CERCETĂRI EXPERIMENTALE PRIVIND EFECTELE ANTIOXIDANTE ALE UNOR NOI SUBSTANŢE FARMACOLOGIC ACTIVE

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE Gr.T. Popa Iaşi Catedra de Farmacologie-Algeziologie CERCETĂRI EXPERIMENTALE PRIVIND EFECTELE ANTIOXIDANTE ALE UNOR NOI SUBSTANŢE FARMACOLOGIC ACTIVE Rezumatul tezei de doctorat Conducător ştiinţific Prof. Dr. Cătălina Elena Lupuşoru Doctorand Irina Teodora Cernescu Iaşi 2011 0

CUPRINS INTRODUCERE...1 STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII...7 1. PRINCIPII ACTIVE DIN SURSE VEGETALE...8 1.1. DATE GENERALE DESPRE PRINCIPIILE ACTIVE OBŢINUTE DIN SURSE VEGETALE...9 1.2. DATE GENERALE DESPRE CETRARIA ISLANDICA...21 2. OXIDANTE ANTIOXIDANTE...32 3. IMPLICAŢIILE MAGNEZIULUI ÎN IMUNOMODULARE...47 3.1. DISTRIBUŢIA ÎN ORGANISM...48 3.2. NECESARUL ZILNIC ŞI SURSELE NATURALE DE MAGNEZIU...49 3.3. ELEMENTE DE FARMACOCINETICĂ A MAGNEZIULUI...50 3.4. ROLURILE MAGNEZIULUI ÎN ORGANISM...51 3.5. IMPLICAŢIILE MAGNEZIULUI ÎN PATOLOGIE...52 3.6. UTILIZAREA ÎN FARMACOTERAPIE...53 4. MODELE EXPERIMENTALE ANIMALE DE HEPATOPATIE...57 4.1. HEPATOPATIA INDUSĂ DE TETRACLORURA DE CARBON...58 4.2. HEPATOPATII TOXICE INDUSE EXPERIMENTAL CU ACETAMINOFEN...60 4.3. HEPATOPATIA INDUSĂ CU ACRILAMIDĂ...61 4.4. HEPATOPATIA ALCOOLICĂ...64 4.5. HEPATOTOXICITATEA INDUSĂ CU GALACTOZAMINĂ...67 4.6. HEPATOTOXICITATEA INDUSĂ DE TIOACETAMIDĂ...67 1

CONTRIBUŢII PROPRII...68 MOTIVAŢIA CERCETĂRILOR PERSONALE...69 OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE...70 6. MATERIALE ŞI METODE...71 6.1. MODELE EXPERIMENTALE ANIMALE...71 6.1.1. Cercetări experimentale, pe şobolani Wistar cu granulom indus experimental, privind efectele imunomodulatoare şi antioxidante ale extractului din Cetraria islandica în monoterapie sau în asociere cu sulfatul de magneziu...72 6.1.1.1. Efectele extractului din Cetraria islandica în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 asupra ţesutului de granulaţie...73 6.1.1.2. Efectele de tip imunomodulator şi antioxidant ale extractului din Cetraria islandica în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4... 75 6.1.2. Cercetări experimentale, privind efectele imunomodulatoare şi antioxidante ale extractului din Cetraria islandica în monoterapie sau în asociere cu sulfatul de magneziu pe un model experimental de hepatopatie cronică indusă cu tetraclorură de carbon la şobolani Wistar...76 6.2. CRITERII ETICE ÎN ABORDAREA EXPERIMENTALĂ...77 6.3. TEHNICI ŞI METODE EXPERIMENTALE UTILIZATE...82 6.4. TEHNICI ŞI METODE DE INTERPRETARE STATISTICĂ A DATELOR...89 7. REZULTATE...97 2

7.1. CERCETĂRI EXPERIMENTALE, PE ŞOBOLANI WISTAR CU GRANULOM INDUS EXPERIMENTAL, PRIVIND EFECTELE IMUNOMODULATOARE ŞI ANTIOXIDANTE ALE EXTRACTULUI DIN CETRARIA ISLANDICA ÎN MONOTERAPIE SAU ÎN ASOCIERE CU SULFATUL DE MAGNEZIU...98 7.1.1. Efectele extractului din Cetraria islandica în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 asupra ţesutului de granulaţie...98 7.1.2. Efectele de tip imunomodulator şi antioxidant ale extractului din Cetraria islandica în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4... 101 7.2. CERCETĂRI EXPERIMENTALE, PRIVIND EFECTELE IMUNOMODULATOARE ŞI ANTIOXIDANTE ALE EXTRACTULUI DIN CETRARIA ISLANDICA ÎN MONOTERAPIE SAU ÎN ASOCIERE CU SULFATUL DE MAGNEZIU PE UN MODEL EXPERIMENTAL DE HEPATOPATIE CRONICĂ INDUSĂ CU TETRACLORURĂ DE CARBON LA ŞOBOLANI WISTAR...137 8. DISCUŢII...162 ASPECTELE DE ORIGINALITATE ALE TEZEI DE DOCTORAT...179 PERSPECTIVELE PE CARE LE DESCHIDE TEZA DE DOCTORAT...180 9. CONCLUZII...181 BIBLIOGRAFIE...182 LISTA LUCRĂRILOR PERSONALE PUBLICATE.199 3

INTRODUCERE Zi de zi organismul se confruntă cu variaţi factori stresanţi, de multe ori insesizabili, dar a căror influenţă îi compromite homeostazia. Ficatul joacă un rol esenţial în metabolizarea şi epurarea substanţelor toxice care pătrund pe diferite căi în organismul uman. Aceste substanţe toxice pot fi noxe din mediul înconjurător, dar şi toxice specifice, din mediul industrial. De asemenea, ficatul poate fi afectat şi de consumul excesiv de medicamente. Reglarea răspunsului la stres implică participarea a trei sisteme fundamentale ale organismului: sistemul endocrin, sistemul nervos central (mai ales sistemul nervos vegetativ) şi sistemul imunitar. Stresul mental şi emoţional poate spori stresul oxidativ. Stresul oxidativ este cauzat de un dezechilibru între producţia de oxigen reactiv şi capacitatea unui sistem biologic de detoxifiere rapidă a reactivilor intermediari. Apărarea antioxidantă se realizează prin intermediul antioxidanţilor endogeni, iar în cazul în care aceste mecanisme sunt depăşite, prin intermediul celor exogeni. În ultimul timp o serie de produse naturale obţinute din plante medicinale tradiţionale au fost tot mai mult cercetate şi investigate din punct de vedere chimic şi biologic pentru efectele lor de stimulare ale unor funcţii ale organismului. Există o varietate largă de imunomodulatori de origine vegetală cu importante efecte antioxidante, unii înscriindu-se în noul grup de principii active vegetale denumite adaptogeni. În general, adaptogenii sunt antioxidanţii potenţi, care se pare că măresc rezistenţa şi produc efecte ce diminuă stresul, ca de exemplu îmbunătăţirea somnului şi creşterea performanţelor fizice. 4

Adaptogenii pot avea efecte individuale, în raport de starea generală de sănătate, constituţie, deficienţele de elemente nutritive specifice şi stările patologice ale fiecărei persoane, în particular. Antioxidanţii se găsesc în fructe, cereale şi diferite alte produse vegetale, sau pot fi luaţi sub formă de suplimente alimentare. Adaptogenii, administraţi zilnic, acţionează în sensul prevenirii bolilor şi sporind vitalitatea şi echilibrul. Deasemenea, ajută organismul prin capacitatea lor de a restabili homeostazia, de a optimiza metabolismul, de a revitaliza sistemele epuizate şi îmbunătăţind rezistenţa la un număr mare de agenţi agresori, fără a provoca efecte secundare. În prezenţa unui extract de origine vegetală, cu proprietăţi adaptogene se impune necesitatea unor investigaţii privind implicaţiile terapeutice şi profilactice ale administrării sale, în particular în condiţii de stres sau de afectare hepatică. Cetraria islandica este un lichen arctic, răspândit pe continentul Nord American, în Canada, zona Marilor Lacuri din SUA, Alaska; în toate ţările din nordul Europei, întâlnit şi la noi în zonele montane înalte. În acest context, este justificată alegerea temei tezei de doctorat, având drept scop cercetarea efectelor antioxidante ale unor noi substanţe farmacologic active din surse vegetale. În cadrul tezei de doctorat am investigat efectele unui extract dintr-un adaptogen cunoscut Cetraria islandica, administrat singur sau în asociere cu sulfatlu de magneziu asupra stresului oxidativ şi asupra sistemului imunitar, şi totodată am cercetat efectele sale pe un model experimental de hepatopatie indusă cu tetraclorură de carbon la animale de laborator. 5

STADIUL CUNOAŞTERII Partea generală este structurată astfel: Capitolul Principii active din surse vegetale prezintă date generale legate de istoricul utilizării în scopuri medicale a plantelor, datorită efectelor pe care principiile active conţinute în acestea le exercită în diferite stări patologice prin care trece organismul. Sunt prezentate pe larg cele mai noi date din literatură în legătură posibilele implicaţii în terapie a extractelor vegetale, cu efecte favorabile în special în condiţii de stres. Capitolul Oxidante - antioxidante prezintă date teoretice privind fiziologia şi fiziopatologia stresului oxidativ. Sunt detaliate etapele metabolismului celular şi în mod special a importanţei radicalilor liberi în producerea şi evoluţia leziunilor tisulare, atunci când sunt depăşite mecanismele naturale de apărare împotriva agresiunilor externe. Tot în această parte sunt prezentaţi principalii compuşi prooxidanţi şi antioxidanţi implicaţi în menţinerea homeostaziei organismului, în diferite stări patologice sau în condiţii de expunere la stres. Capitolul: Implicaţiile magneziului în imunomodulare aduce în discuţie problema unuia dintre cei mai importanţi cationi din organism, magneziul, prezent în proporţie crescută la nivel celular, şi care este implicat în activitatea a peste 300 de sisteme enzimatice. În continuare sunt prezentate detaliat particularităţile de farmacocinetică ale acestui cation, principalele sale roluri fiziologice în organism, implicarea acestuia în patologie, precum şi utilizarea sa terapeutică. În ultimul capitol: Modele experimentale animale de hepatopatie sunt descrise principalele posibiltăţi de 6

inducere a hepatopatiei experimentale, şi anume: hepatopatia toxică produsă de tetraclorura de carbon; hepatopatia determinată de acetaminofen, administrat cronic, şi în doze mari); hepatopatia indusă cu acrilamidă; hepatopatia generată de administrarea cronică de alcool. Teza de doctorat cuprinde un număr de 200 de pagini (67 de pagini partea generală, 135 pagini partea personală) şi include un număr de 29 de tabele şi 56 figuri. Bibliografia conţine 349 de referinţe bibliografice din literatura de specialitate consultată. În rezumat numerotarea paginilor de la cuprins a fost preluată ca atare din teză. CONTRIBUŢII PROPRII Investigarea efectelor unor extracte naturale asupra mecanismelor celulare şi moleculare implicate în disfuncţia imunitară asociată unor situaţii stresante sau disfuncţiei hepatice, reprezintă un domeniu prioritar al cercetării actuale. Studiul de faţă urmăreşte demonstrarea modului în care substanţele active din acest extract vegetal influenţează dezechilibrul imunitar determinat de stresul provocat experimental şi în condiţii de hepatopatie toxică indusă la animale de laborator. Alegerea ca temă de cercetare a efectelor unui extract vegetal din Cetraria islandica este oportună, cu atât mai mult cu cât astăzi se acordă o atenţie deosebită influenţei pe care adaptogenii îl au asupra menţinerii stării de sănătate, dat şi în tratarea unor boli. Extractul din C. islandica a fost obţinut în laboratoarele SC Centrul de Cercetare si Prelucrare Plante Medicinale Plantavorel SA, Piatra Neamţ. Doza de substanţă totală reprezintă 1/80 din DL 50. Partea personală este structurată în trei secţiuni, cuprinzând modele experimentale complexe ce au permis 7

studierea efectelor extractului din Cetraria islandica administrat în monoterapie sau în asociere cu sulfat de magneziu atât în condiţii de inflamţie cronică, cât şi în cazul hepatopatiei induse experimental. 1. Cercetări experimentale, pe şobolani Wistar cu granulom indus experimental, privind efectele imunomodulatoare şi antioxidante ale extractului din C. islandica în monoterapie sau în asociere cu sulfatul de magneziu; 2. Cercetări experimentale, privind efectele imunomodulatoare şi antioxidante ale extractului din C. islandica în monoterapie sau în asociere cu sulfat de magneziu pe un model experimental de hepatopatie cronică indusă cu tetraclorură de carbon la şobolani Wistar; 3. Discuţii Prima parte cuprinde cercetări experimentale, pe şobolani Wistar cu granulom indus experimental, privind efectele imunomodulatoare şi antioxidante ale extractului de C. islandica (notat cu numele de cod Ci) în monoterapie sau în asociere cu sulfatul de magneziu. Au fost utilizate 6 loturi de către 6 şobolani Wistar, în greutate de 180-200g, cu repartiţie uniformă pe sexe, proveniţi de la Institutul de Sănătate Publică Iaşi, trataţi conform următoarei scheme: Lot 1. (SF): Ser fiziologic (0,5 ml/100g c/zi); Lot 2. (LEV): Levamisol (10 mg/kg c/zi); Lot 3. (PDN): Prednison (5 mg/kg c/zi); Lot 4. (MgSO 4 ): sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi); Lot 5. (Ci): extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi); Lot 6. (Ci + MgSO 4 ): extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi) + sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi). 8

Substanţele au fost administrate în doză unică zilnică, la 8 dimineaţa, timp de 14 zile, pe cale intraperitoneală. În a opta zi a experimentului s-a practicat testul granulomului. S-au introdus subcutanat, bilateral pe flancuri, pelete sterile de bumbac, cântărind 62mg. Apoi s-a continuat administrarea substanţelor de testat încă 7 zile conform schemei de mai sus. În a 15-a zi a experimentului, animalele au fost sacrificate, s-au scos peletele împreună cu ţesutul de granulaţie din jur, au fost uscate 18 ore la temperatura de 56 ºC, apoi au fost cântărite. Greutatea granulomului format s-a calculat scăzând din greutatea peletelor din ziua a 8-a de experiment, greutatea peletelor de la momentul zero (M0 - înainte de implantare). Lotul martor este reprezentat de animale fără implant de pelete, la care s-a administrat intraperitoneal ser fiziologic 0,5ml/100g corp în priză zilnică unică. Ca martori pozitivi în experiment s-au considerat loturile cu implant de pelete de bumbac, care au primit prednison (PDN 5mg/kg corp) un analog glucocorticosteroidian, derivat cu puternice efecte antiinflamatoare şi imunosupresoare, şi levamisol (LEV 10mg/kg corp), agent imunosupresor cunoscut. Efectele de tip imunomodulator şi antioxidant ale extractului de C. islandica (Ci) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4. Au fost utilizate12 loturi de câte 6 şobolani Wistar, cu greutate cuprinsă între 180-200g, cu repartiţie uniformă pe sexe, proveniţi de la Institutul de Sănătate Publică din Iaşi, trataţi conform schemei: Lot 1. (L1) = SF= Ser fiziologic (0,5 ml/100g c/zi); Lot 2. (L2) = SFp = Pelete, ser fiziologic (0,5 ml/100g c/zi); Lot 3. (L3) = LEV = Levamisol (10 9

mg/kg c/zi); Lot 4. (L4) = LEVp = Pelete, Levamisol (10 mg/kg c/zi); Lot 5. (L5) = PDN = Prednison (5 mg/kg c/zi); Lot 6. (L6) = PDNp = Pelete, prednison (5 mg/100g c/zi); Lot 7. (L7) = MgSO 4 = sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi); Lot 8. (L8) = MgSO 4 p = Pelete, sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi); Lot 9. (L9) = Ci = extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi); Lot 10. (L10) = Cip = Pelete, extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi); Lot 11. (L11) = Ci + MgSO 4 = extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi) + sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi); Lot 12. (L12) = Ci + MgSO 4 p = Pelete, extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi) + sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi). Substanţele au fost administrate în doză unică zilnică, la ora 8 dimineaţa, timp de 14 zile, pe cale intraperitoneală. În ziua a opta zi a experimentului, la animalele din loturile notate cu p, s-a practicat testul granulomului, apoi s-a continuat administrarea substanţelor conform schemei de mai sus. După 14 zile de tratament s-a recoltat sânge din plexul retroorbitar (respectând condiţiile de etică a experimentului pe animale de laborator) şi au fost determinaţi următorii parametri: formula leucocitară, capacitatea de fagocitoză a PMN din sângele periferic, activitatea complementului seric, activitatea malondialdehidei, catalazei, glutation peroxidazei şi a glutationului redus. Rezultatele au fost apoi prelucrate statistic folosind testul t-student. Rezultatele au fost exprimate ca medie ± deviaţie standard. A fost considerată semnificativă valoarea p<0.05. 10

Cercetări experimentale, privind efectele imunomodulatoare şi antioxidante ale extractului din C. islandica (Ci) în monoterapie sau în asociere cu sulfatul de magneziu pe un model experimental de hepatopatie cronică indusă cu tetraclorură de carbon la şobolani Wistar Au fost utilizate 8 loturi de câte 6 şobolani Wistar, cu greutate cuprinsă între 180-200g, cu repartiţie uniformă pe sexe, proveniţi de la Institutul de Sănătate Publică din Iaşi, trataţi conform schemei: Lot 1. (L1) = SF = Ser fiziologic (0,5 ml/100g c/zi); Lot 2. (L2) = MgSO 4 = sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi); Lot 3. (L3) = Ci = extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi); Lot 4. (L4) = Ci + MgSO 4 = extract C. islandica (21,56 mg/kg c/zi) + sulfat de magneziu (5 mg/kg c/zi); Lot 5. (L5) = TC = tetraclorură de carbon (0,1 ml/100g c/zi); Lot 6. (L6) = TC+MgSO 4 = tetraclorură de carbon (0,1 ml/100g c/zi) + sulfat de magneziu (5 mg/kgc/zi); Lot 7. (L7) = TC+Ci = tetraclorură de carbon (0,1 ml/100g c/zi) + extract C. islandica (21,56 mg/kgc/zi); Lot 8. (L8) = TC+Ci+MgSO4 = tetraclorură de carbon (0,1 ml/100g c/zi) + extract C. islandica (21,56 mg/kgc/zi) + sulfat de magneziu (5 mg/kgc/zi). Substanţele au fost administrate în doză unică zilnică, la ora 8 dimineaţa, timp de 28 zile, pe cale intraperitoneală, cu excepţia tetraclorurii de carbon, care a fost administrată pe cale orală, pe sondă esogastrică. După 28 zile de tratament s-a recoltat sânge din plexul retroorbitar (respectând condiţiile de etică a experimentului pe animale de laborator) şi au fost determinaţi următorii parametri: formula leucocitară, capacitatea de fagocitoză a PMN din sângele periferic, activitatea complementului seric, TGO, TGP, GGT, LDH, bilirubină, colesterol total, LDLcolesterol şi HDL-colesterol. 11

Rezultatele au fost apoi prelucrate statistic folosind testul t-student. Rezultatele au fost exprimate ca medie ± deviaţie standard. A fost considerată semnificativă valoarea p<0.05. La finalul experimentului, după eutanasierea animalelor au fost recoltate fragmente de ficat pentru evaluarea histopatologică. REZULTATE Efectele extractului din C. islandica în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 asupra ţesutului de granulaţie Comparativ cu lotul martor, tratat cu SF, se constată că PDN şi LEV determină puternice efecte antiinflamatoare, evidenţiate prin scăderea formării ţesutului de granulaţie în jurul peletelor introduse subcutanat pe flancuri, în a 8-a zi a experimentului, la animalele tratate cu PDN şi LEV, faţă de cele tratate cu SF. Inflamaţia cronică experimentală la şobolani trataţi timp de 2 săptămâni. Variaţia procentuală a masei peletelor subcutanate (mg) 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 SF LEV PDN MgSO4 Ci Ci+MgSO4 0,00 Flancul stâng Flancul drept Figura 1. Acţiunea extractului vegetal din Cetraria islandica (în doza de 21,56 mg/kg c/zi) administrat în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (în doza de 5 mg/kgc/zi) timp de 2 săptămâni, asupra ţesutului de granulaţie (valori exprimate în mg). 12

Asocierea extractului din C. islandica cu MgSO 4 a determinat o creştere a efectului antiinflamator comparativ cu rezultatul obţinut prin administrarea în monoterapie a extractului, dar fără semnificaţie statistică. Extractul din C. islandica produce efecte antiinflamatoare mai reduse decât cele determinate de martorii PDN şi LEV, rezultatele fiind asigurate statistic. În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului antiinflamator: PDN > LEV > Ci + MgSO 4 > Ci Se constată că magneziul nu determină efecte semnificative asupra procesului inflamator, dar, în asociere cu C. islandica potenţează efectul său antiinflamator. Efectele de tip imunomodulator şi antioxidant ale extractului din Cetraria islandica în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 La animalele cu granulom indus şi tratate cu ser fiziologic, se constată o creştere semnificativă statistic a procentelor de PMN din sângele periferic faţă de lotul martor tratat cu SF, fără pelete introduse subcutanat. Valorile PMN (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 25,00 SF SFp 20,00 LEV LEVp PDN 15,00 PDNp MgSO4 10,00 MgSO4p Ci 5,00 Cip Ci+MgSO4 0,00 Ci+MgSO4p Figura 2. Procentul de PMN la 14 zile Efectul este datorat procesului inflamator indus. Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu datele din literatură, pe acest model experimental la şobolan. 13

Martorii LEV şi PDN determină o scădere semnificativă statistic a procentelor de PMN din sângele periferic comparativ cu lotul martor tratate cu SF indiferent de condiţiile experimentale realizate. Scăderea procentelor de PMN este semnificativă statistic mai puternică la animalele fără granulom faţă de cele cu granulom indus experimental. MgSO 4 determină o creştere semnificativă statistic a procentelor de PMN din sângele periferic comparativ cu loturile martor tratate cu SF. Efectul de creştere a acestui parametru este mai puternic la animalele cu granulom indus comparativ cu cele fără granulom indus tratate cu MgSO 4, dar fără semnificaţie statistică. Extractul din C. Islandica determină o creştere semnificativă statistic a procentelor de PMN comparativ cu lotul martor tratat cu ser fiziologic, acest lucru fiind semnificativ statistic mai puternic la şobolanii cu pelete subcutanate comparativ cu cei fără granulom indus. Asocierea Mg la extractul de C. islandica a produs o creştere a efectului stimulator asupra acestui parametru indus de C. islandica, dar fără semnificaţie statistică. În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului asupra PMN: a) : LEVp > LEV > PDN > PDNp b) : Ci + MgSO 4 p > Cip > Ci + MgSO 4 > Ci > MgSO 4 p > MgSO 4 Se constată că extractul din C. islandica determină o creştere a procentelor de PMN semnificativ statistic mai puternică la şobolanii cu proces inflamator indus comparativ cu cei fără inflamaţie, situaţie ce poate fi speculată terapeutic (tratamentul cu imunomodulatori este indicat la pacienţii cu diverse afecţiuni şi nu la cei cu sistemul imun normal). 14

Acest efect este constatat atât în cazul administrării extractului de C. islandica în monoterapie, cât şi în cazul administrării asociate cu Mg. Mg asociat extractului de C. islandica determină o creştere a stimulării induse de C. islandica asupra procentelor de PMN (rezulatatele nefiind însă asigurate statistic). La animalele cu granulom indus şi tratate cu ser fiziologic, se constată o creştere semnificativă statistic a procentelor de limfocite din sângele periferic comparativ cu lotul martor tratat cu SF, fără pelete introduse subcutanat. EV determină, atât la animalele cu granulom, cât şi la cele fără granulom, o creştere semnificativă statistic a procentelor de limfocite din sângele periferic comparativ cu loturile martor tratate cu SF, efectul mai puternic la animalele cu granulom indus. Valorile limfocitelor (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 90,00 SF SFp 80,00 LEV 70,00 LEVp 60,00 PDN 50,00 PDNp 40,00 MgSO4 MgSO4p 30,00 Ci 20,00 Cip 10,00 Ci+MgSO4 0,00 Ci+MgSO4p Figura 3. Procentul de limfocite la 14 zile PDN determină o scădere semnificativă statistic a procentelor de limfocite comparativ cu loturile martor tratate cu SF, această creştere fiind semnificativ statistic mai puternică la animalele cu pelete introduse subcutanat (procesul inflamator indus prin tehnica granulomului oferă condiţii de stres suplimentare faţă de imunosupresia indusă de PDN). 15

Mg determină o creştere a procentelor de limfocite comparativ cu loturile martor tratate cu ser fiziologic atât la animalele cu granulom indus, cât şi la cele fără granulom indus experimental, rezultatele nefiind asigurate statistic la animalele cu granulom indus. Extractul din C. islandica, în monoterapie, dar şi în asociere cu MgSO 4 determină o creştere semnificativă statistic a procentelor de limfocite comparativ cu loturile martor tratate cu SF. Stimularea acestui parametru este semnificativă statistic la animalele cu granulom indus faţă de cele fără granulom şi semnificativ statistic mai puternică la animalele care au primit tratament asociat cu Mg comparativ cu cele care au primit monoterapie cu extract din C. islandica. În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului substanţelor testate asupra procentelor de limfocite din sângele periferic: : LEV > Cip > LEVp > Ci + MgSO 4 p > Ci = SFp > Ci + MgSO 4 > Ci + MgSO 4 > MgSO 4 > MgSO 4 p Rezultatele obţinute la loturile martor sunt conforme cu datele obţinute din literatură. La animalele cu granulom indus experimental nu se constată modificări semnificative statistic ale procentelor de eozinofile, în urma tratamentului cu SF. LEV şi PDN determină scăderea semnificativă statistic a procentelor de eozinofile comparativ cu loturile martor tratate cu SF, efectul fiind mai puternic la animalele cu granulom pentru LEV şi respectiv, la animalele fără granulom indus experimental pentru PDN: MgSO 4 determină o scădere, dar nesemnificativă statistic, a procentelor de eozinofile din sângele periferic comparativ cu loturile martor tratate cu SF. 16

Valorile eozinofilelor (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 3,00 SF SFp 2,50 LEV LEVp 2,00 PDN PDNp 1,50 MgSO4 MgSO4p 1,00 Ci 0,50 Cip Ci+MgSO4 0,00 Ci+MgSO4p Figura 4. Procentul de eozinofile la 14 zile Extractul vegetal de C. Islandica nu influenţează semnificativ statistic procentele de eozinofile comparativ cu loturile martor tratate cu SF, atât la animalele cu granulom, cât şi la cele fără granulom indus, atât în cazul administrării în monoterapie cât şi în cazul asocierii cu Mg. MgSO 4, determină o scădere a procentelor de bazofile comparativ cu loturile martor tratate cu SF, la animalele cu granulom indus experimental, dar fără semnificaţie statistică. LEV determină o scădere a procentului de bazofile comparativ cu loturile martor tratate cu SF efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom comparativ cu cele granulom indus experimental, dar fără semnificaţie statistică. Rezultatele obţinute la loturile martor sunt în conformitate cu datele din literatură. Extractul vegetal din C. islandica, determină o scădere semnificativă statistic a procentului bazofilelor comparativ cu loturile martor tratate cu SF, atât în monoterapie, cât şi în asociere cu MgSO 4. Efectul asupra acestui parametru este semnificativ statistic mai puternic la animalele cu granulom indus experimental comparativ cu cele fără granulom indus experimental. Asocierea MgSO 4 nu influenţează semnificativ statistic efectul extractului C. islandica asupra procentelor de bazofile. 17

În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine, a descreşterii efectelor substanţelor testate asupra procentului bazofilelor: : Cip Ci + MgSO4p > LEV > LEVp = Ci + MgSO4 > Ci > MgSO4p Se constată că, extractul din C. islandica la doza utilizată, în monoterapie şi în asociere cu MgSO 4 determină o scădere a procentului de bazofile la animalele cu granulom indus experimental semnificativ mai puternică decât scăderea produsă asupra acestui parametru. La loturile martor cu granulom indus experimental şi tratate cu SF s-a constatat o creştere semnificativă statistc a nivelurilor malondialdehidei serice (MAD) comparativ cu valorile acestei enzime la animalele tratate cu SF, fără granulom, acest aspect certificând existenţa unor procese peroxidative intense la animalele cu granulom. Valorile MDA (µmol/ml) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 10,00 SF 9,00 SFp 8,00 LEV LEVp 7,00 PDN 6,00 PDNp 5,00 MgSO4 4,00 MgSO4p 3,00 Ci 2,00 Cip 1,00 Ci+MgSO4 0,00 Ci+MgSO4p Figura 5. Activitatea MDA la 14 zile Creşterea valorii MDA este în legătură directă cu creşterea nivelului de oxidare lipidică. LEV demonstrează efecte antioxidante, prin reducerea semnificativă statistic valorilor serice ale MDA comparativ cu lotul martor SFp. La animalele cu granulom indus experimental şi tratate cu LEV valorile serice ale MDA sunt semnificativ statistic mai crescute comparativ cu nivelul de 18

la animalele tratate cu LEV fără granulom, dar semnificativ statistic mai reduse comparativ cu cele de la lotul martor SFp. PDN determină scăderea semnificativă statistic a valorilor serice ale MDA indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom şi comparativ cu cel indus de LEV. Datele obţinute la loturile martor sunt în conformitate cu cele din literatură. Extractul de C. islandica determină scăderea semnificativă statistic a valorilor serice ale MDA indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom. MgSO 4 nu influenţează semnificativ statistic nivelurile serice ale MDA, dar potenţează efectul antioxidant al extractului din C. islandica. În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului substanţelor testate asupra acestui parametru: : PDN > Ci + MgSO 4 > Ci > LEV > MgSO 4 > Ci + MgSO 4 p > PDNp > Cip > LEVp > MgSO 4 p Se constată că extractul din C. islandica determină scăderea peroxidării lipidice semnificativ statistic mai puternic comparativ cu cea indusă de LEV, dar semnificativ statistic mai redus comparativ cu cea indusă de PDN. Valorile catalazei (µu Cat/ml) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 800,00 SF SFp 700,00 LEV 600,00 LEVp 500,00 PDN PDNp 400,00 MgSO4 300,00 MgSO4p Ci 200,00 Cip 100,00 Ci+MgSO4 0,00 Ci+MgSO4p Figura 6. Activitatea catalazei la 14 zile 19

LEV determină scăderea semnificativă statistic a valorilor catalazei comparativ cu lotul martor SFp. La animalele cu granulom indus experimental şi tratate cu LEV valorile catalazei sunt semnificativ statistic mai crescute comparativ cu nivelul de la animalele tratate cu LEV fără granulom, dar semnificativ statistic mai reduse comparativ cu cele de la lotul martor SFp. PDN determină scăderea semnificativă statistic a valorilor catalazei indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom şi comparativ cu cel indus de LEV. Datele obţinute la loturile martor sunt în conformitate cu cele din literatură. Extractul din C. islandica determină scăderea semnificativă statistic a valorilor catalazei indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom. MgSO4 nu influenţează semnificativ statistic nivelurile catalazei, dar potenţează efectul antioxidant al extractului din C. islandica. În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului substanţelor testate asupra acestui parametru: : PDN > Ci + MgSO 4 > Ci > LEV > MgSO 4 > Ci + MgSO 4 p > PDNp > Cip > LEVp > MgSO 4 p La loturile martor tratate cu SF şi cu granulom indus experimental nivelurile crescute de glutation peroxidază demonstrează condiţii experimentale de stres oxidativ. LEV determină scăderea semnificativă statistic a valorilor glutation peroxidazei comparativ cu lotul martor SFp. La animalele cu granulom indus experimental şi tratate cu LEV valorile glutation peroxidazei sunt semnificativ statistic mai crescute comparativ cu nivelul de la animalele tratate cu LEV fără granulom, dar semnificativ statistic mai reduse comparativ cu cele de la lotul martor SFp. 20

Valorile glutation peroxidazei (µmolgssg/min/ml) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 3,50 SF SFp 3,00 LEV 2,50 LEVp PDN 2,00 PDNp MgSO4 1,50 MgSO4p 1,00 Ci Cip 0,50 Ci+MgSO4 0,00 Ci+MgSO4p Figura 7. Activitatea glutation peroxidazei la 14 zile PDN determină scăderea semnificativă statistic a valorilor glutation peroxidazei indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom şi comparativ cu cel indus de LEV. Datele obţinute la loturile martor sunt în conformitate cu cele din literatură. Extractul de C. islandica determină scăderea semnificativă statistic a valorilor glutation peroxidazei indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom. MgSO4 nu influenţează nivelurile glutation peroxidazei, atât în monoterapie, cât şi în cazul asocierii cu extractul din C. islandica. În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului substanţelor testate asupra acestui parametru: : PDN > Ci + MgSO 4 = Ci > LEV > MgSO 4 > Ci + MgSO 4 p = PDNp = Cip > LEVp > MgSO 4 p Se constată că efectele extractului de C. Islandica la animalele cu granulom indus sunt similare cu cele determinate de PDN în aceleaşi condiţii experimentale. La loturile martor tratate cu SF şi cu granulom indus experimental nivelurile scăzute de glutation redus 21

demonstrează consumul său ca substrat al glutation peroxidazei. Valorile GSH (µg/ml) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 90,00 SF SFp 80,00 LEV 70,00 LEVp 60,00 PDN 50,00 PDNp 40,00 MgSO4 MgSO4p 30,00 Ci 20,00 Cip 10,00 Ci+MgSO4 0,00 Ci+MgSO4p Figura 8. Valorile glutationului redus la 14 zile LEV determină creşterea semnificativă statistic a valorilor glutationului redus comparativ cu lotul martor SFp. La animalele cu granulom indus experimental şi tratate cu LEV valorile glutationului redus sunt semnificativ statistic mai scăzute comparativ cu nivelul de la animalele tratate cu LEV fără granulom, dar semnificativ statistic mai crescute comparativ cu cele de la lotul martor SFp. PDN determină creşterea semnificativă statistic a valorilor glutationului redus indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom şi comparativ cu cel indus de LEV. Datele obţinute la loturile martor sunt în conformitate cu cele din literatură. Extractul din C. islandica determină creşterea semnificativă statistic a valorilor glutationului redus indiferent de condiţiile experimentale, efectul fiind mai puternic la animalele fără granulom. MgSO4 nu influenţează nivelurile glutationului redus, atât în monoterapie, cât şi în cazul asocierii cu extractul din C. islandica. 22

În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului substanţelor testate asupra acestui parametru: : PDN > Ci + MgSO 4 > Ci > LEV > MgSO 4 > Ci + MgSO 4 p > PDNp = Cip > LEVp > MgSO 4 p Putem trage concluzia că extractul din Cetraria islandica creşte semnificativ capacitatea antioxidantă a serului şobolanilor, efect mult mai evident la animalele fără granulom indus experimental. Sunt posibile două mecanisme prin care acest extract vegetal să acţioneze ca antioxidant într-un sistem biologic în condiţii de stres oxidativ: C. islandica ar putea acţiona ca agent reducător, donor de electron, convertind peroxizii lipidici la hidroxizi lipidici sau peroxizii fosfolipidici la hidroxizi fosfolipidici, inhibând peroxidarea lipidică; este posibil ca cetraria islandica să producă chelarea de ioni metalici tranziţionali. Extractul vegetal testat, obţinut din Cetraria islandica este antiinflamator şi imunomodulator, efectele sale realizându-se la doza de 21,56 mg/kg corp/zi (reprezentând 1/80 din DL 50 ) şi în condiţiile inducerii granulomului, ceea ce sugerează ipoteza utilizării ulterioare a acestui compus, în urma unor multiple testări, ca alternativă de medicament antistres-adaptogen. 23

CERCETĂRI EXPERIMENTALE, PRIVIND EFECTELE IMUNOMODULATOARE ŞI ANTIOXIDANTE ALE EXTRACTULUI DIN C. ISLANDICA (Ci) ÎN MONOTERAPIE SAU ÎN ASOCIERE CU SULFATUL DE MAGNEZIU PE UN MODEL EXPERIMENTAL DE HEPATOPATIE CRONICĂ INDUSĂ CU TETRACLORURĂ DE CARBON LA ŞOBOLANI WISTAR CCl 4 (TC) a determinat o scădere semnificativă statistic a procentelor de PMN din sângele periferic faţă de lotul martor tratat cu SF. MgSO 4 determină o creştere semnificativă statistic a procentelor de PMN comparativ cu loturile martor tratate cu SF. Extractul de Cetraria islandica, determină o creştere semnificativă statistic a procentelor de PMN comparativ cu loturile martor, tratate cu SF. Asocierea MgSO4 la extractul de C. islandica a produs o creştere a efectului stimulator asupra acestui parametru, indus de C. islandica, dar fără semnificaţie statistică. 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Valorile PMN (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 20,00 SF Figura 9. Procentul de PMN la 28 zile 24 MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului asupra PMN:

: Ci + MgSO 4 > TC + Ci + MgSO 4 > Ci > MgSO 4 : TC = TC + MgSO 4 > TC + Ci CCl4 a determinat o scădere semnificativă statistic a procentelor de limfocite din sângele periferic faţă de lotul martor tratat cu SF. MgSO 4 şi extractul de C. islandica, nu determină modificări semnificative statistic a procentelor de limfocite comparativ cu lotul martor tratat cu SF. Asocierea Mg la extractul de C. islandica a diminuat scăderea procentului de limfocite determinată de TC. 76,00 74,00 72,00 70,00 68,00 66,00 64,00 62,00 Valorile limfocitelor (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 78,00 SF Figura 10. Procentul de limfocite la 28 zile MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 Valorile eozinofilelor (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 0,70 SF 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Figura 11. Procentul de eozinofile la 28 zile MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 25

În urma comparării între loturi, se constată următoarea ordine a descreşterii efectului asupra procentelor de limfocite: : TC = TC + MgSO 4 > TC + Ci > TC + Ci + MgSO 4 La animalele din toate loturile testate nu se constată modificări semnificative statistic ale procentelor de eozinofile din sângele periferic faţă de lotul tratat cu SFAdministrarea TC a determinat o bazofilie semnificativă statistic faţă de lotul tratat cu SF. Atât extractul vegetal de C. islandica, la doza utilizată în acest experiment, cât şi MgSO4, nu au antagonizat efectul de supresie produs de TC asupra acestui parametru. În schimb, asocierea Ci cu MgSO4 a determinat diminuarea semnificativă statistic a efectului TC de creştere a procentelor de bazofile comparativ cu lotul tratat cu SF. Valorile bazofilelor (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 9,00 SF 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Figura 12. Procentul de bazofile la 28 zile 26 MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 Administrarea TC a determinat o monocitoză semnificativă statistic faţă de lotul martor tratat cu SF. Atât extractul vegetal din C. islandica, la doza utilizată în acest experiment, cât şi MgSO4, nu au antagonizat efectul de supresie produs de TC asupra acestui parametru.

9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Valorile monocitelor (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 10,00 SF Figura 13. Procentul de monocite la 28 zile MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 În schimb, asocierea Ci cu MgSO4 a determinat diminuarea semnificativă statistic a efectului TC de creştere a procentelor de monocite comparativ cu lotul tratat cu SF. Evaluarea nivelului unor parametri ai apărării imunitare 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Valorile testului NBT (%) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 20,00 SF Figura 14. Valorile testului NBT la 28 zile 27 MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 Administrarea TC a determinat o scădere semnificativă statistic a capacităţii de fagocitoză a PMN din sângele periferic faţă de lotul tratat cu SF.

Extractul de C. islandica a determinat o creştere semnificativă statistic testului NBT comparativ cu lotul martor tratat cu SF, atât în cazul administrării în monoterapie, cât şi în cazul asocierii cu MgSO4. Efectul se menţine şi la animalele cu hepatită toxică indusă experimental, efectul fiind semnificativ statistic mai puternic în cazul asocierii Ci cu MgSO4. Valorile complementului seric (UCH 50 ) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 70,00 SF 60,00 MgSO4 50,00 Ci 40,00 Ci+MgSO4 30,00 TC 20,00 TC+MgSO4 10,00 TC+Ci 0,00 TC+Ci+MgSO4 Figura 15. Activitatea complementului seric la 28 zile Valorile TGP (U/l) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 90,00 SF 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Figura 16. Activitatea TGP la 28 zile MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 28

La animalele din toate loturile testate nu se constată modificări semnificative statistic ale activităţii complementului seric (UCH 50 ) comparativ cu lotul tratat cu SF. Se constată că TC a determinat o alterare hepatică profundă, evidenţiată prin creşterea semnificativă statistic a valorilor enzimei TGP faţă de lotul tratat cu SF. Extractul vegetal din C. islandica, la doza utilizată în acest experiment, a determinat o scădere semnificativă statistic a valorilor enzimei TGP, atât în cazul administrării în monoterapie, cât şi în cazul asocierii cu MgSO4, nivelurile revenind la limitele normale. Efectul este semnificativ statistic mai puternic în cazul asocierii Ci cu MgSO4 la animalele cu hepatită toxică indusă experimental, dar MgSO4 în monoterapie nu influenţează aceşti parametri. Se constată că TC a determinat o alterare hepatică profundă, evidenţiată prin creşterea semnificativă statistic a valorilor enzimei GGT faţă de lotul tratat cu SF. Valorile GGT (U/l) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 100,00 SF 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Figura 17. Activitatea GGT la 28 zile 29 MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 Extractul vegetal din C. islandica, la doza utilizată în acest experiment, a determinat o scădere semnificativă statistic a valorilor enzimei GGT, atât în cazul administrării

în monoterapie, cât şi în cazul asocierii cu MgSO4, nivelurile revenind la limitele normale. Efectul este semnificativ statistic mai puternic în cazul asocierii Ci cu MgSO4 la animalele cu hepatită toxică indusă experimental, dar MgSo4 în monoterapie nu influenţează aceşti parametri. Se constată că TC a determinat creşterea semnificativă statistic a valorilor bilirubinei serice totale faţă de lotul tratat cu SF. Extractul vegetal din C. islandica, la doza utilizată în acest experiment, a determinat o scădere semnificativă statistic a valorilor bilirubinei serice totale, atât în cazul administrării în monoterapie, cât şi în cazul asocierii cu MgSO4, nivelurile revenind la limitele normale. Valorile bilirubinei serice totale (mg/dl) la şobolani trataţi cu Ci (21,56 mg/kgc/zi) în monoterapie sau în asociere cu MgSO 4 (5 mg/kgc/zi) 2,50 SF 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Figura 18. Valorile bilirubinei serice totale la 28 zile 30 MgSO4 Ci Ci+MgSO4 TC TC+MgSO4 TC+Ci TC+Ci+MgSO4 Efectul este semnificativ statistic mai puternic în cazul asocierii Ci cu MgSO4 la animalele cu hepatită toxică indusă experimental, dar MgSO4 în monoterapie nu influenţează aceşti parametri. La animalele din toate loturile testate nu se constată modificări semnificative statistic ale valorilor TGO, LDH,

colesterolului total, LDL-colesterolului şi HDLcolesterolului comparativ cu lotul martor tratat cu SF. Evaluarea modificărilor histologice induse de administrarea extractului de C. Islandica Examen histologic ţesut hepatic Figura 19. Lot martor-morfologie hepatică normală.he x 20 Figura 20. Lot Cetraria -secţiune la nivel hepatic.col HE x10 31

Figura 21. Lot MgSO 4. Arii inflamatorii diseminate perivascular. Col HE x10 Figura 22. Lot Cetraria şi MgSO 4. Parenchim hepatic de aspect normal. Col HE x10 Figura 23. Lot CCl 4. Steatoză micro- şi macroveziculară. Col. HE x 10 32

Figura 24. Lot CCl 4. Infiltrat inflamator masiv la nivel hepatic. Col HE x10 Figura 25. Cetraria şi CCl 4. Vasodilataţii moderate ale vaselor hepatice. Col HE x10 Figura 26. Lot MgSO 4 şi CCl 4. Infiltrat inflamator perihepatocitar. Col HE x40 33

Figura 27. Lot Cetraria, Mg SO 4 şi CCl 4. Secţiune la nivel hepatic. Col HE x20p Figura 28. Expunere la lumină continuă. Parenchim hepatic, col HE x10 CCl 4 reprezintă unul dintre compuşii cu o agresivitate particulară recunoscută asupra ţesutului hepatic. Efectul său direct în acest experiment a dus la instalarea steatozei veziculare, iar în anumite zone se pot observa abundente infiltrate inflamatorii. Lotul căruia i s-a administrat concomitent CCl 4, C. islandica, dar şi MgSO 4 a prezentat modicări de mică amploare la nivel hepatic, iar expunerea la lumină continuă, respectiv întuneric, nu determină modificări hepatice semnificative. 34

Figura 29. Stres - Arii inflamatorii perivasculare. Col HE x 10 Intervenţia C. islandica şi a MgSO 4 modulează intensitatea stresului oxidativ şi a efectelor sale, cu reducerea proceselor inflamatorii şi a distribuţiei lor la nivel hepatic. Figura 30. Stres - Procese inflamatorii pericanaliculare şi perivasculare. Col HE x 10. Examenul histopatologic demonstrează efectele hepatoprotectoare şi, coroborat cu nivelurile markerilor de stres oxidativ, efectele antistres-adaptogene (antioxidative) ale extractului din C. islandica, în doza utilizată. 35

Figura 31. Inflamaţii discrete pericanaliculare. Col HE x 10 Asocierea cu sulfatul de magneziu potenţează efectele hepatoprotectoare şi antioxidative ale extractului din C. islandica. ASPECTELE DE ORIGINALITATE ALE TEZEI DE DOCTORAT Teza de doctorat abordează o temă extrem de actuală în cercetarea medicală. Modularea activităţii sistemului imun reprezintă una din preocupările ultimilor ani datorită perspectivelor pe care le deschide. Manipularea prin intermediul substanţelor farmacologic active a mecanismelor intime ale funcţionării apărării imune ar permite realizarea unor tratamente eficiente unor afecţiuni cu potenţial letal. Se ştie că organismul uman dispune de o capacitate specifică de aparare faţă de agresiunea bacteriană, virală etc. Organismul uman este supus de multe ori unor agresiuni din exterior (factori fizici, de mediu, chimici etc.) sau din interior (afecţiuni generale metabolice sau patologii care asociază imunosupresie). În asemenea situaţii, în cazul unor dezechilibre, este nevoie să se intervină din exterior cu nişte stimuli care sunt 36

capabili să readucă sistemul imun la parametrii optimi de funcţionare. Deci, imunomodularea se referă la reglarea mecanismelor de apărare ale organismului, putând acţiona în două direcţi: - imunostimularea-potenţarea (creşterea) capacităţii de apărare a organismului; - imunosupresia-scăderea capacităţii de apărare, fiindcă în unele situaţii reacţia de apărare a organismului este amplificată (de exemplu, în cazul transplantului, organismul uman respingând în mod automat grefa, imunosupresia face posibilă reuşita unei asemenea intervenţii). În acest sens, noi imunomodulatoric de origine vegetală s-ar adresa unei categorii de pacienţi mai puţin reactivi imunitar (persoane trecute de varsta a doua), care au nevoie de o stimulare imună nespecifică, adică nedirectionată către un anume grup de microorganisme. Prin această imunomodulare s-ar putea obţine activarea unor mecanisme celulare imune, care sunt stimulate în activitatea lor, astfel încât apărarea celulară ar fi capabilă de un răspuns mai prompt şi mai eficient la agresiune. O astfel de terapie imunomodulatoare ar putea reprezenta un adjuvant în tratamentul bolilor infecţioase în primul rând, de acest tratament beneficiind toti cei care au predispozitie la astfel de afecţiuni dar şi cei care sunt în diverse stări de infecţii cronice recidivante care nu au răspuns bine la tratamentele cu antibiotice sau la alte tratamente. Cantastim este eficient în toate bolile cronice (singur sau asociat cu vaccinuri terapeutice), în stările de convalescenţă, în cazul unor boli care afectează sistemul imun şi în stările postcanceroase. 37

Un asemenea preparat ar fi util util, de asemenea, oamenilor care au intrat într-un proces de degradare imunitaro-fiziologică. PERSPECTIVELE PE CARE LE DESCHIDE TEZA DE DOCTORAT În fiecare an, adulţii dezvoltă până la 4 episoade acute de infecţii ale căilor respiratorii, în timp ce copiii pot dezvolta până la 8-12 astfel de episoade. Virozele respiratorii reprezintă cea mai frecventă afecţiune a sezonului rece. Specialiştii atrag atenţia că persoanele afectate de viroze respiratorii au tendinţa de a lua medicamente, în special antibiotice fară a consulta un medic, iar automedicaţia cu antibiotice în cazul acestor viroze respiratorii este una greşită, care poate lăsa urme grave asupra organismului. Virozele respiratorii sunt în proporţie de 90% de origine virală şi nu răspund la tratamentul cu antibiotice. Extractul testat dispune de un triplu mecanism de acţiune: antiviral, antibacterian, imunomodulator, care acţionează direct asupra cauzei infecţiilor, reduce severitatea simptomelor scurtând perioada de convalescenţă. Datorită profilului său de siguranţă, extractul utilizat este sigur, eficient şi bine tolerat, ce îl poate recomanda ca tratament profilactic şi pe termen lung. Recomandările specialiştilor sunt de a se aborda tratamentul afecţiunilor infecţioase respiratorii încă de la primele simptome cu produse imunomodulatoare, secretomotorii, simptomatice şi, doar în cazul apariţiei semnelor de suprainfecţie bacteriană şi numai la recomandarea medicului, administrarea antibioticului. Actualmente există un interes ştiinţifico-practic deosebit pentru chimioterapia antivirală prezintă substanţele 38

biologic active de origine vegetală, în special glicozidele steroide. Efectele benefice (acţiune antivirală, imunomodulatoare, antioxidantă) a extractului ar putea fi folosite în tratamentul şi profilaxia patologiilor infecţioase de etiologie virală: gripă, hepatite virale, HIV/SIDA, infecţii cu virusurile herpetice. Datorită activităţilor nominalizate compuşii chimici de origine vegetală sunt consideraţi drept adaptogeni naturali. Prioritatea substanţelor biologic active de origine vegetală poate fi explicată prin următoarele: absenţa sau toxicitate totalmente redusă, cu prezenţa unui spectru extins de activităţi terapeutice la unul şi acelaşi compus chimic. Alte priorităţi foarte importante pentru această categorie de compuşi chimici includ: posibilităţi minimale de apariţie a tulpinilor virale rezistente la aceşti adaptogeni naturali, sinecostul redus de obţinere, materia primă accesibilă. Problemele şi obiectivele specifice cercetării asupra studierii, evaluării şi elaborării noilor produse medicamentoase cu potenţial antiviral includ: identificarea unor compuşi chimici cu toxicitate maximum redusă, dar cu activităţi terapeutice multipleantivirală, imunomodulatoare, interferonogenă, antioxidantă. Aceste exigenţe includ, de asemenea, posibilităţi de formare a unor combinaţii de medicamente, cu efecte aditive sau sinergice accesibile pentru toate păturile de populaţie pe cale orală. În contextul premiselor expuse un deosebit interes ştiinţifico-practic pentru terapeutica medicală prezintă problema studierii activităţii antivirale, imunomodulatoare a extractelor naturale, în seria cărora se înscrie şi cel din C. islandica utilizat în experimentele realizate în această teză de doctorat. 39