APRECIERI CANTITATIVE ASUPRA VASCULARIZAŢIEI ÎN MELANOMUL MALIGN CU LOCALIZARE FACIALĂ

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GR. T. POPA IAŞI REZUMAT APRECIERI CANTITATIVE ASUPRA VASCULARIZAŢIEI ÎN MELANOMUL MALIGN CU LOCALIZARE FACIALĂ Conducător Ştiinţific, PROF. DR. FĂTU CONSTANTIN Doctorand, DR. TOADER MIHAELA PAULA IAŞI 2009 0

CUPRINS Introducere 4 Stadiul cunoaşterii Capitolul 1 Elemente de anatomie vasculară cutanată în 9 teritoriul facial 1.1. Vascularizaţia arterială 19 1.2. Vascularizaţia venoasă 20 1.3. Vascularizaţia limfatică 23 Capitolul 2 Melanocitul histo- şi histofiziologie. Procesul de 25 melanogeneză 2.1. Originea melanocitului 25 2.2. Date de histologie şi histofiziologie a 27 melanocitului 2.2.1. Morfologia melanocitului 28 2.2.2. Funcţiile melanocitului 29 2.3. Metode de investigare a melanocitului 33 2.3.1.Tehnici convenţionale 33 2.3.2. Imunohistochimie 33 2.3.3.Electronomicroscopie 34 2.4. Procesul de melanogeneză aspecte 34 normale şi patologice 2.5. Natura chimică a melaninei 36 2.6. Aspecte ale procesului de melanogeneză 36 2.7.Reglarea biosintezei melaninei 39 2.7.1. Tirozinaza 39 2.7.2. L-eritro 5,6,7,8 tetrahidrobiopterin 39 1

(6BH4) 2.7.3. Hormonii melanotropi 40 2.8. Tulburări ale metabolismului melaninei 42 2.8.1. Tulburări caracterizate prin 42 hipopigmentare 2.8.2.Tulburări caracterizate prin 45 hiperpigmentare Capitolul 3 Morfologia tumorilor melanice maligne 47 3.1. Incidenţă şi epidemiologie 47 3.2. Clasificarea tumorilor melanice 48 3.3. Aspecte histopatolgice ale diferitelor tipuri 51 de melanom 3.3.1. Melanomul malign cu extensie 53 superficială 3.3.2. Melanomul nodular 54 3.3.3. Lentigo malign 55 3.3.4. Melanomul lentiginos acral 56 3.3.5. Variante neobişnuite de melanom 57 malign 3.3.5.1. Melanomul 57 desmoplastic şi neurotropic 3.3.5.2. Melanomul dezvoltat 57 pe un nev albastru 3.3.5.3. Melanomul cu celule 58 balonizate 3.3.5.4. Melanomul nevoid 59 3.3.5.5. Melanomul mixoid 59 3.3.5.6. Melanomul cu celule 60 în inel cu pecete 3.3.6. Variante speciale de melanom 60 malign 3.3.6.1. Melanomul copilului 60 3.3.6.2. Melanomul regiunii 61 2

capului 3.3.6.3.Melanomul ochiului 62 3.4. Stadializarea şi prognosticul melanomului 62 malign Capitolul 4 Importanţa investigării angiogenezei în stabilirea prognosticului 67 şi aprecierea agresivităţii 4.1. Factori stimulatori ai angiogenezei 69 4.1.1. Familia liganzilor VEGF 69 4.1.2. FGF bazic (FGF-2) 70 4.1.3. Matricea extracelulară 71 4.1.4. Integrina v 3 71 4.2. Inhibitorii angiogenezei 72 4.2.1. Angiostatina 72 4.2.2. Trombospondina-1 72 4.2.3. EMAP-II 72 4.2.4. Endostatina 73 4.2.5. Infecţia 73 4.2.6. Gena umană CC3 73 4.3. Investigarea angiogenezei în melanomul 73 malign 4.4. Influenţa neovascularizaţiei în 76 managementul pacienţilor cu melanom Contribuţii proprii Capitolul 5 Material şi metode 78 5.1. Prelucrarea statistică 78 5.2. Examenul anatomo-patologic 79 5.2.1. Examenul microscopic clasic 79 5.2.2. Imunohistochimia 81 5.2.3. Studiul morfologic cantitativ 86 3

(morfometria) Capitolul 6 Analiza statistică a cazurilor luate în studiu 89 6.1. Studiul statistic al melanoamelor cutanate 89 6.2. Studiul statistic al melanoamelor feţei 93 Capitolul 7 Aspecte de morfologie şi angiogeneză în M.M. cu 102 localizare facială 7.1. Aspecte de morfologie convenţională 102 7.2. Aspecte ale angiogenezei în tehnica 122 histopatologică convenţională Capitolul 8 Aspecte ale diagnosticului imunohistochimic în M.M. 134 faciale 8.1. Vimentina 134 8.2. Proteina S100 135 8.3. Melan-A 144 Capitolul 9 Aspecte ale microvascularizaţiei tumorale identificate prin IHC şi morfometrie 154 9.1. Aprecierea MVD marcate cu CD31 158 9.2. Studiul microvascularizaţiei tumorale prin marcare 165 cu CD34 9.3. Aprecierea angiogenezei pe dubla colorare 204 CD105+Ki67 9.4. Apreciera limfangiogenezei în melanomul malign al 213 feţei Capitolul 10 Discuţii 221 10.1. Incidenţa melanoamelor cu localizare facială 221 10.2. Factori de prognostic în stadializarea 224 4

melanoamelor faciale 10.3. Evaluarea angio/limfangiogenezei ca factor prognostic şi predictiv 227 Capitolul 11 Concluzii finale 240 Bibliografie 242 5

INTRODUCERE Melanomul malign este o neoplazie care continuă să pună serioase probleme în clinică, metodele curente de diagnostic fiind limitate atât în ceea ce priveşte posibilitatea dignosticului precoce al bolii cât şi a exactităţii predicţiei riscului individualt a progresiei neoplaziei şi a rezultatelor. Metodele de diagnostic şi prognostic pentru detecţia bolii în stadii precoce, care se bazează în principal pe aspectele morfologice microscopice şi adâncimea la care ajunge leziunea, măsurată în milimetri nu sunt suficiente pentru a sprijini cu exactitate evaluarea individuală a a riscului progresiei tumorale (Sekulic şi col., 2008). Rata apariţiei melanomului malign este în continuă creştere riscul de apariţie în timpul vieţii la o persoană de rasă albă a crescut de la 1 la 1500 la începutul secolului trecut până la 1 la 87 la începulul secolului 21 (Bedrosian şi col., 2000). Astfel incidenţa melanomului în multe ţări are o creştere de 3 8% pe an începând cu mijlocul anilor 1960. În ciuda acestei creşteri, rata supraveţuirii a fost semnificativ îmbunătăţită din anii 1960, decesele prin melanom scăzând de la 39% la un nivel actual de 11% (Gremel şi col., 2009), aspecte datorate unei detecţii mai precoce şi a îndepărtării chirurgicale a tumorilor mici. Cu toate acestea, dacă melanomul este diagnosticat în stadii avansate, prognosticul rămâne extrem de nefavorabil, rata supraveţuirii la 5 ani scăzând de la 98% pentru tumorile localizate la 15,5% pentru pacienţii cu metastaze la distanţă (date SEER ale Institului Naţional de Cancer, 2005). Spectrul actual al melanomului malign include două categorii clinice extreme la unul din capetele spectrului se află melanoamele cutanate primare subţiri caracterizate printr-un tratament relativ uniform şi o înaltă rată a vindecării iar la celălalt capăt se află melanoamele metastatice caracterizate printr-un tratament eficace nedovedit cu rezultate slabe (Markovic şi col., 2007). Cu toate că nu este o tumoră exclusiv a pielii, melanomul malign cutanat reprezintă peste 95% din toate melanoamele ce pun serioase probleme de sănătate; peste 55.100 de cazuri noi au fost diagnosticate în 2004 în S.U.A. cu o rată a mortalităţii de 6

aproximativ 14,5% (Talantov şi col., 2005). 10 20% din toate melanoamele cutanate se localizează la nivelul regiunii capului şi gâtului, 47% apărând la faţă. Datele din literatură (Golger şi col., 2007) precizează că sediul anatomic al tumorii este purtător de semnificaţie prognostică, astfel că pacienţii cu tumori ale extremităţiilor au un prognostic semnificativ mai favorabil decât cei cu tumori axiale trunchi, cap şi gât. Cu toate că mulţi clinicieni sunt de acord că melanoamele capului şi gâtului au un prognostic mai defavorabil, factorii care afectează rata mortalităţii sunt încă neclari; identificarea factorilor ce influenţează supraveţuirea pacienţilor cu melanome localizate la cap şi gât, în particular la faţă este necesară în vederea elaborării de strategii preventive şi terapeutice care vor schimba mortalitatea prin această boală. Melanomul malign cutanat este o tumoră cu un important potenţial metastatic, melanomul fiind printre cele mai frecvente cauze de cancer metastatic cu localizare primară necunoscută care poate reflecta fie o înclinaţie în a apărea în sedii neaşteptate de-a lungul căii migratorii a crestei neurale fie o creştere rapidă a leziunilor slab diferenţiate ce apar de la leziuni cutanate primare indolente sau neindentificate (Chin şi col., 2006). În ultimii ani, eforturile specialiştilor s-au focalizat nu numai pe diagnosticul melanomului malign în stadii incipiente dar şi pe identificarea de noi factori de prognostic ai progresiei tumorale precum şi a noilor strategii terapeutice care ar putea îmbunătăţi managementul melanoamelor metastatice. Specialitatea de dermatologie pe care am ales-o m-a făcut să înţeleg că la baza progresiei tumorale în melanom stau o serie de procese tisulare, celulare şi moleculare ce trebuie aprofundate împreună cu specialiştii din morfopatologie, imagistică şi oncologie pentru a găsi noi tehnici de detecţie precoce a formei localizate, formă ce beneficiază cu succes de tratament cu o rată a vindecării de peste 95% (Yuan şi col., 2008). Melanomul odată diagnosticat prezintă un risc crescut de metastazare, tratamentul stadiilor tardive fiind limitat ceea ce face din strategiile de prevenţie cheia succesului în management-ul melanomului malign, unul din cele mai fataliste cancere cutanate. Chemoprevenţia devine astfel una din cele mai 7

bune strategii dar care necesită identificarea biomarkerilor intermediari utili şi a noilor ţinte terapeutice. Indiferent de localizare, prognosticul pacienţilor cu melanom este dependent de stadiul bolii la momentul diagnosticului. Pentru melanomul primar localizat, factorii predictivi ai supraveţuirii includ grosimea leziunii, ulceraţia şi infiltrarea ganglionilor limfatici. Studiile recente s-au concentrat pe investigarea şi a altor factori de prognostic cum ar fi vascularizaţia tumorală, invazia vasculară, rata mitotică, regresia tumorală şi infiltraţia limfocitară. Aspectul vascularizaţiei tumorale în melanomul malign al feţei este unul din factorii de prognostic pe care mi-am propus să-l studiez cunoscând asocierea creşterii gradului de vascularizaţie cu cea a recidivelor dar şi a metastazelor ganglionare sau la distanţă în numeroase tumori solide dar destul de controversat încă în literatură, în melanom. Diferitele definiţii, tehnici şi coloraţii imunohistochimice utilizate în analiza vascularizaţiei melanomului malign precum şi a evaluarii divergente a rezultatelor clinice, uneori pe serii mici au condus la numeroase confuzii privind rolul actual al neoangiogenezei în tumorile melanice. Utilizând densitatea microvasculară ca apreciere a angiogenezei tumorale am analizat implicarea prognostică a acesteia în melanomul feţei prin aplicarea unor tehnici imunohistochimice cu markeri cu înaltă specificitate şi o foarte bună senzitivitate pe vase sanguine şi limfatice cum ar fi: CD31, CD34, CD105, VEGF şi D2-40. De asemenea am studiat rolul mastocitelor, ca celule imune ale gazdei în progresia tumorală prin stimularea extinderii angiogenezei la interfaţa tumoră gazdă. Studiul de faţă îşi propune să aducă noi elemente în înţelegerea reglării procesului de angiogeneză tumorală atât de necesară evaluării prognostice a fiecărui pacient în parte dar şi a eficacităţii noilor terapii ce utilizează agenţi anti-angiogenici în prevenirea creşterii tumorale şi a metastazării precum şi în abilitatea acestora de a menţine tumorile într-un stadiu dormant pentru o lungă perioadă de timp. Asocierea cu terapiile oncologice standard cum ar fi chimioterapia, radioterapia şi/sau chirurgia sporeşte activitatea agenţilotr citotoxici în inhibarea progresiei tumorale şi reducerea 8

dimensiunilor tumorale precum şi în potenţarea efectelor radioterapiei. Lucrarea de faţă este structurată pe două părţi: o parte generală - stadiul cunoaşterii şi o parte personală - contribuţii proprii. În prima parte, structurată pe patru capitole am încercat să realizez o prezentare a datelor teoretice cele mai recente din literatura de specialitate privind subiectul abordat. Primul capitol a fost rezervat aspectelor particulare anatomice ale vascularizaţiei în teritoriul viscerocraniului. Morfologia melanocitului, principalul actor în tumorile melanice precum şi complicatul proces al melanogenezei fac obiectul capitolului doi. Capitolul trei a fost rezervat incidenţei, epidemiologiei, clasificării histologice şi prezentării aspectelor morfologice ale celor mai importante tipuri de melanoame maligne. Aspectele vascularizaţiei în melanoamele maligne, incluse în capitolul patru s-au axat pe prezentarea mecanismele prin care angiogeneza intervine în progresia tumorală, a factorilor reglatori ai angiogenezei şi a metodelor de investigare a angiogenezei asociate melanoamelor. Partea a doua, rezervată contribuţiilor proprii prezintă în capitolul cinci cazuistica utilizată precum şi metodele histopatologice clasice dar şi cele moderne imunohistochimia şi morfometria utilizate în evaluarea angiogenezei. Analiza statistică atât a melanoamelor cutanate cât şi a celor cu localizare facială luate în studiu a făcut obiectul capitolului şase, prelucrarea informatizată a datelor permiţându-ne aprecierea obiectivă a caracteristicilor legate de pacient dar şi de tumoră pe toată perioada studiului. Capitolele şapte, opt şi nouă prezintă rezultatele personale ale studierii aspectelor histopatologice clasice ale tipurilor tumorale şi ale angiogenezei în melanoamele maligne faciale precum şi rezultatele studiului calitativ şi cantitativ al angio/limfangiogenezei în cazurile incluse în lot. Cele 181 de microfotografii, 29 de tabele şi 46 figuri redau sugestiv noutăţile aduse în lucrarea de faţă. 9

Ultimele două capitole au fost destinate discuţiilor rezultatelor obţinute, în paralel cu datele din literatura de specialitate şi concluziilor care relevă importanţa practică a evaluării angio/limfangiogenezei în prognosticul şi predicţia melanoamelor maligne cu localizare facială, atât de necesară în stabilirea tratamentului postoperator. Finalizarea lucrării de faţă se datorează îndrumării competente a PROF. DR. FĂTU CONSTANTIN căruia îi aduc sincere mulţumiri atât pentru încrederea acordată cât şi pentru utilele sfaturi în toţi aceşti ani de pregătire doctorală. Mulţumirile mele se adresează PROF. DR. STAMATE THEODOR, şeful clinicii de Chirurgie Plastică şi Reparatorie a Spitalului Clinic de Urgenţă Sf. Ioan Iaşi prin amabilitatea căruia am utilizat baza de date a clinicii în vederea completării lotului de tumori studiate. Cercetările personale au inclus cazuri de melanoame maligne ale feţei diagnosticate cu acurateţe în serviciile de anatomie patologică şi prosectură din Spitalul Clinic de Urgenţă Sf. Ioan şi Spitalul Clinic de Urgenţă Sf. Spiridon de către specialişti de renume ai vieţii medicale ieşene, PROF. DR. RĂDULESCU DOINIŢA şi DR. FLOREA NICULINA cărora le aduc cele mai alese mulţumiri. Cele mai noi tehnici de investigare a vascularizaţiei tumorale le-am putut aplica în studiul personal prin bunăvoinţa şi competenţa în acest domeniu a PROF. DR. RAICA MARIUS, şeful Departamentului de Histologie din cadrul U.M.F. V. Babeş Timişoara care alături de colaboratorii domniei sale m-a sprijinit în demersul meu de finalizare a cercetărilor privind investigarea angio/limfangiogenezei asociate melanoamelor maligne faciale. Studiul morfometric l-am realizat cu ajutorul DR. CHIRANA ALICE, şefa serviciului de anatomie patologică a Spitalului Clinic de Recuperare şi a INGINER DE SISTEM CHIRANA GHEORGHIŢĂ CORINA cărora le exprim întreaga mea gratitudine. Mulţumesc de asemenea CONF. DR. ŢĂRANU TATIANA, şefa Clinicii de Dermatologie a Spitalului Clinic C.F. Iaşi pentru susţinerea morală în momentele de dificultate inerente ivite pe parcursul acestor ani de 10

cercetări aprofundate într-un domeniu al dermatologiei ce suscită interesul numeroşilor specialişti. Numeroasele obstacole ivite pe parcursul acestor ani le-am depăşit mai uşor datorită persoanelor dragi din FAMILIA MEA care m-au sprijinit şi susţinut necondiţionat până la finalizarea întregii lucrări. Dedic această lucrare memoriei PROF. DR. DOC. DOBRESCU GIOCONDA om de înaltă valoare ştiinţifică şi probitate morală care m-a învăţat că cercetarea ştiinţifică face parte din viaţa fiecărui medic, indiferent de specialitate sau de anii de experienţă. Preţioasele sfaturi şi îndrumări m-au călăuzit pe tot parcursul elaborării acestei lucrări chiar şi după ce n-a mai fost fizic, printre noi. CAPITOLUL 5 MATERIAL ŞI METODE Cercetările personale s-au bazat pe cazurile de melanom malign excizate chirurgical în perioada ianuarie 1998 decembrie 2007 în două spitale ieşene Spitalul Clinic de Urgenţă Sf. Ioan şi Spitalul Clinic de Urgenţă Sf. Spiridon, spitale cu o cazuistică bogată în melanoame cutanate. Studiul retrospectiv a cuprins un număr de 269 melanoame cutanate cu diferite localizări, din care 41 au fost localizate la nivelul feţei, baza de date constituind-o foile de observaţie şi registrele histopatologice din care s-au reţinut datele clinice sex, vârstă, diagnosticul de trimitere, sediul anatomic al tumorii precum şi datele histopatologice aspecte macroscopice şi microscopice cu diagnosticul complet al tipului tumoral şi al stadiului. Un lot restrâns de 14 cazuri de melanom malign al feţei a constituit baza cercetărilor imunohistochimice atât pentru diagnostic, cât şi pentru evaluarea angiogenezei ca factor de prognostic. 5.1. Prelucrarea statistică a datelor a fost realizată cu ajutorul programelor Microsoft Office Excel şi SPSS 17.0. Microsoft Office Excel permite transformarea datelor în informaţii cu ajutorul unor instrumente performante, pentru a analiza, 11

comunica şi partaja datele obţinute. Utilizatorul, cu ajutorul programului Excel 2003 prelucrează date în orice schemă definită cu posibilitatea de a analiza folosind diagrame, tabele sau grafice. SPSS 17.0 (Statistical Program for Social Studies) este un program statistic cu ajutorul căruia s-a realizat prelucrarea datelor clinice generale. Acest program utilizează o serie de mărimi medii (media, mediana şi modulul) precum şi câţiva indicatori ai dispersiei (deviaţia standard şi varianţa). S-au mai utilizat mărimi ca frecvenţa şi procentul simplu, numărându-se atât valorile valide cât şi cele lipsă. 5.2. Examenul anatomo-patologic al pieselor tumorale a fost efectuat în serviciile de anatomie-patologică din cele două spitale. Pentru diagnosticul histopatologic clasic au fost utilizate coloraţia standard (hematoxilină-eozină) dar şi coloraţii speciale pentru diferitele componente celulare şi tisulare. Cercetările imunohistochimice au fost realizate pe 14 cazuri de melanoame maligne cutanate cu localizare facială, toate cazurile fiind în stadii avansate, cu un nivel Clark variind între III şi V. S-a utilizat o serie de markeri pentru identificarea melanocitelor tumorale vimentina, proteina S100 şi Melan-A dar şi a expresiei VEGF în celulele tumorale. Angiogeneza şi limfangiogeneza au fost evaluate cu ajutorul anticorpilor CD-31, CD-34 şi respectiv D2-40. Proliferarea celulelor endoteliale a fost evaluată cu ajutorul endoglinei (CD-105) şi a factorului Ki-67 iar proliferarea mastocitelor cu ajutorul anticorpului monoclonal anti-triptază mastocitară clona AA1. Blocurile de parafină ale celor 14 melanoame maligne au fost prelucrate şi secţionate la microtom (secţiuni de 3 m) în laboratorul Departamentului de Histologie a Universităţii de Medicină şi Farmacie Victor Babeş, Timişoara, utilizându-se sistemul LSAB+ (Labelled Streptavidin-Biotin+) sau ENVISION; toate lamele au fost procesate automat utilizând Dako Cytomation Autostainer; rezultatele coloraţiilor imunohistochimice au fost evaluate şi interpretate în colaborare cu Prof. Dr. Marius Raica şi Şef. Lucrări Dr. Anca Câmpean. 12

Parametrii de lucru al anticorpilor utilizaţi, sursa DAKO GOLSTRUP DENMARK sunt redaţi în tabelul numărul 3. Studiul microscopic cantitativ (morfometric) a urmărit cuantificarea angiogenezei tumorale şi peritumorale prin măsurarea densităţii microvasculare (MVD) cu ajutorul metodei hot spot precum şi a unor parametri vasculari cum ar fi aria vasculară, raportul faţă de aria totală a câmpului şi perimetrul vaselor cu ajutorul programului computerizat NIS-Elements de la firma Nikon. Prelucrarea datelor pentru ambele tipuri de măsurători s-a realizat computerizat în MS Excel, rezultatele fiind sistematizate în tabele şi evaluate statistic. Ac. Clona Diluţi DemascareTimp Sistem Cromogen/ primar incubar lucru control VEGF(AVG1 1:25 MW, 15, 30, LSAB+ DAB /AEC ph înalt RT HRP ţes.renal N Vimenti V9 RTU MW, 5 30, RT LSAB+ HRP DAB /AEC ţes.conj.perivas. S100 Policl. RTU MW, 5 30,RT LSAB+ DAB/ţes. adipos Melan A A103 1:25 MW, 30, 30, citrat, ph6 RT LSAB+ DAB CD31 JC70A RTU MW, 30, 30, citrat, ph6 RT LSAB+ AEC/DAB cel. endoteliale CD34 QBENDRTU MW, 30, 30, LSAB+ DAB/cel.endot. 10 citrat, ph6 RT fibroblaste CD105 SN6h 1:25 RT, 15, 60, LSAB+ DAB proteinază RT limfocite reactiv D2-40 D2-40 RTU MW, 30, 30, RTLSAB+ DAB/cel.bazale citrat, ph6 epidermice Ki67 MIB-1 RTU MW, 30, 30, RTLSAB+ AEC/cel. bazale citrat, ph6 epidermice SMAct. 1A4 RTU MW, 5, citrate, ph 30, RTLSAB+ AEC/cel. musc. netede perivas. MCT AA1 1:200 MW, 30, 30, RTLSAB+ AEC/mastocit citrat, ph6 intraepitelial Tabel nr. 3 Parametrii de lucru utilizaţi (MW- microunde, RTU gata preparate, RT temperatura camerei) 13

CAPITOLUL 6 ANALIZA STATISTICĂ A CAZURILOR LUATE ÎN STUDIU 6. 1. Studiul statistic al melanoamelor maligne cutanate În perioada 1998 2007 (10 ani) în serviciile de anatomie patologică a celor două spitale au fost diagnosticate histopatologic un număr de 269 de melanoame maligne cutanate, distribuţia pe fiecare an fiind redată în figura nr. 9. Dacă în primii ani frecvenţa melanoamelor maligne cutanate a variat între 20 şi 28 de cazuri anual cu un minim de 18 cazuri în anul 2002, în ultimii ani ai studiului numărul de cazuri diagnosticate şi tratate chirurgical a crescut constant cu un maxim de 37 cazuri în anul 2007, demonstrând o creştere a incidenţei melanoamelor cutanate în perioada de timp studiată. Figura nr. 9 Reprezentarea grafică a distribuţiei cazurilor de M.M. cutanat pe ani Analiza frecvenţei procentuale a cazurilor de melanoame pe grupe de vârstă figura nr. 10 evidenţiază un procent de peste 60% din cazuri la persoane între 40 şi 79 de ani, 46% din cazuri afectând adulţii în plină activitate profesională. Adulţii tineri sunt afectaţi în proporţie de 11% iar personele peste 70 de ani în proporţie de 25%. Frecvenţa cea mai mare a melanoamelor cutanate a fost întâlnită în a şasea decadă de viaţă, peste un sfert din cazuri (26%) afectând persoanele cu vârste cuprinse între 50 şi 59 de ani. 14

Figura nr. 10 Reprezentarea grafică a frecvenţei cazurilor de M.M. cutanat pe grupe de vârstă Repartiţia pe sexe a cazurilor de melanoame maligne cutanate este redată grafic în figura nr. 11. Frecvenţa de apariţie este aproximativ egală la cele două sexe, sexul feminin fiind mai afectat, în proporţie de 55%, adresabilitatea mai bună fiind principala cauză a preponderenţei melanoamelor la persoanele de sex feminin. Figura nr. 11 Reprezentarea grafică a repartiţiei M.M. cutanate pe sexe Analiza frecvenţei localizărilor melanoamelor maligne a arătat o frecvenţă mare a afectării regiunii trunchiului (42%) din care regiunea toracală dorsală a reprezentat 28% din cazuri, urmată de o frecvenţă de 28% din localizări la nivelul extremităţilor inferioare. 15

Figura nr. 12 Reprezentarea grafică a distribuţiei cazurilor de M.M. în funcţie de localizare Faţa a fost afectată în 15% din totalul cazurilor de melanom malign cutanat figura nr. 12. Distribuţia localizărilor cazurilor de melanoame maligne cutanate la cele două sexe este redată grafic în figura nr. 13. Membrele inferioare şi faţa sunt regiunile cele mai afectate la femei iar toracele şi abdomenul sunt localizările cele mai frecvente ale melanoamelor la bărbaţi. Figura nr. 13 Reprezentarea grafică a localizărilor melanoamelor la cele două sexe 16

6.2. Studiul statistic al melanoamelor maligne cu localizare facială Studiul de faţă s-a axat pe evaluarea angiogenezei calitative şi cantitative a melanoamelor cutanate cu localizare facială, localizare ce a fost întânită la 41 de cazuri, reprezentând 15% din totalul cazurilor de melanoame maligne cutanate studiate. Reprezentarea grafică a distribuţiei pe ani a cazurilor de melanom cu localizare facială figura nr. 17 evidenţiază existenţa unui platou de creştere în prima jumătate a perioadei de timp studiate cu două vârfuri de incidenţă, 2004 şi respectiv 2007 în a doua jumătate a perioadei analizate. Figura nr. 17 Reprezentarea grafică a distribuţiei pe ani a M.M. cutanate ale feţei Frecvenţa procentuală a cazurilor de melanom malign al feţei pe vârste este sugestiv redată în figura nr. 18. Analiza statistică a arătat că peste jumătate din cazuri (59%) au afectat pacienţi cu vârste 70 de ani, peste un sfert din cazuri (29%) afectând pacienţii din a 9-a decadă de viaţă. Frecvenţa procentuală a melanoamelor maligne cu localizare facială pe sexe este redată sugestiv în figura nr. 20 sexul feminin fiind cel mai frecvent afectat, raportul M/F = 1/1,7, ceea ce denotă o mai mare adresabilitate la medic a pacientelor cu leziuni pigmentare la nivelul feţei, leziuni ce afectează aspectul estetic al acestora. 17

Figura nr. 18 Frecvenţa cazurilor de M.M. al feţei pe grupe de vârstă Figura nr. 20 Reprezentarea grafică a frecvenţei procentuale a M.M. al feţei pe sexe Din punct de vedere histopatologic, melanoamele maligne ale feţei au prezentat două tipuri melanomul malign extensiv în suprafaţă (17%) şi un tip cu creştere verticală, melanomul malign nodular (83%). Distribuţia nivelului Clark al melanoamelor maligne pe grupe de vârstă este redată grafic, în figura nr. 23. Melanoamele cu nivele Clark III şi IV au fost cele mai frecvente, 12 şi respectiv 19 cazuri, majoritatea fiind la pacienţi peste 60 de ani cu excepţia a unui singur caz de melanom malign Clark III la grupa de vârstă 20 29 ani. Un 18

număr egal de cazuri (5) au prezentat nivele Clark II sau V, ultimele fiind apanajul pacienţilor cu vârste peste 60 de ani, mai numeroase la femei, pentru ca cele cu nivel Clark V să fie mai multe la bărbaţi. Figura nr. 23 Reprezentarea grafică a repartiţiei M.M. ale feţei pe grupe de vârstă şi nivele de invazie Reprezentarea grafică a distribuţiei cazurilor de melanom malign în funcţie de sex şi nivelul de invazie Clark este sugestiv prezentată în figura nr. 24. Tumorile cu nivele Clark I şi II sunt relativ egal distribuite la ambele sexe, cele cu nivele Clark III şi IV predomină la femei iar cele cu nivel Clark V la bărbaţi. Figura nr. 24 Reprezentarea grafică a distribuţiei M.M. ale feţei pe sexe şi nivele de invazie 19

CAPITOLUL 7 ASPECTE DE MORFOLOGIE ŞI ANGIOGENEZĂ ÎN MELANOAMELE MALIGNE CU LOCALIZARE FACIALĂ Un lot de 14 melanoame ale feţei a constituit baza cercetărilor imunohistochimice întreprinse pentru evidenţierea melanocitelor tumorale dar mai ales pentru evaluarea angiogenezei ca factor prognostic şi predictiv. Studiul morfometric al angiogenezei vine să aducă un plus de acurateţe evaluării gradului de vascularizaţie tumorală în stabilirea unui prognostic rapid pentru fiecare caz. 7.2. Aspectele angiogenezei în tehnica histopatologică clasică evidenţiază diferenţe calitative şi cantitative ale vascularizaţiei între ariile peritumorale şi cele intratumorale. Ariile peritumorale din melanomul malign prezintă numeroase vase dilatate de mărimi şi forme diferite cu perete subţire (microfotografia nr. 40). Microfoto nr. 40 Col. H&E 10x M.M. nodular, Clark III vase dilatate peritumoral şi vase mici adiacente Vasele de la baza tumorii pot fi mari sau mici şi neregulate în zonele cele mai groase ale tumorilor din faza de creştere verticală şi în zonele cu bogat infiltrat limfocitar. Aceste vase pot prezenta un 20

diametru de 3 până la 4 ori mai mare decât vasele normale microfotografia nr. 41. Microfoto nr. 41 Col. H&E, 10x M.M. nodular acromic, Clark IV vase dilatate peritumoral Microfoto nr. 42 Col. H&E 10x M.M. extensiv în suprafaţă vase sinuoase cu lumen neregulat Vasele intratumorale, prezente atât în zonele superficiale ale tumorii cât şi în masele profunde din derm evidenţiază aspecte 21

eterogene: în zonele superficiale ale tumorii vasele sanguine pot fi sinuoase cu lumen neregulat (microfotografia nr. 42) sau mici şi dilatate dispuse atât printe celulele tumorale cât şi printre limfocitele ce infiltrează tumora (microfotografia nr. 44). Microfoto nr. 44 Col. H&E 10x M.M. nodular ulcerat grupuri de vase mici cu lumen larg Microfoto nr. 46 Col. H&E 10x M.M. nodular ulcerat, Clark IV vase mature intratumorale 22

Intratumoral, pe lângă vase mature cu medie groasă (microfotografia nr. 46) apar şi vase dilatate cu perete subţire sau cu lumenul colabat. Poziţionarea vaselor a fost variată: în septurile ce despart masele tumorale, în infiltratul limfocitar intratumoral precum şi printre melanocite tumorale, unele încărcate cu pigment melanic. CAPITOLUL 8 ASPECTE ALE DIAGNOSTICULUI IMUNOHISTOCHIMIC ÎN MELANOAMELE MALIGNE FACIALE Melanomul malign prezintă trăsături clinice şi citomorfologige diverse, cazurile înalt nediferenţiate fiind greu de recunoscut, mai ales cele lipsite de pigment melanic. Atât pentru tumorile nediferenţiate cât şi pentru tumorile melanice acromice diagnosticul pozitiv de certitudine necesită coloraţii imunohistochimice în diferenţierea melanoamelor de alte tumori. Pentru orice studiu corect al melanoamelor malige recunoaşterea celulelor din linia melanocitară este necesară, markerii melanocitari cei mai utilizaţi fiind S100, HMB-45, Mart-1/Melan-A, MiTF (microphthalmia transcription factor), vimentina, tirozinaza. etc. În studiul de faţă, pentru cele 14 cazuri de melanom malign al feţei s-au utilizat trei markeri ce indică diferenţierea melanocitară manifestată prin semne ale sintezei de melanină. Acest panel de markeri face posibilă diferenţierea melanomelor de carcinoamele slab diferenţiate, sarcoame sau limfoame. Vimentina, un filament intermediar asociat frecvent cu ţesuturile mezenchimale a fost exprimat în toate cazurile de melanom cercetate, vizualizarea realizându-se fie cu DAB (coloraţie citoplasmatică brună) fie cu AEC (coloraţie citoplasmatică roşie). Melanoamele, spre deosebire de carcinoame exprimă vimentina, pozitivitatea fiind prezentă atât în celulele tumorale poliedrice (microfotografia nr. 57), fusiforme sau gigante. Vimentina a fost exprimată atât în melanoamele în faza de creştere radială melanomul cu extensie superficială (microfotografia nr. 57) cât şi în faza de creştere verticală 23

melanomul nodular; pozitivitatea a fost prezentă în melanocitele şi melanofagele tumorilor pigmentare dar şi în melanocitele tumorilor acromice. Microfoto nr. 57 Col. IHC 10x (AEC)M.M. extensiv în suprafaţă vimentină + în celulele tumorale şi în celulele endoteliale sau conjunctive Proteina S100 a fost intens pozitivă în toate cazurile studiate atât citoplasmatic cât şi nuclear. Intensitatea coloraţiei nu este dependentă de tipul histopatologic al melanomului, tipul celular sau prezenţa sau nu a pigmentului melanic (microfotografia nr. 69 ), nucleii fiind mai intens coloraţi. Deşi S100 este un marker sensibil în melanom dat fiind reacţia pozitivă în toate celulele tumorale, reacţia este nespecifică colorând şi alte structuri cum ar fi fibrele nervoase sau celulele Langerhans din epiteliu. Melan-A(Mart-1) este un antigen iniţial recunoscut de de celulele T la pacienţii cu melanom, fiind asociat, la fel ca HMB-45 cu aparatul pigmentar. Sensibilitatea recunoscută, mai mare decât cea a HMB-45 a fost bine demonstrată atât în melanoamele cutanate cât şi în metastaze. Melan-A este considerat un marker puternic al melanocitelor şi nu al melanoamelor fiind prezent perivascular şi în 24

tumorile cu celulele epiteloide având o specificitate similară cu cea a HMB-45 dar o sensibilitate uneori mai mare fiind utilizat în asociere cu alţi markeri melanocitari mai noi cum ar fi tirozinaza, care are o sensibilitate şi specificitate asemănătoare HMB-45 şi Melan-A, putând fi pozitivă în unele melanoame negative la aceşti markeri. Microfoto nr.69 Col. IHC 20x (DAB) M.M. nodular acromic S100 intens pozitiv în toate celulele tumorale Microfoto nr. 76 Col. IHC 10x (DAB) M.M. cutanat nodular Melan-A+ cu model de distribuţie difuz în toate celulele tumorale poligonale şi mici 25

În cazuistica noastră reactivitatea anticorpului Melan-A a fost eterogenă cu diferite grade de intensitate ale coloraţiei, proporţia celulelor pozitive variind de la caz la caz şi de la o zonă la alta în cadrul aceleiaşi tumori (microfotografia nr. 76). Expresia Melan-A a prezentat aspecte diferite mergând de la modelul de distribuţie difuz (microfotografia nr. 76) sau fusiform, colorat omogen la aspectele eterogene cu pozitivitate focală, reacţia fiind mai intensă în celulele tumorale din jurul insulelor mici de stromă tumorală. Datorită specificităţii mari pentru melanocitele tumorale s-au evidenţiat chiar şi celulele maligne prezente în vasele limfatice, având astfel, posibilitatea detectării emboliilor tumorale. CAPITOLUL 9 ASPECTE ALE MICROVASCULARIZAŢIEI TUMORALE IDENTIFICATE PRIN IMUNOHISTOCHIMIE ŞI MORFOMETRIE În pielea normală, liniştea vasculară este menţinută prin influenţa dominantă a inhibitorilor endogeni ai angiogenezei pe când angiogeneza este indusă prin secreţia crescută a factorilor angiogenici şi/sau prin reglarea în minus a inhibitorilor angiogenezei. Factorul major al reglării angiogenezei în piele este factorul de creştere a endoteliului vascular VEGF, care in vivo creşte permeabilitatea vasculară şi angiogeneza. În studiul de faţă am evaluat expresia VEGF (VEGF-A) ca principal factor reglator al angiogenezei secretat atât de celulele tumorale cât şi de celulele gazdei, creşterea expresiei acestui marker fiind asociată tumorilor în faza de creştere verticală. În lotul de tumori studiate intensitatea reacţiei a prezentat aspecte ce a mers de la slab la puternic (microfotografia nr. 93), procentul celulelor tumorale pozitive fiind cuprins între 15 30%, expresia VEGF fiind considerată moderată pentru majoritatea cazurilor tumorale (microfotografia nr. 94). Pentru evaluarea angiogenezei în lotul de melanoame studiate s-au aplicat metode morfemetrice pe coloraţii imunohistochimice care să pună în evidenţă mai bine vasele peri- şi intratumorale, sanguine sau limfatice. 26

Microfoto nr. 93 - Col. IHC 20x (AEC) M.M. nodular, Clark III celule tumorale cu intensitate puternică a VEGF Microfoto nr. 94 Col. IHC 10x (AEC) M.M. nodular, Clark V VEGF+ în celulele tumorale dispuse perivascular 9.1. Aprecierea microdensităţii vasculare (MVD) marcate cu CD31 a fost realizată pe cele 14 cazuri de melanoame maligne invazive ale feţei, cu nivel Clark cuprins între III şi V; pacienţii au avut vârste cuprinse între 38 şi 85 ani, 6 fiind femei iar 8 bărbaţi. 27

Vasele sanguine prezente în ariile peritumorale sunt mari, cu perete subţire, regulat, limitate de celule endoteliale pozitive la CD31 sau vase uşor dilatate în ţesutul conjunctiv ce separă nodulii tumorali (microfotografia nr. 102). Microfoto nr. 102 Col. IHC 20x (AEC) M.M. nodular, Clark III vase CD31+ de dimensiuni medii în septuri Microfoto nr. 104 Col. IHC 40x (AEC) M.M. nodular, Clark V vase sinuoase, cu perete neregulat CD31+ 28

Intratumoral, vasele prezintă aspecte eterogene: vase sub formă de cordoane cu lumen colabat, vase sinuoase cu lumen neregulat (microfotografiile nr. 104 şi 106) precum şi vase mici de neoformaţie, sinuoase cu dispoziţie tortuoasă (microfotografia nr. 106). Microfoto nr. 106 Col. IHC 20x (AEC) M.M. nodular Clark IV vase intratumoral CD31+ cu aspecte diverse: vase mari, dilatate şi vase mici cu lumen colabat Morfometric, evaluarea densităţii microvasculare (MVD) a fost realizată cu ajutorul metodei hot spot în ţesutul normal, peritumoral şi intratumoral la toate cazurile din lot. Valorile maxime, minime şi medii ale numărului de vase din ariile normale, peritumorale şi intratumorale sunt prezentate în tabelul nr. 11. Numărul Normal Peritumoral Intratumoral vaselor Minim 10,65 24,92 12,98 Maxim 14,41 38,23 21,76 Mediu 12,53 31,57 17,37 Tabel nr. 11 Valorile minime maxime şi medii al numărului vaselor în lotul studiat 29

În ţesutul normal densitatea medie a fost de 12,53 pe câmp cu o creştere a MVD în ariile peritumorale, media fiind de 31, 57 vase/câmp. În ariile cu bogat infiltrat inflamator s-a remarcat o creştere a numărului de vase, maximum fiind de 38,23/câmp. Angiogeneza intratumorală evaluată prin MVD a arătat valori mai mari comparativ cu cele din ţesutul normal (17,37 faţă de 12,53), sporirea numărului fiind moderată în raport cu zonele peritumorale aspecte ce sunt semnificativ redate în figura nr. 27. Figura nr. 27 Reprezentarea grafică a valorilor MVD (CD31) perişi intratumoral comparativ cu ţesutul normal 9.2. Studiul calitativ şi cantitativ al microvascularizaţiei tumorale prin marcare cu CD34 a urmărit evidenţierea tipului vaselor şi a gradului vascularizaţiei tumorale prin dubla colorare CD34 - actină (specifică mulşchiului neted) precum şi aprecierea densităţii microvasculare şi a mastocitelor prin dubla colorare anti CD34 - antitriptază mastocitară; pe aceeaşi coloraţie s-a evaluat aria vasculară şi raportul aria vasculară/aria tumorală sau peritumorală. Analiza imunohistochimică ne-a permis să stabilim tipul vaselor peri- şi intratumorale la cazurile studiate, evidenţiindu-se toate cele trei tipuri: imature (CD34+/actină-), intermediare (CD34+/actină-) şi mature (CD34+/actină+). Intratumoral, în cazurile studiate au predominat vasele imature şi/sau intermediare 30

microfotografiile nr. 112 şi 118. Intratumoral, pe lângă vase mature mari, dilatate s-au evidenţiat şi vase cu lumen colabat sau vase mici alături de alte tipuri vasculare (microfotografia nr. 125). Microfoto nr. 112 Col. IHC 10x M.M. cutanat cordoane vasculare neregulate CD34+/actină Microfoto nr. 118 Col. IHC 10xM.M. cutanat vase intermediare cu lumen larg CD34+/actină- dispuse intratumoral 31

Microfoto nr. 125 Col. IHC 20x M.M. cutanat vase de diferite tipuri dispuse intratumoral Analiza microscopică cantitativă a angiogenezei a vizat estimarea densităţii microvasculare şi a densităţii celulelor mastocitare din stromă considerate ca principali promotori ai angiogenezei. S-a utilizat dubla colorare imunohistochimică cu anticorp anti-cd34 şi anti-triptază mastocitară în vederea determinării densităţii vasculare (celule endoteliale pozitive pentru CD34 colorare în brun) şi numărul mastocitelor (pozitive MCT colorare în roşu). Lotul studiat a cuprins 14 cazuri de melanoame primare avansate ale feţei gradate conform nivelului Clark al invaziei: Clark V (2 cazuri), Clark IV (6 cazuri) şi Clark III (6 cazuri); pacienţii au avut o medie de vârstă de 71,78 ani (38 85 ani), 8 fiind bărbaţi iar 6 femei. La acelaşi lot au fost evaluate ariile vasculare în ariile peritumorale şi intratumorale precum şi raportul dintre aria vasculară şi aria totală a câmpului utilizând un program morfometric NIS- Elements Documentation. În ţesutul normal adiacent tumorii s-au remarcat vase sanguine în număr redus (9,87+/- 4.54/câmp) cu lumen regulat şi perete relativ subţire limitat de celule endoteliale pozitive pentru CD34+ (maron). Mastocitele au fost prezente predominant în derm 32

cu o dispoziţie în jurul vaselor de sânge dar şi în jurul structurilor anexiale. Valoarea medie a densităţii mastocitare în derm a fost de 24,314+/- 12,27/câmp (coloraţie roşie). În ariile peritumorale s-a observat o creştere semnificativă atât a numărului de vase (25,00 +/- 9,03/câmp) cât şi a mastocitelor (33,84 +/- 12,72) densitatea variind însă de la tumoră la tumoră.componenta peritumorală a tumorilor studiate a fost caracterizată printr-o densitate vasculară redusă cu vase mici şi mari dilatate cu endoteliu bine marcat şi mastocite de dimensiuni mai mari decât cele din ţesuturile normale. Număr crescut de mastocite a fost observat în zonele peritumorale cu bogat infiltrat inflamator (microfotografia nr. 142) cu aglomerarea la periferia infiltratului. În ariile de la periferia tumorilor vasele sunt fie mari şi cu lumen dilatat înconjurate de un număr variabil de mastocite (microfotografia 147) fie mici cu perete subţire, neregulat cu lumene moderat dilatate până la colabate. Microfotografia nr. 142 Col. IHC 10xM.M. nodular, Clark IV infiltrat inflamator peritumoral cu numeroase vase şi mastocite CD34+/MCT+ Intratumoral, atât vasele cât şi mastocitele sunt relativ reduse ca număr comparativ cu ariile peritumorale (17,0214 +/- 6,8 33

respectiv 7,74 +/- 10,97) dar mai multe faţă de zonele normale microfotografia nr. 149. Microfoto nr. 147 Col. IHC 20x M.M. nodular, Clark IV - vase mari, dilatate dispuse peritumoral (CD34+) Microfoto nr.149 Col. IHC 20x M.M. nodular, Clark V vase (CD34+) şi mastocite (MCT+) reduse ca număr Vasele intratumorale prezintă aspecte eterogene: mici, cu lumen îngust şi perete neregulat cu numeroase ramificaţii sau mature, 34

dilatate unele prezentând celule tumorale în lumen sau simple cordoane de celule endoteliale. În ariile intratumorale, mastocitele de dimensiuni mari au fost în număr scăzut dispuse perivascular (microfotografia nr. 163) sau în contact direct cu celulele endoteliale. Microfoto nr. 163 Col. IHC 40x M.M. nodular, Clark V mastocite aglomerate în jurul vaselor mari Calcularea valorilor minime, maxime şi medii pe totatul cazurilor studiate a relevat o creştere semnificativă a numărului de vase şi mastocite în ariile peritumorale comparativ cu ariile intratumorale sau normale tabelul nr. 13 şi figura nr. 28. Normal Peritumoral Intratumoral Minim 9,250 21,923 11,928 Vase Maxim 13,416 32,233 19,785 Medie 11,525 26,920 17,020 MVD Mediana 9.87+/-4.54 25.00+/-9.03 17.02+/-6.8 Masto cite Minim 22,916 29,076 5,350 Maxim 33,333 42,615 11 Medie 28,360 36,446 7,74 MCD Mediana 24.31+/-12.27 33.84+/-12.72 7.74+/-10.97 Tabel nr. 13 Valorile minime, maxime şi medii pe totalul cazurilor studiate ale vaselor şi mastocitelor în cele trei zone 35

Figura nr. 28 Variaţia numărului de vase şi mastocite în cele trei zone diferite în lotul de tumori studiate Valorile ariilor vasculare şi procentul din aria totală a câmpului examinat au fost mai mari în zonele peritumorale comparativ cu cele intratumorale indiferent de nivelul de invazie (nivelul Clark) al melanoamelor maligne figura numărul 30. Figura nr. 30 Reprezentarea grafică a valorilor ariilor pe nivele Clark 36

9.3. Aprecierea calitativă şi cantitativă a angiogenezei pe dubla colorare CD105 + Ki67 s-a realizat pe acelaşi lot de melanoame maligne, studiul morfometric urmărind măsurarea ariilor vasculare peritumorale şi intratumorale. În urma prelucrării imaginilor digitale din ariile peritumorale şi intratumorale a cazurilor studiate s-au calculat valorile medii ale ariilor minime, maxime şi medii în m 2 precum şi media raportului dintre aria vasculară şi aria totală a câmpului examinat tabelul nr. 22 şi figura 37. Figura nr. 37 Valorile ariilor vasculare şi procentul ariei vasculare din aria totală a câmpului examinat (CD105 + Ki67) Ariile vaselor peritumorale au fost mai mari decât cele intratumorale, cu diferenţe semnificativ mai mari pentru valorile maxime ale ariilor vasculare măsurate. Peritumoral s-au observat vase mari cu perete relativ regulat şi lumene variate de la largi la colabate, vase pozitive la CD105 cu activitate proliferativă redusă (Ki-67 negativ); angiogeneza crescută este legată de infiltratul inflamator bogat şi de cantitatea de pigment melanic microfotografia nr. 166. Intratumoral, vasele CD105 sunt de mărimi diferite, de la de la mari cu lumen dilatat la mici cu lumen îngust sau chiar colabat, intensitatea reacţiei fiind moderată microfotografia nr. 167, procentul ariei vasculare fiind de doar 0,29% din aria totală a câmpului examinat. 37

Microfoto nr. 166 Col. IHC 20x M.M. nodular, Clark III vase CD105+ dispuse peritumoral Microfoto nr. 167 Col. IHC 20x M.M. nodular, Clark III vase CD105+ dispuse intratumoral 9.4. Aprecierea calitativă şi cantitativă a limfangiogenezei în melanomul malign al feţei a fost realizată utilizând un anticorp monoclonal recent descoperit, D2-40 care reacţionează specific cu un epitop rezistent la fixare de pe endoteliul limfatic. 38

Peritumoral, vasele limfatice evidenţiate prin pozitivare la D2-40 (colorare brună a endoteliului) au prezentat perete subţire, neregulat, în general cu lumene dilatate dispuse în plin proces inflamator alături de vasele de sânge negative D2-40 (microfotografia nr. 172). Microfoto nr. 172 Col. IHC 20x M.M. nodular acromic, Clark IV peritumoral, vase limfatice D2-40+ alături de vase sanguine Microfoto nr. 181 Col. IHC 20x.M. cutanat, Clark IV vase limfatice D2-40+ dispuse intratumoral. 39

Intratumoral, vasele limfatice sunt mici, neregulate cu pereţi proeminenţi şi lumen îngust sau chiar colabat (microfotografia nr.181). Numărul vaselor limfatice intratumoral este mai mic decât a celor dispuse peritumoral, majoritatea fiind localizate la marginea nodulilor tumorali sau printre insulele tumorale, rar în plină masă tumorală, printre celulele tumorale. Studiul morfometric a constat în determinarea densităţii vaselor limfatice prin metoda hot spot precum şi a ariilor vaselor limfatice şi a raportului dintre aria vasculară şi aria totală a câmpului examinat în cele două ari cu ajutorul programului NIS-Elements de la Nikon. Densitatea limfovasculară a fost semnificativ mai crescută în regiunile peritumorale comparativ cu cele intratumorale, valoarea medie a ariei peritumorale sau intratumorale ocupată de vasele limfatice fiind aproximativ egală, cu un procent din aria câmpului uşor crescut în zona peritumorală. Densitatea microvasculară (măsurată pe vase CD34+) este net mai mare decât cea limfovasculară în ambele zone ale melanoamelor în timp ce aria limfovasculară (valoarea medie) este uşor mai mare decât media ariei vaselor sanguine atât peritumoral cât şi intratumoral tabelul nr. 29 şi figura nr. 44. Figura nr. 44 - Reprezentarea grafică a trăsăturilor morfometrice a celor două tipuri de vase 40

DISCUŢII În acest capitol am abordat incidenţa melanoamelor cu localizare facială în cadrul melanoamelor maligne cutanate, factorii de prognostic în stadializarea melanoamelor maligne ale feţei şi aspecte ale evaluării angi/limfangiogenezei ca factor prognostic şi predictiv în aceste tumori cu rată mară a mortalităţii. CONCLUZII FINALE 1. În perioada ianuarie 1998-decembrie 2007 (10 ani) au fost excizate chirurgical şi diagnosticate anatomo-patologic 269 melanoame maligne cutanate primitive în 2 spitale clinice ieşene. 2. În această perioadă melanoamele maligne cu localizare facială au reprezentat 15% din totalul MM cutanate (41 cazuri). 3. Numărul de cazuri/an de melanoame maligne ale feţei a crescut relativ constant pe toată perioada studiului, în concordanţă cu creşterea incidenţei cazurilor de melanoame cutanate. 4. În timp ce melanoamele maligne cutanate, în general au afectat toate grupele de vârstă cu un vârf al incidenţei între 50-59 ani, cele cu localizare faciale au predominat la vârste peste 60 ani (75% din cazuri). 5. Repartiţia pe sexe a melanoamelor maligne faciale a relevat o predominenţă a sexului feminin (raport F:B = 1,7:1). 6. La cazurile studiate tipurile histopatologice au fost: melanom malign nodular (83%) şi melanom malign extensiv în suprafaţă (17%). 7. Stabilirea stadiului tumorii a ţinut cont de nivelul de invazie Clark, fiind întâlnite tumori cu diferite nivele de la Clark I la Clark V. 8. Melanoamele maligne faciale invazive (Clark III, IV) au fost cele mai frecvente, afectând predominant sexul feminin şi grupele de vârstă peste 60 ani. 9. Diagnosticul histopatologic clasic a evidenţiat arhitectura şi citologia, caracteristicele tipurilor anatomo-patologicefiind în concordanţă cu literatura de specialitate. 41

10. Pattern-ul citologic dominant a fost cel epitelioid şi cel mixt (epitelioid şi fusiform). 11. Diagnosticul de certitudine al diferenţierii melanocitare a fost realizat cu ajutorul unui panel de markeri: vimentina, proteina S100, Melan-A (Mart-1). 12. Din ce în ce mai mult discutată ca potenţial factor de prognostic, vascularizaţia tumorală a constituit obiectul analizei amănunţite a unui lot de 14 melanoame maligne ale feţei. 13. Studiul histopatologic clasic a evidenţiat o bogată vascularizaţie peritumorală, la baza tumorii sau în zonele cu bogat infiltrat inflamator; structurile vasculare mari, dilatate, cu perete subţire au dominat regiunile peritumorale în timp ce vascularizaţia intratumorală a fost caracterizată de aspecte eterogene. 14. Studiul modern imunohistochimic şi morfometric al angiogenezei tumorale a constituit baza cercetărilor personale în vederea aprecierii concordanţei gradului de vascularizaţie cu progresia tumorală. 15. Analiza expresiei VEGF-A ca principal factor reglator al angiogenezei a arătat o pozitivitate moderată în cazurile incluse în studiu. 16. Pentru studiul calitativ al vascularizaţiei tumorale am utilizat markeri specifici pentru endoteliul vaselor sanguine (CD31, CD34, CD105) şi pentru vasele limfatice (D2-40). 17. Pentru o mai corectă apreciere studiul cantitativ al vascularizaţiei tumorale a fost realizat pe marcaj endotelial imunohistochimic specific celor 2 categorii de vase. 18. Densitatea microvasculară determinată pe vase sanguine CD31 pozitive a arătat un număr crescut în zonele peritumorale (31,57 vase/câmp) comparativ cu zonele peritumorale (17,37 vase/câmp) şi cu ţesutul normal (12,53 vase/câmp). 19. Numărul vaselor şi mărimea ariilor vasculare determinate pe vase CD34 pozitive au fost semnificativ crescute în zonele peritumorale comparativ cu cele intratumorale, fapt ce s-a corelat cu nivelul de invazie în derm. 20. Asocierea actinei la CD34 ne-a oferit posibilitatea evidenţierii tipurilor de vase sanguine: imature, intermediare, mature; 42

în ariile peritumorale au predominat vasele mature, pe când intratumoral au fost prezente toate cele 3 tipuri. 21. Asocierea Ac antitriptază mastocitară la CD34 ne-a permis corelarea valorilor microdensităţii vasculare şi densităţii mastocitare în cele 2 zone analizate (peri- şi intratumoral) demonstrând creşteri sinergice ale numărului de vase şi mastocite, elemente fundamental implicate în progresia tumorală. 22. Aria vasculară totală şi aria vasculară procentuală calculate pentru vase CD105 pozitive au prezentat valori maxime semnificativ mai mari în zonele peritumorale, corelate cu prezenţa de vase dilatate cu pereţi subţiri faţă de vasele mici cu lumen îngust şi pereţi îngroşaţi din zonele intratumorale. 23. Studiul morfologic cantitativ al vaselor limfatice a relevat o densitate limfovasculară crescută în zonele peritumorale, concordantă cu aria limfovasculară totală şi cu aria procentuală limfovasculară. 24. Densitatea microvasculară (măsurată pentru vase CD34 pozitive) este net mai mare decât densitatea limfovasculară în ambele zone analizate, în timp ce aria limfovasculară e uşor mai mare decât aria medie a vaselor sanguine în fiecare din cele 2 zone. 25. Studiul de faţă deschide perspectivele cercetării unor terapii antitumorale în melanoamele maligne invazive ale feţei cu factori antiangiogenici şi antivasculari, şi posibil cu inhibitori ai degranulării mastocitare. 26. Noutatea cercetărilor personale rezidă în aplicarea metodelor moderne de apreciere cantitativă şi calitativă a angiogenezei în melanomul malign al feţei, o localizare în care vascularizaţia normală prezintă anumite particularităţi anatomice. 43