OPTIMIZAREA DIAGNOSTICULUI ŞI PROFILAXIEI RETARDULUI MENTAL DE CAUZE GENETICE

Transcription

1 Investeşte în oameni! Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane Axa prioritară Educatia si formarea profesională în sprijinul cresterii economice si dezvoltării societătii bazate pe cunoastere Domeniul major de intervenţie 1.5 Programe doctorale si post-doctorale în sprijinul cercetării Titlul proiectului: Burse doctorale pentru cresterea competitivitatii in domeniul medical si farmaceutic Numărul de identificare al contractului: POSDRU/88/1.5/S/58965 Beneficiar : Universitatea de Mdicina si Farmacie Gr. T. Popa Iasi Partener : Universitatea de Medicina si Farmacie Iuliu Hatieganu Cluj Napoca UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GRIGORE T.POPA IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ OPTIMIZAREA DIAGNOSTICULUI ŞI PROFILAXIEI RETARDULUI MENTAL DE CAUZE GENETICE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC, PROF. UNIV. DR. MIRCEA COVIC DOCTORAND, ADRIANA CARAMAN (SIRETEANU) 2013

2 CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT I. INTRODUCERE...1 II. STUDIUL LITERATURII RETARDUL MENTAL - DATE GENERALE Definiţie Clasificare şi prevalenţă Etiologie ETIOLOGIA GENETICĂ Anomalii cromozomiale Forme monogenice de retard mental MECANISME CELULARE ŞI MOLECULARE ÎN RETARDUL MENTAL Neurogeneza Migrarea neuronală Funcţia sinaptică Mecanisme epigenetice METODE FOLOSITE PENTRU IDENTIFICAREA CAUZELOR GENETICE ALE RETARDULUI MENTAL Cariotipul şi tehnicile ce evaluează un număr limitat de regiuni genomice Tehnologiile bazate pe microreţele (microarray) Tehnici de secvenţiere masivă paralelă PROFILAXIA RETARDULUI MENTAL DE CAUZE GENETICE III. CONTRIBUŢII PERSONALE METODE ŞI LOTURI DE STUDIU Metode generale Loturi de studiu STUDIU CITOGENETIC AL PACIENŢILOR CU RETARD MENTAL IDIOPATIC Introducere Lot şi metode Rezultate Discuţii Concluzii OPTIMIZAREA DIAGNOSTICULUI PACIENŢILOR CU RETARD MENTAL DE CAUZE GENETICE FOLOSIND TEHNICA MLPA Introducere Loturi şi metode Rezultate Discuţii Concluzii...70

3 4. BENEFICIILE TEHNICII SNP ARRAY PENTRU DIAGNOSTICUL RETARDULUI MENTAL SPECIFIC (STUDIU PE 20 DE CAZURI) Introducere Lot şi metode Rezultate Discuţii Concluzii OPTIMIZAREA DIAGNOSTICULUI ÎN SINDROMUL AARSKOG ŞI SINDROMUL X FRAGIL Caracterizarea fenotipică şi moleculară a pacienţilor cu Sindrom Aarskog Optimizarea strategiei de diagnostic în Sindromul X fragil IV. CONCLUZII GENERALE BIBLIOGRAFIE ANEXA 1. LUCRĂRI PUBLICATE ÎN TIMPUL STAGIULUI DOCTORAL Teza de doctorat este ilustrată prin 73 de figuri şi 27 de tabele. Acest rezumat redă selectiv bibliografia şi iconografia în text, respectând numerotarea şi cuprinsul din teză. Cercetarea a fost realizată în cadrul proiectului Burse doctorale pentru creşterea competitivităţii în domeniul medical şi farmaceutic POSDRU/88/1.5/S/58965, cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane

4 SECŢIUNEA I. INTRODUCERE Retardul mental (RM) este o afecţiune frecventă, cu consecinţe majore pentru individ şi familie, dar şi pentru societate. Cauzele sunt variate, ponderea celor genetice fiind diferită în funcţie de severitatea RM. Datorită heterogenităţii genetice şi clinice a RM, în aproximativ jumătate din cazuri diagnosticul etiologic nu poate fi stabilit, în ciuda investigaţiilor extensive. Stabilirea unui diagnostic specific, precis sau suficient de clar privind cauzele şi patogenia RM va avea beneficii pentru bolnav (eliminarea testelor inutile şi scumpe, stabilirea acţiunilor medicale şi terapeutice adecvate, depistarea presimptomatică a complicaţiilor, planning educaţional şi intervenţie socială), dar şi pentru familia bolnavului (prognostic ce va permite o ghidare anticipativă, sprijin medical, social, şi educativ, sfat genetic şi opţiuni reproductive). Obiectivul principal al acestei teze de doctorat este optimizarea modului de evaluare al cazurilor cu RM prin selectarea adecvată a metodelor de testare genetică care să furnizeze rezultatele cele mai bune diagnostic precoce, complet şi corect la un cost cât mai scăzut. De asemenea, lucrarea îşi propune stabilirea frecvenţei diferitelor categorii genetice de RM în lotul studiat, precum şi actualizarea datelor privind spectrul mutaţiilor şi tabloul clinic la pacienţii cu RM, pentru optimizarea sfatului genetic şi a diagnosticului prenatal. CAPITOLUL III.2 STUDIU CITOGENETIC AL PACIENŢILOR CU RETARD MENTAL IDIOPATIC 2.1. Introducere Tehnicile de marcaj în benzi reprezintă proceduri de rutină în laboratoarele de citogenetică clinică şi sunt deosebit de importante în evaluarea indivizilor cu RM sau întârziere în dezvoltare, indiferent de asocierea cu trăsături dismorfice, tulburări de creştere, hipostatură, anomalii congenitale sau tulburări de comportament. Procentul de anomalii cromozomiale relevante clinic identificate la cariotipul standard este dificil de stabilit cu precizie, deoarece studiile efectuate sunt diferite în ceea ce priveşte locaţia efectuării (clinică de pediatrie sau instituţie destinată copiilor cu RM), 1

5 severitatea RM, prezenţa sau absenţa anomaliilor congenitale, şi tipul de studiu citogenetic. Obiectivul acestui studiu a fost stabilirea frecvenţei şi a tipurilor de anomalii cromozomiale identificate prin cariotipul standard la un grup de 319 pacienţi cu RM sindromic idiopatic Lot şi metode În acest studiu retrospectiv am analizat din punct de vedere citogenetic 319 pacienţi cu RM sindromic, evaluaţi la Cabinetul de Genetică Medicală în perioada , la care s-a efectuat analiza cromozomială standard. Pacienţii cu tablou clinic sugestiv de sindrom Down au fost excluşi din studiu. Analiza cromozomială standard s-a realizat conform unei metode adaptate după Moorhead et al. [1], pe culturi de limfocite din sânge periferic heparinat. S-au analizat minim 16 metafaze cu 550 de benzi la un microscop Nikon, dotat cu cameră CCD, iar imaginile captate au fost analizate cu ajutorul programului CytoVision. În cazul depistării a două linii celulare numărul de metafaze analizate a crescut la 32, iar identificarea a 3 linii celulare a impus examinarea a minim 64 de celule. Denumirea anomaliilor identificate s-a realizat conform nomenclaturii standard internaţionale (International Standard Nomenclature - ISCN 2005) Rezultate Dintre cele 319 cazuri cu RM sindromic, la 84 de pacienţi (26.3%) s-a identificat o anomalie cromozomială. La 11.9% dintre toţi pacienţii analizaţi (38 din 319) diagnosticul clinic a fost concordant cu diagnosticul citogenetic. Anomaliile numerice au reprezentat 40% dintre cazurile anormale (34 din 84), autozomii fiind implicaţi în 71% din cazuri (24 din 34). Repartiţia pe sexe a fost relativ egală (16 indivizi de sex masculin, 18 de sex feminin). Anomaliile structurale au reprezentat 53% dintre cazurile anormale (44 din 84); dintre anomaliile structurale, cele mai frecvente au fost deleţiile (46%, respectiv 6,3% din tot lotul studiat). Anomaliile structurale au fost uşor mai frecvente la sexul feminin (24 cazuri din 44). Anomalii complexe (mozaicuri cu anomalii numerice şi structurale prezente la acelaşi individ) au fost detectate la 6 pacienţi (7.1% dintre anomaliile identificate). 2

6 2.4. Discuţii În acest studiu, prezenţa anomaliilor cromozomiale la pacienţii cu RM (excluzând sindromul Down) a fost de 26,3%. Diferite studii (recenzate de Battaglia [2]) au raportat o frecvenţă a anomaliilor cromozomiale de % la indivizii cu RM. Factorii care influenţează rezultatul studiilor citogenetice în RM sunt: sursa de selectare a pacienţilor (studiile efectuate pe copii instituţionalizaţi deseori au o selecţie foarte riguroasă a pacienţilor - de exemplu pacienţi cu RM sever), vârsta evaluării (la o vârstă mică sunt disponibile informaţii despre dezvoltarea pre-, peri- şi postnatală), gradul de severitate al RM (un IQ < 50 creşte rata de stabilire a diagnosticului), progresul tehnicilor imagistice şi de laborator, şi experienţa clinicienilor [3]. Pacienţii incluşi în studiul nostru au fost selectaţi iniţial în teritoriu, de către medicul de familie (deseori pe baza asocierii RM cu o dismorfie facială evidentă şi/sau anomalii congenitale multiple) şi ulterior de către medicul genetician, pe baza aşa-numitului fenotip "cromozomial" (care determină anomalii cromozomiale de dimensiuni mari), caracterizat prin RM moderat-sever asociat cu una sau mai multe anomalii congenitale majore. CAPITOLUL III.3 OPTIMIZAREA DIAGNOSTICULUI PACIENŢILOR CU RM DE CAUZE GENETICE FOLOSIND TEHNICA MLPA 3.1. Introducere Introducerea în ultima decadă a tehnologiei microarray a permis detecţia CNV-urilor (sub)microscopice la o rezoluţie de până la dimensiunea unui singur exon şi a dus la identificarea a numeroase sindroame cu microdeleţii şi microduplicaţii [4], fiind recomandată ca prim test diagnostic în evaluarea indivizilor cu RM sau anomalii congenitale multiple [5]. Această tehnologie necesită însă echipamente şi consumabile scumpe, care nu sunt accesibile pentru toate centrele diagnostice. În principiu, o parte dintre anomaliile identificate prin microarray sunt detectabile şi folosind diferite seturi MLPA. Având în vedere diferenţa de costuri dintre platformele array pentru întregul genom şi MLPA, şi faptul că efortul de a clarifica un rezultat iniţial anormal (diferenţierea CNV-urilor fără semnificaţie clinică de cele patogene) este valabil în aceeaşi măsură pentru ambele metode, screening-ul pacienţilor cu RM folosind tehnica MLPA reprezintă o 3

7 opţiune rezonabilă în evaluarea diagnostică a RM, mai ales în ţările în curs de dezvoltare. Obiectivul acestui studiu a fost stabilirea capacităţii de stabilire a diagnosticului etiologic la un grup de pacienţi cu RM sindromic (asociat cu dismorfie cranio-facială şi/sau anomalii congenitale multiple), folosind o combinaţie de seturi MLPA Loturi şi metode Pentru acest studiu lotul de pacienţi a constat din 307 de bolnavi cu RM sindromic de etiologie necunoscută, cu vârsta peste 3 luni. Pacienţii cu tablou clinic sugestiv pentru aneuploidii (trisomiile 21, 13, 18 şi sindromul Turner) şi sindrom X fragil nu au fost incluşi în studiu. Toţi pacienţii au fost investigaţi prin metoda MLPA, folosind fie seturile pentru rearanjări subtelomerice P036 şi P070, dacă fenotipul nu a fost sugestiv pentru un sindrom cu microdeleţie (sublotul A pacienţi), fie seturile P064 sau P096, dacă fenotipul a fost sugestiv pentru o microdeleţie (sublotul B pacienţi). Pacienţii cu diagnostic clinic de sindrom Prader Willi conform criteriilor consens stabilite de Holm (sublotul C - 17 pacienţi) au fost investigaţi prin tehnica MLPA specifică pentru metilare. Pentru pacienţii din sublotul A au fost folosite două seturi de sonde: SALSA P036 (variantele B1 şi E1) şi P070-B2. Aceste seturi au fost create pentru a detecta diferenţele numărului de copii din regiunile subtelomerice ale tuturor cromozomilor, cu excepţia braţelor scurte ale cromozomilor acrocentrici (13p, 14p, 15p, 21p şi 22p), pentru care seturile includ sonde situate pe braţul q, în apropiere de regiunea centromerică. Rezultatele concordante la ambele seturi au fost caracterizate folosind un set MLPA de follow-up, în funcţie de anomalia cromozomială descoperită. Dimensiunile rearanjărilor au fost stabilite folosind browserul genomic UCSC (NCBI36/hg18, Pentru pacienţii din sublotul B s-au folosit două seturi MLPA (P064 şi P096) a căror sonde ţintesc regiunile frecvent implicate în sindroamele cu RM determinate de microdeleţii. Rezultatele au fost interpretate ca fiind patogene atunci când mai mult de două sonde din aceeaşi regiune au avut rezultate anormale. Pentru pacienţii din sublotul C s-a folosit un set MLPA specific pentru metilare (ME028-B1), care oferă informaţii atât despre numărul 4

8 de copii cât şi despre statusul metilării în regiunea 15q11, implicată în sindroamele Prader Willi/Angelman Rezultate Sublotul A Cohorta de pacienţi a inclus 176 de indivizi cu RM sindromic. Rezultatele au fost neconcordante între cele două seturi la 12 pacienţi. Dintre cele 164 de cazuri concordante, 18 cazuri au avut rezultate anormale (~10% din totalul cazurilor, vezi figura 3.1), iar 146 au avut rezultate normale. Descrierea clinică şi moleculară a celor 18 rearanjări subtelomerice detectate de două sonde MLPA diferite (seturile P036 şi P070) este prezentată în tabelul 3.3. Confirmarea şi caracterizarea anomaliilor prin setul de urmărire adecvat a fost posibilă pentru cazurile 7-18; au fost caracterizate în total 21 de anomalii, dintre care 15 singulare (nerepetate) Sublotul B Cohorta de pacienţi a inclus 114 indivizi cu RM specific sugestiv pentru un sindrom cu microdeleţie. Folosind (în funcţie suspiciunea clinică) unul dintre cele două seturi MLPA (P064 sau P096) au fost identificate 12 cazuri (10,5%) cu microdeleţii: 6 cazuri cu sindrom velocardiofacial, 5 cazuri cu sindrom Williams şi 1 caz cu sindrom Wolf Hirschhorn. Toate cazurile identificate au fost confirmate prin tehnica FISH Sublotul C Sublotul C a inclus 17 pacienţi cu fenotip sugestiv de Sindrom Prader Willi. Folosirea tehnicii MLPA specifică pentru metilare a relevat o deleţie heterozigotă tip II (între punctele de ruptură 2 şi 3) în 15q11.2-q13 la un pacient (pacientul 5) (figura 3.7) şi prezenţa a două copii metilate şi dozaj normal pe 15q11.2-q13 la 4 pacienţi (pacienţii 1-4). Deleţia a fost confirmată prin testul FISH. Profilul anormal al metilării la unul dintre cei patru pacienţi este redat exemplificativ în figura

9 Figura 3.7. Detecţia unei deleţii heterozigote pe 15q11.2-q13 la un pacient cu sindrom Prader Willi Vârfurile date de produşii de amplificare sunt reduse la ~50% de la punctul de ruptură 2 (gena MKRN3) la punctul de ruptură 3 (gena GABRB3), corespunzător unei deleţii tip II. Figura 3.8. Detectarea a două copii metilate la o pacientă cu sindrom Prader Willi. Panoul superior: dozaj normal pe 15q11.2-q13 (vârfurile date de produsul de amplificare sunt la nivelul 1). Panoul inferior: cele cinci sonde oligonucleotidice nemetilate specifice pentru regiunea amprentată din sindromul Prader Willi formează cu ADN-ul metilat al pacientei hibrizi hemimetilaţi care nu sunt digeraţi de enzima sensibilă la metilare Hha1, se amplifică şi produc semnal. Vârfurile date de produsul de amplificare sunt la nivelul 1, corespunzător prezenţei a două copii metilate (materne). 6

10 3.4. Discuţii Sublotul A Dintre cele 18 cazuri cu rearanjări identificate de două sonde MLPA diferite, semnificaţia clinică a anomaliei a fost neclară în trei cazuri (1, 2 şi 7), iar pentru 15 cazuri anomalia a fost considerată patogenă, fiind concordantă cu fenotipul. Luând în considerare datele din literatură şi localizarea anomaliilor (cazul 1 şi 2), precum şi dimensiunea şi conţinutul genic (cazul 7), am considerat că CNV-ul identificat la cazul 1 este posibil patogen, iar cele identificate la cazurile 2 şi 7 sunt cel mai probabil benigne, dar pentru a stabili acest lucru este imperios necesară testarea părinţilor. Prin urmare, folosind combinaţia de seturi MLPA P036/P070 am stabilit diagnosticul etiologic la 15 din 176 de indivizi cu RM sindromic (8,5%). Într-un articol tip recenzie realizat de Ravnan et al. se arată că frecvenţa RM determinat de dezechilibre subtelomerice este per ansamblu de 6%, variind între diferite studii de la 2 la 29% [6]. Motivele pentru existenţa acestei diferenţe sunt criteriile de includere în studiu, dimensiunea lotului şi excluderea completă (sau nu) a polimorfismelor. Dacă se iau în consideraţie doar studiile pe grupuri mari, frecvenţa anomaliilor subtelomerice criptice este estimată între 2.5% [6] şi 2.6% [7]. Selectând pacienţii pe baza prezenţei RM sindromic idiopatic în acest studiu am obţinut o rată de detecţie de 8,5%, peste media de 6% raportată de Ravnan et al. [6], ceea ce ilustrează eficienţa utilizării a două seturi de screening subtelomeric la toţi pacienţii şi evaluării rezultatelor anormale folosind seturi follow-up. Utilizarea unui set follow-up permite atât confirmarea prezenţei anomaliei, cât şi determinarea dimensiunii ei. Folosind diferite seturi follow-up în acest studiu la 12 pacienţi am stabilit dimensiunea aproximativă la 9 din 15 anomalii singulare caracterizate prin follow-up (60%) (tabelul 3.3). În plus, la doi pacienţi (9 şi 10), la care seturile de screening au arătat prezenţa unor deleţii (5pter, respectiv 2qter), folosirea seturilor follow-up (P358, respectiv P264) a arătat şi prezenţa unor duplicaţii proximale. S-a reuşit astfel identificarea materialului suplimentar de origine neprecizată observat la cariotipul standard la aceşti doi pacienţi. În literatură există un singur studiu, publicat în luna februarie 2013, care foloseşte seturile follow-up pentru confirmarea şi stabilirea dimensiunilor dezechilibrelor subtelomerice [8]. Autorii au 7

11 stabilit dimensiunea dezechilibrelor subtelomerice la două treimi dintre anomaliile identificate Sublotul B Incidenţa sindroamelor cu microdeleţie/microduplicaţie a fost de 10,5%, marea majoritate (11 din 12) fiind identificate folosind setul P064. Alte studii MLPA ce au folosit setul P064 au avut o rată de detecţie de 5,8-9,2%, dacă pacienţii au fost selectaţi pe baza prezenţei RM şi/sau a anomaliilor congenitale multiple [9, 10], respectiv de 14,1%, dacă pacienţii au fost selectaţi pe baza suspiciunii de sindrom cu microdeleţie [9]. Toate aceste date subliniază faptul că anomaliile submicroscopice sunt implicate într-un număr important de cazuri cu RM/anomalii congenitale multiple, iar selectarea pacienţilor pe baza suspiciunii clinice de sindrom cu microdeleţie/microduplicaţie poate creşte rata de detecţie Sublotul C Testul MLPA specific pentru metilare (setul ME028) are capacitatea de a detecta peste 99% din cazurile de sindrom Prader Willi, realizând atât analiza metilării cât şi analiza numărului de copii în regiunea critică pentru sindromul Prader Willi (identifică tipurile de deleţie 1 şi 2), dar nu poate face diferenţa între disomia uniparentală maternă şi defectele centrului de amprentare [11]. Unele laboratoare, în special din Europa, folosesc in prezent acest test ca prim test diagnostic în sindromul Prader Willi în locul analizei metilării prin Southern blot sau PCR specific pentru metilare, deoarece aduce suplimentar informaţii privind numărul de copii din regiunea 15q11.2. Folosind acest set am stabilit diagnosticul etiologic la 5 din 17 pacienţi selectaţi conform criteriilor Holm (29,4%). Sumarizând datele obţinute din cele trei loturi, folosirea combinată a seturilor MLPA a dus la stabilirea diagnosticului la 32 pacienţi din lotul total de 307 cazuri (10,4%). Alte studii ce au folosit o combinaţie de trei seturi MLPA (screening subtelomeric şi set P064 pentru microdeleţii) la toţi pacienţii au avut rate de detecţie de 14% [8], respectiv 20,7% [10], dar criteriile de includere în studiu au fost diferite: pacienţi cu RM cu/fără dismorfie facială sau anomalii congenitale în primul studiu, şi pacienţi cu anomalii congenitale multiple cu/fără RM în cel de-al doilea. Un studiu efectuat pe pacienţi cu RM şi/sau trăsături dismorfice, în care au fost utilizate aceleaşi trei seturi dar separat, pe grupuri de pacienţi, a avut o rată de detecţie de 7,2% [12]. Toate aceste studii arată că folosirea combinată a unor seturi MLPA are o rată de 8

12 detecţie relativ mare la pacienţii cu RM, apropiată de cea de ~19% raportată de o recenzie efectuată pe 29 de studii bazate pe microarray. De altfel, un studiu recent ce a comparat diferite abordări de investigare a pacienţilor cu RM [13] a sugerat că înlocuirea analizei cromozomiale cu MLPA ca prim test diagnostic, urmat de microarray, poate fi eficientă în ceea ce priveşte rata de detecţie şi raportul cost-eficienţă. CAPITOLUL III.4 BENEFICIILE TEHNICII SNP ARRAY PENTRU DIAGNOSTICUL RM SPECIFIC (STUDIU PE 20 DE CAZURI) 4.1. Introducere Recent, un consorţiu internaţional de experţi a recomandat utilizarea tehnologiei microarray ca prim test de diagnostic în evaluarea pacienţilor cu RM şi/sau anomalii congenitale multiple [5]. Nu există însă un consens privind alegerea tipului de microarray, a distribuţiei sondelor în genom sau a rezoluţiei potrivite pentru utilizarea în scop diagnostic. Odată cu creşterea rezoluţiei şi a acoperirii genomului reprezentat pe microarray, numărul CNV-urilor cu semnificaţie clinică neclară creşte disproporţional. Estimări recente indică faptul că până la 12% din genomul uman normal este reprezentat de CNV-uri [14], numărul de CNV-uri aparent benigne per persoană variind de la în diferite studii, în funcţie de tehnologia folosită şi de dimensiunea inclusă în definirea unui CNV [15]. În stadiul actual al cunoaşterii, identificarea unor CNV-uri la un pacient cu RM/ACM ridică problema diferenţierii între variantele genetice benigne şi cele implicate în determinarea fenotipului pacientului [16]. Interpretarea este dificilă, mai ales într-un laborator clinic. În acest studiu vom prezenta rezultatele obţinute prin testarea a 20 de pacienţi cu RM sindromic idiopatic folosind două platforme SNP array cu rezoluţie mare şi vom discuta dificultăţile în stabilirea semnificaţiei clinice a anomaliilor detectate Lot şi metode Dintre pacienţii evaluaţi la Cabinetul de Genetică Medicală Iaşi în perioada am selectat 20 de pacienţi (10 fete şi 10 băieţi, cu vârste cuprinse între 1 an şi 9 luni şi 22 de ani) cu RM uşor-sever asociat cu alte trăsături sugestive pentru o anomalie cromozomială (DF, tulburări de creştere cu debut pre/postnatal, anomalii congenitale şi/sau istoric familial pozitiv). 9

13 Au fost folosite două platforme SNP array pentru identificarea anomaliilor cromozomiale. Pentru pacienţii 1-5 tehnica SNP array s-a realizat cu platforma CytoScan HD Array (Affymetrix), la Departamentul de Genetică Umană de la Radboud University Nijmegen Medical Centre, iar pentru pacienţii 6-20 s-a realizat cu platforma HumanCytoSNP-12 v2.1 BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA), la Departamentul de Genetică al Universităţii din Groningen. Doar la 3 pacienţi au putut fi evaluaţi prin SNP array şi părinţii (5 părinţi, unul fiind decedat înainte de recoltarea ADN-ului), aceştia fiind testaţi prin SNP array ţintit pe regiunea cu CNV-ul identificat la copil. Toate CNV-urile detectate au fost căutate sistematic în bazele de date locale ale instituţiilor unde s-a efectuat analiza şi în baza de date publică Database of Genomic Variants (DGV) care conţine CNV-uri raportate la indivizi normali. S-au aplicat următoarele reguli pentru a determina dacă CNV-ul este benign: un CNV benign trebuie să fie raportat la minim 3 indivizi (preferabil în seturi de date diferite) şi cu aceeaşi orientare (deleţie/amplificare). În plus, CNV-ul descoperit la pacient s-a considerat că se suprapune semnificativ cu CNV-ul cunoscut (comun) dacă această suprapunere este de minim 50% iar segmentul genomic nesuprapus (unic) are o dimensiune mai mică de 100 kb. Dacă anomalia nu a fost raportată ca o variantă benignă, s-a analizat existenţa unei legături între fenotip (sau o anumită trăsătură fenotipică) şi poziţia genomică, genele conţinute şi funcţia acestora. Acest lucru s-a realizat prin interogarea bazelor de date publice DECIPHER şi ECARUCA în vederea identificării anomaliilor similare sau suprapuse, precum şi a browser-ului genomic UCSC şi a bazei de date OMIM pentru a cunoaşte funcţiile genelor, patogenicitatea lor şi tipul de transmitere. Cercetarea literaturii privind un anumit CNV a fost de asemenea un pas important pentru a determina semnificaţia lui clinică.conform ghidurilor pentru intepretarea şi raportarea CNV-urilor constituţionale postnatale [17, 18], CNV-urile detectate au fost clasificate în 4 categorii: CNV-uri patogene, CNV-uri cu o posibilă relevanţă clinică, CNV-uri cu semnificaţie clinică incertă (Variant of Uncertain Clinical Significance - VOUS) şi CNV-uri benigne Rezultate Studiul s-a axat pe detectarea CNV-urilor la 20 de pacienţi cu RM sindromic folosind două platforme SNP array ce includ sonde polimorfice şi nonpolimorfice. 10

14 Pentru 5 pacienţi s-a folosit pentru testare platforma CytoScan HD şi s-au identificat 6 CNV-uri, iar pentru 15 pacienţi s-a folosit platforma HumanCytoSNP-12, fiind identificate 19 CNV-uri. Şase pacienţi au prezentat regiuni de homozigozitate, asociate sau nu cu CNV-uri Discuţii În acest studiu tehnica SNP array a fost utilizată pentru a identifica CNV-uri patogene la 20 pacienţi cu RM/ACM de etiologie necunoscută. Din totalul de 25 CNV-uri identificate, 8 anomalii au fost considerate patogene, 4 CNV-uri au fost polimorfisme benigne, 12 VOUS (7 probabil benigne, 5 cu semnificaţie necunoscută) şi 1 CNV cu posibilă relevanţă clinică. Polimorfismele benigne (identificate în DGV) au fost excluse de la cercetări ulterioare Anomalii patogene Opt CNV-uri (identificate la şapte cazuri: 4 şi 15-20) au fost considerate patogene deoarece sunt asociate cu sindroame cunoscute. Aceste sindroame au fost recunoscute ulterior de către medicul genetician, ceea ce subliniază dificultatea de a stabili diagnosticul exclusiv pe bază clinică CNV-uri cu semnificaţie clinică incertă (VOUS) Stabilirea semnificaţiei clinice a CNV-urilor care nu sunt raportate în DGV şi care nu au mai asociate cu sindroame cu microdeleţii/microduplicaţii reprezintă o provocare, deoarece regiuni care conţin gene codante pot fi prezente într-un număr variabil de copii fără a determina manifestări clinice evidente. CNV-urile identificate la pacienţii 1, 3 şi 5 au fost considerate VOUS probabil benigne deoarece au fost moştenite de la unul dintre părinţi, fenotipic normali. Totuşi, având în vedere că ele nu au mai fost raportate în literatură şi în bazele de date publice, consecinţele clinice ale acestora nu pot fi prevăzute. Au fost raportate numeroase rearanjări de dimensiuni reduse, detectate la pacienţi cu RM şi moştenite de la părinţi cu fenotip normal. Unele dintre acestea sunt variante benigne, dar altele pot reprezenta loci de susceptibilitate pentru diferite boli [19]. De exemplu, deleţia submicroscopică 1q21.1, caracteristică pentru sindromul trombocitopenie-radius absent, este întâlnită la toţi pacienţii cu acest sindrom, dar într-un număr de cazuri este moştenită de la un părinte normal fenotipic [20]. Multe dintre CNV-urile moştenite au un fenotip foarte variabil, incluzând şi fenotipuri considerate normale: deleţia 22q11.2 [21], deleţia 16p11.2 [22] etc. Mecanismele care pot explica de 11

15 ce unele CNV-uri moştenite determină un fenotip anormal includ: penetranţa incompletă (CNV-ul este nonpenetrant la părinte), expresivitatea variabilă (părintele considerat "normal" prezintă anomalii subtile la o examinare mai detaliată), efecte de amprentare (dacă regiunea în care se găseşte CNV-ul este amprentată boala se manifestă doar atunci când CNV-ul este transmis de la un părinte de un anumit sex), prezenţa unei mutaţii în aceeaşi regiune pe cromozomul omolog sau în gene "modificatoare", prezenţa CNV-ului în mozaic sau cu dimensiuni uşor diferite la unul dintre părinţi, factori genetici, epigenetici sau de mediu încă neidentificaţi [17]. VOUS probabil benigne au fost considerate şi duplicaţiile identificate la cazurile 12 şi 14 (deoarece nu conţin gene), precum şi deleţia identificată la cazul 2. Această deleţie de 13 kb este mai mică decât regiunea critică minimă care este deletată recurent la pacienţii cu sindrom 17q21.31 (160,8 kb) [23], iar trăsăturile clinice ale pacientei sunt diferite de cele stabilite pentru acest sindrom, prin urmare cel mai probabil CNV-ul nu este implicat în fenotipul acestei paciente. Pentru 5 VOUS stabilirea caracterului de novo prin testarea părinţilor nu a fost posibilă. Interpretarea acestora este şi mai dificilă. Pentru a demonstra patogenicitatea unei VOUS, trebuie identificaţi pacienţi cu acelaşi CNV şi concordanţi din punct de vedere fenotipic. Prin urmare, au fost create baze de date precum DECIPHER şi ECARUCA ce adună datele de citogenetică moleculară oferite de studiile clinice pentru a facilita înţelegerea rolului diferitelor CNV-uri în bolile genetice. Pentru aceste 5 VOUS la care nu s-a putut realiza testarea părinţilor nu au fost descrise cazuri cu suprapunere completă în DECIPHER şi ECARUCA, deci ele reprezintă VOUS cu semnificaţie necunoscută (neclasificate). Sunt necesare mai multe date array la pacienţi cu RM şi indivizi sănătoşi pentru a determina relevanţa clinică a acestor CNV-uri Regiuni de homozigozitate (ROH) Datorită faptului că utilizează o combinaţie de sonde ce evaluează numărul de copii şi sonde ce genotipează SNP-urile, platformele SNP array pot identifica regiunile genomice care prezintă absenţa heterozigozităţii, sub forma uneia sau mai multor regiuni de homozigozitate. În prezent nu există criterii standardizate pentru definirea ROH, în consecinţă diferite studii efectuate au folosit criterii proprii în analiza homozigozităţii. Primele studii efectuate în acest sens s-au focalizat pe secvenţe de ADN neîntrerupte lipsite de 12

16 heterozigozitate în statusul diploid cel puţin egale cu 1Mb [24, 25], însă studii mai recente au stabilit lungimea minimă pentru a defini ROH la 500 kb [26], anticipând asocierea inclusiv a unor ROH mai scurte cu fenotipuri complexe. În acest studiu am identificat ROH la şase pacienţi (5-7, 8, 9, şi 13). Cu excepţia cazului 7 (copil instituţionalizat), părinţii au declarat absenţa consangvinităţii. În funcţie de contextul genomic, etiologia ROH poate fi homozigozitatea ancestrală, disomia uniparentală sau consangvinitatea. CAPITOLUL III.5.1 CARACTERIZAREA FENOTIPICĂ ŞI MOLECULARĂ A PACIENŢILOR CU SINDROM AARSKOG Introducere Sindromul Aarskog Scott (AAS) sau Displazia faciogenitală (OMIM #305400) este o afecţiune rară, descrisă pentru prima dată de Aarskog [27] şi caracterizată ulterior de Scott [28]. Deşi au fost descrise forme autozomal recesive [29] sau autozomal dominante [30], cea mai bine caracterizată formă a bolii este cea transmisă legat de X (OMIM#305400). Până în prezent au fost identificate 31 de mutaţii unice în gena FGD1 [31, 32], dar nu există dovezi pentru existenţa unei corelaţii între tipul şi poziţia mutaţiilor şi fenotip [32, 33]. În aproape toate mutaţiile raportate (exceptând două) în care au fost testate mamele probanzilor, acestea s-au dovedit a fi purtătoare, ceea ce indică faptul că sunt puţine mutaţii de novo [32]. Scopul studiului nostru este actualizarea datelor privind spectrul mutaţiilor şi tabloul clinic din AAS, prin prezentarea datelor clinice şi genetice la 15 cazuri cu mutaţii în gena FGD Lot şi metode Studiul nostru a fost iniţiat de patru pacienţi de sex masculin proveniţi din patru familii diferite, care au prezentat fenotip tipic pentru AAS asociat sau nu cu istoric familial sugestiv pentru transmiterea legată de X. Evaluarea standard a tuturor pacienţilor a inclus anamneza prenatală, perinatală şi postnatală, istoricul familial, măsurători antropometrice, examenul clinic, examenul psihologic. Diagnosticul clinic de Sindrom Aarskog a fost bazat pe criteriile de diagnostic primare şi secundare stabilite de Teebi et al. [34]. 13

17 Amplificarea PCR şi secvenţierea Sanger pentru toţi cei 18 exoni ai genei FGD1 (incluzând graniţele intron-exon) s-au realizat la Greenwood Genetic Center, Greenwood, Carolina de Sud. Secvenţa de referinţă folosită a fost NM_ Toate mutaţiile au fost denumite conform recomandărilor Human Genome Variation Society (HGVS). Impactul posibil al mutaţiilor în gena FGD1 asupra structurii şi funcţiei proteinei codificate a fost analizat in silico folosind programele MutationTaster, PolyPhen-2 şi SIFT Rezultate La cele patru familii luate în studiu au fost identificate patru mutaţii: două substituţii (c.1829g>a în exonul 10 (familia 1) şi c.1138g>a în exonul 5 (familia 2)) şi două deleţii (c.297_306del10 în exonul 1 (familia 3) şi c.342delc în exonul 3 (familia 4)) Discuţii Mutaţiile identificate în studiul nostru la familiile 2-4 nu au mai fost raportate până în prezent la pacienţi cu AAS, iar mutaţia identificată la familia 1 a mai fost raportată de Orrico et al. în anul 2000 [29]. Până în prezent, rezultatele altor studii, deşi au demonstrat o heterogenitate alelică extinsă şi un spectru larg al fenotipurilor clinice, nu au reuşit să deducă o corelaţie clară între tipul mutaţiilor şi severitatea manifestărilor clinice [33]. La pacienţii noştri, mutaţia c.342delc (care nu a mai fost raportată până în prezent) a determinat un fenotip mai sever comparativ cu celelalte mutaţii, iar variabilitatea intrafamilială a fost redusă. Pentru stabilirea unei corelaţii genotipfenotip, este necesară confirmarea acestor date prin identificarea altor pacienţi cu aceeaşi mutaţie, în familii neînrudite. CAPITOLUL III.5.2 OPTIMIZAREA STRATEGIEI DE DIAGNOSTIC ÎN SINDROMUL X FRAGIL Introducere Sindromul X fragil (SXF) este cea mai frecventă cauză ereditară de RM, având o prevalenţă în populaţia generală de 1:4.000 de indivizii de sex masculin [35]. Datorită faptului că SXF reprezintă o cauză majoră de RM, au fost dezvoltate numeroase programe de screening în diferite ţări pentru identificarea pacienţilor afectaţi. Deşi în prezent este recomandată testarea moleculară a FMR1 pentru stabilirea 14

18 repetiţiilor trinucleotidice la toţi copiii cu RM, întârziere în dezvoltare sau autism [36], datorită variabilităţii fenotipice a acestor pacienţi, doar la 1-2% dintre copiii testaţi astfel se identifică o mutaţie completă [37]. În acest studiu ne-am propus stabilirea unor date clinice sau anamnestice care ar putea orienta medicul clinician spre o selectare mai bună a pacienţilor cu suspiciune de SXF în vederea efectuării testelor moleculare. În acest scop am realizat o analiză retrospectivă a trăsăturilor clinice la 22 de pacienţi cu suspiciune clinică de SXF investigaţi prin metoda PCR, folosind un scor clinic modificat după Giangreco et al. [38] Lot şi metode Lotul a cuprins 22 pacienţi cu diagnostic clinic de SXF stabilit la Cabinetul de Anomalii Congenitale Iaşi, la care s-a efectuat testul PCR pentru zona de repetiţii trinucleotidice CGG din gena FMR1 folosind secvenţele primerilor proiectaţi de Burlet et al. [39]. Pentru cei 22 de pacienţi foile de consult genetic de la Cabinetul de Anomalii Congenitale au fost recenzate pentru prezenţa/absenţa a 9 criterii - 6 criterii stabilite de Giangreco et al. [38], la care au mai fost adăugate trei criterii: palatul înalt şi ingust, macroorhidismul şi pliurile plantare Pentru fiecare dintre cele trei criterii s-a folosit un scor general de 0 - dacă trăsătura a fost absentă, 1 - dacă afectarea a fost uşoară (la limită) şi 2 - dacă trăsătura a fost în mod clar prezentă. În final, scorul total a fost folosit pentru a evalua severitatea clinică a bolii. Scorul maxim posibil a fost 18. Analiza statistică a fost efectuată folosind programul Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versiunea 19 (SPSS; Chicago, IL, USA). Variabilele au fost testate folosind testul T pentru eşantioane perechi, unde intervalul de încredere a fost considerat de 95%, în consecinţă valoarea p< 0.05 fiind statistic semnificativă Rezultate Prin tehnica folosită nu a putut fi amplificată zona de interes (repetiţiile trinucleotidice) la şapte pacienţi, aspect ce sugerează prezenţa unui număr mai mare de 200 de repetiţii trinucleotidice, corespunzător unei mutaţii complete. Pentru cazurile 1-4 mutaţia completă a fost confirmată prin tehnica Southern blot. Comparaţia statistică între fiecare criteriu al scorului şi suma lor la indivizii cu şi fără diagnostic pozitiv de SXF a arătat că o diferenţă semnificativă (p<0,05) există pentru trăsăturile: facies alungit, urechi mari, pliu plantar, RM şi pentru scorul de diagnostic. Diferenţa a fost 15

19 foarte semnificativă (p<0,001) pentru RM şi pentru scorul de diagnostic. Scorul de diagnostic la pacienţii cu diagnostic de SXF confirmat prin PCR a fost de minim 9 (în medie 13,42), iar la cei la care numărul de repetiţii trinucleotidice a fost în limite normale a fost de maxim 9 (în medie 5,86). Scorul de diagnostic mediu la pacienţii SXF confirmat molecular cu vârsta peste 14 ani a fost de 15, iar la cei sub această vârstă a fost de 11, Discuţii Şapte cazuri (patru index) din 22 de pacienţi au avut diagnostic clinic şi molecular concordant de SXF, ceea ce corespunde unei frecvenţe a SXF în lotul studiat de 18%. Frecvenţa este mult mai mare decât cele obţinute de alte studii efectuate pe loturi mari de pacienţi neselectaţi (~2,8%) [40, 41]. Studiul a analizat atât trăsături fizice cât şi de comportament întâlnite frecvent în SXF. Trăsăturile clinice ale celor şapte indivizi cu mutaţie completă au fost comparate cu cele ale indivizilor la care diagnosticul clinic de SXF a fost infirmat. Studiul nostru a arătat că faciesul alungit (p< 0.05), urechile mari (p< 0.05), pliul plantar (p< 0.05) şi RM (p< 0.001) sunt trăsăturile caracteristice care au diferenţiat pacienţii cu diagnostic pozitiv de SXF de ceilalţi. De asemenea, scorul de diagnostic (p< 0.001) a făcut diferenţa între pacienţii cu şi fără SXF. Macroochidismul nu a fost considerat până în prezent un marker clinic bun pentru selectarea pacienţilor cu SXF cu vârste sub 14 ani [42], acest lucru fiind susţinut şi de studiul nostru. Media scorului de diagnostic a crescut odată cu vârsta la pacienţii cu diagnostic pozitiv de SXF, prin urmare severitatea manifestărilor clinice la pacienţii cu SXF creşte odată cu vârsta, după cum au arătat şi alte studii [43]. SECŢIUNEA IV CONCLUZII GENERALE 1. Cariotipul oferă o analiză de ansamblu a genomului uman, dar rezoluţia testului (şi prin urmare capacitatea de a stabili diagnosticul la cazurile cu retard mental şi/sau anomalii congenitale) este foarte mică comparativ cu noile tehnologii bazate pe microarray. Evaluarea clinică minuţioasă a pacienţilor cu RM şi selectarea cazurilor cu fenotip sever afectat creşte rata 16

20 de detecţie a anomaliilor cromozomiale identificate la cariotipul standard. 2. Folosirea combinată a unor seturi MLPA (pentru rearanjări subtelomerice, pentru sindroame cu RM determinate de microdeleţii şi setul specific pentru metilare în sindromul Prader Willi) a permis stabilirea diagnosticului etiologic la 10,4% dintre pacienţii incluşi în studiu. Pentru laboratoarele care nu au (încă) acces la tehnologiile mai sofisticate bazate pe microarray, folosirea mai multor seturi MLPA reprezintă o strategie eficientă pentru stabilirea diagnosticului etiologic la pacienţii cu RM. Folosirea seturilor MLPA follow-up, care conţin mai multe sonde per telomer, permite atât confirmarea prezenţei anomaliei, cât şi determinarea dimensiunii ei, ceea ce facilitează interpretarea semnificaţiei clinice a unei rearanjări subtelomerice. 3. Tehnica SNP array a ajutat în elucidarea diagnosticului la 7 dintre cei 20 de pacienţi investigaţi. Rezultatele obţinute în acest studiu ilustrează clar capacitatea tehnicii SNP array de a detecta CNV-urile submicroscopice şi de a caracteriza detaliat defectele vizibile citogenetic asociate cu RM. Colectarea în bazele de date publice a informaţiilor genotipice şi fenotipice de la un număr cât mai mare de pacienţi cu RM sau anomalii congenitale multiple este esenţială în interpretarea CNV-urilor, în special în cazul platformelor cu rezoluţie mare sau atunci când probele ADN ale părinţilor nu sunt disponibile. Deşi au fost stabilite criterii care ajută la stabilirea semnificaţiei clinice a VOUS, doar asocierea recurentă a dezechilibrelor cromozomiale cu trăsături fenotipice specifice va clarifica relaţia cauzală. Stabilirea etiologiei RM permite evitarea efectuării altor teste de diagnostic, oferirea unor informaţii precise asupra bolii, prevenirea complicaţiilor specifice şi acordarea unui sfat genetic precis, incluzând riscul de recurenţă şi opţiunile pentru diagnostic prenatal. 17

21 4. Studiul pacienţilor cu sindrom Aarskog lărgeşte spectrul mutaţiilor în acest sindrom, oferind date noi privind tipurile şi frecvenţa mutaţiilor în FGD1. Trei dintre mutaţiile identificate nu au mai fost raportate până în prezent, iar cea de-a patra a mai fost raportată la o singură familie. Una dintre mutaţiile care nu au mai fost raportate (c.342delc) a determinat afectarea mai severă a fenotipului, relativ constant la membrii familiei, dar sunt necesare studii suplimentare pentru a stabili o corelaţie genotip-fenotip. Sindromul Aarskog are o expresie fenotipică cu variabilitate mare intra- şi inter-familială, ceea ce sugerează implicarea altor factori în determinarea fenotipului (precum genele modificatoare sau factorii de mediu), în afara genei FGD1. Din punct de vedere clinic, asocierea unor semne clinice obiective (mâinile şi picioarele mici, scrotul în şal şi metatarsus adductus) şi a dismorfiei faciale sugestive sunt suficiente pentru suspiciunea clinică de sindrom Aarskog. RM sever nu a fost descoperit la pacienţii din lotul studiat, dar 60% dintre aceştia au prezentat RM uşor, aspect concordant cu datele din literatură. Urmărirea pacienţilor pe termen lung a arătat că trăsăturile dismorfice se modifică cu vârsta, devenind mai greu de recunoscut, iar la unii pacienţi deficitul cognitiv şi hipostatura se ameliorează. 5. Tabloul clinic al sindromului X fragil este extrem de variabil, rata de diagnostic prin tehnici moleculare a indivizilor cu RM neselectaţi fiind scăzută. Scorul clinic utilizat în acest studiu poate fi de folos clinicienilor pentru selectarea indivizilor cu suspiciune de sindrom X fragil în vederea efectuării testelor moleculare. Se pot identifica astfel, într-o manieră cost-eficientă, marea majoritate a cazurilor cu sindrom X fragil. Folosirea unui scor clinic este necesară în special în ţările în care metodele de diagnostic molecular sunt disponibile în puţine centre (cum este şi ţara noastră). Studiul nostru arată că următoarele semne clinice sunt cele mai importante pentru selectarea pacienţilor cu diagnostic clinic de sindrom X fragil în vederea testării genetice: aspectul alungit al faciesului, urechile mari, pliul plantar şi RM. 18

22 Bibliografie selectivă 1. Moorhead, P.S., et al., Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res, : p Battaglia, A. and J.C. Carey, Diagnostic evaluation of developmental delay/mental retardation: An overview. Am J Med Genet C Semin Med Genet, C(1): p Moog, U., The outcome of diagnostic studies on the etiology of mental retardation: considerations on the classification of the causes. Am J Med Genet A, (2): p Slavotinek, A.M., Novel microdeletion syndromes detected by chromosome microarrays. Hum Genet, (1): p Miller, D.T., et al., Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet, (5): p Ravnan, J.B., et al., Subtelomere FISH analysis of cases: an evaluation of the frequency and pattern of subtelomere rearrangements in individuals with developmental disabilities. J Med Genet, (6): p Yu, S., et al., Frequency of truly cryptic subtelomere abnormalities--a study of 534 patients and literature review. Clin Genet, (5): p Pohovski, L.M., et al., Multiplex ligation-dependent probe amplification workflow for the detection of submicroscopic chromosomal abnormalities in patients with developmental delay/intellectual disability. Mol Cytogenet, (1): p Kirchhoff, M., et al., MLPA analysis for a panel of syndromes with mental retardation reveals imbalances in 5.8% of patients with mental retardation and dysmorphic features, including duplications of the Sotos syndrome and Williams-Beuren syndrome regions. Eur J Med Genet, (1): p Jehee, F.S., et al., Using a combination of MLPA kits to detect chromosomal imbalances in patients with multiple congenital anomalies and mental retardation is a valuable choice for developing countries. Eur J Med Genet, (4): p. e Cassidy, S.B., et al., Prader-Willi syndrome. Genet Med, (1): p Ahn, J.W., et al., Submicroscopic chromosome imbalance in patients with developmental delay and/or dysmorphism referred specifically for Fragile X testing and karyotype analysis. Mol Cytogenet, : p Kriek, M., et al., Diagnosis of genetic abnormalities in developmentally delayed patients: a new strategy combining MLPA and array-cgh. Am J Med Genet A, (6): p Redon, R., et al., Global variation in copy number in the human genome. Nature, (7118): p

23 15. Friedman, J., et al., Detection of pathogenic copy number variants in children with idiopathic intellectual disability using 500 K SNP array genomic hybridization. BMC Genomics, : p Hehir-Kwa, J.Y., et al., Accurate distinction of pathogenic from benign CNVs in mental retardation. PLoS Comput Biol, (4): p. e Kearney, H.M., et al., American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants. Genet Med, (7): p Vermeesch, J.R., et al., Genome-wide arrays: quality criteria and platforms to be used in routine diagnostics. Hum Mutat, (6): p de Ravel, T.J., et al., Molecular karyotyping of patients with MCA/MR: the blurred boundary between normal and pathogenic variation. Cytogenet Genome Res, (3-4): p Klopocki, E., et al., Complex inheritance pattern resembling autosomal recessive inheritance involving a microdeletion in thrombocytopeniaabsent radius syndrome. Am J Hum Genet, (2): p Derbent, M., et al., Variable phenotype and associations in chromosome 22q11.2 microdeletion. Am J Med Genet A, (6): p Bijlsma, E.K., et al., Extending the phenotype of recurrent rearrangements of 16p11.2: deletions in mentally retarded patients without autism and in normal individuals. Eur J Med Genet, (2-3): p Dubourg, C., et al., Clinical and molecular characterization of 17q21.31 microdeletion syndrome in 14 French patients with mental retardation. Eur J Med Genet, (2): p Gibson, J., N.E. Morton, and A. Collins, Extended tracts of homozygosity in outbred human populations. Hum Mol Genet, (5): p Li, L.H., et al., Long contiguous stretches of homozygosity in the human genome. Hum Mutat, (11): p Yang, T.L., et al., Runs of homozygosity identify a recessive locus 12q21.31 for human adult height. J Clin Endocrinol Metab, (8): p Aarskog, D., A familial syndrome of short stature associated with facial dysplasia and genital anomalies. J Pediatr, (5): p Scott, C.I., Unusual facies, joint hypermobility, genital anomaly and short stature: a new dysmorphic syndrome. Birth Defects Orig Artic Ser, (6): p Orrico, A., et al., A mutation in the pleckstrin homology (PH) domain of the FGD1 gene in an Italian family with faciogenital dysplasia (Aarskog- Scott syndrome). FEBS Lett, (3): p van de Vooren, M.J., M.F. Niermeijer, and A.J. Hoogeboom, The Aarskog syndrome in a large family, suggestive for autosomal dominant inheritance. Clin Genet, (6): p Bedoyan, J.K., et al., First case of deletion of the faciogenital dysplasia 1 (FGD1) gene in a patient with Aarskog-Scott syndrome. Eur J Med Genet, (4): p

24 32. Orrico, A., et al., Aarskog-Scott syndrome: clinical update and report of nine novel mutations of the FGD1 gene. Am J Med Genet A, A(2): p Orrico, A., et al., Phenotypic and molecular characterisation of the Aarskog-Scott syndrome: a survey of the clinical variability in light of FGD1 mutation analysis in 46 patients. Eur J Hum Genet, (1): p Teebi, A.S., J.K. Rucquoi, and M.S. Meyn, Aarskog syndrome: report of a family with review and discussion of nosology. Am J Med Genet, (5): p Turner, G., et al., Prevalence of fragile X syndrome. Am J Med Genet, (1): p Sherman, S., B.A. Pletcher, and D.A. Driscoll, Fragile X syndrome: diagnostic and carrier testing. Genet Med, (8): p Rauch, A., et al., Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation. Am J Med Genet A, (19): p Giangreco, C.A., et al., A simplified six-item checklist for screening for fragile X syndrome in the pediatric population. J Pediatr, (4): p Burlet, P., et al., Multiple displacement amplification improves PGD for fragile X syndrome. Mol Hum Reprod, (10): p Zhong, N., et al., Frequency of the fragile X syndrome in Chinese mentally retarded populations is similar to that in Caucasians. Am J Med Genet, (3): p Puusepp, H., et al., Prevalence of the fragile X syndrome among Estonian mentally retarded and the entire children's population. J Child Neurol, (12): p Lachiewicz, A.M. and D.V. Dawson, Do young boys with fragile X syndrome have macroorchidism? Pediatrics, (6 Pt 1): p Visootsak, J., et al., Fragile X syndrome: an update and review for the primary pediatrician. Clin Pediatr (Phila), (5): p