UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE,,GR. T. POPA IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ DISCIPLINA DE MORFOPATOLOGIE

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE,,GR. T. POPA IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ DISCIPLINA DE MORFOPATOLOGIE TEZĂ DE DOCTORAT Aportul tehnicilor noi de investigaţie în diagnosticul leziunilor preinvazive şi invazive ale colului uterin Conducător ştiinţific, Prof. Univ. Dr. Maria Sultana Mihailovici Doctorand, Asist. Univ. Carmen Ungureanu IAŞI 2011

CUPRINS Introducere 1 STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII Capitolul 1 CARCINOGENEZA COLULUI UTERIN 3 1.1. Carcinogeneza virală. 3 1.2. Virusul papiloma uman (HPV) 4 1.2.1. Ciclul de viaţă al HPV 5 1.2.2. Genomul virusului papiloma uman. 5 1.2.2.1. Proteina E1 6 1.2.2.2. Proteina E2 7 1.2.2.3. Proteina E4 8 1.2.2.4. Proteina E5 8 1.2.2.5. Proteina E6 9 1.2.2.6. Proteina E7 11 1.2.2.7. Proteina L1 14 1.2.2.8. Proteina L2 14 Capitolul 2 MECANISME IMUNOPATOGENICE IMPLICATE ÎN NEOPLAZIA CERVICALĂ 15 2.1. Epidemiologia infecţiei HPV 16 2.2. Factori de risc 16 2.2.1. Factori de risc virali 19 2.2.1.1. Variantele virale 19 2.2.1.2. Încărcătura virală 19 2.2.1.3. Integrarea HPV 20 2.2.1.4. Coinfecţii 20 2.2.2. Factori de risc non-hpv 20 2.2.2.1. Cofactori exogeni 20 2.2.2.2. Cofactori endogeni 22 2.3. Modificări citogenetice şi epigenetice în cancerul cervical 23 2.4. Răspunsul imun 25 2.4.1. Răspunsul imun natural anti-viral 25 2.4.2. Răspunsul imun adaptativ la infecţia HPV 26 2.4.2.1. Răspunsul imun mediat umoral în infecţia HPV 26 2.4.2.2. Răspunsul imun mediat celular în infecţia HPV 27 2.4.3. Mecanismele eludării imune specifice infecţiei HPV 29 Capitolul 3 METODE DE DIAGNOSTIC A LEZIUNILOR CERVICALE PREINVAZIVE 33 3.1. Screeningul citologic al leziunilor preinvazive şi invazive ale colului uterin 33 3.1.1. Istoric 33 3.1.2. Citologia convenţională 34 3.1.3. Citologia în mediu lichid (CML) 34 3.1.4. Sistemul de raportare Bethesda 2001 35 3.2. Examinarea colposcopică 37 3.2.1. Obiectivele şi indicaţiile colposcopiei 37 3.2.2. Terminologia şi clasificarea leziunilor colposcopice 38 3.3. Diagnosticul histopatologic 39 3.3.1. Biopsia cervicală 39 2

3.3.2. Conizaţia 39 3.3.3. Clasificarea CIN (neoplazia intraepitelială cervicală) 40 3.4.Testarea virală 41 3.4.1. Tipurile de teste utilizate pentru evidentierea HPV 41 3.5.Rolul biomarkerilor 43 3.5.1. Proteina L1 de capsidă a HPV 44 3.5.2. Proteina p16 INK4a 44 3.5.3. Biomarkerul Ki-67 45 3.5.4. Biomarkerul ProEx C 46 Capitolul 4 MANAGEMENTUL CONDUITEI DE DIAGNOSTIC ŞI TERAPIE A PACIENTELOR CU 48 LEZIUNI PREINVAZIVE ALE COLULUI UTERIN 4.1. Managementul pacientelor cu anomalii citologice ale celulelor scuamoase cervicale 48 4.1.1. Managementul recomandat pacientelor cu ASC-US 48 4.1.2. Managementul recomandat pacientelor cu ASC-H 51 4.1.3. Managementul recomandat pacientelor cu LSIL 51 4.1.4. Managementul recomandat pacientelor cu HSIL 53 4.2. Managementul recomandat pacientelor cu neoplazie intraepitelială cervicală 54 4.2.1. Managementul recomandat pacientelor cu neoplazie intraepitelială de grad redus (CIN 1) 54 4.2.2. Managementul recomandat pacientelor cu neoplazie intraepitelială de grad înalt (CIN 2, 3) 55 Capitolul 5 VACCINAREA PROFILACTICĂ ŞI TERAPEUTICĂ ÎMPOTRIVA HPV 58 5.1. Vaccinarea profilactică 58 5.2. Vaccinarea terapeutică 60 5.2.1. Vaccinarea cu vectori virali 60 5.2.2. Vaccinurile bazate pe vectori bacterieni 60 5.2.3. Vaccinurile bazate pe celule 61 5.2.4. Vaccinuri bazate pe peptide 61 5.2.5. Vaccinuri bazate pe proteine 61 5.2.6. Vaccinuri ADN 61 5.2.7. Vaccinuri bazate pe repliconi tip ARN 62 5.2.8. Vaccinuri preventive şi terapeutice bazate pe pseudovirioni HPV nereplicativi 62 CONTRIBUŢII PERSONALE Capitolul 6 OBIECTIVELE CERCETĂRII 64 Capitolul 7 MATERIAL ŞI METODĂ 66 7.1. Lot de studiu 66 7.1.1. Criterii de selecţie a cazurilor de studiu 66 7.2. Metodologia cercetării 66 7.3. Citologia convenţională (cc) şi citologia în mediu lichid (cml) 67 7.3.1. Citologia convenţională 67 7.3.2. Citologia în mediu lichid (CML) 68 7.3.3. Coloraţia Papanicolaou 68 7.3.4. Raportul citopatologic 69 7.4. Genotiparea ADN-HPV 70 7.5. Diagnosticul colposcopic 71 7.6. Evaluarea imunocitochimică a biomarkerilor pe frotiurile cervico-vaginale (L1, p16 INK4a, p16/ki-67, 73 ProEx C) 3

7.6.1. Tehnica de lucru 73 7.6.2. Interpretarea rezultatelor 74 7.6.2.1. Proteina L1 HPV 74 7.6.2.2. Proteina p16ink4a 75 7.6.2.3. Proteina p16ink4a şi markerul de proliferare Ki-67 75 7.6.2.4. Biomarkerul ProEx C 76 7.7. Diagnosticul histopatologic 77 7.7.1. Metode de prelevare 77 7.7.2. Prelucrarea pieselor bioptice 77 7.7.3. Interpretarea rezultatelor 78 7.8. Evaluarea imunohistochimică a biomarkerilor pe secţiuni histologice (L1, p16ink4a, Ki-67, p16/ki- 79 67, ProEx C) 7.8.1. Tehnica de colorare imunohistochimică 79 7.8.2. Interpretarea rezultatelor 80 7.8.2.1. Proteina L1 HPV 80 7.8.2.2. Proteina p16 INK4a 80 7.8.2.3. Proteina p16 INK4a şi markerul de proliferare Ki-67 80 7.8.2.4. Biomarkerul ProEx C 81 7.9. Metode statistice aplicate 81 Capitolul 8 REZULTATE 84 8.1. Caracteristicile generale ale lotului de studiu 84 8.2. Studiu explorator iniţial 92 8.2.1. Evaluarea citologică (citologie convenţională) 92 8.2.2. Citologia în mediu lichid (CML) 93 8.2.3. Testarea HPV 99 8.2.4. Evaluarea colposcopică 105 8.3. Evaluare imunocitochimică 106 8.3.1. Proteina de capsidă L1 a HPV 107 8.3.2. Proteina p16ink4a 116 8.3.3. Biomarkerul Ki-67 124 8.3.4. Biomarkerul ProEx C 136 8.3.5. Expresia combinată a markerilor imunocitochimici 146 8.4. Evaluare histopatologică 151 8.5. Studiu asupra aportului metodelor de diagnostic utilizate în evaluarea iniţială pentru depistarea 156 neoplaziei intraepiteliale cervicale de grad înalt (CIN2+) 8.6. Studiu asupra aportului markerilor imunocitochimici în depistarea leziunilor intraepiteliale cervicale 160 de grad înalt (CIN2+) 8.7. Evaluare imunohistochimică 162 8.7.1. Proteina de capsidă L1 HPV 162 8.7.2. Biomarkerul p16ink4a 167 8.7.3. Biomarkerul Ki-67 175 8.7.4. Biomarkerul ProEx C 183 8.7.5. Analiza combinată a rezultatelor marcajului imunohistochimic 191 8.8. Evoluţia leziunilor 194 8.8.1. Evoluţia cazurilor netratate chirurgical 194 8.8.1.1. Evoluţia cazurilor ASC-US/ LSIL 194 8.8.1.2. Evoluţia cazurilor HSIL 195 8.8.2. Evoluţia cazurilor post-conizaţie 196 4

Capitolul 9 DISCUŢII 198 9.1. Date generale 199 9.2. Citologia convenţională (CC) 200 9.3. Citologia în mediu lichid (CML) 200 9.4. Testarea HPV 201 9.5. Examenul colposcopic 202 9.6. Evaluarea biomarkerilor pe frotiurile cervico-vaginale (L1,p16INK4a, Ki-67, ProEx C) 203 9.6.1. Proteina majoră de capsidă L1 HPV 203 9.6.2. Proteina p16ink4a 205 9.6.3. Biomarkerul Ki-67 205 9.6.4. Biomarkerul ProEx C 206 9.6.5. Expresia combinată a markerilor imunocitochimici 208 9.7. Evaluarea biomarkerilor pe secţiuni histologice (L1, p16ink4a, Ki-67, ProEx C) 210 9.7.1. Proteina L1 de capsidă IHC 210 9.7.2. Proteina p16ink4a IHC 211 9.7.3. Biomarkerul Ki-67 IHC 212 9.7.4. Biomarkerul ProEx C IHC 213 9.7.5. Expresia combinată a markerilor imunohistochimici 213 9.8. Evoluţia leziunilor 215 Capitolul 10 CONCLUZII 217 Bibliografie 219 LISTA DE ABREVIERI Ac Acurateţe ADN acid dezoxiribonucleic ALTS eng. ASCUS-LSIL Triage Study APOT eng. amplification of Papillomavirus Oncogene Transcripts (amplificarea transcripţilor oncogenelor virale) ARN acid ribonucleic ASC-US eng. atipical scuamous cells of undetermened significance (celule scuamoase atipice de semnificaţie nedeterminată) APC eng. antigen-presenting cell ATP adenozin trifosfat CDC eng. cell division cycle (ciclul de diviziune celulară) cdk Eng. Cyclin-dependent kinase (kinază dependentă de ciclină) CIN eng. Cervical Intraepithelial Neoplasia (neoplazie intraepitelială cervicală) CIS Carcinom in situ CMH complex major de histocompatibilitate CML Citologie în mediu lichid CO contraceptive orale CTL eng. cytotoxic T lymphocyte limfocite T citotoxice DC dendritic cell DES diethylstilbestrol DNMT Eng. DNA methyltransferase DTC diatermocoagulare EBV eng. Epstein-Barr virus EGFR eng. epidermal growth factor receptor ( receptorul factorului de creştere 5

epidermal) FDA eng. Food & Drug Administration (administraţia pentru calitatea alimentelor si medicamentelor) HAT Eng. histone acetyltransferase HC eng. Hybrid capture HDAC eng. Histone deacetylase HE Hematoxilină-eozină HSIL eng. High Grade Scuamous Intraepithelial Lesion (leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt) HIV eng. Human Immunodeficiency virus (virusul imunodeficienţei umane) HLA I eng. human leukocyte antigen class I (antigen leucocitar uman de clasă I) HPV eng. Human Papilloma Virus (virusul papiloma uman) HPV-LR eng. Human Papilloma Virus - Low risk (virusul papiloma uman risc scăzut) HPV-HR eng. Human Papilloma Virus - High risk (virusul papiloma uman risc înalt) HSV Herpes simplex virus IGF eng. Insulin-like growth factor IFN interferon IgG imunoglobulină G IL interleukine (interleukină) IRF eng. interferon regulatory factor ISGF-3 eng. Interferon-Stimulated Gene Factor-3 ISRE eng. interferon-stimulated response element LCR eng. Long Control Region LEEP eng. loop electrosurgical excision procedure (procedeu de excizie cu ansă diatermică) LHc eng. Langerhans cells LMP eng. low molecular mass protein LSIL eng. Low Grade Scuamous Intraepithelial Lesion (leziune intraepitelială scuamoasă de grad redus) LLETZ eng. Large loop excision of the transformation zone ( conizaţia cu ansă diatermică) M2-PK Eng. M2 pyruvate kinaze MCM2 eng. Minichromosome maintenance protein2 MCP-1 eng. monocyte chemoattractant protein-1 MIP-3alfa eng. macrophage inflammatory protein-3alpha NCR eng. Non Coding Region NHANES eng. National Health and Nutrition Examination Survey NK eng. natural killer (celule NK) ORF eng. open reading frame (cadru deschis citirii) PCR eng.polymerase chain reaction (reactia de polimerizare în lanţ) PDZ eng. Post synaptic density protein (PSD95) Drosophila disc large tumor suppressor (DlgA) Zonula occludens-1 protein (zo-1) prb proteina retinoblastomului SCC eng. Squamous-cell carcinoma Sn sensibilitate Sp specificitate STAT eng. signal transducer and activator of transcription (semnalizator şi activator al transcripţiei) 6

TAP eng. transporters of antigenic peptid (transportatorii peptidelor antigenice) TBP eng. TATA box binding protein TBS eng. The Bethesda system TGF eng. tumor growth factor (factor de creştere tumoral) TNF eng. tumor necrosis factor (factorul de necroză tumoral) TOP2A Topoisomerase IIα Tyk2 tyrosine kinase 2 URR eng. Upstream Regulatory Region ( regiunea reglatoare situată în amonte) VHB Virusul Hepatitei B VIA eng. visual inspection with acetic acid (inspecţie vizuală cu acid acetic) VLP eng. Virus like-particles (particule care mimează virusul) VPN valoare predictivă negativă VPP Valoare predictivă pozitivă XPGC Xeroderma pigmentosum group G complementing protein ZT Zona de Transformare 7

INTRODUCERE Cancerul cervical reprezintă a doua formă de cancer ca frecvenţă în lume, cu aproximativ 493.000 cazuri noi diagnosticate anual. Cele mai multe cazuri sunt raportate în ţările în curs de dezvoltare unde reprezintă cauza principală a mortalităţii la femei. Cifrele ridicate de mortalitate prin cancer de col uterin care se înregistrează în România, se datorează în primul rând diagnosticării tardive a bolii (cele mai multe paciente fiind diagnosticate în faza de cancer invaziv). Citologia exfoliativă vaginală a fost prima metodă citologică cu ajutorul căreia s-a precizat un diagnostic prin examinarea celulelor izolate şi a avut aplicabilitate practică în diagnosticul neoplaziilor maligne ale colului uterin. Screeningul citologic organizat şi susţinut a determinat scăderea cu 70% a deceselor prin cancer cervical în ţările în care au fost implementate aceste programe. Localizarea accesibilă investigaţiilor şi faptul că stadiul invaziv al cancerului cervical este precedat de perioade lungi în care transformarea neoplazică este strict intraepitelială, sunt factorii care explică succesul remarcabil pe care l-a avut introducerea examenului citologic în acţiunile de depistare precoce a leziunilor preinvazive sau invazive cervicale. Cu toate acestea, examenul citologic prezintă o sensibilitate scăzută în detectarea leziunilor intraepiteliale de grad înalt (între 30% şi 87%) cu o rată medie de 60%. La începutul anilor 1980, Harald zur Hausen şi colaboratorii au demonstrat rolul infecţiei HPV în etiologia cancerului cervical. Demonstrarea relaţiei de cauzalitate strânsă între infecţia persistentă cu HPV-HR şi cancerul cervical a dus la dezvoltarea unor noi tehnici de detectare a ADN şi ARN HPV. Testarea HPV prezintă o sensibilitatea superioară diagnosticului citologic, în schimb specificitatea acestui test este scăzută. Datorită faptului că un procent redus din infecţiile HPV-HR vor evolua spre un carcinom cervical invaziv, noile direcţii de cercetare s-au axat pe identificarea unor noi markeri care să ofere informaţii despre statusul infecţiei HPV şi riscul de progresie al leziunilor. În acest context, în ultimii 10 ani s-a tentat abordarea neoplaziei cervicale prin metode de biologie moleculară (imunocitochimie, imunohistochimie) în încercarea de a îmbunătăţi diagnosticul leziunilor cervicale preinvazive şi de a stabili prognosticul acestor leziuni. Scopul acestui studiu a fost de a identifica aportul atât al metodelor clasice (citologie, colposcopie, testare HPV), precum şi al metodelor noi de biologie moleculară în detectarea neoplaziei intraepiteliale cervicale de grad înalt, şi în stabilirea predicţiei evoluţiei spre carcinom invaziv a pacientelor cu leziuni preinvazive cervicale. Această cercetare a fost posibilă datorită colaborării cu medici de la Spitalul de Obstetrică-Ginecologie Cuza-Vodă Iaşi şi de la Laboratorul de Inginerie Genetică Virală a Institutului de Virusologie Ştefan S. Nicolau, Bucureşti. Reactivii imunologici utilizaţi pentru realizarea acestei cercetări au fost achiziţionaţi în principal din fondurile proiectului de cercetare PNII 41-030/2007, finanţat de Autoritatea Naţională de Cercetare Ştiinţifică şi Centrul Naţional de Management Proiecte. CAPITOLUL 6 OBIECTIVELE CERCETĂRII Prevenţia cancerului cervical reprezintă un proces extrem de dinamic. Noi descoperiri cu privire la HPV, reconsiderarea permanentă a managementului testelor Papanicolaou anormale şi obţinerea unor vaccinuri terapeutice anti-hpv sunt direcţii de cercetare asupra cărora specialiştii îşi îndreaptă atenţia în permanenţă. Conform statisticilor OMS din 2010, România se situează pe primul loc în Europa atât în ceea ce priveşte incidenţa cancerului de col uterin - 29,9/100.000 femei, cât şi rata mortalităţii cauzată de acest tip de cancer - 12,06/100.000 femei. Această rată a mortalităţii este de două ori mai mare decât în majoritatea 8

ţărilor din Europa Centrală şi de Est şi de şase ori decât media din statele membre ale UE. Cancerul de col uterin reprezintă a doua cauza de mortalitate prin cancer la femeile din România, după cancerul de sân, şi prima cauză de mortalitate prin cancer la femeile din grupa de vârstă 15-44 de ani, constituind o problemă de sănătate publică cu importante costuri sociale. În SUA, de la iniţierea screening-ului citologic (1949), incidenţa şi mortalitatea prin cancer cervical au scăzut cu 75%, respectiv 73%. După anul 1960, metoda se aplică şi în ţările dezvoltate economic, cu rezultate spectaculoase în privinţa scăderii dramatice a incidenţei cancerului invaziv, căpătând o susţinere teoretică puternică odată cu emiterea conceptului de continuum biologic al leziunilor preinvazive cervicale. Cu toate acestea, chiar şi în ţările dezvoltate, unde programe de screening organizat sunt bine puse la punct, problema nu este complet rezolvată. Din 1980 până astăzi mortalitatea prin cancer de col uterin a ramas neschimbată. În acest context, studiul literaturii de specialitate din ultimii 10 ani a relevat importanţa abordării neoplaziei cervicale prin metode de biologie moleculară (imunocitochimie, imunohistochimie, testare virală) pentru identificarea unor corelaţii între aspectele imunocitochimice şi imunohistochimice şi îmbunătăţirea prognosticului pacientelor cu leziuni cervicale preinvazive. Situaţia particulară a incidenţei şi mortalităţii prin carcinom cervical care se înregistrează în ţara noastră, alături de posibilităţile de diagnostic precoce al acestor leziuni au creat premisele prezentului studiu axat pe leziunile cervicale preinvazive. Scopul acestui studiu a fost de a identifica aportul atât al metodelor clasice (citologie, colposcopie, testare HPV), precum şi al metodelor noi de biologie moleculară în detectarea neoplaziei intraepiteliale cervicale de grad înalt, şi în stabilirea predicţiei evoluţiei spre carcinom invaziv a pacientelor cu leziuni preinvazive cervicale. Această cercetare a fost posibilă datorită colaborării cu Spitalul de Obstetrică-Ginecologie Cuza- Vodă Iaşi şi cu Laboratorul de Inginerie Genetică Virală a Institutului de Virusologie Ştefan S. Nicolau, Bucureşti. Reactivii imunologici utilizaţi pentru realizarea acestei cercetări au fost achiziţionaţi în principal din fondurile proiectului de cercetare PNII 41-030/2007, finanţat de Autoritatea Naţională de Cercetare Ştiinţifică şi Centrul Naţional de Management Proiecte. Pornind de la aceste considerente studiul nostru a vizat stabilirea aportului diferitelor metode de diagnostic utilizate în depistarea neoplaziei cervicale intraepiteliale, precum şi încercarea de a stabili prognosticului acestor leziuni. în vederea alcătuirii pe viitor a unui protocol de investigaţie şi terapeutic complet şi complex, individualizat în funcţie de factorii proprii de prognostic. Obiectivele studiului: Evaluarea metodelor clasice diagnostic al leziunilor scuamoase ale colului uterin (citologie cervicală, testare virală, colposcopie); Evaluarea expresiei imunocitochimice a diferiţilor markeri cu rol diagnostic şi prognostic (p16, Ki-67, L1, ProEx C) în leziunile scuamoase preinvazive ale colului uterin; Evaluarea histopatologică a leziunilor scuamoase preinvazive ale colului uterin; Evaluarea expresiei imunohistochimice a diferiţilor markeri cu rol diagnostic şi prognostic (p16, Ki-67, L1, ProEx C) în leziunile scuamoase preinvazive ale colului uterin; Identificarea corelaţiilor posibile între diferitele metode utilizate în diagnosticarea leziunilor scuamoase preinvazive ale colului uterin; Identificarea biomarkerilor utili în diagnosticul corect al leziunilor scuamoase cervicale intraepiteliale, precum şi a celor asociaţi cu riscul de persistenţă a infecţiei HPV şi a progresiei leziunilor; Stabilirea rolului prognostic al metodelor de diagnostic ale leziunilor scuamoase preinvazive ale colului uterin utilizate, prin analiza datelor obţinute în urma evaluării pacientelor din punct de vedere citologic, colposcopic şi genotipare HPV la 6 luni de la diagnosticul iniţial, pe o perioadă de 18 luni. 9

CAPITOLUL 7 MATERIAL ŞI METODĂ 7.1. LOT DE STUDIU Populaţia de studiu a constat din 395 paciente selectate din totalul de 2793 paciente testate citologic în Laboratorul de Citodiagnostic al Spitalului de Urgenţe Sf. Spiridon Iaşi în perioada 2006 2009. Pacientele au fost evaluate citologic, colposcopic, testate HPV şi urmărite în evoluţie în colaborare cu medici ginecologi de la Spitalul de Obstetrică Ginecologie Cuza-Vodă Iaşi, într-un studiu prospectiv. Toate pacientele şi-au dat acordul informat privind stabilirea protocolului investigaţiilor: recoltarea frotiurilor pentru citologie convenţională şi citologie în mediu lichid; detectarea şi tiparea HPV; colposcopie cu biopsie ţintită sau conizaţie în cazul pacientelor cu leziuni; marcaje imuncitochimice şi imunhistochimice. 7.1.1. CRITERII DE SELECŢIE A CAZURILOR DE STUDIU Cazurile de studiat au fost incluse în 5 loturi conform diagnosticului citologic iniţial: Lotul NILM - 105 de femei cu examen citologic normal; Lotul ASC-US - 41 de paciente cu atipii ale celulelor scuamoase cu semnificaţie incertă diagnosticate citologic ; Lotul LSIL - 140 de paciente cu leziuni intraepiteliale de grad redus diagnosticate citologic; Lotul HSIL - 104 de paciente cu leziuni intraepiteliale de grad înalt; Lotul CSC 5 paciente cu carcinom scuamocelular invaziv. Criteriile de excludere, stabilite iniţial, au fost: paciente însărcinate; paciente cu tratamente pentru neoplazie intraepitelială cervicală (CIN) cu mai puţin de un an în urmă; paciente cu histerectomie totală. 7.2. METODOLOGIA CERCETĂRII Toate cazurile selecţionate pentru studiu au fost evaluate conform unui protocol prestabilit, fişele de evaluare cuprinzând: date de ordin general, antecedente fiziologice şi patologice, date clinice şi terapeutice anterioare. În momentul primei consultaţii s-au recoltat frotiuri convenţionale şi probe pentru citologie în mediu lichid, probe pentru testarea ADN HPV şi s-a efectuat un control colposcopic. Nu s-a efectuat nici un tratament şi nu s-au recoltat probe bioptice. Pacientele cu toate testele screening negative au fost rechemate la control peste 6 luni. La pacientele cu rezultat pozitiv la măcar unul dintre testele screening efectuate, s-au recoltat biopsii ţintite colposcopic. În cazurile cu suspiciune de leziune de grad înalt s-a efectuat conizaţie. În cazul pacientelor cu leziuni cervicale diagnosticate citologic, cu infecţii HPV-HR sau cu suspiciune colposcopică de neoplazie de grad înalt (249 cazuri) s-au efectuat biopsii ţintite colposcopic pentru evaluarea histopatologică a gradului de displazie sau conizaţii cu rol diagnostic şi terapeutic. În funcţie de rezultatul evaluării complexe (citologie, colposcopie, testare ADN HPV) iniţiale, pacientele au fost urmărite citologic, colposcopic şi testate HPV la intervale variind între 3 şi 6 luni pe o perioadă de minimum 1 an. În cazul pacientelor diagnosticate histopatologic cu carcinom scuamocelular invaziv s-a practicat histerectomie totală şi au fost excluse din studiu. 10

7.3.EXAMENUL CITOLOGIC 7.3.1. CITOLOGIA CONVENŢIONALĂ (CC) Recoltarea s-a efectuat utilizând periuţe Cervex-Brush care permit recoltarea simultană a celulelor atât de la nivel exocervical, cât şi endocervical (325). În citologia convenţională, celulele colectate cu ajutorul periuţei au fost etalate rapid pe lamă. Pentru a păstra detaliile morfologice ale celulelor, imediat după etalare frotiurile au fost fixate prin imersia în alcool 96 0, timp de minimum 30 minute, uscarea la aer a frotiului limitând interpretarea acestuia. 7.3.2. CITOLOGIA ÎN MEDIU LICHID (CML) Celulele de la nivel cervical au fost recoltate cu Papette brush (Wallach, Orange, CT). Capul periuţei cu materialul recoltat a fost depus într-un recipient cu lichid fixator (PapSpin Collection Fluid ). Pentru prelucrarea frotiurilor am utilizat citocentrifuga Shandon Cytospin 3 (ThermoElectron, Pittsburgh, PA). Atât frotiurile convenţionale cât şi cele prelucrate în mediu lichid au fost colorate prin metoda Papanicolaou. Raportul Citopatologic a utilizat Sistemul Bethesda 2001 7.4. GENOTIPAREA ADN HPV Genotiparea HPV s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Inginerie Genetică Virală a Institutului de Virusologie Ştefan S. Nicolau, Bucureşti. Lavajele cervicale au fost colectate în mediu lichid de transport Copan, care permite conservarea acizilor nucleici virali, bacterieni, fungici. ADN a fost izolat din lavajele cervicale în maxim 2 zile de la recoltare, folosind kitul commercial QIAmp (Qiagen). Genotiparea ADN HPV s-a efectuat cu kitul commercial Linear Array HPV Genotyping (Roche Diagnostics) ce permite genotiparea a 37 tipuri HPV diferite (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39, CP6108). 7.5. DIAGNOSTICUL COLPOSCOPIC Examenul colposcopic şi recoltarea probelor bioptice au fost realizate de către medici de la Spitalul de Obstetrică Ginecologie,,Cuza-Vodă,, Iaşi. Colposcopia este o metodă endoscopică, endovaginală, de examinare a tractului genital inferior). Realizarea examenului: examinarea colposcopică s-a efectuat cu pacienta pe masa ginecologică, în poziţie de litotomie. Înainte de examinarea colului s-au examinat vaginul şi vulva, examen important întrucât există un risc crescut de neoplazie vulvară sau vaginală la femeile cu patologie cervicală. Probele pentru citotestul cervical au fost recoltate înainte de examenul colposcopic propriu-zis, întrucât soluţiile de acid acetic sau Lugol pot interfera cu morfologia celulară. Diagnosticul colposcopic a utilizat terminologia IFCPC (International Federation of Cervical Pathology and Colposcopy) 2011. 7.6. EVALUAREA IMUNOCITOCHIMICĂ A BIOMARKERILOR PE FROTIURILE CERVICO-VAGINALE (L1, p16 INK4a, p16/ki-67, ProEx C) Reacţiile imunocitochimice s-au efectuat la Disciplina de Morfopatologie din cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie Gr. T. Popa Iaşi, folosind în principal reactivi imunocitochimici achiziţionaţi în cadrul proiectului de cercetare TD-42/2007 contractat de finanţare 474/03.10.2007 încheiat cu Unitatea Executivă pentru Finanţarea Învăţământului Superior şi a Cercetării Ştiinţifice Universitare. Pentru controlul reacţiilor imunocitochimice am folosit în fiecare ciclu de colorare lame de control pozitiv şi negativ. Control pozitiv: - în cazul proteinei L1 de capsidă a HPV s-au utilizat frotiurile cu celule HPV pozitive distribuite de firma producătoare (Fig. nr. 1); - în cazul celorlalţi anticorpi am realizat frotiuri cu celule SiHa pe care le-am inclus în bateria de lucru Fig. nr. 2, 3, 4). Pentru controlul negativ am utilizat frotiuri de la paciente cu diagnostic citologic de NILM, HPV negative. 11

Tabel V. Colorarea imunocitochimică - tehnica de lucru L1 Cytoactiv Screening Set p16 INK4a CINtec (MTM) p16 INK4a /Ki-67 CINtec PLUS (MTM) Clona HPV L1 E6H4 E6H4 274-11 AC3 ProEx C BD Tripath MCM226H6.19, MCM227C5.6, TOP2A WT3D1 Demascarea antigenului 20 min 20 min 10 min 20 min Inactivarea peroxidazei - 5 min 5 min 5 min endogene Blocarea proteinelor - - - 5 min Ac. primar 30 min 30 min 30 min 30 min Colorarea Ac. 10 min 30 min HRP- 15 min 20 min ICC secundar AP- 15 min Developare FR- 5 min DAB-10 DAB- 10 min DAB-5 min min FR- 15 min Contracolorare 10 sec 2 min 2 min 1 min Hematoxilină Montare Aquatex, Merck Entelan CINtec PLUS Mount Entelan Fig.nr.1. Martor pozitiv Proteina L1 de capsidă; Fig.nr 2 Proteina p16 INK4a Fig.nr 3 Biomarkerii p16 INK4a şi Ki-67 Fig.nr 4 Biomarkerul ProEx C 7.6.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR Înainte de a începe interpretarea marcajelor imunocitochimice au fost evaluate lamele de control pozitiv şi negativ. Algoritmul de examinare a frotiurilor Frotiurile cervicale au fost examinate după un algoritm ce utilizează 3 etape: 1. aprecierea calităţii frotiului în acord cu Sistemul de raportare Bethesda 2001; 2. determinarea prezenţei imunomarcajului (marcaj nuclear roşu pentru proteina L1 de capsidă, Ki-67, marcaj nuclear brun pentru ProEx C şi marcaj brun nuclear şi citoplasmatic pentru p16 INK4a ); 3. etapa finală în care am examinat prezenţa/absenţa anomaliilor citologice ale celulelor ce prezentau imunomarcaj. Am luat în studiu doar frotiurile satisfăcătoare şi am considerat rezultat pozitiv doar imunomarcajul celulelor atipice. 12

7.6.2.1. Proteina L1 HPV Anticorpul HPV L1 pentru screening de la Cytoactiv este direcţionat împotriva epitopilor proteinei L1 de capsidă bine conservaţi ai tuturor tipurilor de HPV. Proteina L1 de capsidă a HPV este sintetizată în epiteliul scuamos diferenţiat din straturile superioare fiind uşor de obţinut în cursul recoltării. Ea este sintetizată în citoplasmă şi transportată rapid în nucleul celulei, din acest motiv colorarea specifică pentru L1 fiind nucleară, dar poate fi observată şi sub aspect vezicular la nivelul citoplasmei, ribozomii fiind sediul sintezei proteinei L1 (Fig. nr.16). Imunomarcarea nucleului chiar şi într-o singură celulă a fost considerată rezultat pozitiv, conform indicaţiilor firmei producătoare rezultat al studiilor efectuate. Marcajul imunocitochimic a fost observat doar în celulele superficiale şi intermediare ale epiteliului, dar nu şi în cele bazale şi parabazale. 7.6.2.2. Proteina p16 INK4a Un rezultat p16 INK4a pozitiv a fost definit prin imunocolorarea a cel puţin o celulă anormală morfologic (displazică sau atipică), conform indicaţiilor firmei producătoare rezultat al studiilor efectuate. Intensitatea colorării ca şi localizarea semnalului nu sunt factori determinanţi în stabilirea rezultatului pozitiv. Un rezultat p16 INK4a negativ a fost definit prin absenţa colorării celulare sau colorarea unor celule identificate morfologic ca fiind metaplazice sau endocervicale. 7.6.2.3. Proteina p16 INK4a şi markerul de proliferare Ki-67 Tehnica CINtec PLUS determină apariţia a doi produşi de reacţie coloraţi diferit: un precipitat brun la nivelul situsurilor antigenului p16 INK4a şi un precipitat roşu pentru situsurile antigenului Ki-67. Colorarea brună a celulelor (marcaj nuclear şi/sau citoplasmatic) indică supraexpresia p16 INK4a. Colorarea în roşu a nucleilor indică expresia Ki-67. Celulele cu dublu marcaj prezintă citoplasma colorată în brun şi nucleii în roşu închis (Fig. nr. 18). Pentru a fi considerat rezultat pozitiv, interpretarea imunomarcajului brun (imunoreactivitate pentru p16 INK4a ) trebuie să ţină cont şi de criteriile morfologice de displazie ale celulelor marcate, conform indicaţiilor firmei producătoare rezultat al studiilor efectuate. În cazul prezenţei dublului marcaj în una sau mai multe celule scuamoase este considerat rezultat pozitiv. 7.6.2.4. Biomarkerul ProEx C ProEx C reprezintă un cocktail de anticorpi monoclonali împotriva proteinelor asociate cu inducerea aberantă a fazei S a ciclului celular: topoizomeraza IIA (TOPIIA) şi proteina de menţinere a minicromozomilor 2 (MCM2). Localizarea imunocitochimică a TOP2A/MCM2 este nucleară. Colorarea nucleară poate fi considerată un rezultat pozitiv doar dacă celulele respective au fost examinate din punct de vedere morfologic şi au fost evaluate ca atipice, conform indicaţiilor firmei producătoare rezultat al studiilor efectuate (Fig. nr. 19). Colorarea sporadică şi focală a celulelor endocervicale a fost considerată rezultat negativ. 7.7. DIAGNOSTICUL HISTOPATOLOGIC 7.7.1. METODE DE PRELEVARE Biopsia cervicală ţintită colposcopic rol diagnostic; Rezecţia/conizaţia cu ansa diatermică (large loop excision of the transformation zone-lletz) rol diagnostic şi terapeutic. 7.7.2. PRELUCRAREA PIESELOR BIOPTICE Proba bioptică a fost fixată în formol 10% tamponat, inclusă în parafină, secţionată seriat. Secţiunile au fost colorate cu hematoxilină-eozină (H-E). Raportul histopatologic a fost elaborat conform terminologiei CIN (neoplazie intraepitelială cervicală). 7.7.3. INTERPRETAREA REZULTATELOR Raportul histopatologic în cazul efectuării unei biopsii trebuie să includă: gradul leziunii; 13

prezenţa sau absenţa extensiei glandulare; prezenţa sau absenţa modificărilor HPV asociate. În cazul conizaţiei, raportul trebuie să includă marginile chirurgicale, cea endocervicală fiind cea mai importantă. Marginile pozitive şi afectarea glandulară reprezintă semnale de alarmă pentru boală reziduală sau recurenţă. 7.8. EVALUAREA IMUNOHISTOCHIMICĂ A BIOMARKERILOR PE SECŢIUNI HISTOLOGICE (L1, p16 INK4a, p16/ki-67, ProEx C) Pentru studiul imunohistochimic am folosit secţiuni de 4 microni care au fost întinse pe lame de sticlă pretratate cu polilizină - SuperFrost Plus (Menzel GmbH&Co Kg). Pentru o mai bună aderenţă a secţiunilor pe lame acestea au fost lăsate peste noapte la termostat, la 37 C. 7.8.1. TEHNICA DE COLORARE IMUNOHISTOCHIMICĂ Secţiunile histologice au fost iniţial deparafinate şi rehidratate. Este importantă îndepărtarea oricărei urme de parafină pentru a nu apărea o colorare nespecifică. 7.8.2. INTERPRETAREA REZULTATELOR Iniţial au fost evaluate lamele de control pozitiv şi negativ. Algoritmul de examinare a secţiunilor histologice 1. Aprecierea calităţii coloraţiei; 2. Determinarea prezenţei imunomarcajului (marcaj nuclear roşu pentru proteina L1 de capsidă, Ki-67, marcaj nuclear brun pentru ProEx C şi marcaj brun nuclear şi citoplasmatic pentru p16 INK4a ); Interpretarea secţiunilor colorate imunohistochimic s-a efectuat în corelaţie cu secţiunile colorate H- E, fiind necesară corelarea diagnosticului histopatologic iniţial cu cel imunohistochimic pentru stabilirea diagnosticului final. 7.8.2.1.Proteina L1 HPV Colorarea în roşu a nucleului unei celule scuamoase a fost considerat rezultat pozitiv. Marcajul imunohistochimic a fost observat doar în celulele superficiale şi intermediare ale epiteliului, dar nu şi în cele bazale şi parabazale. 7.8.2.2. Proteina p16 INK4a Un rezultat p16 INK4a pozitiv a fost definit prin imunocolorarea a cel puţin o celulă anormală morfologic (displazică sau atipică). Intensitatea colorării ca şi localizarea semnalului nu sunt factori determinanţi în stabilirea rezultatului pozitiv. Un rezultat p16 INK4a negativ a fost definit prin absenţa colorării celulare sau colorarea unor celule identificate morfologic ca fiind metaplazice sau endocervicale. Imunomarcajul pentru p16ink4a nuclear +/- citoplasmatic, a fost interpretat utilizând un scor semicantitativ (331): 0- rezultat negativ 0%-5% celule imunomarcate; 1- pozitivitate focală/izolată sau pozitivitate difuză întâlnită în 1/3 inferioară a epiteliului; 2- pozitivitate difuză în 2/3 inferioare ale epiteliului; 3- pozitivitate difuză în toată grosimea epiteliului. 7.8.2.3. Proteina p16 INK4a şi markerul de proliferare Ki-67 Tehnica CINtec PLUS determină apariţia a doi produşi de reacţie coloraţi diferit: un precipitat brun la nivelul situsurilor antigenului p16 INK4a şi un precipitat roşu pentru situsurile antigenului Ki-67 (332). Colorarea brună a celulelor (marcaj nuclear şi/sau citoplasmatic) indică supraexpresia p16 INK4a. Colorarea în roşu a nucleilor indică expresia Ki-67. Celulele cu dublu marcaj prezintă citoplasma colorată în brun şi nucleii în roşu închis. Pentru a fi considerat rezultat pozitiv, interpretarea imunomarcajului brun (imunoreactivitate pentru p16 INK4a ) trebuie să ţină cont şi de criteriile morfologice de displazie ale celulelor marcate. În cazul prezenţei dublului marcaj în una sau mai multe celule scuamoase este considerat rezultat pozitiv. 14

Imunomarcajul pentru Ki-67 a fost clasificat în patru clase în raport cu extinderea colorării nucleare în grosimea epiteliului, în baza următorului scor semicantitativ (333). 0- rezultat negativ, imunomarcarea exclusivă a celulelor parabazale; 1- imunomarcaj nuclear prezent în 1/3 inferioară a epiteliului; 2- imunomarcaj nuclear prezent în 2/3 inferioare ale epiteliului; 3- imunomarcaj nuclear prezent în toată grosimea epiteliului. 7.8.2.4. ProEx C ProEx C reprezintă un cocktail de anticorpi monoclonali împotriva proteinelor asociate cu inducerea aberantă a fazei S a ciclului celular: topoizomeraza IIA (TOPIIA) şi proteina de menţinere a minicromozomilor 2 (MCM2) (334). Localizarea imunocitochimică a TOP2A/MCM2 este nucleară. Colorarea nucleară poate fi considerată un rezultat pozitiv doar dacă celulele respective au fost examinate din punct de vedere morfologic şi au fost evaluate ca atipice. Colorarea sporadică şi focală a celulelor endocervicale a fost considerată rezultat negativ. Marcajul pozitiv pentru ProEx C este exclusive nuclear, uniform, intersând de cele mai multe ori diferite straturi ale epiteliului scuamos. Imunomarcajul pentru ProEx C a fost clasificat în patru clase în raport cu extinderea colorării nucleare în grosimea epiteliului, în baza următorului scor semicantitativ (335): 0- rezultat negativ, imunomarcarea exclusivă a celulelor bazale (<25%); 1- imunomarcaj nuclear prezent în 1/2 inferioară a epiteliului (25%-50%); 2- imunomarcaj nuclear prezent în 3/4 inferioare ale epiteliului (50%-75%); 3- imunomarcaj nuclear prezent în toată grosimea epiteliului (>75%). Preparatele citologice şi histologice au fost examinate, folosind un microscop Olympus CX-41. în aceleaşi condiţii de iluminare exterioară. Au fost utilizate obiectivele 10X, 20X, 40X şi 100X. Imaginile digitale au fost realizate utilizând camera Olympus SP-350. Reacţiile imunohistochimice s-au efectuat la Disciplina de Morfopatologie din cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie Gr. T. Popa Iaşi, folosind în principal reactivi achiziţionaţi în cadrul proiectului de cercetare TD-42/2007 contractat de finanţare 474/03.10.2007 încheiat cu Unitatea Executivă pentru Finanţarea Învăţământului Superior şi a Cercetării Ştiinţifice Universitare. 7.9. METODE STATISTICE APLICATE Statistica medicală are la bază o metodă adecvată cunoaşterii proceselor ce se derulează aleatoriu - teoria probabilităţilor- reuşind să descifreze cu o eroare cunoscută şi acceptabilă, corelaţia multiplă dintre fenomenele studiate şi factorii determinanţi, în vederea stabilirii tendinţelor principale ale acestora. Datele au fost centralizate în baze de date EXCEL şi prelucrate cu funcţiile statistice la care acesta se pretează. Un test / procedeu diagnostic poate aduce practicii medicale două beneficii majore: Aprecierea mai exactă a diagnosticului (valoarea diagnostică este confirmată de legătura între prezenţa testului şi a bolii); O decizie terapeutică mai bună. Introducerea şi menţinerea în practică a unui test necesită o evaluare prealabilă riguroasă privind avantajele şi inconvenientele, în comparaţie cu ceea ce se aplică deja în domeniul respectiv al patologiei. În acest studiu am urmărit: evaluarea performanţelor testului, respectiv determinarea sensibilităţii (Sn) şi specificităţii (Sp); alegerea plajei/limitei de pozitivitate pentru un test cantitativ pentru a avea valorile Sn şi Sp cele mai adecvate obiectivelor propuse; evaluarea performanţelor testului prin determinarea Valorii Predictive Pozitive (VPP) şi a Valorii Predictive Negative (VPN). Statistica epidemiologică: screening şi markeri de studiu noi 15

Riscul relativ RR (risk ratio) măsoară forţa asociaţiei epidemiologice, riscul reprezentând probabilitatea ca un eveniment sa aibă loc. P value reprezintă probabilitatea de apariţie a unei erori observate din întâmplare şi arată semnificaţia statistică a testului (semnificaţia statistică relevanţă clinică). Pentru a creşte acurateţea diagnosticului am utilizat baterii de teste. Acestea au fost aplicate în: paralel - cresc Sn + când macar unul dintre ele este pozitiv; când toate sunt negative. serie - cresc Sp + când toate sunt pozitive; când măcar unul este negativ. CAPITOLUL 8 REZULTATE 8.1. CARACTERISTICILE GENERALE ALE LOTULUI DE STUDIU Carcinomul scuamocelular de col uterin poate fi prevenit, atât timp cât aproape toate cazurile pot fi depistate în stadiul preinvaziv, dacă screeningul populaţiei feminine este efectuat corect şi complet. Localizarea accesibilă investigaţiilor şi faptul că stadiul invaziv al cancerului de col este precedat de perioade lungi în care transformarea neoplazică este strict intraepitelială, fără depăşirea membranei bazale, sunt factori care explică succesul remarcabil pe care l-a avut introducerea examenului citologic în acţiunile de depistare precoce a leziunilor preinvazive sau invazive cervicale (metodă de diagnostic imaginată de Babeş şi Papanicolaou). Toate pacientele şi-au dat acordul privind stabilirea protocolului investigaţiilor: - recoltarea frotiurilor pentru citologie convenţională şi citologie în mediu lichid; - detectarea şi tiparea HPV; - colposcopie cu biopsie ţintită sau conizaţie în cazul pacientelor cu leziuni de grad înalt; - marcaje imuncitochimice şi imunhistochimice. Pentru cele 5 loturi s-a completat o fişă epidemiologică. Toate cazurile selecţionate pentru studiu au fost evaluate conform unui protocol prestabilit, fişele de evaluare cuprinzând: date de ordin general, antecedente fiziologice şi patologice, date clinice şi terapeutice anterioare. În momentul primei consultaţii s-au recoltat frotiuri convenţionale (CC) şi pentru unele paciente probe pentru citologie în mediu lichid (CML), probe pentru testarea ADN HPV şi de asemenea s-a efectuat un control colposcopic. Nu s-a efectuat nici un tratament şi nu s-au recoltat probe bioptice. La pacientele cu rezultat pozitiv la cel puţin unul dintre testele screening efectuate, s-au recoltat biopsii ţintite colposcopic. În cazurile cu suspiciune de leziune de grad înalt s-a efectuat conizaţie. 8.2. STUDIU EXPLORATOR INIŢIAL 8.2.1. EVALUAREA CITOLOGICĂ (CITOLOGIE CONVENŢIONALĂ) Evaluarea citologică a evidenţiat următoarele aspecte (Fig.nr.5): NILM (negativ pentru leziune intraepitelială sau malignitate) 105 cazuri (26,6%); ASC-US (atipii ale celulelor scuamoase cu semnificaţie incertă) 10,4% (fig.); LSIL (leziune scuamoasă intraepitelială de grad redus) 35,4%; HSIL (leziune scuamoasă intraepitelială de grad înalt) 26,3%; CSC- carcinom scuamocelular invaziv 1,3%. Media de vârstă a pacientelor cu LSIL a fost de 35,5 ani, cu HSIL de 37,8 ani, iar a celor cu CSC de 45,6 ani. Distribuţia diagnosticului citologic pe grupe de vârstă a arătat un procent crescut al cazurilor HSIL la grupa de vârstă 40-49 ani, procent similar întâlnind şi la pacientele peste 50 ani. În cazul carcinoamelor scuamocelulare invazive procentul creşte odată cu vârsta pacientelor (Fig.nr.6). 16

HSIL 26.3% CSC 1.3% NILM 26.6% ASC-US 10.4% 40 35 30 25 20 15 NILM ASC-US LSIL HSIL LSIL 35.4% 10 5 CSC 0 20-29 30-39 40-49 > 50 Fig.nr. 5. Distribuţia cazurilor în funcţie de diagnosticul citologic (citologie convenţională) Fig.nr. 6. Distribuţia cazurilor în funcţie de diagnosticul citologic pe grupe de vârstă 8.2.2. CITOLOGIA ÎN MEDIU LICHID (CML) La 34,4% (136/395) din totalul pacientelor luate în studiu s-au recoltat şi probe pentru citologia în mediu lichid. Rezultatele au fost: 28 cazuri NILM, 9 cazuri ASC-US, 43 LSIL, 52 HSIL şi 4 CSC (Fig.nr.7). Corelarea diagnosticelor citologice elaborate pe citologie convenţională şi citologie în mediu lichid nu a evidenţiat diferenţe semnificative din punct de vedere statistic între cele două metode de diagnostic (r=0,954), dar s-a observat o reducere a numărului diagnosticelor citologice de ASC-US, procentul leziunilor intraepiteliale de grad înalt fiind similar prin ambele metode (Fig.nr. 8). Principalul avantaj al citologiei în mediu lichid este faptul că materiul rezidual poate fi utilizat pentru alte teste auxiliare cum ar fi detectarea ADN HPV sau a reacţiilor imunocitochimice, fără a fi necesară o reprelevare (Fig.nr.9, 10, 11). HSIL 38.2% CSC 2.9% NILM 20.7% ASC-US 6.6% 40 30 20 C C LSIL 10 31.6% 0 NILM ASC-US LSIL HSIL CSC Fig.nr.7. Distribuţia cazurilor în funcţie de diagnosticul CML Fig.nr.8. Distribuţia cazurilor citologie convenţională, citologie în mediu lichid Fig. nr. 9: a. LSIL col. Pap (x400) Fig. nr. 10 HSIL col. Pap (x1000) Fig. nr. 11 CSC col. Pap (x200) 17

8.2.3. TESTAREA HPV Testarea virală a evidenţiat prezenţa infecţiei HPV la 282 cazuri (71,4%). Cele mai multe femei (60,8%) au prezentat HPV cu risc crescut de transformare malignă (HPV-HR) şi numai 10,6% dintre acestea au prezentat HPV cu risc scăzut de transformare malignă (HPV-LR), restul pacientelor fiind HPV negative (Fig.nr.12). Din totalul pacientelor HPV pozitive (n=282), 72,9% au prezentat infecţii unice şi 27,1% infecţii cu genotipuri multiple. În funcţie de tipul infecţiei HPV se remarcă distribuţia semnificativ mai mare a cazurilor cu HPV-HR ce prezintă infecţie cu multiple genotipuri (95,9%), comparativ cu cea a cazurilor cu genotip unic (79,5%) (p=0,0005) (Fig.nr.13). HPV-HR 60.8% HPV multiplu 93 4 HPV-LR 10.6% HPV unic 147 38 HPV negativ 28.6% Fig.nr.12. Distribuţia cazurilor pe grupe de risc HPV 0 50 100 150 200 HPV-HR HPV-LR Fig.nr.13. Corelarea infecţiilor unice sau multiple cu grupa de risc a HPV Distribuţia cazurilor evidenţiază asocierea semnificativă a prezenţei infecţiei HPV-HR cu leziunile scuamoase intraepiteliale de grad înalt şi a carcinoamelor scuamocelulare (χ 2 =21,62; GL=3; p=0,00008) (Fig.nr.14). Genotipurile cel mai frecvent întâlnite atât în infecţia unică cât şi în cea multiplă au fost: HPV16 (39,4%), HPV18 (15,2%), HPV31 (12,4%) şi HPV11 (8,5%)(Fig.nr.15). 100 80 60 40 20 0 HPV- NEG HPV-LR HPV-HR NILM ASC-US LSIL HSIL CSC Fig.nr.14. Corelarea rezultatelor testării HPV cu diagnosticul citologic nr. paciente 120 100 80 60 40 20 6 14 10 10 0 50 61 26 13 17 22 12 10 13 5 6 9 4 2 5 7 2 6 11 9 5 4 2 9 18 10 7 5 1 2 3 3 3 2 3 1 2 2 1 4 4 8 1 1 3 2 4 1 6 1116183133353940424551525354555658596162646667687071727381828384 genotip HPV multiplu HPV unic Fig.nr.15. Distribuţia pacientelor în funcţie de genotipul şi tipul infecţiei HPV Pacientele cu infecţie HPV-HR prezintă un risc de 11,08 ori mai mare de a dezvolta o leziune intraepitelială de grad înalt comparativ cu cele HPV-HR negative (RR= 11,08; IC = 95%: 4,99 24,62; p= 0,001). 8.2.4. EVALUAREA COLPOSCOPICĂ Examinarea colposcopică s-a realizat la toate cazurile din lotul iniţial. Pentru calculul statistic am luat în considerare doar 386 de cazuri, 9 colposcopii fiind nesatisfăcătoare (nu s-a evidenţiat joncţiunea scuamocilindrică). Evaluarea colposcopică a evidenţiat următoarele aspecte (Fig.nr.16): 26,7% - colposcopie normală sau modificări benigne (B); 18

56,7% - cazuri cu modificări colposcopice minore (G1); 15,8% - cazuri cu modificări colposcopice majore (G2); 0,8% - cazuri cu suspiciune de invazie (CSC). Distribuţia cazurilor în funcţie de prezenţa infecţiei HPV şi diagnosticul colposcopic evidenţiază asocierea semnificativă a cazurilor HPV-HR pozitive cu prezenţa modificărilor majore la examinarea colposcopică (p=0,001) (Fig.nr.17). G2 15.8% CSC 0.8% B 26.7% 120 100 80 60 40 20 G1 56.7% 0 B G1 G2 CSC HPV-NEG HPV-LR HPV-HR Fig.nr.16. Distribuţia cazurilor în funcţie de examenul colposcopic Fig.nr.17. Corelarea aspectelor colposcopice cu tipul infecţiei HPV Rezultatele evaluării colposcopice corelate cu diagnosticul citologic evidenţiază următoarele aspecte (Tab.I): 96,12% dintre cazurile cu aspecte colposcopice benigne şi 81,65% dintre cazurile cu modificări minore evidenţiate colposcopic, au prezentat rezultat citologic negativ pentru leziune intraepitelială de grad înalt sau malignitate; 75% dintre cazurile cu diagnostic citologic de ASC-US, au prezentat modificări minore (G1) la examinarea colposcopică; 84% dintre cazurile cu diagnostic citologic de LSIL au relevat modificări minore în urma evaluării colposcopice; 40% dintre cazurile cu diagnostic citologic de HSIL au asociat modificări minore, iar 56% dintre acestea au prezentat modificări majore la examinarea colposcopică; carcinoamele scuamocelulare au fost confirmate de ambele tipuri de examene; modificările majore evidenţiate colposcopic s-au corelat în 96,92% cu leziunile intraepiteliale de grad înalt sau malignitate diagnosticate citologic. Tabel.I. Asocierea rezultatelor evaluării citologice cu cele colposcopice Colposcopie B G1 G2 CSC Total n/% n/% n/% n/% Citologie NILM 68 (49%) 34 (51%) - - 102 ASC-US 10 (25%) 30 (75%) - - 40 LSIL 21 (15%) 114 2 (1%) - 137 (84%) HSIL 4 (3%) 40 (40%) 57 1 (1%) 102 (56%) CSC - - 3 2 (40%) 5 (60%) Total 103 218 62 3 386 19

8.3. EVALUARE IMUNOCITOCHIMICĂ Marcajul imunocitochimic s-a realizat la 125 dintre cazuri. Acestea au prezentat următoarele diagnostice citologice elaborate pe frotiuri prelucrate în mediu lichid (CML): 18 cazuri NILM, 8 ASC-US, 43 LSIL, 52 HSIL şi 4 cazuri CSC. 8.3.1. PROTEINA DE CAPSIDĂ L1 A HPV Proteina L1 de capsidă a HPV a fost detectată imunocitochimic în 32% din cazuri (Fig.nr.18). La 30,61% dintre cazurile HPV-HR pozitive s-a detectat prezenţa proteinei L1, acest procent fiind semnificativ mai redus comparativ cu procentajul de 90,9% paciente HPV-LR pozitive (χ 2 =17,44; GL=1; p=0,00003). În cazurile HPV-negative s-a confirmat absenţa infecţiei HPV prin lipsa marcajului pozitiv pentru proteina L1 (Fig.nr.19). L1 HPV (- ) 68.0% 100 80 100 90.9 69.4 L1 HPV (+) 32.0% 60 40 20 0 9.1 30.6 L1 (-) L1 (+) 0 HPV-NEG HPV-LR HPV-HR Fig.nr.18. Distribuţia cazurilor în raport cu detectarea imunocitochimică a proteinei de capsidă L1 a HPV Fig.nr.19. Corelaţia dintre infecţia HPV şi prezenţa marcajului imunocitochimic pentru proteina L1 În lotul de studiu prezenţa imunomarcajului pentru proteina L1 de capsidă a HPV a fost întâlnită în 25% din cazurile de ASC-US, 62,8% LSIL, 17,31% HSIL şi în nici un caz de CSC, acest fapt indicând faptul că expresia proteinei L1 tinde să scadă odată cu creşterea severităţii leziunilor (Tab.II). Tabel.II. Rata de detecţie imunocitochimică a proteinei L1de capsidă a HPV Diagnostic citologic Număr total Proteina de capsidă L1 pozitivă (CML) cazuri n % NILM 18 2 11,1 ASC-US 8 2 25,0 LSIL 43 27 62,8 HSIL 52 9 17,3 CSC 4 0 0 Total 125 40 32,0 Proteina L1 de capsidă s-a identificat în principal în nuclei, dar ocazional a fost întâlnit imunomarcaj şi în citoplasma celulelor. De notat este faptul că marcajul este localizat în majoritatea cazurilor în celulele scuamoase superficiale (Fig.nr.20, 21, 22). 20

Fig.nr.20. ASC-US (ICC) L1 pozitiv, (1000x) Fig.nr.21. LSIL (ICC) L1 pozitiv (1000x) Fig. nr.22. HSIL (ICC) L1 pozitiv (400x) 8.3.2. PROTEINA p16 INK4a Proteina p16 INK4a a fost detectată imunocitochimic în 62,4% din cazuri (Fig.nr.23). În 79,6% dintre cazurile HPV-HR pozitive s-a observat pozitivarea biomarkerului p16 INK4a, în timp ce în cazurile HPV-HR negative nu s-a înregistrat nici un caz p16 INK4a pozitiv (χ 2 =27,0; GL=1; p=0,0000002) (fig. 24). p16ink4a (-) 37.6% p16ink4a (+) 62.4% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HPV-NEG HPV-LR HPV-HR p16ink4a (+) p16ink4a (-) Fig.nr.23. Distribuţia cazurilor în raport cu detectarea imunocitochimică a proteinei p16 INK4a Fig.nr.24. Corelaţia dintre infecţia HPV şi prezenţa marcajului imunocitochimic pentru p16 INK4a În frotiurile analizate s-a constatat o creştere a pozitivării p16 INK4a de la 12,5% în frotiurile cu ASC-US, la 53,5% în LSIL, 96,2% în HSIL, respectiv 100% în carcinoamele scuamocelulare (Tab.III). Tabel.III. Rata de detecţie imunocitochimică a biomarkerului p16 INK4a Diagnostic Număr p16 INK4a pozitiv citologic cazuri n % NILM 18 - - ASC-US 8 1 12,5 LSIL 43 23 53,5 HSIL 52 50 96,2 CSC 4 4 100,0 Total 125 78 62,4 În loturile studiate nici un caz cu diagnostic citologic de NILM nu a prezentat marcaj pozitiv pentru proteina p16 INK4a. Prezenţa imunomarcajului pentru p16 INK4a a fost întâlnită în cazurile cu LSIL în procente ce variază între 25% la grupa de vârstă peste 50 ani şi 50-70% la celelalte grupe de vârstă. În cazurile cu HSIL imunomarcajul pentru p16 INK4a a fost întâlnit în procent de 93,3% la grupa de vârstă 20-29 ani, 94,1% la grupa de vârstă 30-39 ani şi în 100% din cazurile peste 40 ani (fig.nr.25, 26, 27). 21

Fig.nr.25. LSIL (ICC) p16 INK4a pozitiv (x200) Fig.nr.26. LSIL (ICC) p16 INK4a pozitiv (x400) Fig.nr.27. HSIL (ICC) p16 INK4a pozitiv(x200) 8.3.3. BIOMARKERUl Ki-67 Biomarkerul Ki-67 a fost detectat imunocitochimic în 62,4% din cazuri (Fig.nr.28). În 76,5% dintre cazurile HPV-HR pozitiv s-a observat pozitivarea biomarkerului Ki-67, în timp ce în cazurile HPV-HR negative nu s-a înregistrat nici un caz Ki-67 pozitiv (p=0,000001) ( Fig.nr.29). Asocierea infecţiei HPV-HR cu pozitivitatea Ki-67 induce un risc relativ oncogen viral de 1,48 ori mai mare (RR=1,48; IC95%: 1,17 1,87). Ki-67(+) 60.0% 100 80 60 HPV-HR (-) Ki-67(-) 40.0% 40 20 0 76.5 Ki-67 (+) Ki-67 (-) 23.5 HPV-HR (+) Fig.nr.28. Distribuţia cazurilor în raport cu detectarea imunocitochimică a biomarkerului Ki-67 Fig.nr.29. Corelaţia dintre infecţia HPV şi prezenţa marcajului imunocitochimic pentru Ki-67 În frotiurile analizate s-a constatat o creştere a pozitivării Ki-67 de la 12,5% în cazurile cu ASC-US la 48,8% în LSIL, 94,2% în HSIL, respectiv 100% în carcinoamele scuamocelulare (Tab.IV). Tabel.IV. Rata de detecţie imunocitochimică a biomarkerului Ki-67 Diagnostic Număr total Ki-67 pozitiv citologic cazuri n % NILM 18 0 0,0 ASC-US 8 1 12,5 LSIL 43 21 48,8 HSIL 52 49 94,2 CSC 4 4 100,0 Total 125 75 60,0 În loturile studiate nici un caz cu diagnostic citologic de NILM nu a prezentat marcaj pozitiv pentru biomarkerul Ki-67. Prezenţa imunomarcajului pentru Ki-67 a fost întâlnită în cazurile cu LSIL în procente ce variază între 25% la grupa de vârstă peste 50 ani şi 45-60% la celelalte grupe de vârstă. În cazurile cu HSIL imunomarcajul pentru Ki-67 a fost întâlnit în procent de 93,8% la grupa de vârstă 20-29 ani, 88,2% la grupa de vârstă 30-39 ani şi în 100% din cazurile peste 40 ani (Fig.nr.30, 31, 32). 22

Fig.nr.30.LSIL (ICC) - p16/ki- 67 pozitiv (x400) Fig.nr.31. HSIL (ICC) p16/ki-67 pozitiv (x1000) Fig.nr.32. CSC (ICC) Ki- 67 pozitiv (x400) 8.3.4. BIOMARKERUL ProEx C Pozitivitatea biomarkerului ProEx C în frotiul citologic preparat în mediu lichid s-a evidenţiat la 48,0% dintre paciente (Fig.nr.33). La 60,2% dintre pacientele HPV-HR pozitive s-a observat pozitivarea biomarkerului ProEx C, în timp ce la pacientele HPV-HR negative s-a înregistrat doar un caz ProEx C pozitiv (3,7%) (p=0,0005)( fig.34). Asocierea infecţiei HPV-HR cu pozitivitatea ProEx C induce un risc relativ oncogen viral de 1,28 ori mai mare (RR=1,28; IC95%: 1,11 1,49). În prezentul studiu s-a constatat o creştere a pozitivării ProEx C de la 12,5% în frotiurile cu ASC-US la 18,6% în LSIL, 90,4% în HSIL, respectiv 100% în carcinoamele scuamocelulare (Tab.V). ProEx C (-) 52.0% 100 80 60.2 60 40 ProEx C (+) 48.0% 20 3.7 ProEx C (-) ProEx C (+) 0 HPV-HR (-) HPV-HR (+) Fig.nr.33. Distribuţia pacientelor în funcţie de pozitivitatea biomarkerului ProEx C Fig.nr.34. Corelaţia dintre grupa de risc HPV şi imunomarcajul ProEx C Tabel. V. Rata de detecţie a biomarkerului ProEx C în frotiul citologic în mediu lichid Diagnostic Număr total ProEx C pozitiv citologic cazuri n % NILM 18 0 0,0 ASC-US 8 1 12,5 LSIL 43 8 18,6 HSIL 52 47 90,4 CSC 4 4 100,0 Total 125 60 48,0 În loturile studiate nici un caz cu diagnostic citologic de NILM nu a prezentat marcaj pozitiv pentru biomarkerul ProEx C. Prezenţa imunomarcajului pentru ProEx C a fost întâlnită în cazurile cu LSIL în procente ce variază între 0% la grupa de vârstă peste 50 ani şi 15-33,3% la celelalte grupe de vârstă. În cazurile cu HSIL imunomarcajul pentru ProEx C a fost întâlnit în procent de 81,3% la grupa de vârstă 20-29 ani, 88,2% la grupa de vârstă 30-39 ani şi în 100% din cazurile peste 40 ani (Fig.nr.35, 36, 37). 23

Fig. nr.35. LSIL (ICC) - ProEx C pozitiv (x400) Fig.nr.36. HSIL (ICC) - ProEx C pozitiv (x1000) Fig.nr.37. SCC (ICC) - ProEx C pozitiv (x400) 8.4. EVALUARE HISTOPATOLOGICĂ În cazul pacientelor cu leziuni cervicale diagnosticate citologic, cu infecţii HPV-HR sau cu suspiciune colposcopică de neoplazie de grad înalt (249 cazuri) s-au efectuat biopsii ţintite colposcopic pentru evaluarea histopatologică a gradului de displazie sau conizaţii cu rol diagnostic şi terapeutic. Rezultatele au fost: 17 cazuri cu aspecte benigne, 128 cazuri cu CIN1, 50 cazuri cu CIN2, 28 cazuri cu CIN3, 12 cazuri cu CIS şi 14 cazuri cu CSC (Fig.nr.38, 39, 40). Fig.nr.38. CIN1, condilom accuminat, col. H-E (x400) Fig.nr.39. CIN2, col. H-E (x400) Fig.nr.40. CIN3, col. H-E (x400) Vârsta medie a pacientelor la care s-a efectuat biopsia a fost de 36,99 ± 7,34 ani, variind de la 20 la 63 ani. Rezultatele statistice au arătat frecvenţa crescută a neoplaziei intraepiteliale de grad redus (CIN1) în categoria de vârstă sub 40 de ani (53%). Diagnosticul histopatologic de carcinom scuamocelular invaziv a avut frecvenţa cea mai crescută la pacientele peste 40 ani într-un procent de 12% (10/85 cazuri), comparativ cu pacientele sub 40 ani la care a fost prezent în 2,43% (4/107) (RR= 4,82; IC = 95%: 1,56 14,9; p= 0,003) (Fig.nr.41). Corelarea tipului de infecţie HPV cu diagnosticul histopatologic a arătat creşterea procentului de infecţii HPV-HR de la 58% în B, la 80% în CIN1, 92% în CIN2 şi la 100% în CIN3, CIS şi CSC (p=0.0001)(fig.nr.42). 24

60 120 50 40 30 20 B CIN1 CIN2 CIN3 CIS 100 80 60 40 HPV-NEG HPV-LR HPV-HR 10 CSC 20 0 20-29 30-39 40-49 >50 0 B CIN1 CIN2 CIN3 CIS CSC Fig.nr.41. Distribuţia diagnosticului histopatologic pe grupe de vârstă Fig.nr.42. Corelarea diagnosticului histopatologic cu grupa de risc HPV 8.5. STUDIU ASUPRA APORTULUI METODELOR DE DIAGNOSTIC UTILIZATE ÎN EVALUAREA INIŢIALĂ PENTRU DEPISTAREA NEOPLAZIEI INTRAEPITELIALE CERVICALE DE GRAD ÎNALT (CIN2+) Evaluarea statistică a sensibilităţii (Sn), specificităţii (Sp) şi a valorilor predictive pozitive (VPP) şi negative (VPN) a utilizat ca standard diagnosticul histopatologic, rezultatele pozitive fiind cele CIN2+. Acest studiu a fost realizat pe 249 de cazuri la care s-a realizat examinarea de referinţă: diagnosticul histopatologic. În 86,54% (90/104) din cazurile cu diagnostic histopatologic de CIN2+, leziunile au fost identificate şi prin examenul citologic, în timp ce 13,46% (14/104) au prezentat rezultate fals negative pe citologie (RR= 8,82; IC = 95%: 5,33 14,5; p;0.0001) (Fig.nr.43). Examinarea colposcopică a identificat doar 56,73% (59/104) dintre cazurile cu neoplazie intraepitelială de grad înalt, 43,27% (45/104) din cazurile CIN2+ nefiind diagnosticate colposcopic (RR= 3,63; IC = 95%: 2,78 4,74; p;0.0001) (Fig.nr.44). Testarea HPV a identificat 95,20% (99/104) dintre leziunile CIN2+, în schimb procentul rezultatelor fals pozitive a fost de 77,93% (113/145) (RR= 3,45; IC = 95%: 1,51 7,90; p;0.0003) (Fig.nr.45). 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 < HSIL > HSIL < CIN2 > CIN2 100 80 60 40 20 0 < > CIN2 CIN2 < G2 > G2 100 80 60 40 20 0 < CIN2 > CIN2 HPV-HR (-) HPV-HR (+) Fig.nr.43. Corelaţia citologie convenţională, diagnostic histopatologic Fig.nr.44. Corelaţia examen colposcopic, diagnostic histopatologic Fig.nr.45. Corelaţia testare ADN- HPV, diagnostic histopatologic Rezultatele coroborate ale acestor trei metode de diagnostic au demonstrat următoarele (Tab.VI): - Citologia convenţională prezintă o sensibilitate şi o specificitate în diagnosticarea neoplaziei intraepiteliale de grad înalt de 86,5%, respectiv 89,7%, prezentând acurateţea cea mai mare 89,2%. - Examenul colposcopic are o specificitate crescută (95,2%), în schimb sensibilitatea este de 56,7%. - Testarea ADN HPV prezintă cea mai mare sensibilitate (95,2%), dar specificitatea este foarte redusă (22,0%). Tabel.VI. Corelarea metodelor de diagnostic citologic, colposcopic şi testare HPV Metode de Sn (%) Sp (%) VPP (%) VPN Ac p diagnostic (%) (%) Citodiagnostic 86,5 89,7 85,7 90,3 89,2 <0,0001 Colposcopie 56,7 95,2 89,4 75,4 79,1 <0.0001 Testare HPV 95,2 22,0 46,7 86,5 52,6 <0.0003 25

Corelarea rezultatelor, aplicată în paralel (un singur rezultat pozitiv), a arătat (Tab.VII): - Valoarea cea mai crescută a sensibilităţii a fost obţinută prin combinarea citologiei cu testarea virală (98,0%), rezultat identic fiind obţinut şi prin corelarea celor trei metode de diagnostic (citologie, colposcopie, testare HPV). - În schimb asocierea examenului citologic cu testarea HPV prezintă cea mai mică specificitate (20,7%). Corelarea rezultatelor, aplicată în serie (un singur rezultat negativ), a evidenţiat valori crescute ale specificităţii ce variază între 95,0% şi 98,6%, în defavoarea sensibilităţii care a scăzut până la valoarea de 55,7% (Tab.VIII). Tabel.VII. Corelarea în paralel a metodelor de diagnostic citologic, colposcopic şi testare HPV Metode de Sn (%) Sp (%) VPP (%) VPN Ac p diagnostic (%) (%) Cito/HPV 98,0 20,7 47,0 93,7 53,0 <0.0001 Cito/Colpo 87,5 89,0 85,0 90,8 88,4 <0.0001 Cito/Colpo/HPV 98,0 20,7 47,0 93,7 53,0 <0.0001 Tabel.VIII. Corelarea în serie a metodelor de diagnostic citologic, colposcopic şi testare HPV Metode de Se (%) Sp (%) VPP (%) VPN Ac p diagnostic (%) (%) Cito/HPV 56,7 97,9 95,2 76,0 80,7 <0.0001 Cito/Colpo 55,7 95,0 95,0 75,5 80,3 <0.0001 Cito/Colpo/HPV 55,8 98,6 96,7 75,7 80,7 <0.0001 8.6. STUDIU ASUPRA APORTULUI MARKERILOR IMUNOCITOCHIMICI ÎN DEPISTAREA LEZIUNILOR INTRAEPITELIALE CERVICALE DE GRAD ÎNALT (CIN2+) Evaluarea statistică a sensibilităţii (Sn), specificităţii (Sp) şi a valorilor predictive pozitive (VPP) şi negative (VPN) a utilizat ca standard diagnosticul histopatologic, rezultatele pozitive fiind cele CIN2+. Rezultatele coroborate ale acestor patru biomarkeri imunocitochimici au demonstrat următoarele (Tab.IX): - Imunomarcajul pentru p16 INK4a prezintă cea mai crescută sensibilitate (96,5%) şi valoare predictivă negativă (93,9%), în schimb specificitatea este scăzută (57,4%). - Imonomarcajul pentru ProEx C are cea mai bună specificitate în detectarea leziunilor CIN2+ (87,0%). - Proteina L1 de capisă prezintă cea mai scăzută acurateţe în diagnosticul neoplaziei intraepiteliale de grad înalt. - Factorul de proliferare Ki-67, deşi nu are nici cea mai bună sensibilitate şi nici specificitate, prezintă o acurateţe a diagnosticului similară p16 INK4a (78,4%). Tabel.IX. Analiza comparativă a acurateţei diagnosticului imunocitochimic în depistarea leziunilor CIN2+ Test Sn Sp VPP VPN Ac p ICC (%) (%) (%) (%) (%) L1 (-) 86,0 57,4 68,1 79,5 72,1 <.0001 p16 (+) 96,5 57,4 70,5 93,9 77,5 <.0001 Ki-67 (+) 94,7 61,1 67,6 91,7 78,4 <.0001 ProExC (+) 93,0 87,0 88,3 92,2 90,0 <.0001 26

- Corelarea rezultatelor imunocitochimice, aplicată în paralel (un singur rezultat pozitiv), a arătat cea mai bună acurateţe a diagnosticării neoplaziei intraepiteliale cervicale de grad înalt a fost obţinută prin combinarea rezultatelor imunomarcajului pentru p16 INK4a şi ProEx C (78,4%), rezultat identic fiind obţinut şi prin corelarea celor trei markeri (p16 INK4a, Ki-67 şi ProEx C) (Tab.X). Asocierea rezultatelor imunomarcajului pentru proteina L1 şi p16 INK4a a prezentat o sensibilitate şi o valoare predictivă negativă de 100%, în schimb specificitatea a fost de 35,2%. Tabel.X.Corelarea în paralel a rezultatelor marcajului imunocitochimic Metode de Sn Sp (%) VPP (%) VPN Ac p diagnostic (%) (%) (%) L1/p16 100 35,2 62,0 100 68,5 <0.0001 p16/ki-67 96,5 57,4 70,5 93,9 77,5 <0.0001 p16/proex C 98,2 57,4 70,9 96,9 78,4 <0.0001 Ki-67/ProEx C 96,5 61,1 72,4 94,3 79,3 <0.0001 p16/ki-67/ ProEx 98,2 57,4 70,9 96,9 78,4 <0.0001 C Corelarea rezultatelor, aplicată în serie (un singur rezultat negativ), a evidenţiat valori crescute ale specificităţii, precum şi ale sensibilităţii ce variază între 61,1% - 87,0%, respectiv 91,2% - 94,7% (exceptând asocierea L1/p16)(Tab.XI). Tabel.XI.Corelarea în serie a rezultatelor marcajului imunocitochimic Metode de Sn Sp (%) VPP VPN (%) Ac p diagnostic (%) (%) (%) L1/p16 98,0 20,7 47,0 93,7 53,0 <0.0001 p16/ki-67 94,7 61,1 72,0 87,5 91,7 <0.0001 p16/proex C 91,2 87,0 88,1 90,4 89,2 <0.0001 Ki-67/ProEx C 91,2 87,0 88,1 90,4 89,2 <0.0001 p16/ki-67/ ProEx C 91,2 87,0 88,1 90,4 89,2 <0.0001 8.7. EVALUARE IMUNOHISTOCHIMICĂ 8.7.1. PROTEINA DE CAPSIDĂ L1 HPV Expresia proteinei L1 scade odată cu creşterea severităţii leziunilor, astfel încât la cazurile cu CIN2 imunomarcajul pozitiv s-a evidenţiat la 33,3% dintre secţiuni, iar la cazurile CIN3+ nu s-a mai pozitivat nici un caz (Fig.nr.46, 47, 48, Tab.XII). Tabel.XII.Rata de detecţie IHC a proteinei de capsidă L1 Diagnostic histopatologic Număr total cazuri Proteina de capsidă L1 pozitivă n % B 7 2 28,6 CIN1 46 30 65,2 CIN2 27 9 33,3 CIN3 15 0 0 CIS 7 0 0 CSC 8 0 0 Total 110 41 37,3 27

La 32% dintre pacientele HPV-HR pozitive s-a detectat prezenţa proteinei de capsidă L1, pondere semnificativ mai redusă comparativ cu procentajul de 76,9% paciente HPV-HR negative (p=0,004) (Tab.XIII). Tabel.XIII.Corelaţia dintre infecţia HPV-HR şi rata de detecţie IHC a proteinei de capsidă L1 Proteina de capsidă L1 HPV Semnificaţie statistică HR LR NEG n % n % n % Pozitivă 31 32,0 10 100 0 0 χ 2 =8,08; GL=1; Negativă 66 68,0 0 0 3 100 p=0,004 Se confirmă statistic că, prezenţa proteinei L1 la pacientele HPV-HR pozitive este un factor protectiv deoarece riscul relativ este subunitar (RR=0,79; IC95%: 0,66 0,95). Fig.nr.46. CIN1 (IHC), proteina L1 de capsidă pozitiv (x400) Fig.nr.47. CIN1 (IHC), proteina L1 de capsidă pozitiv extensie glandulară (x400) Fig.nr.48. CIN2 (IHC), proteina L1 de capsidă pozitiv (x400) 8.7.2. BIOMARKERUL p16 INK4a În studiul de faţă am investigat distribuţia şi intensitatea imunomarcajului pentru p16 INK4a în neoplazia intraepitelială cervicală şi am încercat stabilirea unei corelaţii între supraexpresia p16 INK4a şi infecţia HPV- HR. În secţiunile histologice analizate s-a constatat pozitivarea p16 INK4a de la 14,3% în cazul pacientelor cu aspecte histologice normale, la 52,1% în CIN1, 96,3% în CIN2, şi respectiv 100% în CIN3, CIS şi carcinoamele scuamocelulare (Tab.XIV, Fig.nr.49, 50, 51). Tabel. XIV. Rata de detecţie IHC a biomarkerului p16 INK4a Diagnostic Număr total Biomarker p16 INK4a pozitiv histopatologic cazuri n % Normal 7 1 14,3 CIN1 46 24 52,1 CIN2 27 26 96,3 CIN3 15 15 100,0 CIS 7 7 100,0 CSC 8 8 100,0 Total 110 81 73,6 28

Fig.nr.49. CIN1 (IHC), p16 INK4a scor 1, (x400) Fig.nr.50. CIN3 (IHC), p16 INK4a, extensie glandulară scor 3, (x400) Fig.nr.51. CIS (IHC), p16 INK4a, extensie glandulară - scor 3 (x200) 8.7.3. BIOMARKERUL Ki-67 Pentru creşterea acurateţii diagnosticului CIN s-au efectuat numeroase studii care au avut drept ţintă antigenul Ki-67 ca marker al proliferării celulare. Ki-67 nu este specific unei anumite faze ale ciclului celular, fiind exprimat în toate etapele active ale acestuia, exceptând faza G 0. Infecţia HPV activează progresia ciclului celular al gazdei ceea ce are un impact direct asupra expresiei markerilor de proliferare în sensul creşterii acestora. Rezultatele noastre au demonstrat că distribuţia şi indexul Ki-67 creşte odată cu gradul leziunii, atingând un maxim în cazul carcinomului scuamo-celular invaziv (CSC). La prezentul lot de studiu, distribuţia cazurilor în funcţie de pozitivarea Ki-67 a crescut de la 39,1% în CIN1 la 100% în CIN3, carcinom in situ şi carcinoame scuamocelulare (Tab.XV, Fig.nr.52, 53, 54). Tabel.XV. Rata de detecţie imunohistochimică a biomarkerului Ki-67 Diagnostic Număr total Ki-67 pozitiv histopatologic cazuri n % B 7 - - CIN1 46 18 39,1 CIN2 27 25 92,6 CIN3 15 15 100,0 CIS 7 7 100,0 CSC 8 8 100,0 Total 110 73 66,4 În leziunile intraepiteliale cervicale, prezenţa celulelor Ki-67 pozitive a crescut dinspre stratul parabazal (unde sunt întâlnite şi în cazul epiteliului normal) spre straturile intermediare şi superficiale odată cu creşterea gradului leziunii, conferindu-i acestui marker un rol important în diferenţierea neoplaziei intraepiteliale cervicale de epiteliul cervical normal, metaplazic, atrofic sau cu modificări reactive. În studiul nostru toate cazurile cu modificări benigne, 18 dintre cazurile cu CIN1 şi un caz cu CIN2 au fost negative la marcarea cu Ki-67. Creşterea indexului de proliferare, evidenţiat prin prezenţa marcajului cu Ki-67 în 2/3 inferioară a epiteliului (scor 2), a fost întâlnit în 4 (8,7%) dintre cazurile de CIN1 şi 20 dintre cazuri (74,1%) cu CIN2, asociate infecţiei HPV-HR. 29

Fig.nr.52. CIN1 (IHC), p16 INK4a /Ki-67 scor 1 (x400) Fig.nr.53. CIN2 (IHC), p16 INK4a /Ki-67 scor 2 (x400) Fig.nr.54. CIS (IHC), p16 INK4a /Ki-67 scor 3 (x200) 8.7.4. BIOMARKERUL ProEx C În secţiunile histopatologice analizate s-a constatat o creştere a pozitivării ProEx C de la 17,4% în CIN1, la 85,2% în CIN2, până la 100% în CIN3 şi carcinoamele in situ şi scuamocelulare (Tab.XVI, Fig. nr.55, 56, 57). Tabel XVI. Rata de detecţie a marcajului imunohstochimic pentru ProEx C Diagnostic Număr total Biomarker ProEx C pozitiv histopatologic cazuri n % B 7 1 14,3 CIN1 46 8 17,4 CIN2 27 23 85,2 CIN3 15 15 100,0 CIS 7 7 100,0 CSC 8 8 100,0 Total 110 62 56,4 În studiul nostru, 7 dintre cazurile normale, 28 dintre cazurile cu CIN1 şi 2 cazuri cu CIN2 au fost negative la marcarea cu ProEx C (43,6%). Prezenţa marcajului cu ProEx C în 2/3 inferioară a epiteliului (scor 2), a fost întâlnit în 1 (2,2%) dintre cazurile de CIN1, la 17 dintre cazurile (63%) cu CIN2 şi 4 cazuri cu CIN3 (26,7%), toate asociate şi cu HPV- HR. Fig.nr.55. CIN1, marcaj nuclear în treimea inferioară a epiteliului - scor 1 (IHC, ProEx C, x400) Fig.nr.56. CIN2, marcaj nuclear, margine de siguranţă - scor 2 (IHC, ProEx C, x400) Fig.nr.57. CIS, marcaj nuclear, în toată grosimea epiteliului, extensie glandulară - scor 3 (IHC, ProEx C, x200) 30