Tỉ lệ dương tính của các mẫu bệnh phẩm đối với EV và EV71 trình bày trong bảng 5. Mẫu phết họng có tỉ lệ dương tính cao nhất với EV cao nhất khi so sánh với mẫu phết trực tràng và dịch não tủy. Bảng 5: Kết quả xét nghiệm EV, EV71 của các mẫu bệnh phẩm Cỡ Dương tính EV Dương tính EV71 Bệnh phẩm mẫu n % n % Phết họng 439 371/439 84,5 136/371 36,7 Phết trực tràng 415 229/415 55,2 69/229 30,1 Dịch não tủy 164 66/164 40,2 11/66 6,7 Phết bóng nước 3 2/3 66,7 0 - Những mẫu có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 sẽ được thử nghiệm Real-time RT- PCR để xác định NĐVR. Phân tích trị số trung bình của NĐVR giữa hai nhóm có và không có biến chứng bằng phép kiểm T dành cho 2 mẫu độc lập. Trong phân tích định chuẩn xét nghiệm ban đầu, tương quan tuyến tính chỉ xuất hiện khi NĐVR từ 10 2 đến 10 5 copies/ml. Do NĐVR tính toán khi thực hiện xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm căn cứ vào quan hệ tuyến tính trên nên chúng tôi chỉ phân tích các trường hợp NĐVR trong ngưỡng nhằm đánh giá mối tương quan giữa NĐVR và biến chứng. Kết quả phân tích giá trị trung bình của NĐVR các trường hợp có kết quả nằm trong ngưỡng có tương quan tuyến tính từ 10 2-10 5 copies/ml cho thấy không khác biệt có ý nghĩa thống kê về giá trị trung bình giữa hai nhóm (bảng 6). Bảng 6: So sánh nồng độ vi rút giữa nhóm có biến chứng và không biến chứng Loại bệnh phẩm Phết họng Phết trực tràng Dịch não tủy Nhóm không biến chứng n Trung bình (copies/ml) n Nhóm có biến chứng Trung bình (copies/ml) 30 4.960 ± 12.701 40 4.852 ± 11.171 0,97 22 18.314 ± 22.419 31 11.159 ± 13.971 0,159 3 4.083 ± 6.261 5 3.512 ± 4.705 0,887 Khi phân tích tương quan giữa NĐVR và các biến chứng nặng, giá trị trung bình của NĐVR trong mẫu phết họng ở nhóm không có biến chứng nặng là 4.892 ± 12.005 copies/ml (n=60) so với nhóm có biến chứng nặng là 4.957 ± 10.766 P 100 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học copies/ml (n=10), không khác biệt về mặt thống kê với p = 0,991. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TS BTCM Tỉ lệ biến chứng Tỉ lệ EV71 Tỉ lệ biến chứng nặng 04/07 05/07 06/07 07/07 08/07 09/07 10/07 11/07 12/07 01/08 02/08 03/08 Hình 6: Tương quan giữa tỉ lệ EV71 và BTCM, biến chứng Hình 6: Tương quan giữa tỉ lệ EV71 và BTCM, biến chứng Tương tự như vậy, NĐVR trong mẫu PTT ở nhóm không biến chứng nặng là 13.616 ± 18.449 copies/ml (n=47) thấp hơn so với nhóm có biến chứng nặng là 18,147 ± 16,138 copies/ml (n=6), nhưng sự khác biệt này không ý nghĩa thống kê với p = 0,569. Như vậy, NĐVR trong mẫu phết họng và PTT không có tương quan với cả biến chứng chung và các biến chứng nặng là viêm não, phù phổi, viêm cơ tim và sốc. Phân tích mối tương quan giữa tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 trên tổng số được xác định dương tính theo tháng và tỉ lệ bệnh nhân có biến chứng cũng như có biến chứng nặng cho thấy không có tương quan thuận rõ ràng (hình 6). Tuy nhiên, những thời điểm có tỉ lệ EV71 cao thường trùng lặp với các đợt cao điểm của bệnh trong năm. KẾT LUẬN Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm có độ lập lại tốt và tính ổn định cao. Qui trình chẩn đoán 3 bước đã thiết lập có khả năng phát hiện EV và EV71 cao với tỉ lệ tương ứng là 84,5% và 36,7% trên mẫu bệnh phẩm phết họng. Đây là mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ dương tính cao nhất, lấy mẫu đơn giản nên có thể áp dụng thường qui trên lâm sàng. 700 525 350 175 0 NĐVR trong mẫu bệnh phẩm phết họng, PTT, DNT được lấy ở từ ngày 2-4 của bệnh chưa thấy có mối tương quan rõ ràng với khả năng gây biến chứng của EV71. Cần nghiên cứu thêm về sự thay đổi của NĐVR theo thời gian của bệnh để có đánh giá chính xác hơn. Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo thời gian tương ứng với những cao điểm của BTCM, nhưng chưa thấy tương quan rõ rệt với biến chứng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brown BA, Kilpatrick DR, Oberste MS, Pallansch MA (2000). Serotype-specific identification of enterovirus 71 by PCR. J. Clin. Virol.; 16: 107 12 2. Brown BA, Oberste MS, Alexander JP, Kennett ML, Pallansch MA (1999). Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998. J. Virol.; 73: 9969 75 3. Cardosa MJ, Krishnan S, Tio PH, Perara D, Wong SC (1997). Isolation of subgenus B adenovirus during fatal outbreak of enterovirus 71-associated hand, foot and mouth disease in sicu, sarawak. The Lancet; 354:987 91. 4. Đỗ Văn Niệm và cộng sự (2005). Giám sát bệnh tay chân miệng dựa vào bệnh viện: phương pháp dự báo dịch viêm não do enterovirus 71. Y học - TP.HCM, tập 9, số 3: 66-71 5. Hand AK (2000), foot and mouth disease outbreak reported in Singapore. The Lancet; 356: 1338 6. Mckay IM, Arden KE, Nitsche A (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res.;30: 1292 305 7. McMinn PC (2002). An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance. FEMS Microbiol Rev.; 26: 91 107 8. Nijhuis M, van Maarseveen N, Schuurman R, Verkuijlen S, de Vos M, Hendriksen K, et al (2002). Rapid and sensitive routine detection of all members of the genus enterovirus in different clinical specimens by real-time PCR. J Clin Microbiol;40: 3666 70 9. Phan Van Tu, et al (2007). Epidemiologic and Virologic Investigation of Hand, Foot, and Mouth Disease, Southern Vietnam, 2005; Emerging Infectious Diseases; 13 (11): 1733-41 10. Read SJ, Mitchell JL, Fink CG (2001). LightCycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system. J Clin Microbiol; 39: 3056 9 11. Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH (1974). An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of central nervous system. J. Infect Dis.;129: 304 9. 12. Singh S, Chow VTK, Phoon MC, Chan KP, Poh CL (2002). Direct detection of enterovirus 71 (EV71) in clinical specimens from a hand, foot and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-pcr with universal enterovirus and EV71- specific primers. J. Clin. Microbiol; 40: 2823 7 13. Trương Hữu Khanh (2005). Những kinh nghiệm bước đầu trong chẩn đoán và xử trí nhiễm enterovirus 71 ở trẻ em. Y học - TP.HCM, tập 9, số 3: 58-66 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 101

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 TÓM TẮT CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG DO ENTEROVIRUS Tăng Chí Thượng*, Nguyễn Thanh Hùng*, Đỗ Văn Niệm*, Trương Hữu Khanh*, Bạch Văn Cam*, Nguyễn Thị Bạch Huệ*, Lê Anh Tuấn*, Lê Phan Kim Thoa* Mục tiêu: Xác định yếu tố lâm sàng và cận lâm sàng tiên lượng biến chứng, biến chứng nặng và tử vong. Phương pháp: Nghiên cứu 419 trường hợp BTCM có xét nghiệm khẳng định PCR dương tính với Enterovirus(EV) từ tháng 4/2007 đến tháng 3/2008. Các bệnh nhân vào lô nghiên cứu sẽ được theo dõi diễn tiến lâm sàng ít nhất 7 ngày trong bệnh viện. Đối tượng nghiên cứu sẽ được lấy mẫu phết họng, phết bóng nước (nếu có thể), dịch não tủy khi có biến chứng để thực hiện chẩn đoán nguyên nhân bằng qui trình chẩn đoán 3 bước cho EV71. Kết quả: Tỷ lệ biến chứng 47,7 %, biến chứng nặng (viêm não, phù phổi, viêm cơ tim) chiếm tỉ lệ 10%. Tử vong chiếm 1,4% tổng số bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu; 3% ở nhóm có biến chứng và 10,9 % ở nhóm có biến chứng nặng. Các yếu tố sốt, sốt 38 o 5C, phát ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, bạch cầu trong máu tăng > 13.000/mm 3, neutrophile tăng trên 7.000/mm 3 có giá trị tiên lượng biến chứng. Các yếu tố phát ban ít, sốt 38 o 5C, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, thở nhanh theo tuổi, bạch cầu máu tăng trên 16.000/mm 3 có giá trị trong tiên lượng biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim). Các yếu tố nhịp tim nhanh, hôn mê, sốc, phù phổi hoặc biến chứng viêm não, lactate DNT > 2,5 mmol/l có giá trị tiên lượng tử vong. Kết luận: BTCM thường gặp ở trẻ dưới 36 tháng. Đây là một bệnh cấp tính, tỉ lệ biến chứng cao đến 47,7%. Biến chứng nặng như viêm não, phù phổi, viêm cơ tim chiếm 10%. Tử vong chiếm 10,9% tổng số các trường hợp biến chứng nặng. Từ khóa: bệnh tay chân miệng, enterovirus, yếu tố tiên lượng, RT-PCR. ABSTRACT PROGNOSTIC FACTORS IN HAND-FOOT-MOUTH DISEASE DUE TO ENTEROVIRUS Tang Chi Thuong, Nguyen Thanh Hung, Do Van Niem, Truong Huu Khanh, Bach Van Cam, Nguyen Thi Bach Hue, Le Anh Tuan, Le Phan Kim Thoa * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 3-2011: 102-109 Objetives: Determine clinical and lab factors in relation with complications, severe complications and hospital death prognosis. Method: study 419 EV-induced HFMD confirmed by PCR from April 2007 to Mar 2008 4/2007. All enrollments will be followed up in at least 7 hospitalized days. Pharyngeal swab, vesicle swab (if possible) and cerebrospinal fluid (in severe cases) will be collected for etilology identification by three-step diagnosis process for EV71. Results: The prevalence of overall complications and severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis is 47.7 % and 10% respectively; The overall mortality rate is 1.4% in total, 3% among the cases with complications and 10.9 % among the cases with severe complications. * Bv. Nhi Đồng 1 Tác giả liên lạc: Bs Trương Hữu Khanh, ĐT: 0913117965, Email: khanhnhiem@yahoo.com 102 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học Factors such as fever, fever 38 o 5C, a few rashes, myoclonic jerks, vomiting, tachypnea, heart beat over 150 times per minute, while blood count above 13,000/mm 3, neutrophile count above 7,000/mm 3 are significantly associated with the presence of complications. Factors such as fever 38 o 5C, a few rashes, tachypnea, tachycardia, while blood count above 16,000/mm 3 among the cases with severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis. While factors including coma, shock, encephalitis and CSF-lactate > 2.5 mmol/l are significantly associated with death. Conclusion: HFMD commonly occurs in children less than 36 months of age. It is an acute disease with the complication rate of 47.7%. Common severe complications are encephalitis, pulmonary edema, myocarditis with the total rate of 10%. Mortatily rate among the cases with severe complication is 10.9%. Key words: Hand-foot-mouth disease, enterovirus, prognostic factors, RT-PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tay chân miệng (BTCM) hiện đã trở thành một bệnh lưu hành ở khu vực phía Nam. Thống kê hằng năm tại Bệnh viện Nhi đồng 1 (BVNĐ1), tổng số lượt khám và nhập viện do BTCM tương đương với sốt xuất huyết Dengue. BTCM do vi rút đường ruột gây ra, lây lan nhanh qua đường tiêu hóa, nguy cơ phát triển thành dịch, đặc biệt trong môi trường chăm sóc trẻ tập trung như nhà trẻ, mẫu giáo. Biểu hiện lâm sàng bằng vết loét ở miệng, nổi bóng nước vùng lòng bàn tay, bàn chân, mông, gối. Hai tác nhân quan trọng là Coxaskie A 16 và Enterovirus 71 (EV71). BTCM do EV71 có thể gây biến chứng nguy hiểm như viêm thân não, viêm cơ tim, phù phổi cấp; diễn tiến bệnh nặng rất nhanh và tử vong cao. Trên thế giới từ năm 1974 (6), BTCM do EV71 đã xuất hiện ở hầu hết các nước và gây ra khoảng 13 trận dịch lớn nhỏ như năm 1973 và 1978 tại Nhật Bản; tại Bungary và Hungary vào những năm cuối của thập kỷ 70 đã có 4 trận dịch và gây nhiều ca tử vong do biến chứng viêm thân não; tại Mã Lai và Trung quốc - Đài Loan năm 1997 1998 (7), Singapore (1) Trong thời gian xảy ra dịch tại Trung quốc - Đài Loan năm 1998 đã có trên 100.000 ca mắc bệnh và 78 ca tử vong. Từ năm 2002 2003, tại BVNĐ1 đã xuất hiện nhiều ca viêm não tối cấp, gây tử vong rất nhanh ở trẻ nhỏ hơn 3 tuổi (9,5). Trong đó, một số trẻ có biểu hiện lâm sàng điển hình của BTCM. Qua nghiên cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, lần đầu tiên đã phân lập được EV71 trong phân trẻ BTCM có biến chứng viêm não tại Việt nam vào ngày 04 tháng 8 năm 2003 (5). Từ đó đến nay, số ca mắc BTCM gia tăng nhanh hàng năm. Năm 2006 đã có trên 2000 trường hợp mắc mới được chẩn đoán với trên 400 ca có biến chứng thần kinh, trong đó 63% trẻ bệnh thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu về tác nhân BTCM phối hợp giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh năm 2005 bằng phương pháp nuôi cấy đã xác định được 2 tác nhân chính là Coxsaskie A 16 và EV71, trong đó EV71 chiếm tỉ lệ 46% (8). Nhằm xác định các yếu tố tiên lượng bệnh nặng, giúp cho việc theo dõi và can thiệp sớm, góp phần giảm tỉ lệ tử vong nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu này. Mục tiêu nghiên cứu Xác định yếu tố lâm sàng tiên lượng biến chứng, biến chứng nặng và tử vong. Xác định yếu tố cận lâm sàng tiên lượng biến chứng, biến chứng nặng và tử vong. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tiêu chuẩn chọn bệnh Bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu khi có 2 tiêu chuẩn sau: (a) Có chẩn đoán lâm sàng là BTCM: khi có một trong các dấu hiệu sau: (1) có sang thương điển hình ở miệng: vết loét đỏ hay bóng nước đường kính 2-3 mm ở vòm khẩu cái, niêm mạc má, nướu, lưỡi; (2) bóng nước có kích thước 2-10 mm ở lòng bàn tay, bàn chân, gối, mông có tính chất: hình bầu dục, nổi cộm hay ẩn dưới da, trên Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 103

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 nền hồng ban, không đau, khi bóng nước khô để lại vết thâm, không loét. Trường hợp biến chứng nếu kèm theo một trong các biểu hiện sau: (1) run chi hoặc giật mình; (2) yếu liệt chi hay liệt thần kinh sọ, (3) co giật hoặc hôn mê; (4) phù phổi hay trụy mạch; (5) dịch não tủy có số lượng tế bào bạch cầu > 5 tế bào/mm3. Trường hợp biến chứng nặng nếu kèm theo biểu hiện (1) viêm cơ tim, (2) viêm não hoặc (3) phù phổi cấp. (b) Có xét nghiệm RT-PCR dương tính với EV, EV71 trên ít nhất một mẫu bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng, phết bóng nước hay dịch não tủy ở trường hợp có nghi ngờ biến chứng thần kinh. Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân được loại trừ khỏi nghiên cứu khi có một trong 2 tiêu chuẩn sau: Gia đình bệnh nhi không đồng ý tham gia nghiên cứu Tổn thương da do vi trùng Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả tiến cứu. Chọn bệnh nhân đến khám lần đầu, có biểu hiện lâm sàng đủ tiêu chuẩn chẩn đoán BTCM. Thời gian chọn ca bệnh vào nhóm nghiên cứu từ tháng 4/2007 đến tháng 3/2008. Mỗi tuần chọn 8 ca bệnh đầu tiên. Trường hợp số ca bệnh trong tuần không đủ sẽ chọn bổ sung trong những tuần kế tiếp. Dựa trên kết quả nghiên cứu thử nghiệm tại BVNĐ1 với tỉ lệ phát hiện EV bằng RT-PCR là 67%; nghiên cứu hợp tác giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh với tỉ lệ EV71/EV là 50%; tổng số bệnh nhân BTCM đến khám trong năm 2006 tại BV. Nhi đồng 1 là 2225 bệnh nhân. Ước tính cỡ mẫu nghiên cứu mô tả dựa vào chương trình Epi Info 2002 là 400 bệnh nhân BTCM tương ứng với số bệnh nhân BTCM do EV71 cần đạt là 125, sai số xa nhất chấp nhận ở mức 5%, alpha 95%. Bệnh nhân chọn vào nghiên cứu sẽ được theo dõi diễn tiến lâm sàng trong ít nhất 7 ngày đầu của bệnh, lấy mẫu phết họng, phết bóng nước (nếu có thể), dịch não tủy khi có biến chứng để thực hiện chẩn đoán nguyên nhân bằng qui trình chẩn đoán 3 bước: xác định nhiễm EV bằng RT-PCR với đoạn mồi EV, xác định nhiễm EV71 bằng RT-PCR với đoạn mồi EV71 nếu bước 1 dương tính với EV, định lượng nồng độ vi rút bằng Real-time RT-PCR với đoạn mồi EV nếu kết quả bước 2 dương tính với EV71. Việc điều trị theo Phác đồ điều trị nhi khoa BVNĐ1 do NXB Y Học phát hành, xuất bản năm 2006. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Sau 12 tháng có 449 bệnh nhân chọn lựa để thực hiện xét nghiêm, trong đó có 419 bệnh nhân có ít nhất 1 mẩu bệnh phẩm dương tính với EV (93,3%) được đưa vào phân tích. Có 163 trường hợp dương tính với EV71, đạt yêu cầu cỡ mẫu tối thiểu 125 bệnh nhân EV71 theo thiết kế ban đầu. Tuổi trung bình là 21,19±10,80 tháng (3-80 tháng). Có đến 94% trẻ dưới 36 tháng. So với các nghiên cứu trước đây tại BV.Nhi Đồng 1, tuổi mắc bệnh trong nhóm nghiên cứu này cao hơn, nhưng tương đồng với các nghiên cứu tại Singapore và Đài Loan (4). Có 256 trẻ nam chiếm tỉ lệ 61,1%; tỉ lệ này tương đương với nghiên cứu năm 2005 (9,5). Phân tích theo địa phương, bệnh tập trung chủ yếu ở Tp. Hồ Chí Minh, chiếm phân nửa các trường hợp. Tỷ lệ biến chứng và các loại biến chứng 47,7% bệnh nhân có ít nhất một biểu hiện biến chứng từ nhẹ đến nặng. Các biến chứng thường gặp theo thứ tự là viêm màng não vô trùng, viêm não, yếu liệt chi, co giật. Các biến chứng nặng (viêm não, phù phổi, viêm cơ tim) chiếm tỉ lệ khoảng 10%. Ngoài ra nhóm nghiên cứu cũng ghi nhận các biến chứng như co giật, 104 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học sốc, phù phổi, liệt thần kinh sọ. Không ghi nhận biến chứng cao huyết áp ở các bệnh nhân trong nghiên cứu này như nghiên cứu của Monto Ho và cộng sự, trong khi tỉ lệ biến chứng viêm màng não vô trùng được ghi nhận có tỉ lệ cao hơn, chiếm ưu thế trong tổng số các biến chứng. Biến chứng viêm não ít gặp hơn, chỉ chiếm 9,1% thấp hơn rất nhiều so với nghiên cứu tại Đài Loan (76%) (7). Tỉ lệ xuất hiện của các biến chứng được trình bày trong bảng 1. Biến chứng có thể rất sớm ngay từ ngày đầu tiên (0,95%). Thường gặp nhất từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5 (88,7%). Trong đó, ngày thứ 3 của bệnh là thường gặp nhất chiếm tỉ lệ 35%, phù hợp với thời điểm thường sốt cao và xuất hiện triệu chứng thở nhanh, nhịp tim nhanh. Hầu hết biến chứng xảy ra ở giai đoạn còn sốt (95%). Chỉ vài trường hợp biến chứng xuất hiện muộn từ ngày thứ 6 đến 8, liên quan đến biến chứng viêm màng não vô trùng và liệt mềm cấp. Bảng 1: Các biến chứng của bệnh tay chân miệng trong nhóm nghiên cứu Biến chứng Số ca Tỷ lệ % Có ít nhất 1 biến chứng 200/419 47,7 Viêm màng não 154/419 36.8 Viêm não 38/419 9,1 Yếu liệt chi 35/419 8,4 Co giật 25/419 6,0 Phù phổi 9/419 2,1 Sốc 9/419 2,1 Liệt thần kinh sọ 3/419 0,7 Viêm cơ tim 1/419 0,2 Tử vong 6/419 1,4 Tỷ lệ tử vong chung trong toàn lô nghiên cứu là 1,4%; chiếm 3% trong các ca có biến chứng nói chung và 10,9% trong các ca có biến chứng nặng. Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học với biến chứng Chúng tôi so sánh tuổi trung bình, tỉ lệ nam/nữ và phân bố theo địa dư ở các nhóm BTCM, BTCM có biến chứng, biến chứng nặng và tử vong. Kết quả trình bày trong bảng 2. Bảng 2: Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học với sự xuất hiện biến chứng Cả nhóm Nhóm có nghiên cứu biến chứng Tuổi 21,19±10,8 tháng 22 ±11,3 tháng Nhóm có biến chứng nặng 19,2 ±13,1 tháng Nhóm tử vong 14 ±7 tháng Nam/Nữ 256/163 109/71 27/15 5 /1 Thành 203/216 88/92 16/26 0 /6 phố/tỉnh Qua phân tích chúng tôi nhận thấy, tuổi của trẻ tử vong có xu hướng nhỏ hơn tuổi trung bình chung của cả nhóm. Các trẻ tử vong đều dưới 24 tháng. Trẻ nam có tỉ lệ tử vong cao hơn nữ. Cả 6 bệnh nhân tử vong đều đến từ các tỉnh. Mối tương quan giữa các triệu chứng lâm sàng với biến chứng Để phân tích tương quan giữa các dấu hiệu lâm sàng, cận lâm sàng đối với nguy cơ biến chứng, biến chứng nặng và tử vong; chúng tôi sử dụng phân tích chi bình phương đối với các biến số định tính, tính tỉ số chênh (OR) với ngưỡng khác biệt có ý nghĩa thống kê được chọn là p < 0,05. Những biến định lượng có thang đo liên tục hay thang đo khoảng được sử dụng 1 ngưỡng xác định làm căn cứ chuyển thành dạng biến định tính khi phân tích. Đối với phát ban bóng nước, chúng tôi sử dụng giới hạn 5 bóng nước hay sẩn hồng ban để làm giới hạn phân tích. Đối với biến mạch, chúng tôi sử dụng ngưỡng mạch nhanh đang áp dụng tại bệnh viện hiện nay trong theo dõi BTCM là 150 lần/phút. Biến thân nhiệt sử dụng ngưỡng 38,5 o C là mức thân nhiệt được dùng để chỉ định nhập viện cho các bệnh nhân BTCM theo Phác đồ điều trị. Riêng giá trị bạch cầu trong máu, chúng tôi sử dụng giá trị trung bình, tứ phân vị trên và dưới của bạch cầu trong máu ở nhóm có biến chứng để làm ngưỡng so sánh sự khác biệt. Bảng 3 trình bày kết quả phân tích các yếu tố nguy cơ biến chứng chung về lâm sàng và cận Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 105

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 lâm sàng. Bảng 3: Phân tích các yếu tố nguy cơ biến chứng chung Yếu tố Không BC n = 219 (%) Có BC n =200 (%) p OR (95%CI) Giới nam 135 (61,1) 121 (60,5) 0,8 0,9 (0,6-1,4) Sốt 184 (94) 196 (98) 0,001 9,3 (3,2-26,7) Sốt > 38,5 o C 58 (43) 153/186 (82,3) 0,001 6,1 (3,7-10,2) Phát ban 184 (84) 166 (83) 0,77 0,9 (0,5-1,5) Phát ban ít 55 (25,1) 69 (34,5) 0,036 1,5 (1,03-2,39) Giật mình 131 (59,8) 181 (90,5) 0,001 6,3 (3,7-11,0) Loét miệng 172 (78,5) 138 (69) 0,026 0,6 (0,4-0,9) Bóng nước 132 (60,3) 113 (56,5) 0,4 0,8 (0,5-1,2) Ho 26 (11,9) 32 (16) 0,22 1,4 (0,8-2,4) Chảy mũi 31 (14,2) 21 (10,5) 0,25 0,7 (0,3-1,2) Nôn ói 35 (16) 71 (35,5) 0,001 2,8 (1,8-4,5) Tiêu chảy 17 (7,8) 19 (9,5) 0,52 1,2 (0,6-2,4) Bóng nước 132 (60,3) 113 (56,5) 0,4 0,8 (0,5-1,2) Ho 26 (11,9) 32 (16) 0,22 1,4 (0,8-2,4) Chảy mũi 31 (14,2) 21 (10,5) 0,25 0,7 (0,3-1,2) Thở nhanh 0 49 (24,1) 0,000 - Mạch > 150 l/p 0 63 (31,5) 0,000 - BC > 10 000 BC > 13 000 BC > 16 000 126/199 (63,3) 57/199 (28,6) 22/199 (11,1) 85/195 (75,9) 85/195 (43,6) 51/195 (26,2) 0,007 1,8 (1,1-2,8) 0,002 1,9 (1,2-2,9) 0,001 2,8 (1,6-4,9) EV71 74 (33,8) 89 (44,5) 0,025 1,57 (1,05-2,33) Phân tích mối liên quan giữa các dấu hiệu lâm sàng với mức độ gây biến chứng chung (ít nhất 1 trong các biến chứng như viêm não, viêm màng não, phù phổi cấp, viêm cơ tim, yếu liệt chi hoặc liệt thần kinh sọ, trụy mạch ) cho thấy sốt (bệnh sử), sốt 38 o 5C, phát ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, có liên quan có ý nghĩa thống kê với sự xuất hiện biến chứng. Riêng loét miệng có ý nghĩa như là một yếu tố bảo vệ. Các sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Tình trạng dinh dưỡng của trẻ được đánh giá dựa trên các chỉ số cân nặng và chiều cao. Phân loại tình trạng dinh dưỡng theo tiêu chuẩn phân loại của Tổ Chức Y Tế Thế Giới. Kết quả phân tích về tình trạng dinh dưỡng và nguy cơ biến chứng được trình bày trong bảng 4. Bảng 4: Phân tích liên quan tình trạng dinh dưỡng trẻ và biến chứng Tình trạng dinh dưỡng Biến chứng Không N (%) Có N (%) Tổng số Bình thường 191 (57,5) 141 (42,5) 332 (77) SDD nhẹ và TB 32 (44,4) 40 (55,6) 72 (16,7) SDD nặng 4 (100) 0 4 (0,9) Béo phì 12 (52,2) 11 (47,8) 23 (5,3) Tổng cộng 239 (55,5) 192 (45,5 431 2 = 7.425 (p=0,06) Kết quả, trẻ có tình trạng dinh dưỡng bình thường chiếm tỉ lệ khá cao 77%. Không có liên quan có ý nghĩa thống kê giữa tình trạng dinh dưỡng và nguy cơ biến chứng trong nhóm nghiên cứu. Bảng 5: Phân tích các yếu tố nguy cơ biến chứng nặng Yếu tố Không BCN = 145 n (%) Có BCN = 55 n (%) p OR (95%CI) Giới nam 85 (58,6) 36 (65,5) 0,37 1,33 (0,7-2,5) Sốt 142 (97,9) 54 (98,2) 0,09 1,14 (0,11-11,2) Sốt > 38,5 o C * 116/135 (85,9) 37/51 (72,5) 0,03 0,4 (0,19-0,94) Phát ban ít 42 (29) 27 (49,1) 0,008 2,36 (1,24-4,48) Giật mình * 135 (93,1) 46 (83,6) 0,04 0,39 (0,14-0,98) Loét miệng 105 (72,4) 33 (67) 0,09 0,57 (0,29-1,09) Nôn ói 54 (37,2) 17 (30,9) 0,4 0,75 (0,38-1,46) Thở nhanh 30 (20,7) 19 (34,5) 0,042 2,0 (1,01-4,01) Mạch > 150 l/p BC > 10 000 BC > 13 000 BC > 16 000 Lactate > 2,5 35 (24,1) 28 (50,9) 0,000 3,25 (1,69-6,28) 103/140 (73,6) 45/55 (81,6) 0,22 1,6 (0,74-3,53) 58 (41,4) 27 (49,1) 0,33 1,36 (0,72-2,55) 31 (22,1) 20 (36,4) 0,042 2,0 (1,01-3,9) 10/136 (7,4) 7/50 (14%) 0,16 2,05 (0,73-5,72) EV71 64 (44,1) 25 (45,5) 0,86 1,05 106 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học Yếu tố Không BCN = 145 n (%) Có BCN = 55 n (%) p OR (95%CI) (0,56-1,96) Đối với các bệnh nhân có biến chứng, chúng tôi phân tích mối liên quan giữa các dấu hiệu lâm sàng với mức độ gây biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim) (bảng 5) thông qua so sánh giữa nhóm có biến chứng nặng và nhóm biến chứng nhẹ. Kết quả cho thấy các dấu hiệu phát ban ít, sốt 38 o 5C, giật mình, nhịp tim nhanh và thở nhanh có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm. Tuy nhiên, hai dấu hiệu sốt 38 o 5C và giật mình là 2 yếu tố có giá trị bảo vệ tránh biến chứng nặng. Đây là một đặc điểm cần lưu ý vì trong nghiên cứu này, chúng tôi không can thiệp vào quá trình điều trị (bệnh nhân được theo dõi và điều trị theo Phác đồ điều trị hiện hành của bệnh viện), nên có thể đây là 2 dấu hiệu giúp phát hiện sớm biến chứng và can thiệp sớm nên đã hạn chế diễn tiến đến các biến chứng nặng. Tuy nhiên, cần phải có các nghiên cứu với thiết kế thích hợp để xác định các giả thuyết này. Bảng 6: Phân tích các yếu tố nguy cơ tử vong Yếu tố Sống = 194 n (%) Sốt > 38,5 o C 148/181 (81,8) Tử vong = 6 n (%) p OR (95%CI) 5/5 (100) 0,29 1,03 (1,0-1,06) Phát ban ít 6694 (34) 3 (50) 0,4 1,9 (0,3-9,8) Giật mình 176 (90,7) 5 (83,3) 0,5 0,5 (0,05-4,6) Nôn ói 68 (35,1) 3 (50) 0,4 1,8 (0,36-9,4) Run chi 93 (47,9) 1 (16,7) 0,13 0,2 (0,02-1,8) Thở nhanh 46 (23,7) 3 (50) 0,14 3,2 (0,6-16,4) Tim nhanh 57 (29,4) 6 (100) 0,000 1,1 (1,02-1,19) BC > 16 000 48 (25,4) 3 (50) 0,17 2,9 (0,5-15,5) Lactate > 2,5 15 (8,3) 2/5 (40) 0,015 7,3 (1,14-47,6) Viêm não 34 (17,5) 5 (83,3) 0,000 23 (2,6-207) Liệt mềm 14 (7,2) 1 (16,7) 0,38 2,5 (0,28-23,5) Hôn mê 8 (4,1) 5 (83,3) 0,000 116 Yếu tố Sống = 194 n (%) Tử vong = 6 n (%) p OR (95%CI) (12-1114) Sốc 5 (2,6) 4 (66,7) 0,000 75 (11-513) Phù phổi 7 (3,6) 2 (33,3) 0,001 13,3 (2,2-85,5) Viêm cơ tim 1 (0,5) 0 0,86 - Co giật 24 (12,4) 1 (16,7) 0,7 1,4 (0,15-12,6) Phân tích mối liên quan giữa các dấu hiệu lâm sàng với nguy cơ tử vong cho thấy nhịp tim nhanh, hôn mê, sốc, phù phổi và viêm não liên quan có ý nghĩa thống kê đối với nguy cơ tử vong (bảng 6). Mối tương quan giữa các cận lâm sàng với biến chứng Phân tích số lượng bạch cầu trong máu cho thấy nhóm biến chứng có số lượng bạch cầu trung bình cao hơn: 13.037 4.348/mm 3 so với nhóm không biến chứng 11.553 4.114 /mm 3 (p = 0,001). Tương tự, số lượng neutrophile trung bình của nhóm bệnh có biến chứng cũng cao hơn: 6.828 3.521/mm 3 so với nhóm không biến chứng 5.494 2.939/mm 3 (p<0,001). Tuy nhiên, số lượng bạch cầu lymphocyte ở nhóm biến chứng là 5.440 2.765/mm 3, không khác biệt so với nhóm không biến chứng 5.046 2.287/mm 3 (p=0,13). Chọn 3 ngưỡng bạch cầu tăng khác nhau là 10.000, 13.000 và 16.000 tương ứng với các giá trị tứ phân vị dưới, số trung bình trung vị và tứ phân vị trên của nhóm có biến chứng để phân tích tương quan giữa sự gia tăng bạch cầu và biến chứng cho thấy nhóm biến chứng. Chỉ có tăng bạch cầu trên 16.000/mm 3 có liên quan đến biến chứng nặng nhưng không có khác biệt có ý nghĩa khi so sánh về nguy cơ tử vong (bảng 3, 5, 6). Dùng ngưỡng neutrophile > 7.000/mm 3 làm ngưỡng so sánh; nhận thấy nhóm neutrophile có biến chứng cao hơn với tỉ số chênh là 2,24 (1,44-3,48) (p < 0,001). Trong nghiên cứu của Luan-Yin Chang và cộng sự ghi nhận tăng bạch cầu trên 17500/mm 3 liên quan Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 107

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 với nguy cơ phù phổi cấp (2). Phân tích số lượng bạch cầu trong dịch não tủy ở các trường hợp có biểu hiện biến chứng thần kinh, nhận thấy số lượng bạch cầu tăng cao, trung bình: 161 218/mm 3 (5-1.955), có 50,3% trường hợp bạch cầu đa nhân ưu thế, rất giống với viêm màng não do vi trùng. Tuy nhiên, không có tương quan giữa số lượng tế bào trong DNT với nguy cơ biến chứng nặng. Phân tích giá trị đạm trong DNT cho thấy, gần 70% có lượng đạm trong dịch não tủy < 0,4g/l, nhưng có 4 % có đạm trong dịch não tủy > 1g/l. Không có khác biệt lượng đạm giữa các nhóm biến chứng nặng và tử vong. Phân tích giá trị đường trong dịch não tủy, chúng tôi nhận thấy 100% các trường hợp có đường trong dịch não tủy bình thường so với đường máu. Lactate dịch não tủy trên 2,5 mmol/l không có giá trị tiên lượng trong biến chứng nặng nhưng có giá trị cho tiên lượng tử vong ở những trường hợp có biến chứng (p=0,015). Những mẫu có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 sẽ được thử nghiệm Real-time RT- PCR để xác định NĐVR. Phân tích trị số trung bình của NĐVR giữa hai nhóm có và không có biến chứng bằng phép kiểm T dành cho 2 mẫu độc lập. Trong phân tích định chuẩn xét nghiệm ban đầu, tương quan tuyến tính chỉ xuất hiện khi NĐVR từ 10 2 đến 10 5 copies/ml. Do NĐVR tính toán khi thực hiện xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm căn cứ vào quan hệ tuyến tính trên nên chúng tôi chỉ phân tích các trường hợp NĐVR trong ngưỡng nhằm đánh giá mối tương quan giữa NĐVR và biến chứng. Kết quả phân tích giá trị trung bình của NĐVR các trường hợp có kết quả nằm trong ngưỡng có tương quan tuyến tính từ 102-105 copies/ml cho thấy không khác biệt có ý nghĩa thống kê về giá trị trung bình giữa hai nhóm (bảng 7). Bảng 7: So sánh nồng độ vi rút giữa nhóm có biến chứng và không biến chứng Loại bệnh phẩm Phết họng Phết trực tràng Dịch não tủy Nhóm không biến chứng n Trung bình (copies/ml) n Nhóm có biến chứng Trung bình (copies/ml) 30 4.960 ± 12.701 40 4.852 ± 11.171 0,97 22 18.314 ± 22.419 31 11.159 ± 13.971 0,159 3 4.083 ± 6.261 5 3.512 ± 4.705 0,887 Phân tích tương quan giữa NĐVR trong mẫu phết họng và các biến chứng nặng, giá trị trung bình của ở nhóm không có biến chứng nặng là 4.892 ± 12.005 copies/ml (n=60) không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p=0,99) so với nhóm có biến chứng nặng là 4.957 ± 10.766 copies/ml (n=10). Tương tự như vậy, trong mẫu phết trực tràng ở nhóm không biến chứng nặng là 13.616 ± 18.449 copies/ml (n=47) thấp hơn so với nhóm có biến chứng nặng là 18.147 ± 16.138 copies/ml (n=6), nhưng sự khác biệt này không ý nghĩa thống kê với p = 0,569. KẾT LUẬN BTCM thường gặp ở trẻ dưới 36 tháng. Đây là một bệnh cấp tính, tỉ lệ biến chứng cao đến 47,7%. Biến chứng nặng như viêm não, phù phổi, viêm cơ tim chiếm 10%. Tử vong chiếm 10,9% tổng số các trường hợp biến chứng nặng. Về yếu tố tiên lượng: Các yếu tố sốt, sốt 38 o 5C, phát ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, bạch cầu trong máu tăng > 13.000/mm 3, neutrophile tăng trên 7.000/mm 3 có giá trị tiên lượng biến chứng. Các yếu tố phát ban ít, sốt 38 o 5C, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, thở nhanh theo tuổi, bạch cầu máu tăng trên 16.000/mm 3 có giá trị trong tiên lượng biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim). Các yếu tố nhịp tim nhanh, hôn mê, sốc, phù phổi hoặc biến chứng viêm não, lactate DNT > 2,5 mmol/l có giá trị tiên lượng tử vong. TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1. Chan KP et al (2003). Epidemic Hand, Foot and Mouth Disease Caused by Human Enterovirus 71, Singgapore. Emerg. Infect. Dis. 9 (1): 78-84. P 108 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011