Universitatea de Medicină și Farmacie Grigore T. Popa Iași Facultatea de Farmacie Disciplina de Analiza Medicamentului Teză de doctorat EVALUAREA AALITICĂ A UOR COMPUŞI DE SITEZĂ DI CLASA DIMETILXATIELOR Doctorand BALIT (TAMBA) Adriana Conducător stiințific Prof. Dr. LAZĂR Mihai Ioan - 214-1
Teza de doctorat cuprinde: 226 pagini 312 figuri 83 tabele 1 schemă 146 indicaţii bibliografice În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru cuprins, tabele, figuri şi scheme. Cuvinte cheie: metilxantine, cromatografie, analiză spectrală, spectrometrie, rezonanță magnetică nucleară, infraroșu, ultraviolet. 2
CUPRIS ITRODUCERE 7 STADIUL CUOAȘTERII 11 CAPITOLUL I DATE PRIVID COMPUȘII METILXATIICI 13 I.1. COFEIA 13 STRUCTURA CHIMICĂ 14 PROPRIETĂȚI FIZICO-CHIMICE 14 DATE TERMICE 14 DATE TERMOGRAVIMETRICE 14 AALIZA TERMODIFEREŢIALĂ 15 DATE SPECTRALE 15 SPECTRUL UV 15 SPECTRUL IR 16 SPECTRUL DE MASĂ 16 SPECTRUL RM 17 DIFRACŢIA RAZELOR X 19 BIOSITEZA COFEIEI 19 EXTRACȚIA COFEIEI 2 METABOLISMUL COFEIEI 22 I.2. TEOBROMIA 24 STRUCTURA CHIMICĂ 25 PROPRIETĂȚI FIZICO-CHIMICE 25 DATE SPECTRALE 25 SPECTRUL UV 25 SPECTRUL IR 25 SPECTRUL RM 26 SPECTRUL DE MASĂ 27 I.3. TEOFILIA 27 STRUCTURA TEOFILIEI 28 PROPRIETĂȚI FIZICO-CHIMICE 28 DATE TERMICE 28 AALIZA TERMICĂ DIFEREŢIALĂ 28 CALORIMETRIA PRI SCAARE DIFEREŢIALĂ 28 DATE SPECTRALE 29 SPECTRUL UV 29 SPECTRUL IR 29 SPECTRUL DE MASA 3 BIOSITEZA TEOFILIEI 3 CAPITOLUL II ACȚIUEA FARMACOLOGICĂ A METILXATIELOR 31 II.1. ACȚIUEA FARMACOLOGICĂ A COFEIEI 31 II.2. ACȚIUEA FARMACOLOGICĂ A TEOBROMIEI 35 II.3. ACȚIUEA FARMACOLOGICĂ A TEOFILIEI 36 ACȚIUEA ATIOXIDATĂ A METILXATIELOR 37 ACȚIUEA CITOSTATICĂ A METILXATIELOR 38 CAPITOLUL III METODE DE AALIZĂ CALITATIVĂ ȘI CATITATIVĂ A 41 METILXATIELOR III.1. METODE SPECTROMETRICE 41 III.1.1. UV-VIS 41 III.1.2. IR 46 III.1.3. RM 47 III.2. METODE CROMATOGRAFICE 49 III.2.1. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBŢIRE 49 III.2.2. METODE HPLC 52 III.3. METODE ELECTROFORETICE 56 CROMATOGRAFIA ELECTROCIETICĂ MICELAR CAPILARĂ 56 III.4. METODE TERMICE 58 III.5. METODE CUPLATE 63 COTRIBUȚII PROPRII 65 3
CAPITOLUL IV AALIZA CROMATOGRAFICĂ A COMPUȘILOR XATIICI 67 IV.1. AALIZA PE STRAT SUBȚIRE 67 Compusul C1 68 Compusul C2 68 Compusul C3 69 Compusul C4 7 Compusul C5 7 Compusul C6 71 Compusul C7 72 Compusul C8 73 IV.2. DETERMIAREA DESITOMETRICĂ A COMPUȘILOR C3 şi C8 73 Compusul C3 74 Compusul C8 74 COCLUZII 75 CAPITOLUL V AALIZA SPECTRALĂ Î UV A DERIVAȚILOR METILXATIICI 77 ITRODUCERE 77 MATERIAL ŞI METODĂ 79 Compusul C1 8 Compusul C2 81 Compusul C3 82 Compusul C4 82 Compusul C5 83 Compusul C6 84 Compusul C7 84 Compusul C8 84 COCLUZII 85 CAPITOLUL VI AALIZA IR A DERIVAȚILOR METILXATIICI 87 ITERPRETAREA SPECTRELOR 87 CARACTRISTICILE SPECTRALE Î IR ALE COMPUȘILOR 88 METILXATIICI AALIZAȚI AALIZA IR A COMPUȘILOR XATIICI 88 MATERIAL ȘI METODĂ 88 Compusul C1 89 Compusul C2 9 Compusul C3 91 Compusul C4 92 Compusul C5 93 Compusul C6 94 Compusul C7 95 Compusul C8 96 COCLUZII 97 CAPITOLUL VII AALIZA HPLC A COMPUȘILOR METILXATIICI 99 MATERIAL ȘI METODĂ 1 CODIŢIILE CROMATOGRAFICE 1 REZULTATELE METODEI 1 DISCUȚIA REZULTATELOR 14 COCLUZII 17 CAPITOLUL VIII AALIZA RM A COMPUȘILOR METILXATIICI 19 MATERIAL ȘI METODĂ 19 Compusul C1 11 Compusul C2 118 Compusul C3 124 Compusul C4 13 Compusul C5 136 Compusul C6 139 Compusul C7 143 4
Compusul C8 148 COCLUZII 153 CAPITOLUL IX VALIDAREA UOR METODE HPLC PETRU COMPUȘII 157 METILXATIICI C5 ȘI C8 PARAMETRII DETERMIAȚI PRICIPII TEORETICE 157 COMPATIBILITATEA SISTEMULUI 157 SPECIFICITATEA METODEI 157 ACURATEȚEA METODEI 158 LIIARITATEA 158 VALIDAREA METODEI DI MATRICE FARMACEUTICĂ 158 PRECIZIE - REPETABILITATE 158 LIMITA DE DETECȚIE ŞI DE CUATIFICARE 159 DEPISTAREA VALORILOR ABERATE - TEST DIXO 159 COMPUSUL C5 159 DESCRIEREA METODEI 159 REZULTATE PARAMETRI DETERMIAŢI 159 COMPATIBILITATEA SISTEMULUI 159 SPECIFICITATEA METODEI 16 ACURATETEA METODEI 162 LIIARITATEA 163 VALIDAREA METODEI DI MATRICE 167 FARMACEUTICĂ PRECIZIE - REPETABILITATE 171 LIMITA DE DETECȚIE ŞI DE CUATIFICARE 172 DEPISTAREA VALORILOR ABERATE - TEST DIXO 172 COCLUZII 172 COMPUSUL C8 172 DESCRIEREA METODEI 172 REZULTATE PARAMETRI DETERMIAŢI 173 COMPATIBILITATEA SISTEMULUI 173 SPECIFICITATEA METODEI 173 ACURATEȚEA METODEI 174 LIIARITATEA 176 VALIDAREA METODEI DI MATRICE 182 FARMACEUTICĂ PRECIZIE - REPETABILITATE 185 LIMITA DE DETECȚIE ŞI DE CUATIFICARE 186 DEPISTAREA VALORILOR ABERATE - TEST DIXO 186 COCLUZII 186 CAPITOLUL X DETERMIAREA COMPUSULUI C4 DITR-O MATRICE 187 FARMACEUTICĂ STABILIREA CODIŢIILOR DE AALIZĂ HPLC A COMPUSULUI C4 187 REZULTATE PARAMETRI DETERMIAŢI 187 COMPATIBILITATEA SISTEMULUI 187 SPECIFICITATEA METODEI 187 ACURATEȚEA METODEI 189 LIIARITATEA 19 VALIDAREA METODEI DI MATRICE FARMACEUTICĂ 192 PRECIZIE - REPETABILITATE 196 LIMITA DE DETECȚIE ŞI DE CUATIFICARE 197 DEPISTAREA VALORILOR ABERATE - TEST DIXO 197 COCLUZII 197 CAPITOLUL XI METODA SPECTROMETRICĂ UV-VIS PETRU DETERMIAREA COMPUSULUI C3 MATERIAL ȘI METODĂ 199 REZULTATE PARAMETRI DETERMIAŢI 199 SPECIFICITATEA METODEI 199 ROBUSTEȚEA 2 199 5
ACURATEȚEA METODEI 21 LIIARITATEA 22 PRECIZIA METODEI 25 EXACTITATEA METODEI 26 TESTUL COCHRA Q 27 LIMITA DE DETECȚIE ŞI DE CUATIFICARE 28 COCLUZII 28 COCLUZII GEERALE 29 BIBLIOGRAFIE 213 LISTA LUCRĂRILOR ȘTIIȚIFICE PROPRII 225 6
MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI ŞI OBIECTIVELE PROPUSE Metilxantinele ocupă un rol important şi promiţător în schemele terapeutice actuale. Se cunosc acţiunile farmacologice ale cofeinei, teobrominei şi teofilinei. Pe plan global, la aceşti compuşi s-au adăugat noi derivaţi cu structura de bază xantinică, sintetizarea lor cunoscând în ultimii ani un trend ascendent. Capitolul I face o trecere în revistă a datelor analitice asupra cofeinei, teobrominei şi teofilinei, care reprezintă modelul metilxantinelor naturale şi de sinteză, precum şi cel al substanţelor analizate de noi. Capitolul II prezintă proprietăţile farmacologice ale cofeinei, teobrominei şi teofilinei, insistând asupra celor mai importante dintre ele. Referindu-ne la cofeină am scos în evidenţă acţiunea de stimulare a cortexului, cea de stimulare al centrilor respirator şi a miocardului, a diurezei, a secreţiei gastrice și a metabolismului bazal. Teobromina se caracterizează prin câteva acţiuni specifice structurii sale (acţiunea bronhodilatatoare şi cea diuretică). Pentru metilxantinele prezentate am evidenţiat câteva noi acţiuni precum cea antioxidantă şi anticanceroasă. Proprietăţile fizico-chimice ale metilxantinelor cunoscute și prezentate, au constituit ghidul pentru elaborarea metodelor de analiză ale noilor compuși metilxantinici investigați. Capitolul III prezintă, pentru metilxantinele naturale, metodele instrumentale care au dus la elucidarea structurii formelor polimorfe, la identificarea şi cuantificarea lor. S-au evidenţiat metodele spectrometrice (UV- VIS, IR, RM), metodele cromatografice (CSS, HPLC), metodele termice (TA, DSC), difracţia razelor X și metodele cuplate utilizate. Pentru fiecare metodă au fost detaliate anumite aspecte analitice care au fost de folos în desfăşurarea cercetărilor din cadrul tezei. Pornind de la o serie de opt compuși, metilxantine nou sintetizate în laborator și puse la dispoziție cu amabilitate de către Prof. Univ. Dr. Lenuţa Profire, din cadrul Disciplinei de Chimie Farmaceutică, Facultatea de Farmacie, U.M.F. Gr. T. Popa Iaşi, am iniţiat un studiu analitic asupra caracteristicilor lor fízico-chimice. În acest scop au fost urmărite o serie de obiective: 1. Stabilirea unor metode cromatografice simple pentru identificarea compuşilor xantinici. Evaluarea comportamentului spectral în UV al xantinelor, stabilirea și validarea unor metode spectrale de evaluare cantitativă. 2. Efectuarea unui studiu cromatografic HPLC pentru identificarea şi evaluarea acestor compuşi şi a produşilor de degradare. Metodele HPLC au fost validate pentru aplicarea lor în evaluarea cantitativă din matrici sintetice şi biologice. 3. Efectuarea unui studiu spectral în IR pentru elucidarea structurilor sintetizate şi pentru urmărirea structurală a compuşilor rezultaţi în urma unor degradări. 4. Elucidarea structurii metilxantinelor printr-un studiu de tip 1 H-RM şi 13 C-RM. 5. Validarea unei metode de analiză HPLC pentru una din cele opt metilxantine. 6. Determinarea unui compus metilxantinic dintr-o matrice farmaceutică. 7
COTRIBUȚII PROPRII CAPITOLUL IV: AALIZA CROMATOGRAFICĂ A COMPUȘILOR XATIICI Metilxantinele analizate au fost: COMPUSUL C1, P1 7-[2-hidroxy)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-1,3- dimetilxantina CH 3 O H 3 C O H 2 C CH CH 2 HO O H O CH 3 COMPUSUL C2, P2 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8- bromo-1,3-dimetilxanthina CH 3 O H 3 C Br O H 2 C CH CH 2 HO O H O CH 3 COMPUSUL C3, P3 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8- nitro-1,3-dimetilxantina CH 3 O H 3 C O 2 O H 2 C CH CH 2 HO O H O CH 3 COMPUSUL C4, P4 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8- (imidazol-1-il)-1,3-dimetilxantina CH 3 O H 3 C O H 2 C CH CH 2 HO O H O CH 3 COMPUSUL C5, P5 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8- (piperidin-1-il)-1,3-dimetilxantina CH 3 O H 3 C O H 2 C CH CH 2 HO O H O CH 3 COMPUSUL C6, P6 7-[2-hidroxiy)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8- (morfolin-4-il)-1,3-dimetilxantina CH 3 O H 3 C O H 2 C CH CH 2 HO O O H O CH 3 COMPUSUL C7, P7 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3- metil-5-oxo-pirazol-1-il)-1,3-dimetilxantina CH 3 O O H 3 C CH 3 O H 2 C CH CH 2 HO O H O CH 3 8
COMPUSUL C 8, P8 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3,5- dimetil-pirazol-1-il)-1,3-dimetilxantina IV.1. Analiza pe strat subțire S-a efectuat analiza cromatografică pe strat subţire a celor opt compuşi cu un Automatic TLC Sampler III ATS3 CAMAG. Suport cromatografic folosit: Plăci de aluminiu cu silicagel F 254. Vizualizare: UV: 254, 274, 277 nm. Sistem de solvenți: r. Sisteme developare r. Sisteme developare 1 Acetat de etil-metanol 27: 3 5 Cloroform-etanol-acid formic 88:1:2 2 Cloroform-etanol tamponat la ph 1.8) 9:1 6 Cloroform-diclormetan-isopropanol 4:2:1 3 Acetonă-cloroform-n-butanol-:amoniac 3:3:4:1 7 Diclormetan-etanol (bac saturat cu soluţie de hidroxid de amoniu 3%) 4 Benzen-acetonă 3:7 8 Acid acetic-isopropanol-toluen 1:12:6 Valorile Rf calculate în trei sisteme cromatomatografice pentru cei 8 compuși sunt înscrise în sinteza tabelelor IV.1-8. Tabelele IV.1-8. Valorile Rf pentru C1-8. Proba Sistem solvenţi Rf x 1 Proba Sistem solvenţi Rf x 1 1 2 3 4 1 5 1 5 5 48 5 5 45 8 35 8 4 1 6 1 6 5 49 6 5 5 8 47 8 4 1 7 1 45 5 6 7 5 4 8 4 8 35 1 55 1 65 5 5 8 5 45 8 39 8 4 IV.2. Determinarea densitometrică compuşilor C3 şi C8 S-au analizat densitometric compuşii C3 şi C8 în UV. S-au utilizat: Plăci TLC de sticlă acoperite cu silicagel GF 254 (Merck); Sistemul de developare 1; Soluţiile compuşilor 3, şi 8 ce conţin 1-5 µg/ml; Micropipete seringi; Aparat: Densitometru CD-6; software ProQuant. Determinarea s-a efectuat măsurând absorbanţa prin reflecţie la 25 nm. 9:5 Fig.IV.26. Curba de calibrare densitometrică a C3. Fig.IV.28. Curba de calibrare densitometrică a C8. 9
CAPITOLUL V. AALIZA SPECTRALĂ Î UV A DERIVAȚILOR METILXATIICI Probele au fost analizate cu ajutorul unui spectrofotometru Agilent 8453 monfascicul, utilizându-se metanol ca şi solvent de comparaţie. Spectrofotometrul Agilent UV-VIS a fost folosit pentru înregistrarea spectrelor şi pentru aplicarea tehnicilor de derivatizare. Derivata de ordin 1 s-a aplicat pentru identificarea maximele de absorbţie. Rezultate. Spectrele de absorbţie în UV ale compuşilor C1(P1) - C8 (P8): 2 P1 P2 P3 2 2 Absorbance (AU) Absorbance (AU) Absorbance (AU) 2 25 3 35 175 2 225 25 275 3 325 35 175 2 225 25 275 3 325 35 2 Wavelength (nm) Wavelength (nm) 2 Wavelength (nm) P4 2 P5 P6 Absorbance (AU) Absorbance (AU) Absorbance (AU) 175 2 225 25 275 3 325 35 Wavelength (nm) 175 2 225 25 275 3 325 35 Wavelength (nm) 175 2 225 25 275 3 325 35 Wavelength (nm) 4 4 P7 P8 Absorbance (AU) 2 Absorbance (AU) 2 175 2 225 25 275 3 325 35 Wavelength (nm) 175 2 225 25 275 3 325 35 Wavelength (nm) Fig. V.1.b Spectrele de absorbţie în UV ale compuşilor C1(P1) - C8 (P8). Spectrul de absorbţie şi spectrul derivat de ordinul 1pentru cei 8 compuși este prezentat în figurile V.2-9. Fig.V.2. Spectrul de absorbţie (a) şi spectrul derivat de ordinul unu (b) pentru P1. Fig.V.3. Spectrul de absorbție (a) şi spectrul derivat de ordinul 1(b) pentru P2. 1
Fig.V.4. Spectrul de absorbție (a) şi spectrul derivat de ordinul 1(b) pentru P3. Fig.V.5. Spectrul de absorbție (a) şi spectrul derivat de ordinul 1 (b) pentru P4. Fig.V.6. Spectrul de absorbție (a) şi spectrul derivat de ordinul 1(b) pentru P5. Fig.V.7. Spectrul de absorbție (a) şi spectrul derivat de ordinul 1(b) pentru P6. Fig.V.8. Spectrul de absorbție (a) şi spectrul derivat de ordinul 1(b) pentru P7. 11
Fig.V.9. Spectrul de absorbție (a) şi spectrul derivat de ordin 1 (b) pentru P8. Concluzii 1. Identificarea derivaţilor xantinici s-a realizat pe baza capacităţii de absorbţie în UV a acestor compuşi datorită prezenţei grupărilor cromofore de pe nucleu. 2. Spectrele de absorbţie au prezentat similarităţi datorită structurii apropiate, derivaţii fiind doar diferenţiaţi prin prezenţa anumitor nuclee şi grupări în poziţia 7 la inelul purinic. 3. Derivata spectrală de ordinul unu a dus la scăderea în intensitate a maximelor de asborbţie, şi a permis evidenţierea mai clară a maximelor, reuşindu-se prin această tehnică creşterea specificităţii spectrale a metodelor de identificare şi cuantificare. 4. Datele spectrale obţinute pot fi folosite la elaborarea şi validarea unei metode de analiză calitativă şi cantitativă a substanţelor sintetizate şi din matrici farmaceutice şi biologice. CAPITOLUL VI. AALIZA IR A COMPUȘILOR METILXATIICI Material și metodă Analizele IR au fost efectuate folosind un spectrofotometru Tensor 27 Opitcs FT-IR Bruker, Germania, domeniu spectral de 75-37 cm -1, separator de fascicule, rezoluție <1 cm -1, precizia numerelor de undă <,1 cm -1, precizie fotometrică <,1% T, semnal zgomot (minim) - 5 sec > 6, rezoluția 4 cm -1, interferometru aliniat permanent, viteza de scanare - 3 viteze, 2.2-2 KHz și detector - DATGS. Rezultate 327.11 1689.66 1652.53 1545.43 157.45 1448.7 149.33 1372.6 1268.95 1226.34 111.53 164.33 144.77 125.95 974.2 825.3 82.42 772.19 761.63 747.95 668.21 Fig.VI.2. Spectrul IR al compusului 1. Absorbance.5.1.15.2.25 35 3 25 Wavenumber (cm-1) 2 15 1 Legătura C-O de întindere a grupării de alcool terţiar este evidenţiată în toate spectrele prin absorbţie la 117 cm -1, în timp ce benzile de absorbţie observate în regiunea 141-131 cm -1, aparţin legăturii O - H. Gruparea funcţională eterică este evidenţiată în toate spectrele prin absorbţie în regiunea 114-17 cm -1. Banda largă, observată în toţi compuşii, cu excepţia probei P6, din regiunea 32-33 cm -1 este, de obicei, atribuită unei legături O-H de întindere. G:\BOGDA\xantine\proba 1.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 Page 1/1 12
3281.55 3131.31 366.48 2951.23 287.72 174.34 1653.38 164.19 1542.19 157.64 1454.6 147.4 1359.55 1314.52 1279.98 1237.8 1213.22 1117.57 143.89 978.73 916.71 871.67 837.14 81.27 762.19 746.77 Fig.VI.3. Spectrul IR al compusului 2. Absorbance.5.1.15.2.25.3 Prezenţa atomului de brom în molecula compusului 2 (P2) dă naştere diverse tipuri de vibraţii (7-6 cm -1 pentru legătura alifatică C-Br de întindere sau 15-1 cm -1 pentru legătura aromatică C-Br de intindere). 35 3 25 2 15 1 Wavenumber (cm-1) G:\BOGDA\xantine\proba 2.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 Page 1/1 3117.53 26.2 169.41 1653.22 1545.21 157.2 1479.98 1442.76 149.65 1372.6 1312.92 1283.29 1237.79 1224.63 1186.34 111.35 144.31 125.3 975.28 925.64 824.95 82.2 784.56 772.15 762.56 741.25 666.98 Fig.VI.4. Spectrul IR al compusului 3. Absorbance.5.1.15.2.25.3 Proba P3 prezintă o bandă de absorbţie la 1181 cm -1, atribuit, în general pentru legătura de întinde simetrică a grupării O 2 din compuşii organici. Gruparea nitro arată două benzi de absorbţie de la 1566 şi 1315 cm -1, atribuite vibraţiilor de întindere asimetrice şi simetrice = C-O 2. 35 3 25 2 15 1 Wavenumber (cm-1) G:\BOGDA\xantine\proba 3.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 Page 1/1 3325.16 1697.53 1655.81 164.77 1546.74 159.31 1441.43 146.1 1336.88 1299.5 1261.71 1244.97 1216.79 121.75 174.38 135.97 12.33 96.33 889.61 839.79 822.5 87.64 747.71 735.38 68.98 Fig.VI.5. Spectrul IR al compusului 4. Absorbance.5.1.15.2.25.3.35 35 3 25 2 15 1 Wavenumber (cm-1) G:\BOGDA\xantine\proba 4.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 Page 1/1 Proba P4 ar trebui să afişeze benzile de absorbţie caracteristice legăturii C = de întindere care apar de obicei în regiunea IR 1655-164 cm -1. Din moment ce această vibrație se produce deja pentru toţi compuşii analizaţi din cauza prezenţei grupării amidice din molecula-mamă, benzi de absorbţie noi nu se observă în spectrul IR înregistrat la proba P4. Totuşi, absorbţii de intensitate medie se observă la 1256 cm -1. Această bandă este atribuită, în general vibraţiilor legăturii C- de întindere din compuşii amidici. 3282.94 293.59 1979.18 175.51 1652.88 162.73 1544.18 158.6 1457.43 1428.37 145.25 1358.48 1335.18 1313.52 1299.58 1275.3 1239.37 1213.48 1188.35 117.75 1121.9 1111.27 141.99 15.19 979.38 914.7 873.77 834.51 87.94 793.77 771.39 757.91 743.15 664.43 Fig.VI.6. Spectrul IR al compusului 5. Absorbance.5.1.15.2.25.3 Compusul 5 prezintă în structura sa un nucleu piperidinic care îşi lasă amprenta prin vibraţiile de la 3263 (s); 279 (s), 273 (s), 2675 (m), 2635 (w); 16-1575 (w); IV, 817 (m), 735 (s) cm -1. 35 3 25 2 15 1 Wavenumber (cm-1) G:\BOGDA\xantine\proba 5.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 Page 1/1 13
Absorbance.5.1.15.2.25 35 398.93 3 2845.23 25 Wavenumber (cm-1) 169.23 1653.29 1616.69 1569.4 1516.67 1456.9 143.86 1382.41 1347.96 1313.12 1276.74 126.99 1218.89 1119.38 111.65 168.29 147.17 15.4 979.49 931.6 91.21 845.64 789.42 749.96 721.11 72.19 686.29 673.32 G:\BOGDA\xantine\proba 6.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 2 15 1 Fig.VI.7. Spectrul IR al compusului 6. Spectrul IR înregistrat pentru proba P6 afişează o banda de absorbţie nouă la 111 cm -1, de obicei, atribuită legăturii O-C de întindere din compuşii cu oxigen în moleculă (altele decât acizii carboxilici, esteri, cetone anhidridele, etc), cum ar fi nucleul morfolinic. De asemenea, benzile IR observate în regiunea 32-28 cm -1 sunt caracteristice nucleului morfolinic. Mai mult decât atât acest spectru prezinta doua benzi slabe de absorbţie la 91 cm -1 şi 122 cm -1, care au fost anterior atribuite inelelelor epoxidice sau oxiranice. Page 1/1 3284.69 177.11 1654.55 164.63 1545.99 159.96 1453.24 147.42 136.92 1336.85 1315.73 1282.21 1241.29 1215.34 1172.77 1123.9 1113.28 143.88 981.48 916.78 875.88 836.22 81.4 794.64 76.9 745.37 666.95 Fig.VI.8. Spectrul IR al compusului 7. Absorbance.5.1.15.2.25.3 In spectrul IR al compusului 7, P7 apar toate benzile de absorbţie caracteristice compusului, care a constituit baza sintezelor celolalţi derivaţi metilxantinici. ucleul metilpirazolonic din structura compusului 7 îşi lasă amprenta prin maximele caracteristice acestui nucleu şi apreciate a fi la 3127, 1597, 1525, 1498, 1454 cm -1. 35 3 25 2 15 1 Wavenumber (cm-1) G:\BOGDA\xantine\proba 7.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 3279.32 Page 1/1 17.8 1652.75 162.68 154.87 158.1 1451.5 141.26 1359.1 1334.81 1313.53 1299.73 1279.94 1239.18 1213.42 1171.4 1121.28 142.5 979.67 915.5 874.2 834.4 88.52 792.77 758.26 743.93 Fig.VI.9. Spectrul IR al compusului 8. Absorbance.5.1.15.2.25.3.35 Ca şi în cazul compusului 7, derivatul P8 înscrie în structura sa vibraţiile de valenţă ale dimetilpirazolului, substituentul din poziţia 8 al nucleului xantinic ce sunt situate la: 35, 22, 161 1575, 155, 152, 14, 14 cm -1. 35 3 25 2 15 1 Wavenumber (cm-1) G:\BOGDA\xantine\proba 8.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/21 Page 1/1 CAPITOLUL VII: AALIZA HPLC A COMPUȘILOR METILXATIICI Material și metodă. Determinările cromatografice au fost efectuate pe un sistem HPLC, Surveyor Plus (Thermo - Fisher Scientific, SUA) echipat cu Surveyor LC - Pompa, 4 Barr presiune maximă, un Autosampler și un detector cu grup de fotodiode PDA cu 65 fotodiode sensibile. Software-ul ChromQuest a permis înregistrarea fiecărui test cromatografic, dezvoltarea sensibilităţii metodei on-line a fiecărui maxim de absorbție a componentei analizate. S-a utilizat o fază staționară Phenomenex Inc. Au fost folosite coloane octadecilsilil C18 cu 25 mm lungime, 4,6 mm diametru interior (SUA). Rezultate Prezența grupărilor hidroxipropoxi, fenil, acetamidă pe moleculă precum și pe alți substituenți de pe fiecare compus analizat, a permis apariția unor abateri de maxime de absorbție în mediile parțiale apoase ale fazei mobile utilizate în determinări. Caracteristicile spectrale sunt înscrise în tabelul VII.1. Tabel VII.1 Spectrele moleculare ale celor opt derivaţi metilxantinici Comp. λ max λ max λ max λ max λ max λ max Comp. λ max λ max λ max λ max λ max λ max P1 21 249 341 - P5 212 23 244 27 277 - P2 211 23 245 27 277 - P6 221 26 297-14
P3 28-25 322 - - P7 213 229 244 27 276 345 P4 21 227 244 269 279 - P8 213 23 244 27 276 - Identificarea fiecărui compus a fost efectuată cu ajutorul lungimii de undă de 254 nm, drept canal discret al detectorului PDA (Photodiode Aray). Cromatogramele pentru fiecare compus analizat sunt prezentate în figurile VII.1-8. Fig.VII.1. Cromatograma compusului C1. Fig.VII.2. Cromatograma compusului C2. 6 5 pda-254nm P1-V8 Retention Time ame 6 5 8 pda-254nm P2-V8 Retention Time ame 8 6 6 4 4 mau 3 3 mau mau 4 4 mau 2 2 1 2.57 3.33 3.398 4.65 P1 4.792 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. Minutes 1 2 2.693 2.958 4.68 4.972 5.943 p2 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. Minutes 2 Fig.VII.3. Cromatograma compusului C3. Fig.VII.4. Cromatograma compusului C4. 8 pda-254nm P3-V8 Retention Time ame 8 5 pda-254nm P4-V8 Retention Time ame 5 4 4 6 6 3 3 mau 4 4 mau mau mau 2 2 2 2.575 3.47 3.46 4.182 P3 4.965 5.288 2 1 2.578 2.823 3.12 5.43 P4 1 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. Minutes 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. Minutes Fig.VII.5. Cromatograma compusului C5. Fig.VII.6. Cromatograma compusului C6. 6 pda-254nm P5-V8 Retention Time ame 6 125 pda-254nm P6-V8 Retention Time ame 125 1 1 4 4 75 75 mau mau mau mau 5 5 2 2 25 25 7.692 P5 4.488 P4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Minutes Minutes Fig.VII.7. Cromatograma compusului C7. Fig.VII.8. Cromatograma compusului C8. 6 pda-254nm P7-V8 Retention Time ame 6 5 pda-254nm P8-V8 Retention Time ame 5 4 4 4 4 mau mau mau 3 3 mau 2 2 2 2 8.67 P7 1 7.89 P8 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Minutes Minutes 15
Parametrii pentru caracterizarea calității separării ca, timpul de retenție, eficiența separării, înalţimea, asimetria, picul și factorul de puritate sunt prezentate în tabelul VII.2. Tabel VII.2. Timpul de retenţie, asimetria, talerele teoretice, înălţimea, capacitatea picului, factorul de puritate Proba Parameteri P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Timp retenţie 4.65 5.943 4.182 5.43 7.692 4.488 8.67 7.89 Asimetria 1.15 1.16 1.147 1.12 1.78 1.136 1.87 1.8 Talere teoretice 1193 149 17 1927 1796 12222 1723 1923 Inălţimea 599135 777976 823126 494162 585562 124925 63237 5552 Picul 19.32 2.71 19.9 26.15 37.45 21.44 39.33 38.45 Factor de puritate.975.951.951.98.973.997.968.97 Bazat pe valoarea pka de 7.7 a xantinelor şi pe coeficientul de partiţie (P oct ) de -.69 la ph-7.416, au fost calculați coeficienții de partiție (P oct ) pentru fiecare derivat cu ajutorul unui software ACD/Lab PubChem Log, în scopul de a stabili diferenţele din structurile parametrilor fizico-chimici. Valorile prezise pentru P oct ul fiecărui compus sunt prezentate în tabelul VII.3. Proba Tabel VII.3. Valorile prezise P oct utilizănd software-ul ACD/ Lab PubChem P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Parameteri P oct.44 ±.46 1.85 ±.93 -.29 ±.87 1.7±.97 1.23 ±.93 -.32 ±.95 -.48 ± 1.2 -.9 ±.98 Aceste valori arată unele diferențe minore pentru polaritatea acestor compuși, în raport cu xantina, care a avut o valoare de -.69. Prezența grupărilor hidroxipropoxi, fenil, şi acetamidă a crescut aciditatea compuşilor, astfel încât, în medii parțiale apoase, aceștia au arătat capacitate de ionizare. Având în vedere aceste proprietăți fizico-chimice, au fost luate în considerare trei medii de ph în dezvoltarea metodei (2.2, 7.2 și 1 pentru soluția tampon). De asemenea, pentru metoda gradientului a fost folosită o fază mobilă ce constă dintr-un amestec binar de soluție tampon ph-7.2 și metanol și trei alternative în ceea ce privește programul de eluție. Având în vedere condițiile cromatografice, atunci când procentul de metanol a crescut, valoarea pantei a fost pozitivă (4), Atunci când conținutul de metanol a scăzut în aceleași condiții, valoarea pantei a fost negativă (-4). În caz contrar, în eluţia izocratică, panta are valoarea de. S-a folosit ulterior un design central composite experiment pentru a investiga efectele ph-ului pe o metodă izocratică (X 1 ) precum și procedeul eluției în gradient, cu variația liniară a compoziției metanolului (X 2 ) pentru răspunsurile considerate în procesul de separare (tabelul VII.4). În scopul de a estima răspunsurile Y, care sunt rezultatul interacțiunii a trei parametri incluşi în monitorizarea de evaluare cromatografică (factor de rezoluţie Y Rs, talerele teoretice, Y Tp şi asimetria Y T ) s-a aplicat o analiză matematica de tip regresie multiplă. În selecția variabilă au fost consideraţi parametrii care ating pragul de semnificație (p <,1). Valorile sunt prezentate în tabelul VII.4. Tabel VII.4 Parametrii de calitate ai metodei cromatografice în proiectarea factorială completă cu 2 factori, 3 niveluri și 9 determinări unice. Bloc Factorii codaţi ivelul Răspunsuri factorilor X 1 X 2 X 1 X 2 Rs T Tp 1 1. -1. 1-4.256.857 5626 1-1. 1. 2.2 4.634 1.257 7256 3-1. -1. 2.2-4.542.757 4566 2.. 7.2 3.244 1.14 176 2 1. 1. 1 4.326 1.24 4265 3-1.. 2.2.113 1.165 8832.5 2 1.. 1 1.385 1.145 475.5 16
1. 1. 2.2 4.457 1.123 5721 3. -1. 7.2-4.866.724 6895 În scopul de a evalua predictibilitatea modelului, a fost efectuată o analiză a varianței, AOVA (p<,1). Sinteza valorilor pentru coeficienții polinomiali în conformitate cu ecuația (1) este prezentată în tabelul VII.5. Tabel VII.5. Coeficienții modelului de răspuns statistic obținuţi prin analiza AOVA Tp T Rs Efect St. Err p Efect St. Err p Efect St. Err p b 1.2.1. 6444.11 848.56.2.87.6. b 1 -.11.7.24-2236.83 4647.8 -.48-2.98.32.1 b 2 -.7.6.35-3249.67 36.15.46-1.81.25.2 b 11 -.5.3.21 221.83 18.7.38.98.13.2 b 12.3.5.3-166.75 3117.82.76-1.57.22.2 b 22.25.4.2 2314.96 2381.27.43.25.17.28 Rezultatul arată că datele au o bună compatibilitate cu ecuațiile de gradul al doilea pentru factorul de rezoluție și asimetria cromatografică, parametrii care sunt direct afectaţi de performanța generală a metodei. CAPITOLUL VIII: AALIZA RM A COMPUȘILOR METILXATIICI Material și metodă. Spectrometru Bruker Avance DRX 4 MR Spectrometru Bruker RM Avance DRX 4. Cryo-magnet. 5 MHz. 11,7 Tesla. Calculator. Monitor. Accesorii. Consola de control. Cryo-Diffusion, vas Dewar L 225. -5 - filtru, capete de măsurare. Software-ul. Accesorii. Solvent : DMSO. Determinările efectuate: 1 H-RM (Spectroscopia de Rezonanță Magnetică ucleară de Protoni), 13 C-RM (Spectroscopia de Rezonanță Magnetică ucleară de Carbon), COSY (Correlated Spectroscopy) și DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer - o metodă 13 C-RM). Rezultate COMPUSUL C1 (P1). În tabelul VIII.1. sunt prezentate semnalele caracteristice spectrului 1 HRM şi 13 C-RM înregistrate la o frecvență de 4 MHz. Tabel VIII.1. Maximele de absorbție identificate la pentru compusul 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)fenoxi]-propil-1,3-dimetil-xantina. Deplasare (δ) (ppm) Atribuire Deplasare (δ) (ppm) Atribuire Deplasare (δ) (ppm) Atribuire 1 H-MR 13 C-MR 2.9 s, 3.9, 3H 23.8 C28 143.33 C8 2.5 s 27.7-147.87 C4 3.4 d,7.11, 6H 29.7-15.97 C26 3.571 d,5.49, 6H 39.51 m,c13, C17 154.49 C2 3.98 m,2.28, 2H 49.5 s, C12 167.75 C1 4.243 m,2.13, 2H 67.58 s, C1 4.52 m,1.5, 1H 7.16 s,c14 5.537 s,.71, 1H 16.64-6.867 d,2.5, 2H 114.47 C22 7.482 d,2.3, 2H 12.42 C21-C23 8.7 s,1.5, 2H 132.76 C2-C24 9.7 s,1., 1H 14.6 C19 Spectrele de tip RM pentru compusul 1 sunt prezentate în figurile VIII.1, 4 și 5. 17
Fig.VIII.1. Spectrul 1 H-RM (.-1,5 ppm). Fig.VIII.4. Spectrul DEPT-RM (1-19 ppm). Fig.VIII.5. Spectrul 13 C-RM (1-19 ppm). 18
COMPUSUL C2 (P2) Din perspectiva semnalelor caracteristice spectrului RM, distribuția este prezentată în tabelele VIII.2 și VIII.3. Tabel VIII.2 Deplasare chimică, caracteristicile semnalului, atribuirea atomilor din structură ale compusului C2. r. Crt. Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici semnal Atribuire 1. 2.1 S, 2.97, 3H C29 2. 2.52 S C26 3. 3.37 D, 5.89, 6H - 4. 3.45 D, 7.63, 6H C1, C12 5. 3.91 T, 2.5, 2H C18 6. 4.26 T, 1.84, 2H C14 7. 4.4 d,.95, 1H C15 8. 5.46 S,.88, 1H C16 9. 6.89 D, 1.99, 2H C21, C22 1. 7.45 D, 1.97, 2H C24, C25 11. 9.77 S, 1., 1H - Tabel VIII.3 Caracteristicile spectrale determinate DEPT ale compusului C2 r. Crt Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT* 1 23.8 S C28 + 2 27.7 S C12 + 3 29.7 D C1 + 4 49.5 S C13-5 67.58 S C14 + 6 7.16 S C17-7 16.3 - - 8 16.64 S C22 9 114.47 S C21, C23 + 1 12.42 S C2, C24 + 11 132.76 S C19 12 14.6 D C6 + 13 147.87 S C4 14 148.33 S C8 15 15.97 S C26 16 154.49 S C2 17 167.75 S C9 * + - semnal pozitiv caracteristic grupărilor metil, metin sau asociat cu un element electronegativ * - - semnal negativ caracteristic grupărilor metilen. COMPUSUL C3 (P3) Din perspectiva semnalelor caracteristice spectrului RM, distribuția este prezentată în tabelele VIII.4 și VIII.5. Tabel VIII.4. Caracteristicile spectrale 1 H-RM ale compusului C3 r. Crt. Deplasare chimica (δ) (ppm) Caractestici semnal Atribuire 1. 1.1 d, 1H, OH - 2. 2.1 s, 3.3, 3H C31 3. 2.5 s -H 4. 3.238 d, 5.27, 5H - 5. 3.483 d, 5.49, 5H C1, C12 6. 3.922 m, 2.11, 2H C2 7. 4.224 m, 2.3, 2H C15 8. 4.5 m, 1.1, 1H C16 19
9. 5.5 s,.55, 1H O17 1. 6.844 d, 2.5, 2H C24, C26 11. 7.459 d, 2.2, 2H C23, C27 12. 8.8 d, 1.54, 2H - punte de hidrogen 13. 9.775 s, 1., 1H - Tabel VIII.5. Caracteristicile spectrale DEPT pentru 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-nitro-1,3-dimetil-xantina (compusul C3) r. Crt Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT* 1 23.81 s C31 + 2 27.7 s C12 + 3 29.69 d C1 + 4 39.51 s 5 49.5 s C15-6 56.5 s 7 67.59 - C16 + 8 7.16 s C2-9 16.11 s C22 1 16.48 s C25 11 114.46 s C24, C26 + 12 12.42 s C23, C27 + 13 132.77 s C6 14 14.47 s C4 + 15 148.32 s C8 + 16 151.18 s C29 17 154.41 s C2 18 167.75 s C9 * + - semnal pozitiv caracteristic grupărilor metil, metin sau asociat cu un element electronegativ * - - semnal negativ caracteristic grupărilor metilen. COMPUSUL C4, (P4) Semnalele caracteristice spectrului 1 HRM şi 13 C-RM pentru compusul C4 sunt prezentate în tabelele VIII.6 și VIII.7. Tabel VIII.6. Caracteristicile spectrale 1 H-RM ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(imidazol-1-il)-1,3- dimetil-xantina (compusul 4). r. Deplasare chimică (δ) (ppm) Caractestici semnal Atribuire Crt. 1. 2.1 s, 3, CH3 C33 2. 2.5 - -H 3. 3.31 d, 3.53, 4H C18, C22 4. 3.37 d, 6.37, 6H C1, C12 5. 4.229 q, 1., 1H C19 6. 4.46 m, 1.99, 2H C16, 17 7. 4.527 t, 1.2, 1H C14 8 5.852 s,.97, 1H OH (2) 9. 6.96 d, 2.2, 2H 25, 29 1. 7.522 d, 2., 2H 26, 28 11. 9.917 s, 1., 1H 2
Tabel VIII.7. Caracteristicile spectrale 13 C-RM ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(imidazol-1-il)-1,3- dimetil-xantina(compusul C4). r. Crt Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT* 1 23.8 s C33 + 2 27.31 s C17 + 3 27.84 d C12 + 4 29.75 s C1 + 5 29.78 s C16 + 6 44.87 s C18-7 68.5 s C22-8 87.26 s C14 + 9 114.73 s C25, C29 + 1 12.39 s C26, C28 + 11 133.3 s C6 12 15.8 s C4 13 152.9 s C8 14 153.54 s C2 15 156.32 s C31 16 161.6 s - 17 167.82 s C9 18 174.45 s - COMPUSUL C5 (P5) Semnalele caracteristice spectrului 1 HRM şi 13 C-RM pentru compusul C5 sunt prezentate în tabelele VIII.8 și VIII.9. Tabel VIII.8 Caracteristicile spectrale 1 H-RM pentru 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(piperidin-1-il)-1,3- dimetil-xantina (compusul 5) r. Crt. Deplasare chimică (δ) (ppm) Caractestici semnal Atribuire 1. 2.9 s,3.1, 3H C34 2. 2.5 s -H 3. 3.39 d, 1.21, 1H 5CH2 4. 3.959 s, 2.14, 2H C23 5. 4.2 d, 3.22, 3H C1 6. 5.47 s,.97, 1H OH 7. 6.821 s, 2.7, 2H C26, C3 8. 7.463 s, 2.7, 2H C27, C29 9. 9.771 s, 1., 1H Tabel VIII.9. Caracteristicile spectrale 13 C-RM ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(piperidin-1-il)-1,3- dimetil-xantina (compusul 5). r. Crt Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT 1 23.81 s C34 + 2 27.62 s C12 + 3 29.48 d C1 + 4 39.5 s C14 5 5.18 s C19-6 67.61 s C2 + 7 7.16 s C23-8 18.4 s C25 9 114.37 s C26, C3 + 1 129.3 s C27, C29 + 21
11 132.75 s C6 12 147.7 s C4 13 15.58 s C8 14 153.47 s C2 15 153.99 s C32 16 167.75 s C9 COMPUSUL C6 (P6) Semnalele caracteristice spectrului 1 HRM şi 13 C-RM pentru compusul C6 sunt prezentate în tabelele VIII.1 și VIII.11. Tabel VIII.1. Caracteristicile spectrale ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(morfolin-4-il)-1,3-dimetilxantina (compusul 6). r. Crt. Deplasare chimică (δ) (ppm) Caractestici semnal Atribuire 1. 2.5 s -H (31) 2. 3.2 s, 3.2, 3H C34 3. 3.363 s, 7.74, 6H C22, C2 4. 3.479 t, 4.4, 4H C16, C6 5. 3.68 t, 4.33, 4H C3, C23 Tabel VIII.11. Caracteristicile spectrale ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(morfolin-4-il)-1,3-dimetil-xantina (compusul 6). r. Crt, Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT 1 27.48 s C16-2 29.53 s C4-3 39.5 s C7 4 4.13 s C32 5 45.73 s C22 + 6 65.36 s C2 + 7 12.28 s C25 8 148.61 s C14 9 151.16 s C9 1 152.69 s C12 11 154.64 s C34 12 174.45 s C1 COMPUSUL C7 (P7) Semnalele caracteristice spectrului 13 C-RM pentru compusul C7 este prezentat în tabelul VIII.12. Tabel VIII.12 Caracteristicile spectrale ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3-metil-5-oxo-pirazol-1-il)-1,3-dimetil-xantina ( compusul 7) r. Crt Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT 1 23.8 s C35 + 2 27.73 s C15 + 3 29.46 s C23 + 4 39.5 s - 5 5.18 s C17-6 67.61 s C18 + 7 7.16 - C24-8 18.38 s C3 9 19.15 s C26 1 114.37 s C27, C31 + 11 12.35 s C28, C3 + 12 124.35 s C29 22
13 129.1 s - 14 132.75 s C6 15 147.67 s - 16 147.81 s C13 17 15.56 s C5 18 15.8 s C8 19 153.4 s C9 2 153.99 s C33 21 167.73 s C11 22 174.46 s - COMPUSUL C8 (P8) Semnalele caracteristice spectrului 1 HRM şi 13 C-RM pentru compusul C8 sunt prezentate în tabelele VIII.13 și VIII.14. Tabel VIII.13. Datele spectrale 1 H-RM ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3,5-dimetil-pirazol-1-il)-1,3-dimetil-xantina. r. Crt. Deplasare chimică (δ) (ppm) Caractestici semnal Atribuire 1 2.1 S, 2.97, 3H C35 2 2.5 s, 1H -H (32) 3 3.21 d, 5.25, 5H 2CH3 (C23, C21) 4 3.45 d, 7.63, 7H 2CH 3 (C15, C16) 5 3.91 m, 3.919, 4H C17, C4 6 4.3 m, 1.86, 2H C24 7 4.4 s,.86, 1H C18 8 5.46 s,.89, 1H OH (19) 9 6.89 d, 1.99, 2H, C 6 H 4 C27, C31 1 7.45 d, 1.97, 2H, C 6 H 4 C28, C3 11 9.78 s, 1., 1H, pirazol C5 Tabel VIII.14 Caracteristici spectrale 13 C-RM ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3,5-dimetil-pirazol-1-il)-1,3-dimetilxantina (compusul 8). r. Crt Deplasare chimică (δ) (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT* 1 18.53 s C16 2 23.79 s C35 + 3 27.12 s C15 + 4 29.8 s C23 + 5 39.5 s - 6 5.71 s C17-7 67.6 s C18 + 8 7.16 - C24. - 9 18.4 s C3 1 19.3 s C26 11 114.9 s C27, C31 + 12 12.3 s C28, C3 + 13 124.4 s C29 14 129.1 s 15 132.75 s C6 16 147.7 s - 17 147.87 s C13 18 15.58 s C5 23
19 15.83 s C8 2 153.4 s C9 21 153.99 s C33 22 167.72 s C11 23 174.45 s - Rezumând rezultatele acestui capitol, se poate afirma că, pe baza analizelor multiple 1 H-RM, 13 C-RM şi a unor tehnici adecvate, cele opt metilxantine analizate corespund structurilor propuse. CAPITOLUL IX: VALIDAREA UOR METODE HPLC PETRU COMPUȘII METILXATIICI C5 ȘI C8 Parametri determinaţi: - compatibilitatea sistemului, - specificitate, - linearitate, - interval, - exactitate, - precizie, - limita de detecție și de cuantificare. COMPUSUL 5, P5 Material și metodă. Metoda s-a dezvoltat pe un cromatograf de lichide de înaltă performanţă de tip Agilent, 11 series echipat cu pompă cu presiune maximă de 4 barri, injector manual, detector DAD (Diode Array Detector) şi degazor. Faza staţionară a constat dintr-o coloană cu suport din oţel inoxidabil cu lungimea de 15 mm, diametru intern de 4. mm, cu silice modificată pe suprafaţa căreia s-au grefat grupări octadecilsilil, mărimea particulelor fiind de 3 µm. Faza mobilă a constat dintr-un amestec format din soluție acid formic,2% şi acetonitril în proporţiile 35:65, iar eluţia de tip izocratic la un debit de.9 ml/min. Temperatura de lucru a fost de 3 o C, iar detecţia s-a efectuat la 254 nm. Volumul injectat a fost de 2 µl, iar timpul de analiză de 1 minute. REZULTATE PARAMETRI DETERMIAŢI COMPATIBILITATEA SISTEMULUI. Rezultatele sunt înscrise în tabelul IX.1. Tabel IX.1. Parametrii de determinare a compatibilităţii sistemului Parametru Compusul C5, (P5) Timp de retenţie 5,83 Factorul de capacitate, k 1,6 Rezoluţie (Rs) 8,3 Factor de întindere (T) 1.4 umăr de talere teoretice, 7426 Puritea picului.996 Raport semnal/zgomot de fond (S/) 625,3 Similaritatea (în raport cu spectrul de referinţă) 1. SPECIFICITATEA METODEI. S-a demonstrat că semnalul caracteristic componentului principal, P5, nu interferă cu semnale secundare prezente pe cromatogramele prezentate. Figurile IX 1-4 ilustrează selectivitatea metodei prin demonstrarea separării semnalului corespunzător analitului de semnale secundare interferente. Fig.IX.1. Cromatograma soluție blanc placebo. Fig.IX.2. Cromatograma soluţie standard,1 mg/ml. 24
Fig.IX.3. Cromatograma soluţie standard (,5 mg/ml). Fig.IX.4. Cromatograma soluție placebo-reconstituită. ACURATEȚEA METODEI Rezultatele sunt înscrise în tabelul IX.3 Tabel IX.3. Ariile, timpii de retenţie şi abateri determinate. Proba P5 r det. Aria picului Abateri individuale absolute Timp de retenţie Abateri individuale absolute 1 641 1.87 5.235 -.754 2 645 2.13 5.125 -.1854 3 643.13 5.233 -.774 4 642.5.37 5.365.546 5 644.1 1.23 5.423.1126 6 64.9 1.97 5.425.1146 7 642.7.17 5.369.586 8 642.6.27 5.269 -.414 9 642.9.3 5.36.496 1 644 1.13 5.3 -.14 11 MEDIE 642.87 MEDIA 5.31 12 STDEV 1.29 STDEV.1 13 RSD.2 RSD 1.8 Datele privind rezultatele determinărilor sunt înscrise în tabelul IX.4. Tabel IX.4 Rezultatele testului de determinare a acurateţei metodei Medie Deviaţie standard SEM Varianta ITERVAL D1 1 5.812.149.4712.222 D2 1 5.314.9578.329.917 AALIST A1 1 5.812.149.4712.222 A2 1 5.314.9578.329.917 TOTAL 2 5.5612.28473.6367.817 ITERACȚIUE ÎTRE GRUPURI Analist 1/D1 1 5.812.149.4712.222 Analist 1/D2 1 5.314.9578.329.917 Analist 2/D1 Analist 2/D2 AOVA DF Sum of Squares Mean Square F Value P Value Interval - -7.87E-299 1 Analist - -7.87E-299 1 Model 1.2581 - -7.87E-299 1 Eroare 18.28236.1569 - - TOTAL 18 1.5437 - - - 25
Arie Medie Deviatie standard SEM Varianta ITERVAL D1 1 5.812.149.4712.222 D2 1 5.314.9578.329.917 AALIST A1 1 5.812.149.4712.222 A2 1 5.314.9578.329.917 TOTAL 2 5.5612.28473.6367.817 ITERACTIE ÎTRE GRUPURI Analist 1/D1 1 5.812.149.4712.222 Analist 1/D2 1 5.314.9578.329.917 analist 2/D1 analist 2/D2 AOVA DF Suma Media pătratică Valoare F Valoare P patratică Interval -7.115-15 - -3.485-31 1 Analist -7.11E-15 - -3.485-31 1 Model 1 13.14844 13.14844 3.777.718 Eroare 1 6.27294 6.27294 16.99334 7.123-4 TOTAL 17 6.29656 3.54686 - - TOTAL CORECTAT 18 12.5695 - - - În cadrul determinărilor, deviaţia standard relativă pentru arii este de,2%, valoarea medie a ariilor fiind de 642,85, iar deviaţia standard relativă a determinărilor pentru monitorizarea timpilor de 1,8%,. În aceste condiţii, se respectă condiţia privind repetabilitatea determinărilor pentru care valoare RSD<2%. Din punct de vedere al varibilităţii datelor în cadrul celor 2 grupuri, se constată că pentru un grad de certitudine de 95%, nu există o diferenţă semnificativă F = -7.87E-299 (F<p) în cazul determinării timpilor de retenţie şi cu o valoare de - 3.485-31 F<p pentru cazul sursei de variabilitate 2 (analist). În cazul studiului varibilităţii mediilor determinate pentru factorul numărul 2, analist, se constată ca valoarile parametrilor F sunt aceleaşi, deci şi în acest caz nu există o diferenţă statistic semnificativă. La analiza inter-grupuri prin studiul interacţiunii se constată că în cazul ambilor parametri studiaţi, timp de retenţie şi arie nu există o interacţiune semnificativă, mediile celor două grupuri la analiză nu prezintă diferenţe majore, deci în acest caz metoda prezintă acurateţea necesară (cu un grad de certitudine de 95%). LIIARITATEA Pentru studiul linearităţii s-a utilizat proba P5. Soluţie stoc de referinţă (SSR): 1.4 mg proba P5 s-a dizolvat în 1 ml apă cu ultrasonare şi s-a diluat la 25 ml cu metanol, rezultând o concentraţie de.416 mg/ml. SR1:,1 ml SSR + 9,9 ml fază mobilă. SR2:,25 ml SSR + 9,75 ml fază mobilă. SR3:,5 ml SSR + 9,5 ml fază mobilă. SR4:,75 ml SSR + 9,25 ml fază mobilă. SR5: 1, ml SSR + 9, ml fază mobilă. SR6: 1,5 ml SSR + 8,5 ml fază mobilă. SR7: 2, ml SSR + 8, ml fază mobilă. Rezultate: Concentraţiile teoretice şi rezultatele sub forma ariilor obţinute pe trei determinări consecutive ale probelor anterior prezentate, impreună cu media determinărilor sunt prezentate în tabelul IX.5. Tabel IX.5. Condiţiile determinărilor Concentraţia mg/ml Aria picului.416.14.28.312.416.624.832 1 32 641 11 1532 191.4 2965 392 2 321.4 643.4 115 1538 192 2967 3925 3 32.5 639.7 111 1534.5 1915 2966 391 Media determinărilor 32.63 641.37 115. 1534.83 1915.13 2966. 3912.33 Regresie liniară Y = a + bx Panta 4546,9 Intercept 137,74 26
Interval de confidenţă pentru intercept 54,96-22,51 Deviaţie standard reziduală 32,2 Coefficient de corelaţie.9987 Concluzie. Metoda este liniară pe domeniul studiat, iar între concentraţia probei şi aria picului există o legătură directă, semnificativă statistic, gradul de dependenţă dintre cele două variabile fiind de 99,87%. VALIDAREA METODEI DITR-O MATRICE FARMACEUTICĂ Acurateţea metodei analitice pentru determinarea probei P5 s-a realizat prin determinarea a trei soluţii placebo reconstituit. Excipienţii au rolul de a simula condiţiile existente în cadrul produsului analizat. Matricile analizate corespund procentelor de 9% şi 13% faţă de concentraţia maximă a domeniului de liniaritate considerat. Tabel IX.1. Valori experimentale P5 % din concentraţia ţintă 91,57 18,97 128, Arie Timp de retentie Arie Timp de retentie Arie Timp de retentie Seria 1 1399 5,962 1641 5,861 1862 5,786 Seria 2 1397 5,785 1639 5,851 1895 5,825 Seria 3 1398 5,682 164 5,746 1859 5,766 Interpretarea valorilor experimentale. 91.57% Concentraţii teoretice Concentraţii regăsite Regăsirea procentuală Abaterea procentuală.29.27942 96.35243 3.647567.29.27898 96.19972 3.8281.29.2792 96.2768 3.723924 18,97% Concentraţii teoretice Concentraţii regăsite Regăsirea procentuală Abaterea procentuală.34.3331 97.94391 2.5688.34.33257 97.81366 2.186344.34.33279 97.87878 2.121216 128% Concentraţii teoretice Concentraţii regăsite Regăsirea procentuală Abaterea procentuală.4.38195 95.4866 4.513397.4.38925 97.31344 2.686559.4.38128 95.3253 4.679473 Regăsirea procentuală exprimă oblicitatea experimentală maximă la concentraţiile studiate (1*Xr/Xa). Valoarea maximă a abaterilor procentuale este 4,67, deci se respectă condiţia impusă ca abaterile procentuale ale regăsirii sa fie mai mici decât 5. Valoarea medie a factorilor de recuperare este de 96,73%, deviaţia standard a prezentat valori de 1.14, iar deviaţia standard relativă a fost de 1,51%. Considerând un interval de încredere de 95%, domeniul de confidenţă este cuprins între 95,94% şi 97,52%, fără a considera valoarea de 1%. Cu toate acestea deviaţia de la valorile teoretice este mică, sub 5%, deci valoarea medie a recuperării este corespunzătoare scopului considerat. PRECIZIE REPETABILITATE Tabel IX.12. Valori experimentale. r. det. Aria semnalului Abateri individuale Abateri procentuale 1 641 1.87.2988371 2 645 2.13.33132677 3 643.13.2221818 4 642.5.37.5755444 27
5 644.1 1.23.19132957 6 64.9 1.97.36438316 7 642.7.17.26443916 8 642.6.27.4199916 9 642.9.3.4666573 1 644 1.13.175774262 Media 642.87 Oblicitate -.8361 Eroare standard.47717 Domeniu 4.1 Mediana 642.8 Minimum 64.9 Deviaţie standard 1.289315 Maximum 645 Varianta probelor 1.662333 Suma 6428.7 Distribuţie -.24664 r. determinăi 1 Domeniu de confidenţă 641,94-643,79 Repetabilitatea a fost investigată prin analizarea a 1 probe la concentraţia de 1%. Rezultatele au fost sumarizate în tabelul IX.12. Deviaţia standard relativă a fost de,199% iar domeniul de confidenţă a fost de,92 relativ la valoarea medie. Deci, toate valorile s-au înscris în acest domeniu. LIMITA DE DETECȚIE ŞI DE CUATIFICARE Tabel IX.13. Limita de detecție si de cuantificare P5 coeficient de regresie-r.999365 R2.998731 coeficient ajustat.998477 eroare standard 5.15671 Panta 4546.97 LOD (mg/ml).334 LOQ (mg/ml).11134 DEPISTAREA VALORILOR ABERATE - TESTUL DIXO S-au obținut următoarele date: Q calculat =.12 pentru aria picului pentru P5. Q teoretic, cu pragul de semnificaţie α =,1, este,568. Având în vedere că Q calculat < Q teoretic, în toate cazurile, rezultă că nu sunt valori aberante. Picul corespunzător P5 nu coeluează cu picurile corespunzătoare altor substante, nu este extins, nu are alt aspect. u se observă picuri parazite la același timp de retenţie cu picul corespunzător substanței de analizat. COMPUSUL 8, P8 Material și metodă. Metoda s-a dezvoltat pe un cromatograf de lichide de inalta performanta de tip Agilent, 11 series echipat cu pompă la o presiune maximă 4 barri, injector manual, detector DAD şi degazor. Faza staţionară a constat dintr-o coloană cu suport din otel inoxidabil cu lungimea de 15 mm, diametru intern de 4. mm, ce conţine silice pe suprafaţa căreia s-au grefat grupări octadecilsilil, mărimea particulelor fiind de 3 µm. Faza mobilă a constat dintr-un amestec format din soluție acid formic,2%, metanol şi acetonitril în proporţiile 35:45:2, iar eluţia de tip izocratic la un debit de 1,2 ml/min. REZULTATE PARAMETRI DETERMIAȚI COMPATIBILITATEA SISTEMULUI Tabel IX.14. Rezultate parametri de compatibilitate Parametrii P8 Timp de retenţie 2,83 Factorul de capacitate, k 14 Rezoluţie (Rs) 4,6 Factor de întindere (T) 1. umăr de talere teoretice, 1112 Puritatea picului.999 Raport semnal/zgomot de fond (S/) 2125 Similaritate (în raport cu spectrul de referinţă) 1. SPECIFICITATEA METODEI S-a demonstrat că semnalul caracteristic componentului principal, P8, nu intereferă cu semnale secundare prezente pe cromatogramele prezentate. S-au efectuat analize HPLC pentru soluţiile standard, soluţiile probă, pentru faza mobilă blanc şi pentru soluţiile placebo-reconstituite. Rezultate: Figura IX.17.(a-c) ilustrează selectivitatea metodei prin demonstrarea separării semnalului corespunzător analitului de semnale secundare interferente. 28
Fig.IX.17. HPLC cromatogramele pentru demonstrarea selectivităţii metodei. Puritatea semnalelor cromatografice pentru concentraţiile de,14 mg/ml şi respectiv,2 mg/ml prezintă valori de.993 şi respectiv.998 ceea ce indică faptul că nu există impurităţi sau constituienţi ale matricii în cazul placebo reconstituit care să coelueze cu semnalele componenţilor ţintă. ACURATEȚEA METODEI Tabel IX.16. Ariile, timpii de retenţie şi abateri determinate. D1 D2 PROBA P8 PARAMETRII r det Aria picului Abateri individuale Timp de retenţie Abateri individuale 1 1148 1.285714 2.425.27 2 1144 5.285714 2.423.29 3 114 9.285714 2.438.14 4 1152 2.714286 2.455.3 5 1152 2.714286 2.46.8 6 1148 1.285714 2.485.33 7 1152 2.285714 2.41.51 8 1155 2.714286 2.435.17 9 1145 5.714286 2.52.5 1 1155 4.285714 2.482.3 11 1157 5.714286 2.433.19 12 1153 7.714286 2.485.33 MEDIA 1149.286 MEDIA 2.452 STDEV 5.224625 STDEV.31142 RSD.454598 RSD 1.2761 Tabel IX.17. Rezultatele testului AOVA. Timp de retenție Grupuri umăr Suma Media Varianța D1 6 16.722 2.787.576 D2 6 14.738 2.456333.1525 Sursa variației SS df MS F P-det F crit Intre grupuri.32821 1.32821 99.3723 1.64E-6 4.96463 În cadrul grupului.339 1.331 29
Arie Grupuri umăr Suma Media Varianța D1 7 831 1147.286 18.2381 D2 7 859 1151.286 31.57143 Sursa variației SS df MS F P-det F crit Intre grupuri 56 1 56 2.248566.15958 4.747225 În cadrul grupurilor 298.8571 12 24.9476 În cadrul determinărilor, deviaţia standard relativă pentru arii este de,45%, valoarea medie a ariilor fiind de 1149.29, deviaţia standard relativă a determinărilor pentru monitorizarea timpilor este de 1,27%, valoarea medie fiind 2.45 minute. În aceste condiţii, se respectă condiţia privind repetabilitatea determinărilor pentru care valoare RSD<2%. Din punct de vedere al varibilităţii datelor în cadrul celor două grupuri, determinate de sursa de varibilitate considerată, interval de timp, se constată că pentru un grad de certitudine de 95%, există o diferenţă semnificativă F=99,37 (F>p) și F>F crit. în cazul determinării timpilor de retenţie. Pentru variabila arie, la validarea variației mediilor determinate în cazul analizei în intervalul determinat, nu se constată diferențe statistic semnificative, F determinat <F crit și distribuția datelor relevă dispunerea acestora în intervalul considerat. (p>.5). La analiza inter-grupuri prin studiul interacţiunii se constată că în cazul ambilor parametri studiaţi, timp de retenţie şi arie nu există o interacţiune semnificativă, mediile celor două grupuri la analiză nu prezintă diferenţe majore, deci în acest caz metoda prezintă acurateţea necesară (cu un grad de certitudine de 95%). Analiza descriptivă inter-grupuri a determinat un interval de încredere pentru arie cuprins între 2,43 și 2,47. În cazul ariilor determinate, variabilitatea este cuprinsă între 1152,32 şi 1146,269. LIIARITATE Pentru studiul linearităţii s-a utilizat proba P8. Soluţie stoc de referinţă (SSR): 12,4 mg proba P8 s-a dizolvat în 1 ml apă cu ultrasonare și s-a diluat la 1 ml cu metanol, rezultând o concentraţie de 1,24 mg/ml. SR1: 1, ml SSR + 9, ml fază mobilă (,124 mg/ml). SR2:,75 ml SSR + 9,25 ml fază mobilă (,93 mg/ml) SR3:,5 ml SSR + 9,5 ml fază mobilă (,62 mg/ml). SR4:,25 ml SSR + 9,75 ml fază mobilă (,31 mg/ml). SR5:,1 ml SSR + 9,9 ml fază mobilă (,124 mg/ml). SR6:,5 ml SSR + 9,95 ml fază mobilă (,62 mg/m). Rezultate. Concentraţiile teoretice şi rezultatele sub forma ariilor obţinute pe trei determinări consecutive ale probelor anterior prezentate, împreună cu media determinărilor sunt prezentate în tabelul IX.18. Tabel IX.18. Date privind parametrii determinărilor cromatografice efectuate Concentraţia mg/ml Aria picului.416.14.28.312.416.624.832 1 32 641 11 1532 191.4 2965 392 2 321.4 643.4 115 1538 192 2967 3925 3 32.5 639.7 111 1534.5 1915 2966 391 Media determinărilor 32.63 641.37 115. 1534.83 1915.13 2966. 3912.33 Regresie liniară Y = a + bx Panta 17686 Intercept 19.35 Interval de confidenţă pentru intercept 17138.6-18142.12 Deviaţia standard reziduală 17.71 Coeficient de corelaţie.9999 Concluzie: - metoda este liniară pe domeniul studiat, iar între concentraţia probei şi aria picului există o legătură directă, semnificativă statistic, gradul de dependenţă dintre cele două variabile fiind de 99.99%. ACURATEŢEA METODEI AALITICE Acurateţea metodei analitice pentru determinarea probei P8 s-a realizat prin determinarea a trei soluţii placebo reconstituite. Componenta excipienţilor are rolul de a simula condiţiile existente în cadrul produsului analizat. Matricile analizate corespund procentelor de 8% şi 12% faţă de concentraţia maximă a domeniului de liniaritate considerat (Tabelul IX.22.). Tabel IX.22. Matricea farmaceutică cu compusul C8 (P8). P1 P2 P3 P8 8.1 9.7 11.8 celuloza microcristalină 29.7 29.2 29.9 carbonat de calciu 41.2 4.3 4.1 3