UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE STUDIU ANATOMO-CLINIC PRIVIND CORELAłIA DINTRE LIMFOCITUL T ŞI TOLERANłA IMUNĂ ÎN TRANSPLANTELE RENALE ŞI HEPATICE TEZĂ DE DOCTORAT Conducător ştiinńific, Acad.Prof.univ.Dr. MIRCEA IFRIM Doctorand, ANTONESCU ANGELA-MIRELA 2009

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT Cuvânt înainte Introducere Cap.I. Date actuale privind structura anatomică şi funcńională a rinichiului şi ficatului 1.1. Structura anatomică şi funcńională a rinichiului 1.1.1. Structura anatomică a rinichiului. 1.1.2. VacularizaŃia şi inervańia rinichiului. 1.2. Structura anatomică şi funcńională a ficatului. 1.2.1. Structura anatomică a ficatului. 1.2.2. VascularizaŃia ficatului Cap.II. Rolul funcńional al limfocitelor 2.1. Timusul 2.2. Ganglionii limfatici 2.3. Rolul funcńional al limfocitelor 2.3.1. Limfocitul T 2.3.1.1. Proteinele MHC de clasa I. 2.3.1.2 Proteinele MHC clasa II. 2.3.1.3. Proteinele clasa III. 2.3.1.4. Proteinele HLA solubile. 2.3.2. Limfocitul B 2.3.3. Celulele natural ucigaşe (Natural killer NK) 2.4. Mecanisme imonologice de respingere a transplantului. 2.4.1. Clasificarea grefelor 2.5. Tipuri de rejet Cap.III. Transplatul renal şi hepatic 3.1. Transplantul renal. 3.1.1. IndicaŃiile pentru transplantul renal. 3.1.2. SelecŃionarea donatorului. 3.1.3. Pregătirea bolnavului pentru transplantare. 3.1.4. Rejetul grefei renale 3.1.5. ComplicaŃiile transplantului renal. 3.2. Transplantul de ficat 3.2.1. IndicaŃiile pentru transplant de ficat 3.2.2. ContraidicaŃiile pentru transplantul de ficat 3.2.3. Rejetul grefei hepatice 3.2.4. SelecŃia donatorului 3.2.5. ComplicaŃii postoperatorii 3.2.6. Rezultatele transplantării 2

Cap.IV. Stresul oxidativ şi homocisteina 4.1. Homocisteina metabolit al metioninei 4.2. Metabolismul renal al homocisteinei 4.3. Tratamentul de scădere a homocisteinei 4.4. Speciile reactive ale oxigenului Cap.V. Material şi metodă 5.1. Material 5.2. Metode 5.2.1. Citometrie de flux 5.2.2. ReacŃia de amplificare în lanń a polimerazei 5.2.3. Metode biochimice de determinare a produşilor SRO 5.2.4. Metoda dedeterminare a homocisteinei 5.2.5. Metoda de determinare a feritinei 5.2.6. Metode de prelucrare statistică Cap.VI. Rezultate 6.1. Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi şi hemodializańi 6.1.1. Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi 6.1.2. Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi în funcńie de schema de tratament 6.1.3. Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi în funcńie de prezenńa VHC 6.1.4. Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi cu VHB+ comparativ cu bolnavii transplantańi cu VHC+ 6.1.5. Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii dializańi în funcńie de prezenńa VHC+ 6.1.6. Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi comparativ cu cei dializańi. 6.1.7. Modificările proporńiei limfocitului T în funcńie de prezenńa VHC+, la bolnavii transplantańi comparativ cu bolnavii dializańi. 6.2. Modificările limfocitului T în transplantul hepatic 6.3. ConcentraŃia serică SRO şi a hemocisteinei în condińii de transplant renal şi hemodializă şi a parametrilor biochimici 6.4. Nivelul seric SRO şi homocisteinei la pacienńii hemodializańi Cap.VII. DiscuŃii Cap.VIII. Concluzii Bibliografie 3

În cadrul sistemului integrat, fiecare dintre mecanismele inferioare de recunoaştere acńionează, la un anumit moment, în asamblul fluxului de prelucrare antigenic. Altfel spus, în cursul filogeniei, diferitele mecanisme, ce acńionează în sensul fenomenului de recunoaştere, apărute la vieńuitoarele inferioare, au evoluat şi s-au dezvoltat, atingând la vertebrate stadiul cel mai perfecńionat. Pe această treaptă a evoluńiei, mecanismele de recunoaştere se caracterizează printr-o mare fineńe şi se realizează, în primul rând, prin intermediul celulelor ce aparńin sistemului limfoid. Teza de doctorat este structurată în două părńi, una teoretică, cuprinzând 4 capitole şi o parte de cerectări personale, cuprinzând capitolele de material şi metodă, rezultate, discuńii şi concluzii. Bibliografia cuprinde 442 titluri, din acre majoritatea din ultimii 5 ani. Capitolul I cuprinde date actuale privind structura anatomică şi funcńională a rinichiului şi ficatului. Capitolul II intitulat Rolul funcńional al limfocitelor cuprinde date referitaore la timus, ganglionii limfatici, şi la rolul funcńional al limfocitelor. De asemenea, în acest capitol se regăsesc date privind mecanisme imunologice de respingere a transplantului, clasificarea grefelor şi tipuri de rejet. Capitolul III cuprinde aspecte ale transplatul renal şi hepatic, cum ar fi: idicańiile. selecńionarea donatorului, pregătirea bolnavului pentru transplantare, rejetul şi complicańiile transplantului. Capitolul IV intitulat Stresul oxidativ şi homocisteina cuprinde date actuale privind homocisteina şi metabolismul acestia, precum şi tratamentul de scădere a homocisteinei şi speciile reactive ale oxigenului. Capitolul V Material şi metodă : S-au efectuat două studii, unul privind transplantul renal şi al doilea transplantul hepatic. Pentru transplantul renal s-au luat în studiu trei loturi de pacienńi aflańi în evidenńa Clinicii de Nefrologie a Spitalului Clinic Municipal Oradea în perioada 2006-2008: primul lot a cuprins 24 pacienńi hemodializańi, din care cu VHC+ 11 cazuri; al doilea lot a cuprins un lot de pacienńi ce au fost supuşi transplantului renal, din care cu VHC+ 24 cazuri; al treilea lot, lotul martor a cuprins 25 cazuri fără afecńiuni renale. Datele pentru transplantul hepatic au fost furnizate de către Clinica de Transplant Hepatic al Institutului Fundeni. Metodele utilizate au fost: Citometrie de flux. Metodă de investigare ce permite determinarea simultană a mai multor parametri fizici şi indirect chimici caracteristici unei singure celule. Măsurătorile sunt efectuate de către un dispozitiv de analiză hiperfină, în timp ce particulele (celulele) se află în mişcare într-un curent lichid cu o rată de 500-4000 de celule/secundă. Analizele de citometrie de flux permit determinarea simultană a mai multor parametri (dimensiune, granularitate, fluorescenńă) caracterstici fiecărei celule analizate. 4

Prin citometrie în flux pot fi determinańi atât calitativ cât şi cantitativ markeri şi receptori de la nivelul membranei, citoplasmei sau nucleul celulelor. Metoda permite caracterizarea ciclului ADN-ului celulelor neoplazice, comparativ cu al celulelor diploide normale. Analizele de citometrie de flux pot fi utilizate şi în determinarea capacităńii funcńionale a diferitelor tipuri de celule (leucocite, PMN, limfocite, monocite /macrofage etc). Citometria de flux oferă posibilitatea unor investigańii complexe în domeniul medicinei celulare şi moleculare: studii de activare celulară, divizibilitatea celulară, apoptoza, fagocitoza, procese de îmbătrânire. ReacŃia de amplificare în lanń a polimerazei este un procedeu de biologie moleculară, care în ultimul timp reprezintă o metodă utilizată în analiza de rutină în fiecare laborator de medicină. Această metodă a fost pentru prima dată prezentată în 1985 şi reprezintă amplificarea in vitro a unui fragment de ADN, proces care imită foarte bine replicarea ADN-ului in vivo. Metode biochimice de determinare a produşilor SRO. Determinarea malondialdehidei prin metoda colorimetrică. Modificările produse de speciile reactive ale oxigenului (SRO) asupra metabolismului lipidic se datoresc peroxidării lipidelor celulare şi extracelulare. Peroxidarea lipidelor reprezintă o sursă majoră de produşi citotoxici cum sunt aldehidele care au rezultat din descompunerea hidroperoxizilor lipidici. Malondialdehida (MDA) este unul din produşii de peroxidare lipidică, determinarea ei în sânge reprezintă o metodă standard pentru evaluarea stresului oxidativ. Determinarea proteinelor carbonilate. Metoda spectrofotometrică. Modificarea oxidativă a proteinelor poate apărea într-o varietate de procese fiziologice şi patologice. Deşi distincńia este câteodată arbitrară, aceste modificări pot fi primare şi secundare. Modificările primare sunt produse de oxidarea catalizată de ioni de metal, oxidarea mediată de radiańii, oxidarea provocată de ozon sau de oxizii de azot. Modificările secundare sunt generate prin intervenńia altor molecule oxidate. Un exemplu îl constituie modificarea covalentă a proteinelor prin hidroxinonenal, produs prin oxidarea lipidelor. Dozarea ceruloplasminei. Ceruloplasmina este o α 2 -glicoproteină, de culoare albastră, cu greutate de 150. 000 de daltoni sintetizată în ficat, ce conńine peste 95% din Cu prezent în plasma sanguină. Fiecare moleculă de ceruloplasmină fixează 8 atomi de Cu. Metoda dedeterminare a homocisteinei. Determinarea enzimatică a homocisteinei este o metoda de determinare cantitativă in vitro a homocisteinei totale din ser şi plasmă. Aparatul utilizat pentru determinarea enzimatică a homocisteinei este HITACHI 912, FHER100. Această metodă poate ajuta în dignosticul şi tratamentul pacienńilor suspecńi de a avea hiperhomocisteinemie şi homocisteinurie. Metoda de determinare a feritinei. Feritina este o proteină, care produce şi stochează fier. Componenta majoră de depozitare şi de sinteză este în ficat. Principiul metodei: Proba de ser uman reacńionează pe un strat coloidal auriu cu un amestec de anticorpi monoclonali cu feritină. În prezenńa feritinei particulele 5

aglutinate sunt aduse în porńiunea roşie a luminii spectrale al coloidului. Acesta induce o creştere a densităńii optice la 600nm aceasta fiind direct proporńională cu concentrańia de feritină din probă. Capitolul VI este capitolul de rezultate structurat în 4 subcapitole. Primul subcapitol se referă la Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi şi hemodializańi în care s-au studiat: Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi. Am luat în studiu un lot de 27 bolnavi cu transplant renal, monitorizańi de clinica de Nefrologie Oradea. Dintre aceştia 15 au fost femei (55,6%) şi 12 bărbańi (44,4%). La aceşti pacoenńi s-au determinat: CD3, CD3+CD4, CD3+CD8, CD3+CD4+CD8, precum şi T helper. Am obńinut următoarele valori: În lotul de femei s-au determinat valori normale ale CD3 la 1 caz (6,7%), iar la lotul de bărbańi tot la un caz (8,3%). Valorile medii sunt de 132, respectiv de 74 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este semnificativă (p<0,001). Atât în lotul de femei cât şi în cel de bărbańi s-a înregistrat câte un caz cu valori normale ale CD3+CD4 (6,7%, respectiv 8,3%). Valorile medii sunt de 52, respectiv de 24 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este semnificativă (p<0,001). Ca şi în cazul CD3 şi CD3+CD4 la o singură femei şi la un singur bărbat s- au înregistrat valori normale ale CD3+CD8. Valorile medii sunt de 7,5, respectiv de 3 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este semnificativă (p<0,001). În ceea ce priveşte T helper, la majoritatea pacienńilor din cele două loturi valorile au fost crescute, valori normale înregistrându-se la 5 paciente (33,3%) şi la 2 pacienńi (16,7%). DiferenŃa dintre cele două loturi este semnificativă (p<0,001). Al doilea aspect studiat a fost Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi în funcńie de schema de tratament. S-a luat în studiu un lotu de 27 pacienńi cu transplant renal, din care 15 femei (55,6%) şi 12 bărbańi (44,4%) S-au determinat: CD3, CD3+CD4, CD3+CD8 şi T helper-supresor ratio şi s-au comparat valorile în funcńie de schema de tratament. Lotul 1 format din 18 pacienńi care au urmat posttransplant tratament cu Micofenolat+Prednison+ICN Lotul 2 format din 9 pacienńi care au urmat alte scheme de tratament posttransplant Bolile asociate au fost prezente la 10 cazuri (37,0%). Cea mai frecventă boală asociată a fost HTA (7 cazuri). S-a înregistrat un singur caz de rejet. 6

S-au determinat valori normale ale CD3 la 2 pacienńi din lotul 1 (14,1%) şi la nici un pacient din lotul 2. Valorile medii la lotul 1 au fost de 55,8 ori mai mari decât limita superioară de normalitate, iar la lotul 2 de 95,3 ori, între cele două loturi diferenńa fiind semnificativă (p=0,0255). Valori normale ale CD3+CD4 s-au înregstrat la la 2 cazuri din lotul 1 (11,6%). Valoarea medie la lotul 1 a fost de 20,5 ori mai mare decât limita superioară de normalitate, iar la lotul 2 de 33,1 ori (p=0,0261). În lotul 1 la 2 cazuri (11,1%) s-au determinat valori normale ale CD3+CD8, iar la lotul 2 tońi pacienńii au avut valori crescute. Valoarea medie la lotul 1 a fost de 2,8 ori mai mare decât limita superioară de normalitate, iar la lotul 2 de 5,2 ori (p=0,0179). În ceea ce priveşte T helper, valori normale s-au înregistrat doar la pacienńii lotului 1 (7 cazuri 38,9%), în timp ce lotul 2 valori au fost crescute la tońi pacienńii. DiferenŃa dintre cele două loturi este semnificativă (p=0,0187). Un alt aspect studiat în acest subcapitol a fost Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi în funcńie de prezenńa VHC. În cadrul lotului de 27 bolnavi cu transplant renal s-a determinat o prevalenńă a VHC+ de 22,2% (6 cazuri). În funcńie de prezenńa VHC+, am studiat modificările proporńiei limfocitului T comparativ între bolnavii cu VHC+ şi VHC-. Astfel a rezultat două subloturi: Lot VHC+ - 6 cazuri, din care 5 femei (83,3%) Lot VHC- - 21 cazuri, din care 10 femei (47,6%). La cele două loturi s-a determinat: CD3, CD3+CD4, CD3+CD8 şi T helper/supresor ratio. În lotul VHC+ la nici un caz nu s-au determinat valori normale ale CD3, iar la lotul VHC- la 2 pacienńi (9,5%). Valorile medii sunt de 110, respectiv de 77 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este semnificativă (p=0,0192). În lotul VHC+ la nici un caz s-au determinat valori normale ale CD3+CD4, iar la lotul VHC- la 2 pacienńi (9,5%). Valorile medii sunt de 40, respectiv de 29 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este semnificativă (p=0,0452). Ca şi în cazul CD3 şi CD3+CD4 la nici un pacient din lotul VHC+ şi la 2 pacienńi (9,5%) din lotul VHC+ s-au determinat valori normale ale CD3+CD8. Valorile medii sunt de 3,4, respectiv de 4,7 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este semnificativă (p=0,0553). În ceea ce priveşte T helper, la majoritatea pacienńilor din cele două loturi valorile au fost crescute, valori normale înregistrându-se la un pacient din lotul VHC+ (16,7%) şi la 6 pacienńi din lotul VHC- (28,6%). DiferenŃa dintre cele două loturi este semnificativă (p=0,0024). S-au studiat de asemenea, Modificările proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi cu VHB+ comparativ cu bolnavii transplantańi cu VHC+. Lot 7

transplant: 27 cazuri, din care 5 cazuri cu VHB+ (18,5%) şi 6 cazuri cu VHC+ (22,2%) În lotul VHB+ s-au determinat valori normale ale CD3, CD3+CD4 şi CD3+CD8 la 1 caz, iar la lotul VHC+ la nici un caz. Valorile medii ale CD3 sunt de 122, respectiv de 110 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi nu este semnificativă (p=0,4216). În cazul CD3+CD4 valorile medii sunt de 54, respectiv de 40 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este slab semnificativă (p=0,0514). Valorile medii ale CD3+CD8 sunt de 5, respectiv de 3 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este slab semnificativă (p=0,0487). În ceea ce priveşte T helper, la majoritatea pacienńilor din cele două loturi valorile au fost crescute, valori normale înregistrându-se la 2 pacienńi la lotul VHB+ şi la un pacient în lotul VHC+. DiferenŃa dintre cele două loturi este semnificativă (p=0,0378). Pentru studiul Modificărilor proporńiei limfocitului T la bolnavii dializańi în funcńie de prezenńa VHC+ s-au luat în studiu 24 pacienńi hemodializańi, din care 12 femei (50,0%) şi 12 bărbańi (50,0%) Boli asociate au fost prezente la 1 caz (4,2%) cu diabet zaharat. PrevalenŃa VHC+ a fost 45,8% (11 cazuri). Am subîmpărńit lotul de pacienńi dializańi în două subloturi: VHC+ - 11 cazuri, din care 6 femei (54,5%) VHC- - 13 cazuri, din care 5 femei (38,5%). La cele două loturi s-a determinat: CD3, CD3+CD4, CD3+CD8 şi T helper/supresor ratio. În lotul VHC+ la un singur caz (9,1%) s-au determinat valori normale ale CD3, iar la lotul VHC- la 3 pacienńi (23,1%). Valorile medii sunt de 344, respectiv de 106 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p<0,001). În lotul VHC+ la un singur caz (9,1%) s-au determinat valori normale ale CD3+CD4, iar la lotul VHC- la 2 pacienńi (15,4%). Valorile medii sunt de 234, respectiv de 58 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p<0,001). La câte un pacient din fiecare lot (9,1%, respectiv 7,7%) s-au determinat valori normale ale CD3+CD8. Valorile medii sunt de 13, respectiv de 6 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p=0,0253). În ceea ce priveşte T helper, la majoritatea pacienńilor din cele două loturi valorile au fost crescute, valori normale înregistrându-se la un pacient din lotul VHC+ (9,1%) şi la 4 pacienńi din lotul VHC- (30,8%). DiferenŃa dintre cele două loturi este semnificativă (p=0,0117). 8

S-a efectuat un studiu comparativ a Modificărilor proporńiei limfocitului T la bolnavii transplantańi comparativ cu bolnavii dializańi: Lot dializă: 24 cazuri, din care 12 femei /50,0%) şi 12 bărbańi (50,0%) Lot transplant: 27 cazuri, din care 15 femei (55,6%) şi 12 bărbańi (44,4%) Bolile asociate au fost prezente la 1 caz (4,2%) în lotul de dializă şi la 10 cazuri (37,0%) la lotul de transplant. În lotul de transplant cea mai frecvetă boală asociată a fost HTA (7 cazuri). La cele două loturi s-a determinat: CD3, CD3+CD4, CD3+CD8 şi T helper/supprssor ratio. CD3, CD3+CD4 şi CD3+CD8 s-au determinat la 17 pacienńi din lotul dializă (70,8%) şi la 14 pacienńi din lotul transplant (51,9%), iar T helper la tońi pacienńii. În lotul de dializă la 5 cazuri (29,4%) s-au determinat valori normale ale CD3, iar la lotul de transplant la 2 pacienńi (14,3%). Valorile în afara intervalului de normalitate au fost cuprinse între 44,8 şi 648,5 ori limita superioară în lotul de dializă, şi între 1,6 şi 398 ori în lotul de transplant. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p=0,0178). În lotul de dializă la 3 cazuri (17,6%) s-au determinat valori normale ale CD3+CD4, iar la lotul de transplant la 2 pacienńi (14,3%). Valorile în afara intervalului de normalitate au fost cuprinse între 1,1 şi 512,1 ori limita superioară în lotul de dializă, şi între 2,1 şi 144,8 ori în lotul de transplant. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p<0,001). În lotul de dializă la 1 caz (5,9%) s-a determinat valori normale ale CD3+CD8, iar la lotul de transplant la 2 pacienńi (14,3%). Valorile în afara intervalului de normalitate au fost cuprinse între 1,7 şi 44,8 ori limita superioară în lotul de dializă, şi între 1,3 şi 15,6 ori în lotul de transplant. DiferenŃa între cele două loturi este semnificativă (p=0,0527). În ceea ce priveşte T helper, la majoritatea pacienńilor din cele două loturi valorile au fost crescute, valori normale înregistrându-se la 5 pacienńi din lotul dializă (20,8%) şi la 7 pacienńi din lotul transpat (25,9%). DiferenŃa dintre cele două loturi nu ste semnificativă (p=0,1767). Modificările proporńiei limfocitului T în funcńie de prezenńa VHC+, la bolnavii transplantańi comparativ cu bolnavii dializańi. Valorile medii ale CD3 la pacienńii dializańi cu VHC+ sunt de 344, iar la lotul de transplantatńi cu VHC+ de 110 ori mai mari decât limita superioară de normalitate. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p<0,001). La loturile cu VHC-, valorile CD3 la pacienńii dializańi sunt de 106 ori mai mari decât limita superioară de normalitate, iar la cei transplantańi de 77 ori.(p=0,0426). Valorile medii ale CD3+CD4 la pacienńii dializańi cu VHC+ sunt de 234 ori mai mare decât limita superioară de normalitate, iar la lotul de transplantańi cu VHC+ de 40 ori. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p<0,001). 9

La loturile cu VHC-, valorile CD3+CD4 la pacienńii dializańi sunt de 58 ori mai mari decât limita superioară de normalitate, iar la cei transplantańi de 29 ori. (p=0,0254). Valorile medii ale CD3+CD8 la pacienńii dializańi cu VHC+ sunt de 13 ori mai mare decât limita superioară de normalitate, iar la lotul de transplantańi cu VHC+ de 3,4 ori. DiferenŃa între cele două loturi este înalt semnificativă (p<0,001). La loturile cu VHC-, valorile CD3+CD4 la pacienńii dializańi sunt de 6 ori mai mari decât limita superioară de normalitate, iar la cei transplantańi de 4,7 ori. (p=0,0542). În loturile cu VHC+ valori normale ale T helper s-au înregistrat la 9,1% dintre dializańi, respectiv 16,7% dintre transplantańi (p=0,0514). În loturile cu VHC- valori normale ale T helper s-au înregistrat la 30,8% dintre dializańi, respectiv 28,6% dintre transplantańi. DiferenŃa dintre cele două loturi este semnificativă (p=0,4221). Al doilea subcapitol a studiat Modificările limfocitului T în transplantul hepatic. Am luat în studiu 52 pacienńi internańi în Clinica de Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni. Evaluarea s-a făcut prin metodele SSO/SSP., iar rezultatele au fost următoarele: cele mai frecvente alele ale clasei I au fost A*02 (32,2%); B*35 (27,4%), iar cele mai frecvente antigene la clasa a II-a au fost DRB1*11 (24,0%). Din 52 de donatori şi primitori, cele mai frecvente gene alele au fost: HLA - 10 cazuri (19,2%) (A*02 7 cazuri), HLB 8 cazuri (15,4%) (B*35 + 4 cazuri) şi HLA DRB 1 8 cazuri (15,4%) (DRB1*11 3 cazuri). Crossmatch transplant hepatic. S-au luat în studiu 74 pacienńi cu transplant hepatic din Institutul Clinic Fundeni: primitorii au avut vârste cuprinse între 1 an şi 60 ani, iar donatorii au vârste cuprinse între 16 şi 56 ani. Zece pacienńi au avut un rezultat inińial specific crossmatch pozitiv incluzând trei cu crossmatch pozitiv la celulele T (Clasa I) şi 7 cu rezultate crossmatch pozitiv la celulele B (clasa II). Al treilea subcapitol cuprinde un studiu privind ConcentraŃia serică a SRO a homocisteinei şi feritinei în condińii de transplant renal şi hemodializă. PacienŃii cu transplant renal au un nivel crescut de MDA (4,34±1,06 nmol/ml în comparańie cu lotul martor a cărui concentrańie este de 1,91±0,33 nmol/ml (p<0,001). Această diferenńă se regăseşte atât înainte de hemodializă (2,87±0,35, p<0,001), cât şi după hemodializă (3,15±0,45, p<0,001). PacienŃii înainte de hemodializă au o concentrańie crescută de MDA 2,87±0,35 nmol/ml comparativ cu lotul martor care prezintă valori între 1,91±0,33 nmol /ml ser (p<0,001). Hemodializa modifică nesemnificativ nivelul MDA lui de la 2,87±0,35 nmol/ml la 3,15±0,45 nmol/ml (p>0,05). 10

ConcentraŃia ceruroplasminei serice la pacienńii transplantańi este scăzută comparativ cu lotul martor (26,22±3,45 mg% versus 32,11±4,62 mg%) (p<0,05). ConcentraŃia de ceruloplasmină în serul pacienńilor hemodializańi, atât înainte de hemodializă cât şi după hemodializă este scăzută comparativ cu lotul martor (25,80±4,23mg%, respectiv 28,11±4,55 mg% versus 32,11±4,62 mg%) (p<0, 05). Hemodializa are ca efect creşterea nesemnificativă a valorilor ceruloplasminei (de la 25,80±4,23mg% la 28,11±4,55mg%) (p>0,05). Nivelul homocisteinei serice este crescut de la 7,97±1,57 µmol/l la lotul martor iar la cei cu transplant renal de la 19,80±2,62 µmol/l. Atât înainte, cât şi după hemodaliză, valorile homocisteinei sunt semnificativ mai mari decât cele înregistrate la lotul martor (21,93±3,66 mg%, respectiv 14,12±1,70 mg% versus 7,97±1,57 mg%) (p<0,001). Hemodializa scade semnificativ valorile homocisteinei (de la 21,93±3,66mg% la 14,12±1,70 mg%) (p<0,01). Nivelul feritinei la pacienńii cu transplant renal este crescut fańă de lotul martor, dar creşterea este slab semnificativă din punct de vedere statistic (p<0,05). Pretransplant nivelul colesterolului, respectiv trigliceridelor creşte determinând şi creşterea riscului aparińiei de afecńiuni cardiovasculare. Hiperlipemia este un parametru des întâlnit şi reprezintă un factor important după efectuarea transplantului renal. Al patrulea subcapitol cuprinde studiul privind Nivelul seric SRO şi homocisteinei la pacienńii hemodializańi. PacienŃii înainte de hemodializă au o concentrańie crescută de MDA 2,87±0,35 nmol/ml comparativ cu lotul martor care prezintă valori între 1,91±0,33 nmol /ml ser (p<0,001). Hemodializa modifică nesemnificativ nivelul MDA lui de la 2,87±0,35 nmol/ml la 3,15±0,45 nmol/ml (p>0,05). ConcentraŃia de ceruloplasmină în serul pacienńilor hemodializańi, atât înainte de hemodializă cât şi după hemodializă este scăzută comparativ cu lotul martor (25,80±4,23mg%, respectiv 28,11±4,55 mg% versus 32,11±4,62 mg% )(p<0, 05). Hemodializa are ca efect creşterea nesemnificativă a valorilor ceruloplasminei (de la 25,80±4,23mg% la 28,11±4,55mg%) (p>0,05). Atât înainte, cât şi după hemodaliză, valorile homocisteinei sunt semnificativ mai mari decât cele înregistrate la lotul martor (21,93±3,66 mg%, respectiv 14,12±1,70 mg% versus 7,97±1,57 mg%) (p<0,001). Hemodializa scade semnificativ valorile homocisteinei (de la 21,93±3,66mg% la 14,12±1,70 mg%) (p<0,01). Pretransplant, creatinina are valori de 7,7-8,5 ori mai mari decât valorile normale (între 8,52±1,64 mg% şi 9,36±1,87 mg%). Valorile ureei pretransplant sunt de 3,2-3,7 ori mai mari decât cele normale (între 146±29 mg% şi 165±37 mg%). 11

Acodul uric şi proteinele totale înregistrează valori normale în perioada pretransplant (între 6,77±1,11 mg% şi 7,00±1,19 mg%, respectiv între 6,60±1,26 mg% şi 6,83±1,12 mg%). Capitolul VII DiscuŃii prezintă rezultatale obńinute în studiul nostru comparativ cu cele obńinute de alte studii. Capitolul VIII cuprinde Concluziile studiului nostru: 1. Sistemul imun are capacitatea de a prelua şi prelucra antigene externe, dat fiind că el este organizat astfel încât are capacitatea de a prelucra antigene sau structuri antigen-like din organism, iar acestea din urmă sunt organizate într-o reńea de comunicări intracelulare, care se găsesc într-un echilibru dinamic, funcńionaloptim, iar tulburările acestui echilibru se manifestă prin bolile imunităńii. 2. Prin sistemul imun trece informańie, această informańie este purtată de către un semnal (eveniment material, substanńă chimică etc. ), caracterizat printr-o mărime variabilă, în funcńie de variabila timp. DiferenŃa dintre diferitele sisteme informańionale ale organismului constă în faptul că fiecare sistem are capacitatea de a prelua şi prelucra numi un tip de informańie, pe care o recunoaşte şi integra în modelul intern de existenńă al sistemului. 3. Semnalele care nu au legătură cu construcńia internă a sistemului produc numai modificări substanńial energetice fără sens, interpretate ca zgomot de fond. Privit prin prisma triadei informańionale (nervos, imun şi endocrin) a organismului, zgomotul de fond pentru fluxul de prelucrare a antigenului nu este în realitate zgomot de fond ci parte integrantă a acestui flux. 4. Manipulările imune au scos în evidenńă un fenomen major: în condińii normale sistemul imun nu acńionează decât fańă de antigenul nonself, nu şi fańă şi de cele self. Această conduită a organismului a generat termenul imunologic de toleranńă. 5. În cadrul sistemului imun modalităńile de reglare, în organismul considerat un tot unitar nu există efecte distructive asupra propriilor Ńesuturi; organismul este deci tolerant de el însuşi, fańă de structurile sale componente, în schimb sistemul imun este intolerant fańă de tot. În consecinńă toleranńa imună este un proces foarte activ şi în acelaşi timp specific. 6. ToleranŃa la grefă a fost prima dată demonstrată de Medawar şi colab. în 1940, care a demonstrat pe model animal că dacă celulele alogenice sunt injectate într-un animal nou-născut, animalul atunci când devine adult va deveni tolerant la Ńesutul donatorului acceptând grefa fără a fi nevoie de tratament imunosupresiv. 7. Histocompatibilitatea indică starea de acceptare unei gazde pentru un grefon, iar histoincompatibilitatea are ca expresie imunologică rejetul grefonului care înseamnă eliminarea lui. 8. ReacŃiile biologice de care depinde succesul sau insuccesul unei transplantări sunt legate de ceea ce se numeşte compatibilitate imunologică, adică corespondenńa dintre structura biochimică a Ńesuturilor donatorului şi cea a primitorului de transplant, precum şi reactivitatea sistemului imun a celui din urmă. 12

9. Este cunoscută raritatea corespondenńei structurale perfecte între donator şi primitor; există mici variańii individuale de structură proteică chiar la animale singenice (linii pure ) sau la gemenii univitelini, între care există compatibilitate imunologică. La aceste grupe de indivizi, acceptarea transplantului, respectiv a grefei se apropie de 100%. 10. Nu orice modificare a structurii biochimice a proteinelor tisulare poate fi sesizată de sistemul imun. Pentru a influenńa compatibilitatea imunologică, modificarea structurii biochimice a unei proteine trebuie să afecteze zona determinantului său antigenic chiar dacă este localizată în zona determinantului sau la distanńă, ea modifică structurile spańiale sau electrice superficiale ale acestuia. 11. În urma numeroaselor studii s-a demonstrat că leucocitele pasagere joacă un rol semnificativ în inińierea şi reglarea reacńiilor imune după transplantul de organ, iar limfocitele T CD4 + au un rol crucial în menńinerea şi inducerea toleranńei fańă de alogrefă. 12. Studiul nostru ca şi alte studii a urmărit printr-o metodă facilă non invazivă şi anume prin metoda flowcitometrică modalitatea prin care alogrefa de organ (în cazul nostru ficat, rinichi), influenńează nivelul şi linia de tipar al celulelor aflate în circulańie şi având un rol important în menńinerea toleranńei imune clinice. 13. InvestigaŃiile făcute pentru a evidenńia rolul potenńial al CD4 + în activitatea reglatorie poate juca şi menńine pe termen lung aparińia rejetului şi supravieńuirea grefei transplantate la primitori cu menńinerea tratamentului imunosupresiv. 14. Monitorizarea celulară T CD4, CD8, permite o mai bună ajustare individuală a tratamentului imunosupresiv, datorită numeroaselor efecte adverse pe care le pot prezenta aceste medicamente cu repercursiuni asupra bunei funcńionări a alogrefei. 15. Rezultatele noastre sugerează că inhibitorii de calcineurină nu influenńează în mod semnificativ efectul nivelul şi funcńia limfocitelor T CD4 +, în transplantul renal însă se observă o scădere a efectului reglator al limfocitelor T CD8 +. 16. Reducerea încărcăturii totale a terapiei imunosupresive poate menńine o stabilitate funcńională a grefei iar studiile şi trialele realizate duc la concluzia existenńei unei toleranńe operańionale în mod special la cei cu transplant hepatic şi transplant renal clinic stabil ceea ce este un mod de selectare facil a primitorilor de transplant, iar descoperirea biomarcherilor şi a probelor funcńionale de identificare a diferenńelor imunologice între transplante clinice stabile, ale primitorilor ne asigură de descărcarea imunosupresivă fără riscuri a pacienńilor transplantańi. 17. În clinica transplantului cel mai important lucru este stabilirea unui timp cât mai lung în toleranńa grefei donate şi utilizarea minimă a agenńilor imunosupresivi, iar monitorizarea imună a acestor markeri biologici ne duc la concluzia că aceştia sunt într-o relańie strânsă cu manifestările clinice care au nevoie de a fi investigate pe larg la primitorii de transplante de organe. 13

18. În numeroase studii şi în studiul nostru s-a investigat implicarea interorganismică a sistemului imun având în vedere multitudinea de procese patogenetice implicate în procesul de acceptare a grefei. Limfocitele au variate roluri puse în evidenńă de studiul nostru şi de alte studii experimentale în care aceştia sunt implicańi iar unul dintre ele este şi implicarea în diferitele faze de ischemie şi reperfuzie a organelor solide transplantate. În modelele de tulburări de ischemie-reperfuzie în creier, inimă, ficat, rinichi şi intestin limfocitele mediază leziunile tisulare şi posibil să le şi repare. Aceste descoperiri sugerează că terapii noi de modulare imună pot fi benefice în prevenirea şi tratarea tulburărilor de ischemie şi reperfuzie. 19. Monitorizarea modificărilor mediului limfocitar post-leziuni în urma transplantului solid de organe în studiul nostru de rinichi şi ficat, prin prezenńa proceselor de toleranńă imună operańională(naturală), dobândită, a procesului inflamator ar putea spori procesul de vindecare a Ńesuturilor. 20. PrezenŃa stresului oxidativ la pacienńii transplantańi şi hemodializańi este demonstrată prin creşterea nivelului de malondialdehidă, a proteinelor carbonilate şi a homocisteinei, iar scăderea nivelului de ceruloplasmină la ambele grupe fańă de lotul martor sugerează o reducere a rolului protector împotriva agenńilor răspunzători de stres oxidativ. 21. Transplantul renal este asociat cu o creştere a nivelului de colesterol şi trigliceride nivel care se datorează şi tratamentului imunosupresiv şi duce la aparińia riscului de aparińie a aterosclerozei şi implicit afecńiuni cardiovasculare. 22. PacienŃii cu insuficienńă cronică terminală prezintă un sindrom complex de malnutrińie-inflamańie iar acesta fiind un complex multifactorial este nevoie de o gamă variată de intervenńii medicamentoase cu folosirea unui tratament cu vitamine din complexul B, acid folic, antioxidanńi, proteic, pentru a reduce manifestările cardiovasculare şi osoase întâlnite la pacienńi cu insuficienńă renală cronică cu valori crescute ale homocisteinei. 23. La pacienńii cu transplant renal pe lângă nivelul crescut al malondialdehidei serice şi a proteinelor carbonilate şi scăderea nivelului de ceruroplasmină în comparańie cu lotul martor confirmă prezenńa stresului oxidativ, cu scăderea sistemelor antioxidante ale organismului, ceea ce duce la modificări la nivelul endoteliului vascular, modificarea proprietăńilor membranei celulare şi a membranei mitocondriilor şi lizozomilor, ceea ce duce la disparińia gradienńilor osmotici, chimici şi electrici. În acest fel este anulată excitabilitatea celulară, perturbându-se astfel procesele metabolice cu aparińia leziunilor morfologice. 24. Speciile reactive, citokinele, chemokinele, moleculele de adeziune se generează, se secretă şi se eliberează mărind reacńiile inflamatorii, mărind selecńia infiltrării şi selecńia leucocitelor în Ńesuturile ischemiate post-transplant. 25. Limfocitele T au o particularitate senzitivă la agenńii antiproliferativi, parńial datorită unei largi dependenńe de sinteza de novo a purinelor, pe când celelalte tipuri celulare se recuperează pe căi mai eficiente. Medicamentele care inhibă activarea limfocitelor T fiind un sprijin pentru un regim imunosupresiv. 14

26. Pentru a înńelege mecanismele prin care este indusă toleranńa e nevoie de a dezvolta şi a recunoaşte noi metode pentru monitorizarea şi dezvoltarea toleranńei imune la pacienńi, să ajustăm tratamentul imunosupresiv individual pentru a putea minimaliza efectele adverse apărute în urma acestui tratament şi a prelungi pe termen cât mai lung supravieńuirea grefei transplantate. Bibliografie selectivă 1. Popescu I.M. şi colab.: DicŃionar de imunologie medicală, Editura Universitară Carol Davila - Bucureşti 2002 2. Male D. Brostoff J, Roth DB, Roitt I:.Immunology, Seventh Edition, Mosby Elsevier reprinted 2007. 3. Ifrim şi colab:.atlas de anatomie topografică-regiuni viscerale; Vasile Goldiş University Press:Arad 2008:185-195 4. Naji A, Le Rond S, Durrbach A, Krawice-Radanne I, Creput C, Daouya M, Caumartin J, LeMaoult J, Carossela ED, Rouas-Freiss N.: CD3+CD4low and CD3+CD8low are induced by HLA-G:novel human peripheral blood suppressor T-cell subsets involved in transplant acceptance, Blood, 2007 Dec; 1; 110(12):3936-48. Epub 2007 Sep 5. 5. Hermann W, Schorr H, Geisel J, Riegel W.: Homocysteine, cystathionine, methylmalonic acid and B-vitamins in patients with renal disease, Clin Chem Lab Med 2001;39:739-746, 6. Garibotto G, Saffiotti S, et al. Interorgan exchange of aminothiol in humans, Am J Physiol Endocrinol Metab 2003; 284:E757-E763. 7. Bayes B, Cruz Pastor M, Bonal J et al.homocysteine, C-reactive protein, lipid peroxidation and mortality in haemodialysis patients.nephrol Dial Transplant 2003;18:106-112. 8. Kuroki, T., Isshiki, K., King, G.L.: Oxidative stress: The lead or supporting actor in the pathogenesis of diabetic complications, J. Am. Soc. Nephrol., 2003, 14, S216-S220 9. Lee, H.B., Ha, H., King, G.I.: Reactive oxygen species and diabetic nephropathy, J. Am. Soc. Nephrol., 2003, 14, S209-S210 10. Ueland PM, Refsum H, Stabler SP, et al.: Total Homocysteine in Plasma or serum :Methods and Clinical Application. Clin Chem1993;39:1764-79 11. Velasquez SY, Garcia LF, Alvarez CM.: Regulatory Tcells and their influence in kidney allograft survival, Medicina (B Aires), 2007; 67(5):491-501. 15

12. Martinez-Llordella M, Puig Pey I, Orlando G, et al.: Multiparameter Immune Profiling of Operational Tolerance in Liver Transplantation, American Journal of Transplantation 2007; 7:309 13. Galante NZ, Câmara NO, Kallas EG, Salamaşo R, Pacheco-Silva A, Medina-Pestana JO.: Noninvasive immune monitoring assessed by flowcytometry and real time RT-PCR in urine of renal transplantation recipients, Transplant Immunol 2006; Aug, 16(2):73-80 14. Lyons AB, Parish CR.: Determination of lymphocyte division by flow cytometry, J Immunol Methods 1994; 171:131 15. Benghiat FS, Graca MY, Braun S, Detienne F, Moore S, Buonocore V, Flaman G, Le Moine A.: Critical influence of natural regulatory CD25 + cells in the absence of immunosuppresion, Transplantation 2005; 79:648-654 16. Miyara M and Sakaguchi S.: Natural regulatory Tcells:mechanism of suppresion, Trends Mol. Med 2007; 13:108-116 17. Asiedu CK, Goodwin K, Balgansuren G, Jenkins SM, Le Bas-Bernadet S, Jargal U, et al.: Eleveted Tregulatory cells in long term stable transplant tolerance in rhesus macaques induced by anti- CD3 immunotoxin and deoxyspergualin, J Immunol 2005, 8060-8068 18. Demirkirian A, Hendrikx TK, Baan CC, van der Laan LJ.: Impact of immunosuppressive drugs on CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatory Tcells :does in vitro evidence translate to the clinical setting?, Transplantation 2008; 85:783-789 19. Simone R, Zicca a, Saverino D.: The frequency of regulatory CD3+CD8+CD28-CD25+T lymphocytes in human peripheral blood increases with age.,j Leukoc Biol 2008; 84:1454-1461 20. Wang J, Sim AS, Wang XL, Salonikas C, Moratis M, Naidoo D, Wilken DE.Relation between markers of renal function, coronary risk factors and the occurrence and severity of coronary artery disease.atherosclerosis 2008Apr;197(2):853-9 21. Fisher PA, Dominguez GN, Cuniberti LA, Martinez V, Werba JP, Ramirez AJ, et. al. -Hyperhomocysteinemia induces renal hemodynamic dysfunction :is nitric oxide involved?. J Am. Soc. Nephrol. 2003;14:653-660. 22. El-Ghar S, Qureshi M, Shoker A, Prasad K.Oxidative stress in renal transplant patients who develop cardiovascular disease.journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics2006 Sep;11(3):203-210.) 23. Berberat P. O., Katori M., Kaczmarek E., Anselmi D., Lassman C., Ke B, X. Shen, Busuttil R. W., Yamashita K., Csizmadia E., Tyagi S., Otterben L. E., Brouard S., Tobiasch E., Bach F. H., Kupiec- Weglinski J. W., Soares M. P. Heavy chain ferritin acts as an atiapoptotic gene that protect livers from ischemia reperfusion injury. FASEB Journal 2003. Sep. 17:1724-1726. 16

24. Obeid R, Kuhlmann M, Köhler H, and Herrmann W. Response of homocysteine, cystathionine, and methylmalonic acid to vitamin treatment in dialysis patients. Clin Chem 2005;51:196-201 25. Nguyen-Khoa T, Massy ZA, De Bandt JP, et. al. Oxidative stress and hemodialysis role of inflammation and duration of dialysis treatment. Nephrol Dial Transplant 2001; 16:335-340. 26. Senol E, Ersoy A, Erdinc S, Sarandol E, Yurtkuran M. Oxidative stress and ferritin levels in hemodialysis patients. Nephrol Dial Transplant. 2008;Feb;23(2) :665-72. 17