SPECIILOR DE CULICOIDES VECTORI BLUETONGUE, ÎN ROMÂNIA

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Size: px
Start display at page:

Download "SPECIILOR DE CULICOIDES VECTORI BLUETONGUE, ÎN ROMÂNIA"

Transcription

1 Page 1 of 72 Laboratorul naţional de referinţă pentru vectorii bolilor la animale Şi zoonozelor MANUAL pentru capturarea ŞI IDENTIFICAREA SPECIILOR DE CULICOIDES VECTORI BLUETONGUE, ÎN ROMÂNIA Ed. 1, rev. 2, 2014 Coordonator LNR : Dr. biol. Elena POPA, 2014

2 Page 2 of 72 CUPRINS 1 CAPITOLUL 1 3 Prezentarea actualizată a vectorilor virusului bluetongue 1.1. Introducere Taxonomie Ciclul biologic Determinarea vârstei femelelor Numărul de generaţii pe an (univoltinis/multivoltinism) Hrănirea adulţilor şi relaţia cu gazda Ritmul înţepăturilor produse de adulţi Endofagia/exofagia şi endofilia/exofilia Orele de atac şi distribuţia Habitatul de reproducere Specii de Culicoides vectori pentru virusul bluetongue, în Europa Specii de Culicoides semnalate pe teritoriul României Relaţia virus-vector Influenţa condiţiilor de climă Activitatea sezonieră a vectorilor Modul de definire a perioadei libere de vectori Ecologia vectorilor Biologia vectorilor Controlul vectorilor Metode chimice de control pentru Culicoides Tratarea efectivelor de animale cu insecticide, repelenţi sau medicamente 39 antiparazitare sistemice (avermectine); Tratarea habitatelor larvare sau a adulţilor rămaşi în zone tratate cu insecticide Tratarea adăposturilor de animale şi/sau mijloacelor de transport cu insecticide Controlul mecanic al vectorilor Suprimarea/reducerea habitatelor de înmulţire Folosirea momelilor pentru capturarea vectorilor 48 2 CAPITOLUL 2 49 MONITORIZAREA speciilor de culicoides 2.1. Protocol de capturare şi identificare a speciilor de Culicoides l. Protocol de capturare a speciilor de Culicoides Echipament Kit de colectare Alegerea locului de montare a capcanei Colectarea coordonatelor geografice din locaţiile în care s-au montat capcanele Colectarea datelor din locaţiile în care s-*au montat capcanele cu ajutorul 53 meteostaţiilor Factorii care influenţează capturarea culicoizilor Metode de prelevare, amabalare, transport a larvelor şi nimfelor/pupelor de 55 Culicoides Metode de capturare, amabalare, transport a adulţilor de Culicoides Protocol de identificare a larvelor, pupelor/nimfelor şi adulţilor de Culicoides Metode de prelucrare şi conservare a larvelor şi pupelor de Culicoides Metode de prelucrare şi conservare a adulţilor de Culicoides Examenul microscopic al adulţilor de Culicoides Caracteristici de identificare a adulţilor de Culicoides 62

3 Page 3 of Cheia de identificare a insectelor din genul Culicoides 64 CAPITOLUL 1 PREZENTAREA ACTUALIZATĂ A SPECIILOR DE CULICOIDES VECTORI PENTRU VIRUSUL BLUETONGUE 1.1. INTRODUCERE Speciile genului Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) sunt insecte de dimensiuni mici cuprinse între 1-3 mm, care înţeapă şi consumă sângele de la mamifere, păsări, reptile şi alte insecte (de exemplu Culicoides nubeculosus se hrăneşte pe Aedes aegypti, însă acest fenomen poate fi întâlnit şi la speciile Culicoides imicola, Culicoides schultzi, Culicoides moreli, Culicoides africanus, Culicoides fulvithorax, etc.), (Figura 1), inclusiv de la om, 96% din cele aproximativ 1400 de specii de Culicoides sau chiar mai mult sunt obligatoriu hematofage. În unele zone atacurile sunt în roiuri cauzând alterarea stării generale la om sau producând dermatite alergice acute la cai, motiv pentru care aceste insect au fost denumite: damnosus, diabolicus, irritans. Aceste insect sunt răspândite de la tropice până în tundră şi de la nivelul mării până la 4200 m (Tibet). Aproximativ 120 de specii de Culicoides se găsesc în Europa. Această diversitate scade spre zona Arctică ajungând la 25 de specii care trăiesc sub 60 latitudine. Pe glob mamiferele sunt intens atacate de speciile genului Culicoides. De exemplu, în Africa, s-au capturat cu o capcană cu lumină întunecată peste un million de Culicoides într-o noapte călduroasă de vară (luna mai), în condiţii de ploaie (Meiswinkel, 1998). În mod remarcabil acest număr de Culicoides capturate reprezintă doar 1% din insectele hematofage şi arată nivelul de iritare al animalelor pe timpul nopţii şi riscul de infecţii pe care o fermă de animale poate să-l îndure. Din fericire doar un segment de 2,5% din speciile de Culicoides descries la nivel mondial au implicare dovedită în transmiterea agenţilor patogeni virali care cauzează pagube la animalele de ferme. Aceşti agenţi patogeni fiind reprezentaţi de: virusul bluetongue (BTV), virusul dermatitei africane a cailor (AHSV), virusul bolii hemoragice a cerbului (EHDV), virusul Akabane (AKAV), şi virusul encefalitei ecvine (EEV). Femelel de Culicoides transmit de asemenea o serie de paraziţi, cu importanţă veterinară cum sunt: hemoparaziţii (Haemoproteus sp. la păsări; Hepatocystis kochi la maimuţe) şi unele filarioze (Onchocerca sp. la cai şi bovine). Astfel, speciile de Culicoides prezintă o mare importanţă economică şi veterinară aceasta fiind reprezentată de epidemiile devastatoare care au existat şi în trecut, una din cele mai semnificative fiind dermatita africană a calului (AHSV) care în perioada 1959/1960 a cuprins aproape tot estul mijlociu cauzând moartea a aproximativ de animale ( Howell, 1963), în aceiaşi perioadă virusul bluetongue a produs moartea a de oi

4 Page 4 of 72 (Lopez şi Botija, 1958). Un alt exemplu, este epidemia produsă de dermatita africană a cailor (AHSV)care a decimat de cai în colonia Capul Bunei Speranţe, din Sudul Africii în 1854/1855 (Bayley, 1856). Această izbucnire fără precedent care a decimat aprope 40% din populaţia cabalină a coloniei în aproape 8 luni atestă nu numai eficienţa speciilor de Culicoides în răspândirea infecţiei, dar şi necesitatea protecţiei acestora prin vaccinarea anuală pentru această boală. În privinţa bluetongue (BT), în ultimii 10 ani s-au succedat în valuri incursiuni de câte 5 serotipuri de BTV în bazinul Mediteraneean afectând 15 ţări şi doar în Italia cauzând moartea a cel puţin de oi. Aceste fapte a fost dovada celei mai virulente izbucniri din istoria omenirii, iar persistenţa bolii a fost legată întotdeauna de schimbările climaterice. Figura 1 Culicoides nubeculosus hrănindu-se pe Aedes aegypti 1.2. TAXONOMIE Până la această dată s-au descries aproximativ 1340 specii de Culicoides (Borkent şi Wirth, 1997); 39 din acestea fiind fosile de Culicoides, descoperite în zona Baltică. Genul Culicoides cuprinde aproximativ 39 de subgenuri, care la rândul lor sunt subdivizate în grupuri de specii sau complexe de specii. Carl Linnaeus, în anul 1758, a descries pentru prima dată specia Culicoides pulicaris, însă de atunci şi până în prezent pentru cunoaşterea speciilor genului Culicoides, dar în mod deosebit al acelor localizate în partea vestică a Europei şi-au adus contribuţia taxonomişti eminenţi (Campbell şi Pelham-Clinton, 1960; Delacolle, 1985; Glukhova, 1989; Meiswinkel et al, 2004). Datorită faptului că la nivel mondial numărul

5 Page 5 of 72 specialiştilor taxonomişti este foarte mic identificarea speciilor de Culicoides se face la nivel de complex, folosind caracteristicile de morfologie externă (îndeosebi desenul aripii). Într-un viitor apropiat probabil diferenţierea speciilor de Culicoides se va face apelând la tehnicile de biologie moleculară. Cercetările de biologie molecular pentru identificarea acestor specii au început să fie aplicabile din anul 2000, însă acestea au fost concentrate mai mult pe fauna Europeană a speciilor de Culicoides (Sebastiani et al., 2001; Linton et al., 2002; Dallas et al., 2003; Nolan et al., 2004; Gomulski et al., 2005, 2006; Perrin et al., 2006; Mathieu et al., 2007) CICLUL BIOLOGIC Ciclul biologic la speciile de Culicoides este: adult ouă - larve (au 4 stadii) -nimfe/pupe adulţi (Figura 2). Femelele poartă ouăle în spermateci, acestea fiind fecundate de spermatoforii depuşi de masculi. Femelele se împerechează o singură dată asigurând astfel, fecundarea câtorva ponte. Ouăle sunt de dimensiuni mici, fiind aglomerate în număr de 150 sub forma unor pachete gelatinoase de culoare brun-negricioasă. Forma ouălor este aproape cilindrică, iar la capete sunt uşor subţiate. Suprafaţa oului la speciile de Culicoides prezintă numeroase excrescenţe în formă de cui. Femela fixează pachetele cu ouă pe frunzele sau pe plantele care plutesc la suprafaţa apei. Figura 2 Ciclul biologic la Culicoides sp. (adaptat de EFSA după Purse et al 2005, IAH Pirbraght)

6 Page 6 of Depunerea ouălor (ovipoziţia): Femelel adulte de Culicoides folosesc ca aliment sângele bogat în proteine pentru maturarea ovarelor şi dezvoltarea între de ouă (care măsoară între mlµ lungime şi mlµ lăţime) care sunt eliminate în pachete. Un pachet de ouă se maturează la fiecare masă de sânge consumată. Insectele pentru a supravieţui au nevoie de minim 5 zile pentru a elimina primul pachet de ouă, însă trebuie să supravieţuiască 10 zile pentru a transmite virusul, timp în care elimină 2-3 pachete de ouă. În general ouăle de Culicoides au nevoie pentru a se dezvolta de minim 4-5 zile, cu temperaturi de 25 C, dar pentru o specie din nordul Europei (Culicoides grisescens), dezvoltarea ouălor necesită 7-8 luni (Parker, 1949). Pentru specia Culicoides obsoletus prezentă în zonele temperate, Hill ( 1947) a semnalat că dezvoltarea ouălor acesteia în laborator poate să aibă loc între 30 de ore până la 11 zile după ovipoziţie, însă în medie poate avea loc cam în 3 zile. Pentru specia tropicală Culicoides imicola dezvoltarea ouălor poate avea loc în 2-3 zile la temperature de 30 C, iar ciclul de la ou la adult se poate desfăşoară rapid (în 9-10 zile). De altfel temperaturile joase afectează viabilitatea ouălor, iar în cazul speciilor Culicoides imicola la 6,5 C viabilitatea descreşte după 7 zile şi nu se dezvoltarea decât după 37 de zile (Nevill, 1967). Ovipoziţia a fost rar observată în condiţii de teren. Totuşi în Africa a fost observată în zilele luminoase hrănirea femelelor gravide a diferitelor specii de Culicoides, de asemenea s-a observat şi depunerea ouălor de către aceste insecte în bălegarul de elefant, la câteva minute după depunerea ouălor bălegarul s-a dus la laborator (Meswinkel şi Braack, 1994) iar în intervalul 5-25 de zile s-au obţinut insectele adulte (Meiswinkel el al., 2004 b) Larva : din ouă după eclozare ies larvele care sunt alcătuite din 13 segmente, din primul segment se formează capul, din următoarele 3 toracele, iar din celelalte 9 abdomenul. Larva are 4 stadii de dezvoltare (I-IV). Lungimea larvei creşte de la stadiul I la stadiul IV de 4 ori. Durata de dezvoltare a celor 4 stadii larvare este de o săptămână, a pupei de 4 zile, iar durata de viaţă a adulţilor este de maximum 92 de zile. Toate cele 4 stadii larvare la speciile Culicoides sunt svelte şi fără păr, caracteristici care facilitează mişcările serpetiforme ale larvelor în mediul semisolid. Cea mai proeminentă structură a capului larvei este epifarinxul care împreună cu hipofarinxul se foloseşte pentru strivirea hranei (Kettle şi Lawson, 1952). Larva speciei Europene Culicoides nubeculosus consumă bacterii, alge sau ciuperci care se găsesc la suprafaţa apei (Megahed, 1956), alte specii consumă microorganisme şi nematode (Hill, 1947). Lungimea perioadei de dezvoltare a larvei de Culicoides este dependentă de temperatura mediului ambiant şi de bogăţia în substanţe nutritive a mediului de viaţă al acestora, variind de la o săptămână la speciile care trăiesc în zonele tropicale cum ar fi Culicoides loxodontis (Meiswinkel, 1992), până

7 Page 7 of 72 la 2 ani pentru aceleaşi specii din zona Arctică (Downes, 1962) ; (Hill 1947). Lungimea stadiului larvar la Culicoides obsoletus, în condiţii de laborator a variat până la 5 luni. Lungimea ciclului larvar la latitudini mai mari este influenţată de media temperaturilor anuale şi de numărul de ore din zi cu lumină; în zonele temperate când condiţiile de viaţă nu sunt prielnice larvele intră în diapauză, iar dezvoltarea continuă primăvara, când condiţiile devin favorabile Pupa/Nimfa : are doar un singur stadiu, poate fi acvatică sau semiacvatică. Forma acvatică plutind la suprafaţa apei fără a executa mişcări. Din pupa/nimfă apare adultul în 2 până la 4 săptămâni şi ciclul se reia (durata de viaţă a pupei/nimfei este de aproximativ 4 zile), (Figura 3). Figura 3 Pupă/Nimfă de Culicoides sp Adultul: Durata de viaţă a adultului de Culicoides nu se cunoaşte cu precizie, însă după datele care se cunosc până în prezent perioada de viaţă a acestora este de câteva săptămâni sau mai puţin (de obicei) până la câteva luni (destul de rar). Adulţii de Culicoides obsoletus au putut fi menţinuţi în laborator, timp de 90 de zile (Nevill, 1971 ; Boorman, 1991). Nevill a observat de asemenea că din adulţii de Culicoides imicola ţinuţi la temperaturi de -1,5 C, doar 155 de exemplare au supravieţuit peste 15 zile. S-a estimat că temperatura optimă pentru dezvoltarea şi menţinerea speciilor Culicoides imicola este cuprinsă între C (Ortega et al.,

8 Page 8 of ), iar pentru Culicoides obsoletus fiind cuprinsă între 11-27,5 C (Dzhafarov, 1964). În anul 1963 Nielsen, a capturat din Danemarca exemplare de Culicoides obsoletus care au înţepat un om înainte de apusul soarelui, în luna iunie, când temperatura mediului ambiant era cuprinsă între C, însă au fost semnalate situaţii când aceste insecte au înţepat şi la temperaturi de 7,5 C. La toate speciile de Culicoides, masculii se hrănesc cu cu nectarul florilor, în timp ce femelele sunt hematofage DETERMINAREA VÂRSTEI FEMELELOR La femelele de Culicoides se distingă trei stadii gonotrofice de dezvoltare (Dyce, 1969). Aceste stadii sunt: 1. femele tinere, nehrănite, nulliparous ; 2. femele bătrâne parous şi 3. femele mature gravide, doar ultimele două stadii sunt consumatoare sânge de la animale, timp în care se pot contamina cu virus bluetongue. Cunoaşterea vârstei femelelor de Culicoides este deosebit de importantă pentru studiile epidemiologice doarece cunoaşterea numărului de femele dintr-o zonă şi a stadiului de dezvoltare al acestora ajută la evaluarea nivelul de risc în transmiterea virusului bluetongue. Existenţa într-o zonă a unui număr mare de femele parous indică un mare risc pentru transmiterea virusului bluetongue. Temperatura mediului ambiant influenţează atât creşterea şi dezvoltarea speciilor de Culicoides, cât şi răspândirea acestora, îndeosebi în zonele reci. S-a demonstrat recent, că din partea Nord Europeană au fost colectaţi adulţi de Culicoides, inclusiv a speciilor din complexul Obsoletus (într-un număr mai mic) în fiecare lună din an, inclusiv în perioada de iarnă (noiembrie-martie), (Denison şi Mellor, 2007), majoritatea exemplarelor (95%), fiind reprezentate de femele nulliparous (Dijkstra şi Meiswinkel, 2007) şi doar 5% fiind reprezentate de femele parous, indicând faptul că dezvoltarea larvară la aceste specii continuă şi iarna. Cu toate acestea nu s-a putut demonstra dacă femelele parous au fost infectate cu virusul bluetongue şi dacă ar fi fost capabile să transmită virusul bluetongue. De asemenea nu se ştie dacă această persistenţă a adulţilor de Culicoides peste iarnă este un fenomen recent, datorită creşterii temparaturii medii sau schimbărilor de climă. Totuşi este cunoscut faptul că în regiunile reci trecerea peste iarnă la speciile de Culicoides se face în stadiul de ou sau larvă; de exemplu, în Caucazi, au fost colectate din apa ingheţată larve din stadiile 1 sau 2, rar adulţi de Culicoides pulicaris (Dzhafarov, 1964). În climatul tropical, ciclul biologic la speciile de Culicoides continuă pe tot parcursul anului. Aceasta poate explica în mare măsură diversitatea serotipurilor virusului BT observate la tropice şi subtropice (Africa şi Sud-Estul Asiei, inclusiv India).

9 Page 9 of NUMĂRUL DE GENERAŢII PE AN (UNIVOLTINISM/MULTIVOLTINISM) Este cunoscut faptul că speciile de Culicoides pot fi uni-, bi-, tri- sau multivolitine (Birley şi Boorman 1982, Baverman et al., 1985, Holmes şi Boorman 1987) în funcţie de climatul local. Se ştie că speciile de Culicoides care trăiesc la latitudini mari au o singură generaţie pe an (univoltinism), în timp ce acelea care trăiesc în alte zone au mai multe generaţii pe an (multivoltinism). S-a demonstrat că în partea Central Europeană specia Culicoides obsoletus are 2 până la 4 generaţii pe an (Orzagh şi Masan, 1992) şi până la 11 pentru Culicoides imicola în Israel. Fiecare generaţie se desfăşoară în aproximativ 23 de zile (Bavermann şi Linley, 1988). În Anglia, Hill (1947) a menţinut specia Culicoides obsoletus în condiţii de temperatură joasă şi a constatat că duratele etapelor din ciclul biologic se prelungesc. De altfel creşterea temperaturii medii globale, în special în perioada de iarnă la latitudini mai mari a evidenţiat schimbări în dezvoltarea acestor insect în sensul supravieţuirii acestora şi în perioade reci şi deci creşterea pericolului diseminării virusului bluetongue pe tot parcursul anului şi în aceste zone. Recent datorită încălzirii globale s-a semnalat prezenţa virusului bluetongue şi la 53 latitudine N HRĂNIREA ADULŢILOR ŞI RELAŢIA CU GAZDA Femelele adulte de Culicoides se hrănesc pe gazdele domestic şi sălbatice. Femelele de Culicoides se adună în roiuri în ferme, fiind în număr mult mai mare în jurul turmelor decât acolo unde este un singur animal. Speciilor coprofilice (care depun ouăle în balega animalelor), cum ar fi: Culicoides brevitarsis şi Culicoides dewulfi, se adună în roiuri în jurul bovinelor, nu doar pentru a se hrăni, ci şi pentru a-şi depune ouăle în balegă. Aşa cum au fost descrise de Murray (1987), există trei faze în derularea evenimetului care conduc de la zborul iniţial la hrănirea cu sânge sau la depunerea ouălor (ovipoziţie). Prima fază este dominată de factorii care determină probabilitatea ca insecta să intre în zona ţintă, zonă care cuprinde gazdele potrivite; a doua fază este dominată de factorii care conduc la aterizarea pe gazdă (sau bălegar) şi a treia fază este dominată de factorii care influenţează hrănirea sau ovipoziţia (depunerea ouălor). Intrarea insectelor într-o zona ţintă trebuie să fie activă, iar activitatea zborului este influenţată în primul rând de intensitatea luminii, temperatura mediului, umiditatea aerului şi de viteza vântului. Durata perioadei activităţii de zbor este determinată de relaţiile dintre cei trei factori. La tropice intensitatea luminii este de obicei potrivită pentru cca 10 ore în pe noapte, iar temperature potrivită se menţine pe tot parcursul nopţii. La limita nordică (sau sudică) nopţile de vară sunt potrivit de scurte, iar temperaturile sunt de obicei favorabile doar înainte de miezul nopţii. Pot

10 Page 10 of 72 exista diferenţe majore în probabilitatea ca o insectă să intre în zona ţintă din zonele tropicale sau temperate. Din această descriere a succesiunii şi interdependenţei evenimentelor care permite insectelor să se hrănească cu succes reiese că în Nordul Europei sunt mai mulţi factori care combinaţi au contribuit la creşterea potenţialului vector al unei specii, precum Culicoides dewulfi. Dintre aceşti factori menţionăm: 1. permanenta asociere a insectelor cu bovinele, determinată de fapt de modul de hrănire al acestora pe bovine; 2. Culicoides dewulfi va trebui să se asigure că gazda se găseşte întotdeauna în apropiata sa vecinătate ; 3. evitarea zborului acestei specii pe distanţe mari când condiţiile de mediu nu sunt favorabile; 4. mărirea longevităţii şi a ratei de supravieţuire a acestei specii. Este cunoscut în mare măsură faptul că o femela adultă de Culicoides se hrăneşte o singură dată la interval de 3-5 zile (Holmes şi Birley, 1987; Bravermann, 1988). Pentru Culicoides obsoletus intervalul dintre mese (ciclul gonotrofic) a fost calculate ca fiind de zile, iar pentru Culicoides imicola de zile, însă acest interval poate fi redus în funcţie de condiţiile climaterice optime. Durata consumului de sânge la Culicoides obsoletus de la viţei şi cai a fost calculate a fi de 4-8 minute/masă. Cantitatea de sânge consumată în timpul prânzului sanguin variază la speciile de Culicoides de la 0,0003 ml (la specia Culicoides brevitarsis), până la cantităţi de 10 ori mai mari. Muller (1982), bazându-se pe cantitate mică de sânge consumată de Culicoides brevitarsis a estimat că se poate obţine un vector infectant după minim 12 zile de incubaţie (care să determine mortalitatea zilnică), fiind nevoie de de exemplare de Culicoides brevitarsis care să se hrănească pe fiecare animal dintr-o cireadă RITMUL ÎNŢEPĂTURILOR PRODUSE DE ADULŢI Importanţa veterinară a acestui mod de hrănire a speciilor de Culicoides derivă din faptul că aceste insecte înţeapă toate categoriile de animale de ferme, iar dacă atacurile sunt în număr extraordinar de mare pot cauza animalelor reacţii de hipersensibilitate, iar în alte cazuri pot transmite acestora o serie de agenţi patogeni virali, bacterieni sau parazitari. Este evident că speciile vectori importanţi precum Culicoides imicola, Culicoides brevitarsis şi Culicoides obsoletus sunt ectoparaziţi hematofagi oportunişti care pot ataca o gamă largă de animale de fermă incluzănd ovinele, bovinele, caprinele, cabalinele şi porcinele. Este de asemenea evident că diferitele specii de Culicoides atacă diferite părţi ale animalului gazdă: burta, urechile uneori şi părţile laterale ale corpului animalelor. S-a observant că aceste zone sunt cel mai mult atacate, însă nu se cunoaşte dacă aceste diferenţe sunt specifice unei specii sau sunt rezultatul unor schimbări zilnice ale vremii, intensităţii luminii sau a altor factori de mediu sau sunt datorate

11 Page 11 of 72 unor factori precum temperatura pielii şi densitatea părului care de asemenea se presupune a avea un rol în fixarea insectelor pe corpul animalului. În Danemarca, Nilsen, în 1971 a observat că specia Culicoides obsoletus, atacă vitele la păşune, mai mult în zona burţii, în special în zona ombilicală şi pe picioare şi doar un număr mic din aceste insecte atacă animalele pe zona spatelui şi lateralele corpului. Nilsen, a semnalat de asemena că atacul vitelor este masiv în special seara. În timpul atacurilor produse de Culicoides, animalele sunt în mod evident deranjate încercând să scape de aceste insecte fie lingându-se, muşcându-se, lovindu-se sau scărpinându-se. Autorii, Nilsen şi Chistensen (1975), au raportat colectarea a peste 2000 de exemplare de Culicoides nubeculosus de pe bovine în intervalul de de 15 minute şi au calculat că pe fiecare animal se aflau în acel interval, cel puţin de insecte. În Germania, Olbrish şi Liebisch (1988), au semnalat faptul într-o probă prelevată dintr-o fermă de bovine, în luna august speciile Culicoides dewulfi, Culicoides scoticus şi Culicoides obsoletus au reprezentat 75% din cele 19 specii de Culicoides prezente. De asemenea autorii a evidenţiat faptul că cele mai multe din înţepăturile au fost produse animalelor în intervalul orar Potrivit observaţiilor autorilor animalele închise la culoare erau cel mai atacte de insecte, în special în zonele de pe burtă, spate şi picioare. Un element important semnalat de autori a fost acela că cele mai multe din muşcăturile produse de insecte au avut loc în la luminozitatea cuprinsă între lucşi, iar viteza vântului de 1m/sec. În Australia, Muller (1982), a observant că rata înţepăturilor produse de Culicoides brevitarsis au ajuns până la 5000 de muşcături/animal/oră. Totuşi, de cele mai multe ori rata cea mai înaltă a atacurilor produse de Culicoides bovinelor se datorează îndeosebi speciilor care se inmulţesc exclusive în balega vitelor, precum Culicoides dewulfi (în Europa) şi Culicoides bolitinus (în Africa). Conform celor descries de Murray, în anul 1987, Culicoides brevitarsis se lasă din zbor în mod special pe partea dorsal a corpului animalelor, unde se strecoară prin păr pe piele. La oi, aceste insecte atacă faţa şi urechile şi mai puţin celelalte zone ale corpului. S-a observat faptul că în timp ce suprafaţa disponibilă pentru hrănire a insectelor pe vite este de aproximativ 3m², pe oi este de 0,09 m². Este clar că există un factor de 30 de ori mai mare în favoarea vitelor. În California, Mullens şi Gerry (1998), au colectat de pe un viţel, în 10 minute peste 281 de exemplare de Culicoides sonorensis. Autorii au calculat că aceast număr reprezintă de 7.2 ori numărul exemplarelor de Culicoides sonorensis capturate cu o capcană cu CO2, funcţională situată în apropierea animalelor, indicând faptul că animalele sunt mult mai atractive pentru insecte, decât capcanele. În Europa, pentru capturarea speciilor de Culicoides se folosesc pe scară largă capcanele tip Onderstepoort, cu lumină întunecată, care s-au dovedit a fi mult mai eficiente,

12 Page 12 of 72 decât capcanele cu CO2. S-a dovedit că aceste capcane au avut un succes commercial considerabil, fiind folosite atât pentru capturarea speciilor de Culicoides imicola, C. obsoletus, C. pulicaris,c. dewulfi, C. scoticus, dar şi pentru capturarea speciilor de Culicoides punctatus, insecte care înţeapă cu predilecţie omul. Pentru capturarea speciilor Culicoides punctatus prezente îndeosebi în Estul Scoţiei s-au instalat capcane tip Onderstepoort atât în grădini, subsolul hotelurilor, dar şi în staţiuni balenare. Pentru domeniul veterinar capcanele se montează doar afară, în interiorul clădirilor se folosesc la scară redusă fiind montate doar în padocuri sau ferme de animale valoroase sau ferme de viţei. Toate acestea evidenţiază faptul că dezvoltarea în continuare a acestei tehnologii este justificată doar pentru folosirea acestor capcane în ferme de carantină, în clădiri şi padocuri care au specii de animale de valoare, fiind considerată o metodă care vine în sprijinul altor metode de control al speciilor de Culicoides. Din datele prezentate, reiese faptul că în ferme, rata atacurilor cu specii de Culicoides variază foarte mult, însă atacurile intense sunt mai puţin obişnuite şi au loc doar atunci când acestea pot se înmulţească în apropiere animalelor şi condiţiile de mediu sunt favorabile ENDOFAGIA/EXOFAGIA ŞI ENDOFILIA/EXOFILIA Este important să se cunoască dacă o fermă poate fi considerată ca un magnet pentru speciile de Culicoides în vederea aplicării unor măsuri pentru evitarea acestei situaţii. Se cunoaşte faptul că speciile de Culicoides sunt exofage şi exofile, adică se hrănesc pe animale în mediul exterior (exofage) şi rămân în mediul exterior (exofile), rar intră în clădiri (endofile) şi se hrănesc pe animalele din adăpost (endofage). În Danemarca, Nielsen şi Christensen (1975), au semnalat faptul în intervalul mai-octombrie unele specii de Culicoides se hrănesc pe bovinele sau caii din adăposturi (endofagie), în cazul în care acestea stau permanent în adăposturi. Un fapt similar a fost observant şi în Nordul Europei, în anul 2006, cînd timpul izbucniri bluetongue au fost capturate cu ajutorul capcanelor luminoase, din adăposturile de animale numeroase exemplare de Culicoides obsoletus şi Culicoides dewulfi, însă nu a fost semnalată şi prezenţa speciilor de Culicoides pulicaris (Baldet, Meiswinkel şi Goffredo, 2006). În Africa de Sud, s-a semnalat prezenţa a numeroase exemplare de Culicoides bolitinus în capturile efectuate din grajduri, însă Culicoides imicola nu a fost găsit (Meiswinkel et al., 2000). Alţi autori au observa în Nordul Europei, că speciile Culicoides obsoletus şi Culicoides dewulfi, nu insă şi Culicoides pulicaris au fost capturate din interiorul clădirilor în care se aflau bovine (Baldet, Meiswinkel şi Goffredo, 2006). Potrivit acestor observaţii se poate concluziona faptul că nu este foarte clar dacă animalele din clădiri sau ferme sunt atacate în fiecare noapte de specii de Culicoides

13 Page 13 of 72 exofage/exofile pentru a consuma sânge. Din aceste considerente trebuie avută în vedere capturarea de insecte atât din interiorul grajdului, cât şi din exteriorul acestuia pentru cunoaşterea activităţii speciilor de Culicoides desfăşurate ziua şi noaptea în vederea stabilirii dacă aceasta este relevantă pentru transmiterea BTV. Dacă relevanţa este confirmată sistemul curent de monitorizare a vectorului trebuie adaptat, iar termenul de activitate din interiorul grajdului va trebui standardizat ORELE DE DE ATAC ŞI DISpersia În general activitatea de înţepare a diferitelor specii de Culicoides, din Europa, dar şi din alte zone din lume este intensă de la lăsatul serii şi în orele de noapte. Cu toate acestea cercetările efectuate în UK de Carpenter et al., în 2008 au evidenţiat faptul că speciile de Culicoides pe lângă activitate crepusculară au şi o activitate diurnă. Există indicii, care arată că în condiții meteorologice adecvate şi în special ceva mai târziu decât în sezonul obişnuit speciile de Culicoides potențial vector pentru virusul bluetongue să se hrănescă şi ziua. Implicaţiile în transmiterea virusului BT a vectorilor cu activitate diurnă este neclară în prezent în condiţiile în care programul de capturare a culicoizilor se desfăşoară în intervalul orar 22 şi 06 dimineaţa şi se efectuează capcane luminoase care nu pot ofere informaţii cu privire la activitatea diurnă de înţepare a acestor insecte. Este important de subliniat faptul că dispersia speciilor de Culicoides la nivelul exploatației este foarte slabă, motivul se presupune că este legat de distanţa mică de la locul de hrănire faţă de locurile de reproducere. Cât priveşte dispersia acestor insecte pe distanţe mai lungi, peste zeci sau chiar sute de km, deşi au fost raportată situaţii de mai mulţi lucrători, totuşi proporția populaţiilor implicate este considerată a fi foarte mică. Deoarece există tot mai multe semnale cu privire la activitatea diurnă a speciile de Culicoides se impune efectuarea unor capture diurne pentru stabilirea abundenţei speciilor de Culicoides din capture şi evaluarea relevanţei transmiterii a virusului BT. O metodă alternativă la capcanele luminoase pentru evidenţierea activităţii diurne a speciilor de Culicoides pot fi animalele momeală, dar şi capcanele cu aspirare. S-a demonstrate faptul că speciile de Culicoides prezente mai mult la latitudinile nordice sunt în general crepusculare, însă activitatea acestora poate continua pe tot parcursul nopţii. Totuşi aceste specii prezintă în intervalul de capturare două vârfuri de atac asupra animalelor un atac care se produce la răsăritul soarelui şi un atac la apusul soarelui. Orele de atac se pot

14 Page 14 of 72 prelungi atunci când lumina este slabă, timpul este înnorat şi în pădure (pentru Culicoides obsoletus care poate ataca animalele chiar şi la păşune), dar acestea se pot hrăni şi noaptea când timpul este înnorat este linişte şi cald (Nielsen, 1963). Activitatea diurnă a speciilor de Culicoides, în Africa este slabă chiar dacă lumina este strălucitoare şi există condiţii de umiditate slabă, în timp ce speciile Culicoides imicola înţeapă toată noaptea (Walker, 1979). Speciile de Culicoides prefer în general vremea calmă (liniştită) şi cu vânt slab (2m/sec). Lumina, ploaia cu burniţă nu suprimă activitatea speciilor de Culicoides (Murray, 1987; Meiswinkel, 1988). În general speciile de Culicoides se dispersează pe distanţe mici, în apropierea habitatelor preferate. În zona Mediteraneeană, s-a observant că speciile Culicoides imicola au putut fi dus de vânt până la distanţe de 100 km (Sellers, 1975; Sellers et al., 1977, 1978, 1979; Sellers şi Pedgley, 1985; Sellers şi Maarouf, 1989, 1991; Bravermann şi Chechik, 1996). De asemenea s-a observat că speciile Culicoides pulicaris au fost capturate la distanţe de km distanţă de continent (Hardy şi Cheng, 1986) habitatul DE REPRODUCERE Larvele de Culicoides au nevoie pentru a se dezvolta şi supravieţui de umiditate, motiv pentru care ele pot fi găsite oriunde sunt aceste condiţii. În tabelul 1 sunt prezentate habitatele preferate ale speciilor de Culicoides vectorii virusului bluetongue (Figurile 4-11). HABITATUL PREFERAT DE LARVELE UNOR SECII DE CULICOIDES 1.Specii de apă sărată sau alcalină Culicoides canithorax, C. furens Culicoides crepuscularis, C. haematopotus Culicoides melleus Culicoides tristriatulus 2. Specii de apă proaspătă Culicoides biguttatus Culicoides crepuscularis Culicoides haematopotus Culicoides insignis (inamollae), C. obsoletus, C. scoticus Culicoides piliferus Culicoides stellifer Culicoides variipennis 3.Specii localizate in scorbura copacilor Culicoides arboricola, Culicoides obsoletus Culicoides villosipennis Mlaştină, noroi Marginea unui râu cu apă alcalină Plajă de nisip Mlaştina sau suprafaţa sărată a noroiului Tabelul 1 Marginea unui râu Apă proaspată, marginea unui eleşteu Nisip sau noroi la marginea unui râu sau la marginea unui eleşteu Nisipul de la marginea unui râu Nisipul sau noroiul de la marginea unui râu, apa proaspătă a unei mlaştini Noroiul de la marginea unui eleşteu Apă poluată (canalizare), islaz Coaja copacilor Coaja copacilor, pe trunchiul copacilor

15 Page 15 of 72 4.Specii cu habitate diferite Culicoides obsoletus, C. scoticus continuare tabel 1 Habitat terestru umed, islaz, bălegar, tulpini de cereale descompuse, materiale umede putrezite liziera pădurilor C. imicola zona noroioasă din jurul grajdului Culicoides bolitinus, C. brevitarsis, C. wadai, Bălegar de elefant, rinoceri, zebre, bovine C. dewulfi, Culicoides bolitinus, C. marginea apelor, păşunea irigată chiopterus, C. dwulfi Culicoides obsoletus, C. sanguisuga Fructe şi flori descompuse, Figura 4 Diferite habitate de dezvoltare a speciilor de Culicoides

16 Page 16 of 72 Figura 5 Habitatul preferat dezvoltării larvelor de Culicoides imicola Figura 6 Habitatul preferat dezvoltării larvelor de Culicoides obsoletus (zonă de pădure)

17 Page 17 of 72 Figura 7 Habitatul preferat (mediu de apă dulce) dezvoltării larvelor de Culicoides sp Figura 8 Habitatul preferat (mediu de apă dulce ) dezvoltării larvelor de Culicoides sp.

18 Page 18 of 72 Figura 9 Diagrama: interacţiunea dintre gazdă şi tipurile de habitat larvar preferat a. suprafaţa apei şi/sau suprafaţa solului; b. balega diferitelor animale; c. vizuina copacilor, plante uscate, cavităţile stâncilor; d. tulpini de plante putrezite, fructe şi ciuperci;

19 Page 19 of 72 Figura 10 Habitat pentru dezvoltării larvelor de Culicoides parroti, Culicoides puncticolis, Culicoides nubeculosus, Culicoides circumscriptus, Culicoides riethi Figura 11 Gunoi de grajd habitat preferat dezvoltării larvelor de Culicoides obsoletus, Culicoides dewulfi, Culicoides chiopterus, Culicoides imicola

20 Page 20 of SPECII DE CULICOIDES VECTORI pentru virusul bluetongue În lume s-au descoperit aproximativ 50 de specii de Culicoides care au fost implicate în transmiterea virusului bluetongue la animale (Meiswinkel et al., 2004a). Dintre acestea o parte au fost depistate şi stabilite potenţial vector pentru virusul BT la animale, în Europa (Tabelele 2 şi 3). În Sudul Saharei, Africa, specia Culicoides imicola şi Culicoides bolitinus s-au dovedit că transmit virusul bluetongue la animale, dar şi alte orbivirusuri inclusive virusul encefalitei ecvine (EEV) şi virusul dermatitei ecvine a cailor (AHSV). În Africa de Sud s-au izolat 14 serotipuri ale virusului bluetongue de la Culicoides imicola (Nevill et al., 1992), unul din acestea fiind serotipul 8, care a afectat şi partea de Nord a Europei, în anul În bazinul Mediteraneean, în Est şi Estul Mijlociu, Culicoides imicola este considerat vectorul principal al virusului bluetongue. În partea de sud a Europei, s-a dovedit că 4 specii de Culicoides (Culicoides pulicaris, Culicoides scoticus, Culicoides obsoletus, Culicoides dewulfi) au fost implicate în transmiterea virusului bluetongue. Ultimele trei specii sunt considerate ca fiind cei mai importanţi vectori, din partea de Nord a Europei, speciile Culicoides imicola nefiind semnalate în această parte a Europei. În partea de Vest şi de Nord a Americii, cel mai important vector pentru virusul bluetongue este Culicoides sonorensis, iar în partea de Sud a Americii, Culicoides insignis şi Culicoides pusillu. În Sud - Estul Asiei şi în Australia principalul vector al virusului bluetongue este Culicoides brevitarsis, însă de cele mai multe ori acesta a fost semnalat împreună cu speciile Culicoides wadai, Culicoides fulvus şi Culicoides actoni.

21 Page 21 of 72 Specii din genul Culicoides (Latreille, 1809) cu rol în transmiterea virusului BT, în Europa Subgen Subgen/grup Complex specie Avaritia Fox, 1955 Culicoides Latreille, 1989 Tabelul 2 Imicola Imicola Culicoides imicola Obsoletus Obsoletus Culicoides obsoletus Chiopterus Chiopterus Culicoides chiopterus Scoticus Scoticus Culicoides scoticus Dewulfi Dewulfi Culicoides dewulfi Montanas Montanas Culicoides montanas Culicoides senso strict Pulicaris Culicoides pulicaris Culicoides lupicaris Alte specii neidentificate încă Newsteadi Culicoides newsteadi Culicoides punctatus Alte specii neidentificate încă Impunctatus Culicoides impunctatus Culicoides delta Silvicola Cockerelli Specii necunoscute încă Hoffmania Gutattus Culicoides insignis Culicoides filarifer Fagineus Fagineus Principalele date privind speciile de Culicoides potenţiale vector pentru virusul BT, în Europa Tabelul 3 Specia Culicoides imicola Complexul Obsoletus Culicoides dewulfi Culicoides chiopterus Complex Pulicaris Culicoides pulicaris Culicoides newsteadi Culicoides lupicaris Culicoides punctatus Uşor de identificat după Studiul virusului Izolarea virusului/detecţi a PCR Abundenţa în europa mediteraneean ă Abundenţa în europa temperată Locuri de reproducere Inregistrarea activităţii diurne Inregistrarea prezenţei în interior/exterior Da Câmp +/ expuse la soare, noroi îmbogăţit - +/+ organic, Da Câmp/lab. +/ Pădure, sol + +/+ îmbogăţit organic Nu Câmp -/ Pat de + +/+ Da Câmp -/ bălegar Pat de bălegar + +/+ Da Câmp +/ Expuse la - +/+ soare, Nu Câmp/lab +/+ + +(+) vegetaţie, - noroi, Da Câmp -/ materie - organică Nu Câmp -/- (-) (+) - da Câmp -/- +(+) Legendă : + specie slab abundentă ; +++ specie intens abundentă ; (+) şi (-) specie suspectă

22 Page 22 of SPECII DE CULICOIDES SEMNALATE PE TERITORIUL ROMANIEI 2. Culicoides nubeculosus 3. Culicoides vexans 4. Culicoides furcus 5. Culicoides setosus 6. Culicoides austeni 7. Culicoides variipennis 8. Culicoides milenii 9. Culicoides richardi 10. Culicoides bezzia 11. Culicoides spheromias 12. Culicoide obsoletus 13. Culicoides pulicaris 14. Culicoides grisescens Până la această dată a fost semnalată prezenţa pe teritoriul Romaniei a 14 specii de Culicoides. Dintre acestea 4 au fost implicate in transmiterea virusului bolii limbii albastre, in unele ţări din Europa RELAŢIa VIRUS-VECTOR Culicoides este cel mai important vector biologic care asigură transmiterea virusului bolii bluetongue la animale. Adultul de Culicoides devine infectat cu virusul bolii bluetongue pentru toată viaţa după ce preia infecţia prin consumul de sânge, de la animalele viremice. S-a observant că infecţia gazdei rumegătoare este trecătoare, iar virusul nu persistă într-o regiune geografică în absenţa vectorului competent (Gibbs şi Greiner, 1994). Clima şi condiţiile de mediu exercită o influenţă substanţială asupra transmiterii virusului bluetongue la populaţiile de rumegătoare, influenţând direct replicarea virusului bluetongue în corpul insectei (Mullens et al., 2004). Mecanismele infecţiei şi transmiterii de către vectori a virusului bluetongue a fost descrisă de Mellor (2000) şi poate fi rezumată astfel: -Virusul bluetongue este ingerat de femelele de Culicoides, de la o gazdă viremică, odată cu sângele în timpul prânzului şi ajunge, ajunge în partea terminal a intestinului mijlociu a insectei. Dacă insecta care a ingerat virusul este vector competent, particulele de virus se ataşează

23 Page 23 of 72 de peretele intestinal, pătrunde în celulele intestinului subţire, în interiorul citoplasmei printr-un proces de endocitoză unde se replică. Particulele de virus rezultate în urma acestui process trec în hemocelul vectorului se fixează pe suprafaţa celulelor intestinului şi probabil printr-un proces de inmugurire şi diseminare trec direct în cavitatea corpului, în hemolimfă. Ţinta următoare este reprezentată de ţesuturi, celulele neuronale, şi glandele salivare care de asemenea pot fi infectate în cursul acestui proces de diseminare. În cadrul celulelor glandelor salivare, are loc al doilea ciclu de replicare a virusului, urmând a se forma noi particule de virus care se depozitează în canalele glandelor salivare, urmând a fie eliberate prin înţepare în gazde în timpul prânzului sanguine. Intervalul de timp dintre ingestia virusului şi transmitere necesită o perioadă de incubaţie extrinsecă, iar durata acestui interval este în funcţie de temperature mediului. Concentraţia mare a virusului bolii bluetongue în canalele glandelor salivare a vectorilor este foarte eficientă în transmiterea la gazdele vertebrate. În acest caz înţepăturile produse de o singură insectă va determina infecţia gazdei (O Connell, 2002). De altfel, trenasmiterea de la o gazdă infectată la vector este mai puţin eficientă, fapt dovedit printr-un experiment care a relevat că în această situaţie vârful viremiei este <2%, (O Connell, 2002) pe indivizii infectaţi. La speciile de Culicoides non-vector, apar o serie de bariere sau constrângeri care împiedică diseminarea virusului în corpul insectei. Aceste insect non-vector pot fi infectate cu virusul bolii bluetongue, dar transmiterea pe cale orală nu a putut fi demonstrată deoarece probabil cantitatea de virus ingerată nu a fost suficient de mare cât să infecteze glandele salivare ale insectei. Din aceste considerente este foarte important ca vectorii să fie studiaţi în laborator pentru a face deosebirea între rata de infecţie a insectelor şi rata de transmitere la gazdele vertebrate (Jennings şi Mellor, 1987, Swanepoel, 1994). Unele specii de Phlebotomus şi ţânţari s-au dovedit a fi implicate în transmiterea pe cale verticală sau transovariană a unor arbovirusuri la urmaşi. Aceste insecte se pot contamina prin consumul de sânge de la animalele bolnave. În ce priveşte virusul bluetongue transmiterea acestui virus de către alte insect decât Culicoides nu a fost încă dovedită. Pentru a face dovada transmiterii vertical şi transovariene a virusului bluetongue la speciile de Culicoides s-au efectuat numeroase cercetări în laboratoare de renume din lume, totuşi până în prezent nu s-au obţinut rezultate certe care să facă dovada acestei transmiteri. Recent, în Statele Unite ale Americii, White et al, (2005), au izolat câteva secvenţe de ARN din virusul bluetongue din larve şi pupe de Culicoides sonorensis. Virusul viu nu a fost recuperate, dar aceasta reprezintă o constatare că virusul ar pute fi transmis de insect şi generaţiilor următoare. Barierele diseminării virusului bluetongue în corpul femelelor de Culicoides au fost rezumate de Mellor (1990), astfel:

24 Page 24 of 72 -numărul insectelor infectate după ce înţeapă un animal viremic depinde de nivelul viremiei animalului, de competenţa vectorului şi de rata de atac a insectelor. Sângele unui animal infectat este mult mai infecţios când titrul virusului este mare, imediat după infecţie (înainte de a se dezvolta anticorpii). Totuşi rezultatele experimentului sugerează existenţa unui vârf viremic cu titru >5 log 10 TCID 50 virus/ml. S-a constatat că abilitatea vectorilor în a asigura replicarea şi transmiterea virusului este foarte mult influenţată de temperatura mediului ambiant. Dacă temperatura mediului ambiant este suficient de mare, populaţia de vectori se poate infecta cu virusul bluetongue pe care îl pot transmite apoi la gazdele vertebrate. Rata replicării virusului bluetongue în corpul vectorului creşte cu temeperatura. La temperaturi joase de aproximatix 15 C nu a fost semnalată replicarea virusului bluetongue în corpul insectei, aceasta având loc la temperaturi cuprinse între C. S-a constatat că temperatura optimă necesară pentru transmiterea virusului bluetongue de la insecte la animalele gazdă şi invers este cuprinsă între C. La acest interval de temperaturi abilitatea de transmitere a virusului bluetongue poate fi extinsă şi la alte specii de Culicoides determinând astfel, creşterea incidenţei bolii (Mellor et al., 2000) INFLUENŢA CONDIŢIILOR DE CLIMĂ Ciclul de transmitere a virusului bluetongue şi ciclul biologic al vectorului Culicoides este influenţat de temperatură şi gradul de umiditate. Competenţa vectorială a speciilor de Culicoides, vectori tradiţionali sau a speciilor non-vector este influenţată de temperature crescută (Paweska et al., 2002; Wittmann et al., 2002). La vectorii tradiţionali infectaţi în laborator pe cale orală cu virus, s-a stabilit că rata replicării virale este mult crescută la temperatură ridicată (temperatura optimă C; Van Dijk, 1982), iar eficienţa barierelor care constrâng diseminarea virusului în corpul vectorului este mult redusă (Tabachnick, 1991). S-a observant că în condiţii de laborator virusul bluetongue persistă în corpul însectei chiar şi la temperature joase (<10 C), până la 35 de zile, iar dacă temperature creşte virusul se replică şi poate fi transmis (Mellor et al., 1998). La speciile non-vector, de exemplu la Culicoide nubeculosus competenţa vectorială poate fi indusă, astfel, din larvele crescute la temperaturi ridicate (30-35 C), adulţii devin cu 10% mai infectanţi, comparative cu 0% la 30 C (Mellor et al., 1998; Wittmann et al., 2002). Acest fenomen a fost atribuit dispersiei virusului direct în hemocelul insectei, trecând barierele intestinului mijlociu, permiţând replicarea şi diseminarea virusului. Se consider că atât la speciile vectoari competenţi, cât şi la speciile non-vector

25 Page 25 of 72 potenţialul transmiterii virusului bluetongue creşte în perioadele călduroase şi foarte călduroase de vară/toamnă. Potrivit observaţiilor efectuate în teren de cercetători din întreaga lume s-a demonstrat că în zonele cu climă caldă ratele dezvoltării, activităţii şi supravieţuirii vectorilor culicoizi sunt mult mărite, în timp ce în zonele cu climă temperată unde sunt ierni reci şi very foarte călduroase populaţia de vectori este mult redusă putând creşte doar cîn condiţiile favorabile se menţin pentru cea mai mare parte a anului (Bishop et al., 1996; Welley et al., 1996; Wittmann, 2000). Potenţialul de transmitere a virusului bluetongue este foarte sensibil în concordanţă cu perioada de incubaţie extrinsecă (care descreşte la temperaturi ridicate (Mellor et al., 1998; Paweska et al., 2002; Wittmann et al., 2002), care durează 6-8 zile la 25 C şi doar 4 zile la 30 C) şi probabilitatea de supravieţuire zilnică a adulţilor de Culicoides ( optimă între C şi mult redusă la 30 C). Umiditatea al doilea factor extrinsic la fel de important care afectează speciile de Culicoides şi transmiterea virusului bluetongue. Precipitaţiile influenţează forma şi persistenţa habitatelor semiacvatice (Mellor et al., 2000). De exemplu, speciile complexului Culicoides imicola preferă timpul polios, dar nu potopul, solul îmbogăţit organic şi noroiul (Bavermann et al., 1974, Bavermann 1978, Meisvinkel, 1998). Deşi, nu a fost demonstrată niciodată existenţa unei relaţii între precipitaţii şi creşterea abundenţei speciilor din complexul Imicola (observaţii efectuate de Ortega et al., 1999, în zona Mediteraneeană), totuşi, din observaţiile efectuate în Africa de Sud s-a remarcat că asocierea verilor ploioase cu El Nino determină o creştere a abundenţei speciilor Culicoides imicola (Nevill, 1971, Meiswinkel, 1998, Baylis, Mellor şi Meiswinkel, 1999). Precipitaţiile determină de asemenea disponibilitatea şi durata umidităţii microhabitatului în perioada vară/toamnă, când adulţii se formează. Se consider că pentru stabilirea condiţiilor de transmitere a virusului bluetongue este foarte important să se identifice atât temparatura, cât şi umiditatea (Purse et al., 2005). Creşterea temperaturii (îndeosebi în timpul nopţii şi iarna) şi precipitaţiile intense (îndeosebi vara/toamna) determină creşterea incidenţei transmiterii virusului bluetongue prin: 1.creşterea abundenţei şi activităţii vectorilor; 2.creşterea ratei de dezvoltare a virusului în corpul vectorilor; 3.creşterea proporţiei vectorilor care sunt competenţi; 4.extinderea abilităţii transmiterii virusului şi la alte specii de Culicoides. Legătura dintre virusul bluetongue şi schimbările climaterice sunt mecanisme încă neclare (Purse et al., 2005). Cu toate acestea s-a remarcat o extindere a virusul bluetongue şi a vectorului Culicoides imicola (specie afro-asiatică), în zone din Sudul Europei, (îndeosebi din

26 Page 26 of 72 anul 1990), în prezent nu se ştie dacă astăzi acele zone sunt libere de vectori sau a scăzut abundenţa vectorilor datorită scăderii temperaturii (Purse et al., 2005). Încălzirea global a făcut să crească importanţa vectorilor din complexele Palearctice, în mod deosebit a speciilor din complexele Culicoides obsoletus şi Culicoides pulicaris, în transmiterea virusului bluetongue, atât prin creşterea numeric a acestor populaţii, cât şi a ratei lor de supravieţuire Activitatea sezonieră A VECTORILOR Activitatea sezonieră a vectorilor în Europa a fost evaluată prin folosirea capcanelor luminoase plasate îndeosebi la exteriorul grajdului, de altfel nu există suficiente date pe termen lung care să fie evidenţieze activitatea desfăşurată de culicoizi în interiorul grajdului şi pet imp de zi. În Europa este o înţelegere clară a activităţii sezoniere a speciilor complexelor Imicola şi Obsoletus. Informaţii similar referitoare la alte specii, precum cele din complexele Dewulfi, Chiopterus şi Pulicaris sunt incomplete. Modelul sezonier annual relevă că activitatea începe primăvara şi încetează iarna fiind generată de climat, specificitatea biologic a speciilor, locurile de înmulţire şi disponibilitatea gazdelor. În Europa există puţine date disponiobile cu privire la variaţiile sezoniere anuale, cât şi la abundenţa femelelor nulliparous şi parous, în ciuda importanţei vârstei graduale a femelelor de Culicoides care reprezintă un factor de risc în transmiterea BTV. Pe termen lung setul de date cu privire la implicarea culicoizilor în activitatea din interiorul adăposturilor şi pe zi care să contribuie la reducerea sau extinderea activităţii sezoniere anuale a acestor specii ca vectori BT încă nu sunt clare. Pentru administrarea efectivă a bolii bluetongue şi care poate include vaccinarea profilactică este esenţial să se identifice distribuţia geografică a vectorilor implicaţi în transmiterea virusului acestei boli. Totuşi, deoarece există 70 specii de Culicoides sau mai multe care pot fi găsite într-o ţără este important de asemena să se stabilească sezonalitatea prevalenţei acestora deoarece pentru a fi stabiliţi ca vectori perioada lor de maximă abundenţă trebuie să coincidă cu apariţia bolii. Din aceste motive timp de 15 ani s-au efectuat cercetări la nivel regional sau naţional în mod special în jumătatea vestică a bazinului Mediteraneean. Rezultatele acestor studii au ajutat la cartagrafierea detaliată şi foarte precisă a distribuţiei şi sezonalităţii speciilor din complexul Imicola şi în unele cazuri şi a speciilor din complexele Pulicaris şi Obsoletus. Dintre ţările în care s-au efectuat studii ample în acest sens semnalăm Maroc (Baylis

27 Page 27 of 72 et al., 1998), Spania (Rawlings et al., 1997; Ortega et al., 1999; Sarto, Monteys şi Saiz- Ardanaz, 2003; Calvete et al., 2006), Portugalia (Capela et al., 1993, 2003), Insulele Baleare (Miranda et al., 2003, 2004), Corsica (Baldet et al., 2004), Italia (Goffredo et al., 2003, 2004; Conte et al., 2003; Calistri et al., 2003; Meiswinkel et al., 2007)şi Grecia (Patakakis, 2004) Datele adunate de la capcanele luminoase montate în Spania, Portugalia şi Maroc referitoare la complexele Imicola şi Obsoletus au dezvăluit profundele diferenţe care există între sezonalitatea distribuţiei spaţiale a acestora în spaţiul acestor ţări. S-a remarcat faptul că speciile complexului Imicola apar în număr redus în lunile Aprile/Mai, ulterior numărul acestora înregistrează o creştere progresivă ajungând la un număr foarte mare în intervalul August- Octombrie (mai exact atunci când exploziile de BTV şi AHSV sunt de o intensitate maximă). Speciile complexului Obsoletus s-a observant că apar exploziv primăvara, după care înregistrează o scădere vertiginoasă, iar în unele regiuni cum sunt Italia continentală numărul lor creşte gradual până atinge nivelul moderat de abundenţă spre sfârşitul sezonului vară/toamnă (Savini et al., 2005 b). De aceea, deoarece BTV este o boală a verii târzii spre toamnă rezultatele investigaţiilor entomologice efectuate în regiunea Mediteraneeană au indicat faptul că speciile complexului Imicola ar fi vectorul principal al virusului bluetongue din sudul Europei. Deşi, speciile complexului Obsoletus apar în aceleaşi zone cu speciile complexului Imicola dar ceva mai târziu de-a lungul anului totuşi o convieţuire spaţială a acestora împreună este destul de rară (Ortega et al., 1998) şi astfel coimplicarea acestora în izbucnirea bluetongue şi Culicoides imicola este probabil limitată. În acest context trebuie remarcat faptul că vârfurile majore din timpul verii caracteristice speciilor din complexul Obsoletus şi Pulicaris (Ortega et al., 1998) nu sunt niciodată însoţite de apariţia simultană a virusului bluetongue, sugerând că virusul nu se transmite la Culicoides peste iarnă transovarian, dar printr-un alt mecanism, cum ar fi continuarea la un nivel scăzut şi nedetectabil a ciclului virusului într-un număr mic de vectori şi gazed - ar putea explica perioadă lungă de linişte (6-12 luni) care preced reapariţia formelor clinice la gazdele vertebrate Apariţia în perioade diferite pe parcursul unui an, dar pe aceleaşi teritorii a speciilor din complexele Obsoletus şi Imicola s-a datorat diferenţelor fundamentale ale mediului de dezvoltare, cu toate că acestea rămân un element greu de înţeles. Rezultatele investigaţiilor efectuate în Insulele Sardiniei au evidenţiat că există o mare acoperire spaţială între speciile complexelor Imicola şi Pulicaris. Această suprapunere a fost atribuită în mare parte modului de dezvoltare întâlnit la ambele specii şi anume în zonele cu mult noroi, puţină vegetaţie şi luminat de soare, însă la acestea diferă faptul că în timp ce pupele speciilor complexului Pulicaris înoată uşor, cele de Imicola se îneacă. Această atracţie parţială între cei doi vectori ridică problema cât

28 Page 28 of 72 de puternică este implicarea speciilor din complexul Pulicaris în epidemiologia BTV în sudul Europei. În acest context trebuie făcute 2 observaţii: a) Cel puţin 8 specii din complexul Pulicaris s-au găsit în Sudul Europei, dar pentru că identificarea lor a fost foarte greoaie au rămas incluse în acest complex. b) Eforturile trebuie direcţionate cu scopul de a izola virusul bluetongue din speciile complexului Pulicaris pentru clarificarea rolului vectorial a fiecărei specii din cadrul complexului în epidemiologia bolii În timp ce Complexul Imicola cuprinde specii de climă tropicală/subtropicală, complexul Obsoletus cuprinde specii de climă boreală (temperată). Speciile complexului Obsoletus sunt tolerante la mediile temperaturilor anuale joase care facilitează pătrunderea lor la latitudini mari (66 N) pe când complexul Imicola are specii care sunt limitate ca răspândire sub 45 N Rezultatele cercetărilor efectuate în zona Mediteraneeană au constituit baza în întocmirea unor hărţi de risc îndeosbei pentru complexul Imicola. Deşi aceste hărţi au furnizat o valoroasă introspecţie în potenţialul pericol pe care îl reprezintă speciile complexului Imicola în bazinul Mediteraneean şi au ajutat la direcţionarea viitoarelor activităţi de supraveghere, ele au subestimat realitatea din teren (Calistro et al., 2003). Această slăbiciune include o dependenţă faţă de datele dobândite şi afirmaţia despre unele date incomplete privind ecologia speciilor vector. Recenta descoperire a noii specii Culicoides dewulfi, potenţial vector pentru virusul bluetongue în Olanda a cărei prezenţă nu a fost raportată anterior demonstrează faptul că pentru Nor-Estul Europei nu există suficiente date care să stabilească aria geografică de distribuţie a speciilor de Culicoides vectori MODul DE DEFINIRE A PERIOADEI LIBERE DE VECTORI Conform codului Sănătăţii Animalelor Terestre a Organizaţiei Internaţionale a Epizootiilor s-a stabilit că: O zonă liberă de vectori este o parte dintr-o ţară infectată sau o zonă pentru care într-o perioadă a anului supravegherea a demonstrat lipsa, fie a transmiterii virusului bluetongue, fie a adulţilor de Culicoides care sunt vectori competenţi. Motivul descreşterii şi chiar dispariţiei transmiterii bluetongue a fost atribuit scăderii frecvenţei hrănirii insectelor, datorită scăderii temperaturii, această situaţie ar explica în parte durata scurtă a perioadei de activitate a vectorilor din zonele mai reci.

29 Page 29 of Criteriul folosit pentru determinarea începutului şi sfârşitului perioadei libere de vectori, include: a) ultima evidenţă de transmitere a virusului bluetongue în cadrul unei zone restrictive stabilite prin programele de supraveghere sau alte probe care sugerează oprirea transmiterii bluetongue; b) încetarea existenţei vectorilor şi probabil a activităţii acestora şi demonstrarea acestui fapt prin programele de supraveghere entomologică şi c) condiţiile de mediu care au impact asupra comportamentului vectorilor în ceea ce priveşte capacitatea lor vectorială. Activitatea speciilor de Culicoides se opreşte când maxima temperaturilor scade până la 10 C pentru 2 săptămâni consecutiv sau pentru o săptămână, din care ultimele 3 zile sunt cu chiciură (cu temperature în jur de 0 C), datorită înstalării sezonului rece. Aceste criterii reflectă rezultatele cercetărilor obţinute pe parcursul a peste 100 de ani de observaţii care semnalează faptul că izbucnirea bluetongue (dar şi a vectorilor), încetează odată cu răcirea vremii, în special când apare zăpada. Este clar că în zonele cu frig sever populaţiile adulte de Culicoides nu supravieţuiesc. Dacă considerăm că o fracţie destul de mică (<0,1%) de Culicoides prezente la sfârşitul sezonului toamnă pot fi infectate cu virusul bluetongue atunci devine clar că virusul are puţine şanse să supravieţuiască pe timpul iernii în gazda vector nevertebrată. Aceasta explică în mare parte oprirea transmiterii virusului bluetongue şi rezultatul este silirea retragerii virusului către zonele tropicale unde activitatea vectorială va asigura persistenţa acestuia. Totuşi există unele lacune în susţinerea acestui argument deoarece în zona Mediteraneeană incursiunile unuia sau altui serotip a virusului bluetongue persistă mai mult de un sezon, dar se caracterizează printr-o perioadă de acalmie (6-12 luni) înainte de izbucnirea următorului an, sugerând fie supravieţuirea culicoidelor la un nivel scăzut fără a fi observate, fie aceasta s-a realizat fiind ajutată de un mecanism necunoscut. Transmiterea transovariană a virusului prin ouă şi stadii imature de Culicoides ar fi posibilă însă toate încercările nu au elucidat această prezumţie, astfel: a) s-au efectuat în condiţii de laborator diferite încercări de inoculare a virusului în corpul insectei adulte, acestea au fost hrănite pentru a ajunge la maturitate şi depune ponta, însă în final s-a constatat că nu s-au obţinut exemplare de adulţi de Culicoides infectaţi b) dacă virusul s-ar fi transmis transovarian primăvară de timpuriu, odată cu primul val de Culicoides ar fi trebuit să reapră virusul însă acest lucru nu s-a întâmplat până acum. Poate nu este cazul în această situaţie deoarece bluetongue este o boală de vară târzie spre toamnă. Totuşi, explicaţia rămâne clară că mecanismul precis al virusului bluetongue de (trecere peste iarnă) a supravieţui peste iarnă ne depăşeşte. Această inevitabilitate complică orice încercare de definire a perioadei libere de boală. În completare şi făcând un rezumat al celor prezentate se constată că sezonalitatea vectorilor culicoizi este legată puternic de condiţiile climaterice, care datorită faptului că sunt variabile fac foarte dificilă definirea anotimpurilor libere de vectori. Totuşi în timpul recentei izbucniri a

30 Page 30 of 72 virusului bluetongue în Nordul Europei s-a observat că deşi ce se apropia iarna, un număr tot mai mare de Culicoides erau capturate în capcanele luminoase suspendate în interiorul clădirilor fermelor. Aceste constatări s-au făcute pe arii întinse de-a lungul statelor membre afectate şi în timpul procesului s-a constatat prezenţa a >10 Culicoides/capcană care au fost folosite până acum ca etalon pentru stabilirea perioadei libere de vectori. Ceea ce s-a arătat de asemenea că numărul redus de Culicoides în intervalul de o săptămână poate fi urmat de o creştere importantă a numărului lor în săptămânile următoare sau mai târziu ceea ce întârzie orice afirmaţie care ar pute fi făcută de autorităţile competente asupra exactităţii începerii perioadei libere de vectori. Această întârziere are un impact negativ asupra comerţului, dar este o situaţie ce ar putea fi ameliorată într-o oarecare măsură. S-a constatat că în probele colectate din interiorul clădirilor, din Nordul Europei în perioada de iarnă la temperaturi de 10 C, 99% din exemplarele de Culicoides prezente au fost indivizi tineri nulliparous, proaspăt ieşiţi din ou. Aceasta indică că din ouăle depuse la sfârşitul toamnei şi iarna timpuriu larvele au continuat să se dezvolte, din acestea ieşind adulţi. O altă caracteristică importantă a ciclului de viaţă a speciilor de Culicoides de la latitudini înalte este că acestea iernează în stare larvară şi când temperature s-a încălzit suficient în primăvară larvele îşi termină dezvoltarea şi adulţii vor apărea în masă. Această preponderenţă a speciilor de Culicoides tinere în capcanele luminoase persist pentru cel puţin 3 luni şi pentru cea mai mare parte a acestei perioade a inclus doar indivizi sporadic în doar 1 sau 2 din totalul capcanelor operabile pe teritoriul Olandei. Investigaţiile effectuate pe tot parcursul anului au evidenţiat faptul că în zonele cu climă temperat continentală doar în luna aprilie apar în capcane primele specii de Culicoides hrănite, ceea ce indică faptul că atacul animalelor începe să abia loc în această perioadă. Dacă se ia în consideraţie că temperaturile mai reci vor rămâne normale pe cea mai mare perioadă a primăverii se poate presupune că primele female parous vor începe să apară doar 2-3 săptămâni după capturarea primele specii de Culicoides hrănite. Femelel adulte sunt cele care reprezintă pericolul. Pe această bază sfârşitul perioadei libere de vectori poate fi definită ca fiind atunci când 5 sau mai multe exemplare de female de Culicoides parous s-au capturat cu ajutorul capcanelor luminoase, care vor prelungi perioada liberă de vectori cu cel puţin câteva săptămâni. Este important de adăugat că, chiar femelele parous la începutul perioadei nu ar reprezenta un risc deoarece pentru a fi infectate cu virusul bluetongue este nevoie în primul rând să se hrănească pe o gazdă viremică care nu se întâlneşte în primăvară. În mod evident acest amendament al definirii a ceea ce constituie perioadă liberă de vectori nu este valabil la latitudinile mai călduroase unde femelele de Culicoides parous pot fi întâlnite în număr mai mic de-a lungul iernii. Acestea includ exemplare care au rămas din sezonul trecut şi care pot infecta animalele cu virusul bluetongue constituind un risc. Această teorie anulează

31 Page 31 of 72 valoarea folosită de 5 femele de Culicoides parous ca un etalon de siguranţă în zonele endemice ce apar la latitudini mai călduroase şi de asemenea în zonele unde nu ninge de la altitudini mai mari creeând astfel un mozaic complicat de posibilităţi în care poate deveni destul de greu să inplementezi sistemul de zonă liberă de vectori folosind 5 exemplare de female de Culicoides parous/capcană Ecologia vectorilor Taxonomie, distribuţie şi statusul de vector al speciilor de Culicoides în Europa vectorului În Europa speciile de Culicoides care au fost implicate ca potenţial vectori în transmiterea BTV aparţine genului Avaritia şi Culicoides. Studii privind implicarea speciilor de Culicoides în transmiterea BTV în Europa au evidenţiat faptul că speciile cele mai implicate au fost: Culicoides imicola, din complexul Obsoletus au fost implicate speciile C. dewulfi şi C. chiopterus, iar din complexul Pulicaris speciile C. pulicaris, C. newsteadi, C. punctatus şi C. lupicaris. Aceste date se bazează pe informaţiile obţinute prin colectarea culicoizilor folosind capcanele luminoase. Subgenul Avaritia Studiile privind ecologia vectorilor BT, care aparţin subgenului Avaritia, în Europa evidenţiază o abundenţă mare a acestora, îndeosebi în apropierea fermelor de animale. În Europa acest subgen înclude reprezentanţi cum sunt Culicoides (Avaritia) obsoletus (Meigen), 1818, Culicoides (Avaritia)imicola (Kieffer), 1913, Culicoides (Avaritia) chiopterus (Meigen) 1830, Culicoides (Avaritia) scoticus (Downes and Kettle), 1852, Culicoides (Avaritia) dewulfi (Gaetghebuer), 1836, Culicoides (Avaritia) montanus (Shakirzjanova) Din punct de vedere istoric, în Europa complexul Obsoletus (numit de cei mai mulţi autori grupul Obsoletus) cuprinde următoarele specii: C. obsoletus, C. scoticus, C. montanus, C. chiopterus, C. dewulfi care aparţine subgenului Avaritia în Europa (exclusiv C. imicola care până de curând nu era cunoscută în Europa). Culicoides imicola se deosebeşte uşor după desenul aripii de celelalte specii de europene din subgenul Avaritia. În cazul în care există dubii acestea se diferenţiază prin testul RT-PCR care are o specificitate de 92% şi o sensibilitate de 95% (Cetre-Sossah et al., 2008). Datorită dificultăţilor de diferenţieriere a femelelor de C. imicola de alte specii din subgenul Avaritia din Europa pe baza caracterelor morfologice s-a impus introducerea tehnicii de biologie molecular.

32 Page 32 of 72 Studiile de biologie molecular au permis diferenţierea speciilor de C. obsoletus de C. montanus deoarece acestea sunt foarte greu de diferenţiat doar pe baza caracterelor morfologice. De asemenea tehnica se poate utilize şi pentru diferenţierea specie C. obsoletus de C. scoticus care nu pot fi diferenţiate prin alte metode (Meiswinkel et al., 2004; Nolan et al., 2007; Mathieu et al., 2007). Culicoides imicola: distribuţie, statusul de vector şi habitatul larvar Culicoides imicola are o distirbuţie Afro-Asiatică, fiind relativ recent semnalat în Europa îndeosebi în partea de sud a peninsulei Iberice, dar şi în Grecia şi Turcia. Recent mai mulţi autori au semnalat exapnsiunea spre nord a acestei specii (Mellor şi Wittmann, 2002). Date care au confirmat implicarea C. imicola ca vector pentru virusul BT în Europa s-au bazat pe distribuţia şi abundenţa acesteia în ferme, dar şi pe izolarea virusului BT din femelele parous (M. Goffredo pcomunicare personal, 2006). Cele mai multe studii cu privire la capacitatea vectorială a acestei specii de a transmite BTV s-au efectuat în Africa. Nu au fost publicate alte date care să confirme izolarea virusului BT de la C. imicola în Europa. Implicaţiile C. imicola ca vector pentru virusul BT în Europa se bazează pe distribuţia şi abundenţa în ferme sau din apropierea acestora, izolarea virusului BT din femelele parous cât şi pe evidenţele istorice privind rolul acestora în transmitere a virusului şi în alte zone. Pentru identificarea speciilor complexului Culicoides (Avaritia). imicola se face apel la desenul aripii cel mai important element care ajută la diferenţierea celor 120 de specii de Culicoides care formează fauna Paleartică de Culicoides. Deşi speciile acestui complex se deosebesc de celelalte specii destul de uşor după desenul aripii, totuşi în cazul în care sunt dubii se pot diferenţia şi prin testul RT-PCR, care are o specificitate de 92% şi o sensibilitate de 95% (Cetre Sossah et al., 2008). Speciile complexului Culicoides (Avaritia). imicola au fost implicate ca vector în anul 1943 în transmiterea virusului bluetongue, în Africa de Sud, fiind semnalat la altitudini cuprinse între m, însă este slab reprezentată pe un teren drept sau uşor ondulat şi în care media anuală de ploaie este cuprinsă între mm, (atât vara, cât şi iarna). De asemenea Culicoides imicola este des catalogată ca fiind specie tropical activă capabilă să tolereze o foarte largă gamă de condiţii climatic: pe de o parte trăieşte în arii care au până la 90 de zile zăpadă pe an şi unde zăpada poate să cadă în mod regulat, iar pe de altă parte trăieşte foarte bine în zone cu secetă (Africa de Sud). S-a observant că cel mai mare număr de Culicoides imicola trăieşte în zone unde terenul este predominant argilos, deoarece acest teren perimite reţinerea mai bine a umidităţii la suprafaţă pentrru o perioadă sufficient de lungă, permiţând larvelor de Culicoides imicola să-şi desfăşoare cu success şi repede ciclul de viaţă (7-10 zile).

33 Page 33 of 72 Simultan şi inexplicabil Culicoides imicola este total absent din vecinătatea zonelor unde este teren nisipos. Acesta este cazul particular de-a lungul costelor unde în timpul ploilor la nivelul mării şi vântul care bate dinspre mare spre uscat duce la formarea unor largi enclave de pământ sărac şi nisipos, în interiorul acestor enclave absenţa lui Culicoides imicola astăzi este explicată datorită faptului că orice ploaie care cade se filtrează rapid prin solul poros. În acest mod suprafaţa rămâne uscată şi va duce la moartea oricăror larve de Culicoides care pot apărea. În mod evident aceste terenuri nisipoase au un climat care de altfel este potrivit pentru Culicoides imicola şi demonstrează că temperature şi căderile de ploi nu pot fi considerate indicatori infailibili pentru prezenţa sau absenţa lui Culicoides imicola şi că de asemenea tipul de sol este un factor esenţial în această ecuaţie. În zonele cu temperature ridicate şi cu ploi tropicale, din Africa, cu terenuri sărace în nutrienţi Culicoides imicola este absentă. Cel mai potrivit habitat pentru dezvoltarea larvelor s-a dovedit a fi solul umed îmbogăţit în materie organică (Baverman et al., 1974). Complexul Obsoletus Complexul Obsoletus cuprinde speciile C. obsoletus, C. scoticus şi C. montanus a căror femele nu pot fi diferenţiate decât prin biologie moleculară. Culicoides obsoletus a fost indicat ca potenţial vector pentru BTV 4 în Cypru în 1977 (Mellor şi Pitzolis, 1979) şi mai târziu în Italia pentru BTV 9 şi BTV 2 (Savini et al., 2005). Culicoides obsoletus: distribuţie, statusul de vector şi habitatul larvar Culicoides obsoletus/scoticus Aceste două specii (şi alte 4) împreună formează complexul Obsoletus care ca şi complexul Imicola este unu din cele 6 complexe care formează subgenul Avaritia care se găsesc pe scară largă în întreaga regiunea palearctică, dar C. montanus apare mai puţin frecvent (Boorman, 1986). În Italia această specie a fost identificată folosind testul multiplex PCR (M. Goffredo, comunicare personal). Pentru separarea morfologică a speciilor complexului Culicoides obsoletus de Culicoides scoticus s-au depus eforturi foarte mari însă pentru că această separare nu a reuşit acestea au rămas împreună. Pentru elucidarea densităţii populaţiei şi ariei geografice pentru distingerea Culicoides obsoletus de Culicoides scoticus va trebui să se dezvolte şi să se folosească tehnici de biologie molecular. Potrivit datelor din literature de specialitate nu este încă clară distribuţia C. obsoletus şi C. scoticus în Europa. De altfel populaţiile acestor specii apar extreme de răspândite şi se bazează pe colectarea şi identificarea şi a masculilor. În anul 2007 Carpenter a demonstrate că speciile de Culicoides scoticus sunt capabile să suporte replicarea a BTV-9 şi a BTV-8.

34 Page 34 of 72 Culicoides obsoletus prima dată a fost implicat în transmiterea virusului bluetongue în Insula Cipru, în anul 1977; statutul lui de vector a fost reconfirmat în anul 2003, când cercetări separate efectuate, în Italia, au incriminat pe Culicoides obsoletus, dar şi pe ruda lui apropiată şi Culicoides scoticus în transmiterea virusului bluetongue. Referindu-ne la prima indicaţie ca potenţial vector a specie Culicoides obsoletus în Cypru este important să subliniem că a fost izolat BTV-4 (Mellor şi Pitzolis, 1979), iar mai târziu în Italia s-a izolat BTV-9 şi BTV-2 (Savini et al., 2005). În 2006 în Germania s-a izolat BTV-8, prin RT-PCR (Mehlborn, 2007), iar în Spania BTV-1 (I.M. Sanchez-Vizcaino şi M. Miranda, 2008 comunicare personală). Cei doi vectori Culicoides obsoletus şi Culicoides scoticus sunt endemici în Europa şi pentru că ei apar şi în Nordul îndepărtat la paralele 66 joacă un rol important în regiunea de risc a virusului bolii bluetongue. Deşi, se presupune că aceşti vectori sunt responsabili pentru doar 10%, din transmiterea virusului bluetongue, în Europa se pare că ei încep să joace un important rol vectorial în creştere (ascensiune). Aceasta poate fi pusă şi pe seama încălzirii globale. Totuşi caracteristicile ecologice rămân puţin înţelese. De exemplu, în Italia, o strânsă corelaţie s-a găsit între o pupulaţie mare de Culicoides obsoletus şi decimarea pădurilor care confirm ceea ce se ştie déjà referitor la mediul de reproducere: aşternutul de frunze din pădure. Cu toate acestea au fost semnalate o varietate largă de habitate de reproducere. Pentru Culicoides scoticus situaţia este neclară. Este recunoscut că se inmulţeşte în fungi, dar răspândirea şi abundenţa lui indică cu totul altceva. Astfel, este nevoie de mai mult studiu pentru a clarifica habitatele de inmulţire a ambelor specii şi în mod special la Culicoides scoticus. În present studiile de biologie molecular ajută foarte mult la diferenţierea speciilor C. obsoletus şi C. montanus care de altfel sunt greu chiar imposibil de separat deoarece morfologic sunt foarte apropiate (Meiswinkel et al., 2004). De asemenea studiile de biologie molecular pot ajuta în cunoaşterea densităţii populaţiilor de Culicoides şi a distribuţiei geografice a acestora. De asemenea este nevoie de o mai mare claritate în cunoaşterea capacităţii vectoriale. Este important de subliniat că distribuţia C. obsoletus şi C. scoticus în Europa nu este până la această dată suficient de documentată. Referindu-ne la ariile de reproducere pentru C obsoletus constatăm că acestea includ o largă varietate de habitate cum sunt: fragmente de banane putrede (Mellor and Pitzolis, 1979), gunoi de frunze de pădure, apă stagnantă şi zone mlăştinoase (Dzhafarov, 1976), bălegar de cal (dar nu de bovine) şi grămezi de compost de gradină (Campbell şi Pelham-Clinton, 1960). Referitor la C. scoticus nu sunt clare informaţiile cu privire la site-urile majore de reproducere în ciuda rapoartelor în care se specifică dezvoltarea pe ciuperci cum sunt: Lactarius turpis şi

35 Page 35 of 72 Armillaria mellea (Downes şi Kettle, 1952, Buxton, 1960) şi a habitatelor mlăştinoase din sudul Angliei (Boorman şi Goddard, 1970). Recent au fost găsite larve de C. obsoletus/c. scoticus în reziduuri de porumb de siloz (Zimmer et al., 2008). Cu toate acestea nu sunt lămurite lucrurile cu privire la locurile majore de reproducere pentru C. scoticus şi C. montanus din Europa. Culicoides dewulfi Goetghebuer (1936) Această specie are o distribuţie palearctică fiind înregistrată în toată partea de nord a Europei. Această specie apare ca fiind mai puţin comună şi abundentă în partea de sud a Europei decât complexul Obsoletus fiind semnalat în aceleaşi arii geografice. Deosebirea morfologică a speciilor C. dewulfi faţă de speciile complexului Obsoletus se bazează doar pe desenul aripii, fapt ce poate creia problem pentru un specialist fără experineţă. Foarte recent, în 2006, Culicoides dewulfi a fost implicat ca potenţial nou vector a virusului bluetongue, în timpul izbucnirii în nord-vestul Europei, în Olanad, Belgia, Germania, Franţa, Luxenburg. În timp ce statusul lui vectorial rămâne clar demonstrat ar fi prudent să se dea mai multă atenţie ecologiei acestui vector. În 1952, în Scoţia s-a descoperit că se înmulţeşte în balega vitelor şi cailor, ceea ce înseamnă că distribuţia de-a lungul Europei va fi determinată într-o mare măsură de aceste animale. Această asociere între Culicoides dewulfi şi ferme cresc potenţialul vectorial şi este intensificată de faptul că pătrunde în clădiri şi muşcă animalele din interior. Culicoides dewulfi a fost înregistrat în aproximativ 14 ţări din Irlanda, din Vestul şi până în Estul Rusiei, din Nordul Danemarcii în Sudul Italiei. Într-o mare măsură distribuţia este mare în Nordul temeprat şi scade în intensitate în Sudul Mediteraeean, uscat şi cald. Totuşi, bazându-ne pe datele de biologie molecular Culicoides dewulfi a fost capturat de-a lungul Italiei la altitudini cuprinse între m. Taxonul Culicoides dewulfi este monofiletic şi deci nu trebuie inclus în complexul Obsoletus. În anul 2007 a fost detectat în Olanda, BTV-8 în femele de C. dewulfi, prin RT-PCR (Meiswinkel et al., 2007). Site-uri de reproducere pentru C dewulfi au fost semnalate de cele mai multe ori în bălegarul de cal şi bovine în UK (Kettle şi Lawson, 1952; Campbell şi Pelham-Clinton, 1960) şi în bălegar și amestecuri de sol arat în Belgia (Zimmer et al., 2008). Culicoides chiopterus Meigen (1830) Această specie are o distribuţie palearctică fiind semnalat în partea de nord a Europei la fel ca C. dewulfi. Prezenţa acestei specii în partea de sud a Europei nu a fost suficient clarificată în comparaţie cu prezenţa din nordul Europei. Identificarea acestei specii se bazează pe dimensiunea acesteia şi lipsa de marcaje clare de pe aripi (fiind mult mai mici decât la celelalte

36 Page 36 of 72 specii ale complexului Obsoletus). Această specie a fost relativ recent implicată în transmiterea BTV-8 în nordul Europei fiind detectate pozitive prin RT-PCR female nehrănite cu sânge în ţări precum Olanda şi Franţa (Dijikstra et al., 2008). Site-urile de reproducere pentru C. chiopterus sunt similare ca cele descrise pentru C. dewulfi. Balega de vaca este habitatul larvare principal pentru această specie după cum a citat Kettle şi Lawson (1952), Campbell şi Pelham-Clinton (1960) şi mai recent de Zimmer et al. (2008). Subgenul Culicoides Subgenul Culicoides cuprinde aproximativ 50 de specii şi recent Gomulski et al. (2006) a propus ca acest gen să fie împărţit în 4: subgenul Culicoides sensu strict, sbgenul Silvicola Mirzaeva şi Isaev, subgenul Hoffmania Fox 1948 şi complexul Fagineus. Aceşti autori au recunoscut 14 specii europene care aparţin sugenului Culicoides sensu stricot, printre acestea cele mai commune specii din Europa sunt: Culicoides pulicaris Linne, 1758; Culicoides punctatus Meigen 1818; Culicoides delta (Edwards) 1939; Culicoides lupicaris Downes şi Kettle Bazat pe consideraţii morfologice şi de biologie moleculară în viitor subgenul Culicoides poate fi subdivizat în trei complexe: complexul Pulicaris care include C. pulicaris şi C. lupicaris, complexul Newsteadi care include C. newsteadi şi C. punctatus şi complexul Impunctatus care include C. impunctatus şi C. delta (Gomulski et al., 2006; J.-C. Delacolle). De altfel statusul taxonomic rămâne neclar. Pentru comoditate Culicoides sensu strict a fost denumit complexul Pulicaris. Complexul Pulicaris are o distribuţie Palearctică fiind înregistrat din Europa de Nord și de Sud și Africa de Nord. Virusul BT a fost izolat din insecte din complexul Pulicaris provenite din Italia (Caracappa et al., 2003). Importanţa acestui complex în transmiterea virusului BT poate fi redusă în comparaţie cu alţi potenţiali vectori cum sunt cei din complexul Obsoletus deoarece în general se pare a fi mai abundenţi şi pe scară largă. În sudul Europei (în mod special în Italia şi Spania) C. newsteadi este cea mai abundentă specie din acest grup, dar nu a fost demonstrată ca fiind vector BT. Carpenter et al., (2006) a dovedit că C. pulicaris/c. punctatus sunt capabile de replicare a BTV-9 în UK. Meiswinkel et al., (2007) a testat pri RT-PCR 96 de exemplare de C. pulicaris/c. lupicaris şi 20 de C. puctatus capturate din ferme din Olanda, iar 8 din aceste specii au fost positive.

37 Page 37 of 72 Culicoides pulicaris Linne, 1758; Ca taxon Culicoides pulicaris aparţine subgenului Culicoides (cei mai mulţi autori consideră că este C. pulicaris). Aceasta este doar parţial corect pentru cel puţin 50 de speciireprezentând cel puţin 3 subgenuri- marea majoritate a autorilor sunt nemulţumiţi în present de grupul Culicoides pulicaris. Mai exact subgenul Culicoides (=complexul Pulicaris), cuprinde doar 12 specii dintre care cel puţin 8 se găsesc în Europa; cele mai multe dintre ele pot fi identificate prin mediul lor distinctive de reproducere. Totuşi există problem care rămân în taxonomia complexului Pulicaris şi în mod special Culicoides pulicaris senso strict (ss) care a fost incriminată în 2003 în insula Sicilia ca vector al virusului bluetongue. Din cauza unui taxonomii problematice este puţin probabil ca multe din datele publicate despre ecologia lui Culicoides pulicaris sunt combinate cu unele informaţii referitoare la speciile înrudite. Este evident că Culicoides pulicaris (ss) ca şi Culicoides imicola favorizează de asemenea disprsarea în habitate vegetale moderate care sunt luminate, dar diferă prin aceea că apare mai mult la altitudini şi latitudini boreale. În plus, Culicoides imicola spre deosebire de pupa lui Culicoides pulicaris (ss) nu este susceptibilă de înec şi deci este capabilă să se inmulţescă în situaţii de umiditate excesivă. Totuşi este nevoie de cecetări intense pentru definirea şi diferenţierea completă a habitatului larvar (şi a ariilor geografice) a numeroaselor specii din complexul Pulicaris, din Europa. În timpul recentei izbucniri de bluetongue cu serotipul 8, din Nord-Vestul Europei, Culicoides pulicaris (ss) a reprezentat >5%, din aproximativ exemplare de Culicoides capturate, indicând că a jucat un rol vectorial neglijabil; a fost de aemenea limitat în distribuţia sa şi în plus pare să fi fost exofilic, fiind rar capturat în grajdul de animale BIOLOGIA VECTORILOR În natură speciile de Culicoides se întâlnesc în condiţii de mediu foarte diferite, fapt ce face uneori dificilă capturarea acestora. Locul de refugiu a speciilor de Culicoides este învelişul ierbos, iar în regiunile păduroase acestea se adăpostesc în tufişuri sau în partea inferioară a coronamentului copacilor. În locurile deschise habitatul lor este stratul ierbos. Se găsesc sde asemenea în tufişurile de la marginea râurilor. Pet imp de ceaţă Culicoides se ascunde în crăpăturile din sol, în peşteri sau în fântâni. Cu toate acestea cel mai frecvent se găsesc în preajma aglomeraţiilor de vite, a grajdurilor, în jurul caselor, în cazul când acestea sunt aproape de râu. Nu există specificitate de gazdă, ci mai degrabă preferinţă pentru o specie sau alta. Activitatea speciilor de Culicoides este în funcţie de mai mulţi factori şi anume: temperature, luminozitatea, umiditatea, etc.

38 Page 38 of 72 Activitatea optimă a acestor insect se desfăşoară la temperature cuprinse între C, dacă şi celelalte condiţii sunt favorabile. Aceste specii pot fi foarte aggressive şi la temperature de 5-6 C şi la C. La o lumină puternică activitatea speciilor de Culicoides este mult frânată, uneori nulă, lumina slabă le stimulează activitatea. Specia Culicoides obsoletus este foarte activă între orele 19-22, dar sunt şi specii care atacă în plină zi. În întuneric complet activitatea speciilor de Culicoides este neînsemnată. În zilele mohorâte de vară când temperature este de 20 C atacul cu Culicoides se poate face şi în timpul zilei. Activitatea din timpul nopţii este în strânsă legătură cu răsăritul şi apusul soarelui. Un alt factor care influenţează activitatea speciilor de Culicoides este vântul. S-a constatat că pe vreme liniştită cu o viteză a vântului de 1m/sec activitatea nu este stânjenită, depăşirea vitezei vântului de 2m/sec le face să se adăpostească şi să înceteze activitatea. Speciile de Culicoides au posibilitatea de a se deplasa la distanţe mari de la locul de eclozare. Astfel, acestea se pot deplasa în masă maxim 500 m, după care numărul lor scade mult până la 1 km şi numai întâmplător parcurg distanţe mai mari de 2 km. Speciile de Culicoides zboară la înălţimi mici de la sol. Cele mai bune capturi se obţin din apropierea solului, în partea inferioară a plantelor, dar nu înseamnă că nu pot zbura şi la m înălţime sau mai mult. Temperature are o mare influenţă asupra dezvoltării speciilor de Culicoides. Larvele de Culicoides se pot găsi în băltoace, mocirle, şanţuri cu apă, gropi, fântâni, canale, pâraie, râuri unde de obicei larvele se găsesc în straturile de mâl, în solul nisipos şi argilos de-a lungul malurilor râurilor, dar şi în solurile sărate. Durata de viaţă a adulţilor de Culicoides este de maximum 92 de zile, însă de cele mai multe ori este mult mai mică. Complexul Culicoides obsoletus Aceste specii au o răspândire destul de mare. Adăposturile larvare sunt constituite din mâl sau nisip de-a lungul pâraielor, lacurilor sau bălţilor, uneori pot fi şi lacuri cu ape sărate. Toate speciile complexului Obsoletus sunt foarte aggresive, atacul producându-se în roiuri mari. Acestea se găsesc şi la altitudini mari de peste 1800 m. Sunt specii tipic de pădure, dar ajung şi în zonele montane la peste 2000 m. Se găsesc şi în regiuni joase, chiar şes în număr destul de mare.

39 Page 39 of 72 Complexul Culicoides pulicaris În general sunt specii de talie mare, dar pot prezenta o mare variabilitate atât în ceea ce priveşte mărimea şi coloritul toracelui, cât şi mărimea şi intensitatea petelor de pe aripi. Sunt specii agressive pentru om şi animalele domestic. Larvele acestor specii trăiesc în noroiul de pe malul râurilor şi bălţilor. Speciile din complexul Pulicaris se găsesc în toate zonele ţării, dar în zonele de silvostepă şi de pădure domină numeric faţă de alte specii de Culicoides. Au 1-3 generaţii pe an, în funcţie de temperatura mediului ambient. În ţara noastră speciile acestui complex ating maximum de dezvoltare la sfârşitul verii şi începutul toamnei CONTROLUL vectorilor Nu există produse veterinare autorizate în mod special de UE pentru controlul speciilor de Culicoides. Totuşi există o mare varietate de produse chimice care sunt avizate pentru folosire în combatarea diferitelor specii de dipetere. Mullens (1992) considera ca scopul controlului vectorilor este de a reduce capacitatea vectorială, de a reduce rata inţepăturilor şi de supravieţuire a insectelor. In realitate rar este posibila elimniarea complete a vectorilor dintr-o zona, deci controlul vectorilor este doar o măsura de reducere a acestora care se foloseste împreună cu alte strategii de control. Habitatele preferate pentru C. obsoletus sunt înca incomplet cunoscute (EFSA, 2008). Studiile pentru controlul vectorilor include controlul acestora atât prin metode chimice, cât şi prin metode fizice sau mecanice. Metodele chimice constau în: tratarea efectivelor de animale cu insecticide, repelenţi sau medicamente antiparazitare sistemice (avermectine); tratarea habitatelor larvare sau a adulţilor rămaşi în zone tratate cu insecticide; tratarea adăposturilor de animale şi/sau mijloacelor de transport cu insecticide. Metodele fizice sau mecanice constau în: distrugerea sau reducerea habitatelor larvare din apropierea fermelor; controlarea grajdurilor de animale pentru cunoaşterea activităţii culicoizilor Metode chimice de control pentru Culicoides Lupta împotriva vectorilor virusului bolii bluetongue se poate desfăşura în trei direcţii astfel, pentru: tratarea efectivelor de animale cu insecticide, repelenţi sau medicamente antiparazitare sistemice (avermectine); tratarea habitatelor larvare sau a adulţilor rămaşi în zone tratate cu insecticide; tratarea adăposturilor de animale şi/sau mijloacelor de transport cu insecticide.

40 Page 40 of Tratarea efectivelor de animale cu insecticide, repelenţi sau medicamente antiparazitare sistemice (avermectine); Pentru controlul ecto- şi endoparaziţilor la rumegătoare se utilizează o gamă destul de largă de compuşi chimici, unii dintre aceştia având impact şi asupra speciilor de Culicoides care să se hrăneasc pe animale. Aceşti compuşi pot fi împărţiţi în produse pentru uz local cum ar fi: formulele: pour-on (care de obicei se aplică de-a lungul coloanei vertebrale a animalelor), crotaliile ataşate animalelor, îmbăierea (când animalele sunt îmbăiate în aceste produse) sau formule sistemice injectabile. Produsele pour-on, crotaliile şi îmbăierile se bazează pe piretroide sintetice (cypermethrin, deltamethrin, perimethrin, flumethrin, cyfluthrin, cyhalothrin) sau organofosfaţi. Cele mai multe cercetări relevă faptul că insecticidelor sunt concentrate pe insecte, care atacă de obicei capul şi partea superioară a rumegătoarelor. Totuşi Culicoides preferă să înţepe şi laturile corpului, burta şi picioarele inferioare. În acest context este vital ca insecticidele să fie puse, de-a lungul spatelui animalelor pentru a ajunge într-o concentrație suficientă în zonele ţintă şi să ucidă rapid culicoizii şi orice alte insecte infectate înainte de a putea transmite agenţii unor boli. Aceşti compuşi chimici îşi exercită efectul în două direcţii: - în primul rând sunt toxici pentru insectele care atacă animalele, omorându-le în câteva minute; - în al doilea rând reduc probabilitatea insectelor de a consuma sânge. Se cunoaşte faptul că pentru a evita înţepăturile produse de Culicoides animalelor acestea se pot trata deltamethrin produs care are efect de contact sau orice alt produs care are efect asupra ectoparaziţilor. Deşi, tratarea vitelor cu substanţe chimice nu prea se practică sau se aplică destul de rar, totuşi, aceasta ar fi justificată dacă ne gândim la pericolul transmiterii de bolii. Puţine insecticide piretroide au efect direct asupra dipterelor, iar utilizarea acestora depinde de formulă. Perioada de eliminare a rezidurilor este destul de lungă. Sprayurile şi/sau unele insecticide care se impregnează în piele se pot folosi săptămânal. Aceste produse au efect 4-6 săptămâni. S-au efectuat unele experimente prin injectarea animalelor cu ivomec 200 mcg/kg, în această situaţie media mortalităţii culicoizilor hrăniţi pe aceste animale a fost de 99%, timp de 10 zile după tratament, însă după tratamentul cu ivomec apar o serie de reacţii adverse, una din acestea fiind efectul residual. O măsură aplicabilă în cazul depistării prezenţei bolii în zonă este vaccinarea animalelor, cât mai devreme la o vârstă mică pentru a induce imunitatea acestora şi a impiedica instalarea bolii. Imunizarea tuturor bovinelor dintr-o fermă, teoretic reduce incidenţa animalelor susceptibile şi nivelul virusului transmis la ovine în acea fermă.

41 Page 41 of 72 Literatura de specialitate semnalează faptul că prezenţa bovinelor lângă ovine reduce nivelul infecţiei cu virusul bluetongue a ovinelor, aparent şi asta datorită faptului că speciile de Culicoides preferă să se hrănească pe bovine. (Figura 12). - Figura 12 Tehnica aplicării produselor pour-on dorsal a animalelor, de la gât la baza cozii de-a lungul liniei mediane Produse pour-on În anul 2008 au fost publicate de Mehlhorn et al., două studii in vitro privind efectul letal al produselor deltamethrin şi cylfluthrin asupra Culicoides spp. În aceste studii deltamethrinul (7,5 g/100 ml) sau cyfluthrinul (1 g/100 ml) conţinând soluţii pour-on au fost administrate la bovine şi ovine. Atât pentru cyfluthrin, cât și pentru deltamethrin efectul letal a fost înregistrate până la 21 și respectiv 28 de zile de la aplicare. Crotalii impregnate cu substanţe insecticide Un studiu efectaut în America (Holbrook, 1986) arata ca impregnând crotaliile cu un piretroid acesta are efect pana la 10 săptămâni de la aplicare pentru Culicoides. Liebisch et al., (2008b) a efectuat un experiment cu crotalii la bovine în Nord -Vestul Germaniei, în anul 2007 şi a constatat că dintr-un total de 165 juninci şi vaci de lapte la 20 s-au una sau două crotalii impregnate cu permethrin (1,2 g permethrin per crotalie). Repelenţii şi efectele toxice împrotiva insectelor care atacă bovinele s-au observat abia după 19 zile după ataşarea crotaliilor. Bovinele cu o singură crotalie sunt mai puţin protajate. Cu toate acestea, datorită inconvenientului descris de Liebisch et al., (2008a) în acest studiu este imposibil să se determine dacă rezultatele pot fi folosite ca o concluzie generală.

42 Page 42 of 72 Produse insecticide pentru îmbăierea animalelor Este important de subliniat că nu s-au făcut evaluari suplimentara cu privire la îmbăierea animalelor. Cu toate acestea îmbăierile cu pyretroid au fost retrase de la utilizarea într-un număr mare de ţări nord europene datorită preocupărilor ecologice și câteva produse pe bază de organofosfaţi sunt acum disponibile pentru protejarea operatorului. Repelenţi În prezent se cunosc doar câţiva repelenţi care se utilizează împotriva culicoizilor, însă efectul acestora este de doar câteva ore (Schrecketol, 1979a, 1979b, Baverman şi Chizov- Ginzburg 1997, 1998). Cel mai cunoscut repelent împotriva culicoizilor este Diethyl toluamide (DEET) care este preluat de acestea odată cu consumul de sânge. În anul 1977 Baverman şi şi Chizov-Ginzburg 1997 a testat în Israel un număr suficient de repelenţi la bovine cu efect împotriva Culicoides imicola, efectul produsului fiind de doar 4,4 respectiv 9 ore. Recent au fost dezvoltaţi noi repelenţi chimici a căror eficacitate a fost comparabilă cu cea a DEET (Nentwing, 2003; Badolo et al., 2004). De altefel eficacitatea şi persistenţa acestui repelent împotriva Culicoides din Europa nu a fost încă cunoscut. Pentru atragerea speciilor C. imicola s-au utilizat şi repelenţi derivaţi din plante cum ar fi Mosuguard, formulă parfumată pe bază de eucalipt. Acest repelent s-a folosit pentru impregnarea plaselor capcanelor (Baverman et al., 1999). Este important de subliniat faptul că repelenţii se utilizează rar deoarece necesită aplicare zilnică (imposibil de realizat cu excepţia pentru cel mai valoros de animale) şi că nu poate fi folosit decât în concentraţii mici. Compuşi sistemici Compuşii sistemici cum ar fi lactonele macrociclice pot constitui un mijloc de control pentru Culicoides care poate fi verificat prin mortalitatea acestora după ce se hrănesc pe animalele tratate. Pentru combaterea culicoizilor în Australia şi SUA s-au folosit avermectine injectabile, iar rezultatele obţinute au fost diferite. Astfe, în Australia după injectarea animalelor cu 200 µg/kg ivermectine s-a constat că în intervalul de 48 de ore de la tratament până la 10 zile s-a observat că au fost omorâţi 99% dintre culicoizii hrăniţi pe aceste animale tratate (Standfast et al., 1985). În America Holbrook (1994) şi Holbrook şi Mullens (1994) au semnalat că ivermectinele nu au avut efect semnificativ pentru Culicoides sonorensis (în condiţiile în care s-a

43 Page 43 of 72 utilizat aceiaşi cantitate/aceiaşi greutate). Constatările efectuate au evidenţiat faptul că, sângele animalelor tratate nu a fost suficient de toxic pentru a omorî insectele culicoide. În Europa fectul produselor ivermectine împotriva culicoizilor nu a fost stabilită datorită perioadei lungi de lactaţie a efectivelor Tratarea habitatelor larvare sau a adulţilor rămaşi în zone tratate cu insecticide Pentru tratarea habitatelor larvare în vederea combaterii speciilor de Culicoides mai întâi acestea trebuie identificate, în lipsa identificării acestora tratarea habitatelor este ineficientă. Literatura de specialitate conţine date recente privind habitatele larvare pentru speciile de Culicoides din fermele de animale din tarile europene (Zimmer et al., 2008). Populaţiile de C. imicola trăiesc de obicei în apropierea zonelor cu gunoi de grajd. De aceea este recomandabil ca săptămânal bălegarul să se mute din fermă într-o zonă cât mai departe de animale, iar bovinele să se trateze cu tetrachlorvinphos (Baverman et al., 2001). Acest tratament asigură pe de o parte reducerea numărului adulţilor de C. imicola (fapt care se poate monitoriza prin capturarea insectelor cu capcane cu soluţie slabă de detergent), iar pe de altă parte omorârea larvelor din bălegarul animalelor (Baverman). Există un număr mare de vectori (C. brevitarsis, C. bolitinus, C. wadai, C. dewulfi) care îşi depun ponta în bălegar din care iese o nouă generaţie de insecte la de zile şi care nu sunt afectate de insecticide aplicate după această perioadă. Este cunoscut faptul că gunoiul de grajd este mediul propice de dezvoltare pentru unele specii de culicoizi din acest considerent acesta trebuie tratat periodic cu insecticide pentru a împiedica apariţia unei noi generaţii de culicoizi. Bălegarul tratat cu ivermectine s-a dovedit că acestea au efect larvicidal pentru culicoizi până la 28 de zile (Webster et al., 1992), timp suficient deoarece cele mai multe specii de Culicoides au ciclul complet de dezvoltare doar jumătate din acest interval. Cu toate acestea trebuie menţionat faptul că efectul larvicid al ivermectinelor poate produce pierderea şi a altei faune coprofilice cum ar fi gândacii care trăiesc în gunoiul de grajd şi care sunt esenţiali pentru sanitaţie. Pentru combaterea speciilor de Culicoides există încercări privind aplicarea unor metode active şi paralel a unor metode de apărare. Modificarea habitatelor larvare Speciile Culicoides prefer condițiile umede într-o varietate de habitate, în special zonele umede, zonele pline de noroi și în fecale, dar şi pe plante. Modificarea acestor zone prin eliminarea materiei organice şi zonele de drenare pline de noroi, constituie o parte importantă a strategiei de control pentru Culicoides (Figurile 13 şi 14).

44 Page 44 of 72 Figura 13 Iaz stagnant ce înconjoară zona mlăştinosă loc un ideal de reproducţie pentru Culicoides Figura 14. Modificarea habitatului de reproducere prin drenarea şi acoperirea iazului Acest loc nu mai este adecvat pentru reproducerea Culicoides Utilizarea unor larvicide în posibilele locuri reproducere ale culicoizilor și realizarea controlului mediului prin utilizarea de adulticide (Figurile 15 şi 16). Pentru controlul clădirilor se pot folosi produse cum sunt: capcane de insect, spray-uri, împrăştiere de momeli, aburi, etc. Combaterea activă a culicoizilor constă în înlăturarea condiţiilor favorabile dezvoltării acestora (gunoiul de grajd, apa băltită, etc). Acest sistem poate fi eficient dacă se aplică în zona unde habitatele larvare sunt abundente.

45 Page 45 of 72 Figura 15 Tehnica pulverizării de larvacide în habitatele de reproducere pentru Culicoides. Figura 16 Echipamente pentru pulverizare de adulticide pentru controlul adulţilor de Culicoides În zonele unde există umiditate crescută, iar lavele sunt împrăştiate în diferite habitate (bazine, sol umed, frunzar, scorbura copacilor, vegetaţia de putrefacţie) se poate recurge la defrişarea pădurilor, la secarea bazinelor acvatice, etc. Există şi metode chimice de combatere a speciilor de Culicoides prin folosirea de insecticide cu acţiune de scurtă durată, cum ar fi compuşii organofosforici. Aceste substanţe se pot folosi atât pentru larve, cât şi pentru adulţi. Pentru împrăştierea acestor substanţe se pot face stropiri cu avionul sau elicopterul. Combaterea populaţiilor larvare se poate face şi cu insecticide piretroide şi dieldrin care sunt foarte eficiente. Cu toate acestea speciile de Culicoides devin rezistente la scurt timp după aplicarea acestor produse, chiar şi la doze mici. Pentru adulţii de Culicoides se pot folosi repelenţi, dar efectul acestora este limitat la o perioadă foarte scurtă de timp necesitând repetare.

46 Page 46 of 72 Pentru distrugerea larvelor de Culicoides localizate în sol se pot folosi generatoarele de aerosoli, iar pe scară mică se pot utiliza insecticide fumigene. Aerosolii au efect bun dar de scurtă durată. O metodă destul de eficientă care poate fi folosită pentru combaterea speciilor de Culicoides este cea biologică. Această metodă constă în folosirea în combatere a duşmanilor naturali ai acestor insecte. Un exemplu în acest sens ar fi folosirea speciei Nereis versicolor, (duşmanul natural al speciilor de Culicoides) sau a unor larve de ceratopogonide cum ar fi: Bezzia, Probezzia care să atace larvele de Culicoides. Pentru controlul speciilor de Culicoides în sensul limitării distribuţiei în număr mare a acestora se pot face experimente cu Baccilus thuringiensis, agent biologic pentru ţânţari, dar care are efect şi asupra larvelor de Culicoides. Adulţii de Culicoides pot fi atacaţi şi de muşte din genul Tychydromia, iar larvele pot fi distruse şi de hydra de apă dulce sau larvele de Culicoides pulicaris pot fi atacate de unele ciliate. Adulţii de Culicoides pulicaris, Culicoides obsoletus, dar şi alte specii de Culicoides pot fi parazitate de unii acarieni din familiile Trombididae, Gamasidae. Larvele de Culicoides, cât şi adulţii pot fi infestate cu mermetide, acţiunea acestora putând produce uneori feminizarea masculilor. Ca mijloace de apărare atât a omului, cât şi animalelor de culicoizi se pot folosi plase sau site care să fie puse la geamuri după o prealabilă impregnare cu insecticide, însă rezultatele obţinute sunt slabe deoarece aceste insecte intră destul de rar în interiorul clădirilor, ele atacând de obicei în aer liber. La ovine, pentru a împeidica înţepăturile culicoizilor se poate folosi metoda impregnării lânii cu preparate insecticide, aceiaşi utilizată în combatarea ectoparaziţilor Tratarea adăposturilor de animale şi/sau mijloacelor de transport cu insecticide Vehiculele care transportă animale dintr-un loc în altul se impune să fie tratate cu insecticide care conţin piretroide sintetice, ingredient active. Dintre insecticidele cele mai utilizate pentru stropire sunt piretroidele sintetice (Floor, 1985; Kline et al., 1981). Nu este recomandată utilizarea de spray-uri pentru grajdurile de animale sau abatoare şi pentru vehiculele care transporta animale. În anul 2000 s-au aplicat în toate fermele din Sardinia piretroide atât pe sol, cât şi în grajduri pentru controlul populaţiilor de Culicoides imicola. În două din ferme dintre care una cu o abundenţă slabă şi una o abundenţa mare a culicoizilor s-au făcut tratamente cu piretroide, s-au montat capcane cu lumină întunecată şi s-au capturat culicoizi, atât înainte de efectuarea

47 Page 47 of 72 tratamentului cât şi după tratament. Rezultatele examenelor de laborator au evidenţiat faptul în probele prelevate înainte de tratament abundenţa culicoizilor a fost mare în timp ce în probele prelevate după tratament abundenţa a scăzut mult, dar după o săptămână de la tratament numărul culicoizilor a început să crească (M. Goffredo comunicare personală). Eliminarea vectorilor din grajdurile de animale Nielsen şi Christensen au semnalat faptul că în capturile de insecte efectuate din interiorul grajului de bovine din Danemarca au identificat 7 specii de culicoizi, dintre care şi C. obsoletus (nu însă şi C. pulicaris). Dintre acestea multe fiind female de Culicoides pline cu sânge, fapt atribuit prezenţei permanente a bovinelor în grajd. O observaţie similară s-a înregistrat şi în Olanda în anul 2006, unde un număr semnificativ de Culicoides, inclusiv de C. obsoletus şi C. dewulfi (nu şi de C. pulicaris) au fost capturate din interiorul grajdului (Meiswinkel şi Goffredo, 2006), clădire aproape în întregime închisă, fapt ce indică că pentru a asigura un bun control este nevoie ca animalele să fie inchise foarte bine. Este important de remarcat faptul că specia Culicoides pulicaris este exofilă, motiv pentru care aceasta nu a fost semnalată în probele prelevate din interiorul grajdului comparative cu C. obsoletus, dar şi alţi culicoizi sunt endofili, adică trăiesc în interiorul grajdului de animale. Pentru excluderea aproape în totalitate a speciilor de C. obsoletus din grajd Jamnback (1961) a montat la geamuri plase pe care le-a impregnate cu soluţie malathion. Rezultate similar a obţinut şi Kleine şi Roberts (1981) care a găsit un număr mic de culicoizi în grajd după ce a tratat plasele de la geamuri cu substanţe cum sunt: clorpirifos, fenthion, malathion sau propoxur. În Spania plasele de la geamurile grajdurilor s-au impregnate cu insecticide oferind o protecţie animalelor şi reducând abundenţa cu C. imicola din interiorul grajdului comparativ cu cea de la intrare în grajd (Calvet et al., 2007). În Ghana s-a constatat că prin tratarea plaselor de la geamurile grajdurilor cu insecticide se reduce numărul culicoizilor din capcana montată în interiorul grajdului cu 70-80% (Maia et al., 2005). Impactul substanţelor chimice asupra mediului înconjurător Mai multe substanţe cum ar fi piretroidele sintetice sau avermectinele sunt foarte toxice pentru speciile nețintă cum ar fi albinele, peştii şi animalele acvatice. Impactul compuşilor de insecticide asupra mediului nu este de neluat în seama când se folosesc asfel de produse. De exemplu pireroidele sintetice au o toxicitate slabă pentru animale, dar sunt extrem de toxice pentru animalele acvatice, care pot avea un impact major asupra mediului când sunt contaminate organisemele din apă, dar şi apariţia de scurgeri după utilizare.

48 Page 48 of Controlul mecanic al vectorilor Metodele fizice (mecanice) de luptă împotriva vectorilor virusului bolii limbii albastre sunt reprezentate de: suprimarea/reducerea habitatelor de înmulţire, curăţarea garjdurilor şi folosirea momelilor pentru capturare Suprimarea/reducerea habitatelor de înmulţire Atunci când grajdurile sunt închise (de seara până dimineaţa) este posibil ca numărul exemplarelor de Culicoides capturate din grajd să fie mic deoarece aceste insecte sunt active pe parcursul zilei. În situaţia în care 85% din grajd este închis (plase la geamuri şi uşi) abundenţa speciilor din complexul Obsoletus din interiorul grajdului poate fi cu 20% mai mică decât afară (M. Goffredo). Pentru a împiedica atacarea animalelor de către insecte şi pentru a preveni transmiterea virusului bluetongue la animale este recomandabil ca acestea să fie ţinute zi şi noapte în grajduri curate şi protejate cu plase anti insect la geamuri şi uşi. În ţările mediteraneene habitatele de C. imicola se găsesc destul de aproape de animale, îndeosebi în fermele de bovine. Eliminarea gunoiului de grajd cea mai important component a habitatului ajută la reducerea drastic a populaţie de C. imicola. Îndepărtarea gunoiului de grajd se poate face prin conversia acestuia în compost, biogaz sau scoaterea gunoiului de grajd din curtea animalelor, metodă practicată în unele ferme de animale din Israel. Ori de câte ori există gunoi de grajd acesta trebuie adunat grămezi eliminat şi la fiecare 10 zile. De asemenea pentru distrugerea habitatelor larvare la C. imicola se impune păstrarea uscată a construcţiilor animalelor (grajdurile) şi prevenirea formării scurgerilor de apă, cât şi eliminarea excedentelor de apă de la jgheaburi Folosirea momelilor pentru capturarea vectorilor Dintre toate speciile de animale caii sunt cele mai bune momeli pentru capturarea culicoizilor, aceştia fiind cei mai buni atractanţi în mod special pentru C. imicola comparativ cu ovinele, caprinele şi chiar bovinele. Este important de subliniat faptul că şi animalele sălbatice pot fi buni atractanţi pentru Culicoides.

49 Page 49 of 72 Capitolul 2 MONITORIZAREA SPECIILOR DE CULICOIDES 2.1. PROTOCOL DE capturare ŞI IDENTIFICARE A SPECIILOR DE CULICOIDES În orice sistem de supraveghere entomologică a bluetongue scopul este capturarea larvelor şi adulţilor de Culicoides din vecinătatea gazdelor vertebrate PROTOCOL DE capturare A SPECIILOR DE CULICOIDES ECHIPAMENT Pentru capturarea adulţilor de Culicoides se folosesc capcane tip Onderstepoort South Africa, cu lumină întunecată (model recomandat de Meiswinkel, IZS, Teramo, Italia). Aceste capcane s-au folosit în ultimul timp în toată Europa, iar rezultatele obţinute au dovedit că acest tip de capcane ar fi de 10 ori mai atrăgătoare pentru Culicoide, decât cele prevăzute cu lumina albă. Timpul de funcţionare al capcanei trebuie să fie de minim 8-10 ore, pentru colectare. În partea de jos capcana este prevăzută cu o plasă fină care împiedică pătrunderea în interiorul acesteia a insectelor mari KIT DE COLECTARE Kitul pentru colectarea insectelor din genul Culicoides, vectori BT, conţine următoarele componente: -capcana (completă cu plasă şi sfoară cu care să fie prinsă de suport) aceasta poate fi alimentată fie la 220 sau în lipsa existenţei sursei de curent aceasta poate fi alimentată la baterie de 12 V (cu condiţia să fie încărcată la fiecare 3 zile); -2 pahare de colectare din plastic, culoare alb, cu capacitate de 500 ml; -soluţie slabă de detergent (apă +1-2 picături de detergent lichid); -o bucată de nylon de 20cm/20cm (care nu permite aderarea insectelor), cu orificii fine care împiedică pierderea acestora în timpul spălărilor; -pahare de plastic capacitate ml, cu capac filetat pentru conservarea insectelor în alcool 70%; -sită cu mâner prevăzută cu ochiuri fine necesară pentru strecurarea insectelor în timpul spălărilor; -creion pentru completarea etichetei; -PBS care se foloseşte pentru prelevarea insectelor în vederea izolării de virus; -termometru cu temperaturi minime şi maxime; -Fişa entomologică

50 Page 50 of 72 Figura 12 Kit capturare prelucrare şi identificare specii de Culicoides ALEGEREA LOCULUI DE MONTARE A CAPCANEI La alegerea locului de montare a capcanei trebuie să se ţină cont de următoarele criterii: - prezenţa de animale în zonă fermă, îndeosebi bovine, ovine, caprine; - existenţa în apropierea punctului de montare a unui număr minim 10 animale care să-şi petreacă noaptea în acel loc; - existenţa unei ferme de animale în vecinătatea locului de montare a capcanei; -evitarea montării capcanei în spaţiile închise sau să se apeleze la această modalitate doar pentru monitorizarea activităţii diurne a vectorilor sezonul rece; - să se monteze în ferme sau alte locuri unde sunt condiţii propice dezvoltării culicoizilor: în ferme unde există gunoi de grajd, purin; locuri cu umiditate relative mare (apă creată natural sau format prin irigaţii); la distanţă mică de marginea unei păduri; între zonele unde există viaţă şi în zonele nelocuite; în zonele rezidenţiale sau de recreere; Să se monteze la cel puţin 30 de metri de o clădire şi la 1,5-2 m distanţă de la sol pentru a nu fi distruse de animale; -Să se stabilească dacă există în zonă sursă electric pentru a şti dacă pot fi alimentate capacenle la acestaă sursă, în caz contrar procurarea de capcane alimentate la baterii de 12V;; -Să se stabilească dacă există colaborare cu fermierul care are misiunea de a pune în funcţiune capcanele şi de a colecta şi transporta probele la laborator; Subliniem faptul că nu este recomandată montarea capcanelor în următoarele locuri:: -deasupra unei ape; -direct pe pământ;

51 Page 51 of 72 -în apropierea zonelor cu lumină artificial (acolo unde toată noaptea funcţionează un bec); -în zonele expuse de fum; -în zonele cu smog industrial; -în zonele unde nu sunt animale pe o distanţă mare deoarece în această situaţie sunt şanse mici de capturare a insectelor; -în zonele expuse la vânturi puternice (locul ales pentru montarea capcanei trebuie să fie ferit de curenţi). Pentru cunoaşterea distribuţiei şi abundenţei sezoniere a speciilor de Culicoides teritoriul ţării a fost împărţit în carouri de 50 km x 50 km (117 carouri), (Figura 17). Din acestea s-au ales 41 de localităţi ţintă, câte una pentru fiecare judeţ, în care s-a montat câte o capcană fixă care să funcţioneze timp de un an de zile săptămânal. În restul zilelor din săptămână aceste capcane se pot muta în alte zone, în cadrul aceluiaşi judeţ (pentru stabilirea distribuţiei speciilor). Figura 17. Divizarea teritoriului Românei în carouri cu latura de 50 km X 50 km pentru colectărea probelor de insecte

52 Page 52 of Colectarea coordonatelor geografice din locaţiile în care se montează capcanele Pentru colectarea coordonatelor geografice (altitudine, latitudine, longitudine), din locaţiilor în care se montează capcanele se foloseşte GPS-ul (Figura 18), parcurgând următoarele etape de lucru: 1. Se porneşte receptorul GPS prin apăsarea butonului Power timp de 2 secunde (situate pe partea dreaptă, jos a receptorului); 2. Pentru o localizare cât mai bună trebuie să se recepţioneze minim 4 sateliţi. Atunci când apare pagina Satellite pe ecran se apasă de câteva ori butonul Page până se ajunge la pagina Main Meniu. 3. În pagina Main Meniu se foloseşte stik-ul şi se selectează opţiune Setup care va deschide pagina Setup Menue. Stik-ul permite derularea sus/jos şi stânga/dreapta pentru a selecta un element. 4. Se selectează elemental Time. Se deschide pagina Time setup. Se verifică dacă a fost selectată corect zona şi timpul. În cazul în care nu a fost bine se selectează Time Zone. Se derulează fereastra în care se găsesc mai multe zone de timp. Se poate utiliza stik-ul pentru a selecta zona. 5. Se apasă pe butonul Page pentru a reveni în pagina Main Menue. 6. Se selectează elemental Setup şi se deschide pagina Setup Menue. 7. Se selectează elemental Units. Acesta va deschide pagina Units Setup unde se selectează opţiunile: - Formatul localizării-grade zecimale - Altitudine - Latitudinea - Longitudinea 8. Se apasă butonul Page pentru revenire la pagina Main Menue. 9. Se evidenţiază elemental Setup şi se selectează. Acesta va deschide pagina Setup Menue. 10. Se selectează elemental System. Acesta va deschide pagina System setup. 11. Se selectează elemental WAAS şi se bifează opţiunea Enabled. 12. Se apasă butonul Page de 2 ori pentru revenire în pagina Main Menue.

53 Page 53 of 72 Înregistrarea coordonatelor: 1. Pentru o bună acurateţe a înregistrării coordonatelor geografice trebuie ales un loc pentru înregistrarea datelor unde cerul este senin. 2. La pagina Satellit se aşteaptă până când mesajul care apare se schimbă de la wait tracking satellites în Ready to navigate. Se aşteaptă câteva minute până când acutateţea citită s-a stabilizat (o acurateţe bună este de 7.5 m sau chair mai puţin, se poate obţine şi o acurateţe de 2m). Figura 18. Geographical position system Colectarea datelor din locaţiile în care se montează capcanele cu ajutorul meteostaţiilor Meteostaţia este un echipament format dintr-un suport metalic, un data loger pentru stocarea datelor şi 4 senzori care înregistrează parametrii de mediu din locaţia în care a fost amplasată aceasta. Descărcarea datelor înregistrate de meteostaţie se realizează cu ajutorul unui laptop prevăzut cu un soft special.

54 Page 54 of 72 Meteostaţia poate înregistra patru parametri de mediu: viteza vântului (m/s), temperatura aerului ( C), temperatura solului ( C) şi umiditatea aerului (%). Amplasarea meteostaţiilor se efectuează pe regiuni cu factori climatic diferiţi (zonă de deal, câmpie, munte şi litoral). În fiecare locaţie în care se amplasează câte o meteostaţie trebuie să se monteze şi o capcană pentru capturarea insectelor. Scopul montării capcanei în apropierea meteostaţiei este de a realize o corelaţie între factorii climatic existenţi în zona de amplasare a acesteaia şi dimensiunea populaţiilor de insecte culicoide din zonă FACTORII CARE INFLUENTEAZA CAPTURAREA CULICOIZILOR -Parametrii mediului: -temperatura; -gradul de umiditate al solului; -altitudinea; -nivelul presiunii atmosferice; -viteza de deplasare a vantului; -directia vantului; -compozitia solului; -tipul de habitat (padure, rau, mare, munte, teren pasunabil, etc); -gradul de poluare a atmosferei cu SO2, NO2, O3, CO, CO2, HCL; -mediu cu radiatii electromagnetice; -lumina (slaba, durata, intensitate); -alte date. -Randamentul capcanelor Acesta este influentat de: -temperatura mediului ambient; -numarul de ore de functionare; -durata in timp de functionare. Tipul de sol Astfel solul nisipos este favorabil dezvoltarii larvelor si pupelor de Culicoides deoarece prezinta urmatoarele caracteristici: -permite un drenaj rapid al apei; -are o umiditate slaba; -contine o cantitate mica de nutrienti; -are o temperatura mai mare.

55 Page 55 of 72 Solul umed este de asemenea un mediu favorabil dezvoltarii larvalor si pupelor de Culicoides. Temperatura mediului Este unul dintre cei mai importanti factori ai mediului de care trebuie să se tină cont în capturarea culicoizilor. Astfel: -temperatura minimă pentru dezvoltarea speciei Culicoides imicola este de 12,5 C, nu mai mica, specia rezistand însă şi la temperaturi de 0 C, timp de o sapatamană; -Culicoides imicola poate supravietui timp de o sapatamana la -15 C; -adultii de C. obsoletus supravietuiesc la 4 C, timp de 10 zile; -C. obsoletus poate fi capturat si la temperaturi mai mici de 5 C. C. imicola a fost gasita in Spania, Grecia, Italia, Albania, Iugoslavia, Bosnia si Croatia. Datorita cresterii temperaturii pe glob cu 2 C este posibil ca distributia speciei C. imicola sa se extinda mai mult in Europa Metode de prelevare, ambalare ŞI transport a larvelor, nimfelor si pupelor de Culicoides Habitatele preferate de larvele si pupele de Culicoides sunt cele acvatice si semiacvatice. Principalele puncte de prelevare din mediul acavtic a larvelor de Culicoides sunt redate în figura 19. Pentru recoltarea probelor de larve şi pupe din mediul acvatic se folseşte pensa. Larvele speciilor de Culicoides se recunosc usor deoarce au aspect viermiform şi înoata vioi in apa in timp ce pupele plutesc la suprafata. Exista unele specii de Culicoides a caror larve nu înoată, iar pupele nu plutesc la suprafata apei pentru a uşura recoltarea acestora se adauga în apă zahăr sau sare. Pentru prelevarea larvelor şi pupelor de Culicoides din mediul semiacvatic sau umed (zona de pădure, gunoiul de vite, pământ cu frunze putrezite, coaja de copaci) se foloseste pâlnia Berlese. Probele de larve şi nimfe/pupe de Culicoides sp. se recolteaza în pungi de plastic, se eticheteaza (pe etichetă se pune anul, data şi locul de unde s-a prelevat proba). Pungile cu probe se pun in containere cu ghiaţă şi se transportă imediat la laborator.

56 Page 56 of 72 Figura 19. Puncte de prelevare a larvelor de Culicoides sp METODE DE capturare, AMBALARE, TRANSPORT ŞI conservare A adulţilor CULICOIDES Adulţii de Culicoides spp. se prind cu ajutorul capcanelor cu lumină întunecată tip Onderstepoort, Africa de Sud (Figurile 20 şi 21), parcurgând paşii : - se controlează capcana dacă este în stare de funcţionare; - se controlează plasa din partea de jos dacă este bine prinsă pentru a nu permite intrarea insectelor mari; - se leagă bine în partea de jos a capcanei paharul de colecatare pe a cărui etichetă s-a trecut locaţia şi data de colectare care este cea de dimineaţă când se ridică proba; - cu o sfoară se suspendă capcana la o înălţime de 1,5-2m distanţă de sol pentru ca animalele să nu ajungă la acestea (la intrare în grajd, pe un stâlp sau ăntr-un pom); - se toarnă 200 ml soluţie slabă de detergent în paharul de colectare; - se fixează termometrul într-un punct cât mai aproape de capcană şi la o înălţime permisivă operatorului care face citirea; - se citeşte temperatura de seară care se trece imediat în fişa entomologică; - se determină cu GPS ul coordonatele geografice ale locaţiei: altitudine, latitudine, logitudine care se trec în fişa entomologică; - seară cu o oră înainte de apusul Soarelui se conectează capcana la sursa de curent; - dimineaţă cu o oră înainte de răsăritul Soarelui se deconectează capcana de la sursa de curent; -se citeşte temperature de dimineaţă care se trece în fişa entomologică;

57 Page 57 of 72 - se scoate cu grijă paharul din partea de jos a capcanei, se închide şi se transportă imediat la laborator; - pe timpul transportul se fereşte probe de lumina direct şi Soare deoarece deteriorează insectele. Figura 20. Capcană cu lumină întunecată tip Onderstepoort Africa de Sud Figura 20. Se toarnă soluţia slabă de detergent în paharul colector

58 Page 58 of 72 METODE DE COLECTARE INSECTE CULICOIDE PENTRU IZOLARE DE VIRUS - Colectarea insectelor culicoide în PBS simplu la care se adaugă o picătură de săpun lichid 1. PBS simplu - conţine NaCl - 8g, KH2PO4 0,2g, Na2H2PO4 2,9g, Kcl 0,2g ph final 7,4 2. PBS cu antibiotic - PBS simplu la care se adaugă: penicilină UI/ml, Streptomicină 10 mg/ml, Nistatin 5000 UI/ml, Gentamicină 250 micrograme/ml - Se colectează insectele în PBS simplu, se spală de câteva ori tot cu PBS simplu, după care se sortează culicoizii pe specii şi se transferă în PBS cu antibiotic 2.2. PROTOCOL DE prelucrare, conservare ŞI Identificare A larvelor Şi pupelor ŞI AdulŢilor de Culicoides Identificarea speciilor de Culicoides se efectuează de specialistul entomolog. Iar exemplarele de Culicoides conservate în alcool 70%, pot fi păstrate după identificare o perioadă lungă de timp în vederea efectuării unor studii de taxonomie. Culicoides Metode de prelucrare, conservare Şi examinare a larvelor Şi pupelor de Larvele şi pupele de Culicoides pot fi tratate cu aceleaşi soluţii ca adulţii. Se pun larvele şi pupele cu partea dorsala în sus, fără a necesita disecţie, când acestea au exuvie se îndepartează, deasemenea se scoate şi aparatul respirator. Nici larvele şi nici pupele de Culicoides nu necesită operaţia de curăţire a muşchilor, de aceea ele se trec direct în soluţie 2 propanol şi ulei de usturoi, iar mai departe operaţiunile sunt la fel ca la adulţi. O alta metoda de montare a larvelor şi pupelor de Culicoides este în alcool etilic 70%, marind treptat concentraţia până la 100% alcool etilic saturat cu fenol şi se lasă în repaus peste noapte. A doua zi se plasează exemplarele pe lame pe care s-a pus în prealabil câte o picatură de balsam de Canada şi soluţie fenol cu alcool etilic. Deoarece alcoolul etilic se evaporă în timpul uscării se mai adaugă balsam de Canada. Prin aceasta metodă se obţin preparate bune, dar nu se reuşeşte indepartarea ţesuturilor interne, făcând astfel ca uneori examinarea să fie dificilă (structurile nu sunt clare). Exista câteva metode simple de examinare a probelor de larve şi pupe de Culicoides:

59 Page 59 of 72 - Se examineaza la microscop vasul în care au fost prelevate din mediile acavtic şi semiacvatic probele cu larve şi pupe de culicoizi. - Probele prelevate din habitatele acavtice se plaseaza pe o sticla de ceas peste care se pune apa. Se observa ca majoritatea larvelor de culicoizi incep sa inote rapid executand miscari serpentiforme, in aceste conditii pot fi usor prinse cu pensa. Pupele, insa de cele mai multe ori plutesc deasupra apei. De aceea recoltarea pupelor din mediul acavtic se face cu usurinta doar daca se urmaresc marginile helesteelor, lacurilor sau raurilor. Pentru a usurarea prelevarii larvelor si pupelor de culicoizi unii lucratori adauga sare si zahar in apa. Aceasta tehnica insa, se foloseste in general doar pentru unele specii de culicoizi a caror larve nu inoata, iar pupele nu plutesc la suprafata apei. - Pentru prelevarea larvelor din mediul semiacvatic sau umed (zona de padure) se foloseste palnia Berlese. Dupa identificarea la microscop unele specii pot fi conservate în soluţie de alcool de 70% (sau alte substante conservante), insa pentru ca metoda sa dea rezultate foarte bune preparatele trebuie ca sa fie montat (indeosebi la adulti) pentru aceasta se foloseste alcool etilic. Daca materialul conservat se foloseste pentru studii taxonomice este recomandabil ca acestea sa nu fie mai vechi de 2-3 ani daca sunt pastrate la temperatura camerei, iar daca sunt pastrate la rece si intuneric se pot pastra pala la 7-10 ani Metode de prelucrare Şi conservare a adultilor de Culicoides Metode de prelucrare Şi conservare a culicoizilor în soluţie SLABĂ DE DETERGENT O metoda simplă de conservare adulţilor de Culicoides dupa identificarea speciilor este in alcool etilic 70% (Figura 22). Daca materialul conservat se foloseste pentru studii taxonomice este recomandabil ca preparatul conservat sa nu fie mai vechi de 2-3 ani, dacă este ţinut la temperatura camerei sau 7-10 ani dacî este ţinut la rece. Figura 22. Conservarea insectelor în alcool 70%

60 Page 60 of 72 Pentru conservarea adulţilor de Culicoides exista şi metode ceva mai complexe, cum ar fi aceea de obţinere a preparatelor permanente: In prima etapa de lucru se pun in ¾ dintr-o plăci Petri ulei de usturoi peste care se adaugă o soluţie formata din acid acetic 15% şi 2 propanol. Dupa formarea soluţiei se trece fiecare exemplar de Culicoides prin aceasta soluţie. In etapa a 2 a de lucru se pregatesc 5 exemplare de Culicoides. Se iau 20 de plăci Petri de aceiaşi dimensiune, prevazute cu capac, câte 4 plăci Petri pentru fiecare exemplar de Culicoides. Se separă la fiecare exemplar de Culicoides capul, toraxul, abdomenul şi aripile şi se pun fiecare în plăci Petri separate. Se notează cu acelaşi număr plăcile pentru a se şti că în toate cele 4 plăci se gasesc partile componente ale aceluiaşi exemplar de Culicoides. Operatia pentru scoaterea aripilor, capului, toraxului şi abdomenului exemplarelor de Culicoides se efectueaza la microscop după ce în prealabil acestea au fost puse în sticle de ceas cu alcool etilic. Pentru inceput se scot aripile la fiecare exemplar şi se pun în sticle de ceas în care s-a pus în prealabil acid acetic 15%. Restul părţilor de insectă se pun în fiole in care s-a pus în prealabil hidroxid de potasiu 8% (fiola trebuie să conţina ¼ soluţie). Fiole cu hidroxid de potasiu 8% în care s-au pus părţile corpului insectei se aşează in vase parţial pline cu apă şi se asează pe sita de azbest ţncinsă ca se incalzeste pâna la fierbere. Dupa 2-3 minute de fierbere insectele se vor curaţa de muşchi. Se transferă porţiunile de insecte din fiolele cu hidroxid de poatasiu 8% încins în sticle de ceas în care s-a pus în prealabil tot hidroxide de potasiu 8% şi se controleaza la microscop pentru a se observa dacă s-au curaţat de muşchi. Se scot părţile de insecte din sticlele de ceas cu hidroxid de potasiu 8% şi se pun în plăci Petri în care s-a pus în prealabil o soluţie formată din 2 propanol şi ulei de usturoi şi se lasă în contact până când porţiunile de insecte cad la fundul plăcii. Se lasă în această soluţie 1-2 zile timp în care se mai adaugă 2 propanol deoarce acesta se evaporă, dacă este prea mult propanol se lasă placile fară capac pentru a se evapora excesul. Se scot porţiunile de insecte din soluţia 2 propanol şi ulei de usturoi şi se pun pentru 30 de minute în ulei de usturoi pur. Se pregatesc câte 2 lame pentru fiecare exemplar de Culicoides, din care pe una se pun aripile, iar pe cealaltă se pune capul abdomenul şi toraxul (in total 10 lame pentru cele 5 exemplare de insecte prelucrate în prima etapa).

61 Page 61 of 72 Se pune o picătură de balsam de Canada pe una din lame dupa care se plaseaza aripile, iar peste se pune o lamelă. Pe cea de a doua lamă se pun trei picaturi de balsam de Canada, în care se pune în una capul, în alta abdomenul, iar în cea de a treia toraxul şi peste fiecare se pune câte o lamelă. Daca balsamul de Canada se usucă se adaugă o picatură de xilen care are rolul de a fluidiza balsamul. Abdomenul se asează cu partea ventrala în sus, iar când se pune lamela se apasă şi împinge în jos pentru ca abdomenul sa fie puţin presat. Lamele se numerotează corespunzator astfel ca aripile şi capul, toraxul şi abdomenul să aibă acelaşi număr. Lamele, astfel pregatite se pun la termostat la C. Dupa 1-2 zile se controlează preparatele şi se mai adaugă balsam de Canada deoarece acesta se usucă. Astfel se ridică cu grijă lamela se adaugă o picatură de balsam de Canada şi se pune altă lamela. Operaţia se aplică la toate preparatele. In cazul în care apar în preparate bule de aer se ridică lamelele şi se mai adaugă câte o picatură de balsam de Canada pentru ca bulele să se mişte şi în cele din urmă să dispară. Apoi se pun lamelele la fiecare preparat şi se lasă la termostat. Se fac controale zilnice timp de 1-2 săptămâni. Dupa 1-2 săptămâni se îndepartează lamelele se adaugă câte o picătură de balsam de Canada şi se pun alte lamele. Lamele astfel pregatite se ţin în suportul de lame cu faţa în sus Metode de prelucrare Şi conservare a culicoizilor în pbs Insectele culicoide după capturare în PBS simplu se spală de 2-3 ori tot cu PBS simplu. Apoui, insectele se filtrează printr-o pânză de nylon montată deasupra unei site cu mâner şi se în PBS simplu pentru a fi examinate în vederea identificării speciilor Examenul microscopic de identificare a adulţilor de Culicoides Examenul microscopic de identificare a adulţilor de Culicoides CONSERVAŢI ÎN PBS Insectele conservate în PBS simplu se toarnă într-o placă Petri marcată în prealabil cu un marker în 4 părţi. - Se examinează placa la stereomicroscop pentru identificarea speciilor de Culicoides - Se fac evaluări privind dimensiunea corpului, transparenţa aripilor, numărul segementelor antenare, etc.

62 Page 62 of 72 Se identifică speciile de Culicoides (îndeosebi C. pulicaris, C. obsoletus/c. scoticus, C. nubeculosus) după morfologia aripii folosind cheia de identificare după Meiswinkel-2005 după care se separă în plăci Petri pe specii. Se numără exemplarele de Culicoides pentru fiecare specie Se face aprecierea vârstei femelelor de Culicoides pentru fiecare specie. Se spală cu PBS simplu exemplarele de Culicoides, separat pe specii, se strecoară prin sită după care se transferă în flacoane de dimensiuni corespunzătoare, în care s-a pus în prealabil PBS cu antibiotic, se scrie eticheta pe care se trece: data, localitatea, judeţul. Exemplarele de Culicoides conservate în PBS cu antibiotic se trimit la laboratorul de virusologie pentru identificare de virus BT Examenul microscopic de identificare a adulţilor de Culicoides CONSERVAŢI ÎN ALCOOL 70% Insectele conservate în alcool 70% se toarnă într-o placă Petri. La stereomicroscop se extrag toate exemplarele de Culicoides, care se trec într-o altă placă Petri (Figura 23). Figura 23 Examinarea probei de insecte In etapa a doua se identifica speciile de Culicoides separându-se fiecare specie în câte o placa, după care se numară exemplarele din fiecare specie. Tot in aceasta etapă se numară femelele şi masculii fiecărei specii şi se face raportul procentual. In etapa a treia se face o apreciere a vârstei exemplarelor de Culicoides pentru fiecare specie.

63 Page 63 of 72 După identificarea speciilor acestea se conservă în alcool de 70% în tuburi de dimensiuni corespunzătoare şi se etichetează. Pe eticheta se trece localitatea, judeţul şi locul de unde au fost prelevate insectele, de asemenea data şi anul. Pentru identificarea speciilor de Culicoides se efectueaza atat un examen macroscopic si cu lupa, cat si un examen microscopic pentru aprecierea unor caracteristici de morfologie externă, îndeosebi desenul aripii (Tabelul 4, Figura ) Caracteristici de identificare a adulţilor de Culicoides În prezentul material se va acorda atenţie doar speciilor din complexele Culicoides vectori dovediţi pentru bluetongue, respectiv speciile din complexele Culicoides obsoletus şi Culicoides pulicaris, specii prezente pe teritoriul României şi speciilor din complexul Culicoides imicola, principalul vector pentru bluetongue în Europa, dar care până în prezent nu a fost găsit pe teritoriul ţării noastre. Principalele caracteristici de identificarea ale speciilor din complexele Culicoides obsoletus, Culicoides pulicaris şi Culicoides imicola sunt reprezentate de: dimensiunea corpului transparenţa aripii; culoarea şi numărul articolelor tarsale, aspectul şi numărul segmentelor antenare, forma ochilor. Complexul Culicoides obsoletus Pentru identificarea speciilor acestui complexului se urmăreşte dacă : -aripa este transparentă, în celula radială 2 prezintă o pată întunecată, iar în celula radială r5 o pată albă, de asemenea urmăreşte dacă sunt prezenţi peri de diferite dimensiuni pe toată suprafaţa aripii ; -partea centrală a aripii este separată de două linii radiare, linia din partea externă a aripii este bifurcată separând cele două celule anală şi cubitală, elemente importante în identificarea speciilor complexului; Complexul Culicoides pulicaris Pentru identificarea peciile complexului Pulicaris se urmăreşte dacă : -au dimensiuni cuprinse între 1,5-2,5 mm; -au ochi sudaţi în formă de rinichi sau boabe de fasole prevăzuţi cu numeroase omatidii; -prezintă două spermateci aproape egale şi una rudimentară situată în partea de jos a abdomenului; -pe torax prezintă numeroase desene triunghiulare; -aripile se suprapun una peste alta, sunt transparente prevăzute cu pete clare şi întunecate;

64 Page 64 of 72 -în celula radială r5 se distinge prezenţa unei pete caracteristice în formă de clepsidră, iar la intersecţia celor 3 nervuri (M1, M2, C1) este prezentă o pată de culoare întunecată de forma unei benzi; -în celula cubitală prezintă o pată întunecată de formă triunghiulară, iar la mijlocul nervurii anale se prelungeşte o formaţiune cu aspect de semilună care urcă spre baza aripii; -pe întreaga suprafaţa aripii se găsesc peri, dar mai abundenţi înmdeosebi în partea proximală a aripii. Complexul Culicoides imicola Pentru identificarea speciilor acestui complex se urmăreşte dacă : -femela de Culicoides imicola are în jur de 1,5 mm dimensiune ; -antenele sunt de culoare brun clar şi pedicelul este de culoare brun închis, articolul III este scurt şi pedicelat, iar articolele IV-XV sunt cilindrice ; -pe articolul III se găsesc 5-6 sensile, iar pe articolele IV-XV se găsesc alternativ 3, respectiv 2 sensile, de lungime medie. Figura 24. Desenul aripii la speciile genului Culicoides

65 Page 65 of Cheie de identificare a insectelor din genul Culicoides (După Meiswinkel, 2005) Nr. Caracterul Crt. 1 Aripa cu desen distinct de pete albe şi închise la culoare, sau Aripi fără desen 2 Aripi pe care cea de-a doua celulă radială este în întregime închisă la culoare, sau A doua celulă radială de culoare albă parţial sau total 3 Aripi cu o pată albă de formă neregulată în centrul celulei r5 sau Pată alba este absentă sau de formă perfect rotundă, localizată în r5 în poziţie apicală 4 Pată de culoare închisă în centrul celulei cubitale, de formă excentrică, sau Nu există pată de culoare închisă în centrul celulei cubitale 5 Pată de culoare închisă de formă aproape rotundă, localizată în centrul celulei cubitale sau Nu există pată de culoare închisă în centrul celulei cubitale sau 6 Pată de culoare închisă prezentă în vârful lui r2 se continuă cu cele localizate la baza celulei M1, în zona mediană a celulei M2 şi în celula cubitală, astfel încât delimitează o linie (zonă) albă, relativ întinsă şi dreaptă, care împarte aripa longitudinal, în două zone : zona proximală (spre baza de inserţie a aripii), de culoare albă şi zona distală (spre vârful aripii) de culoare închisă. La apexul lui r5 poate fi prezentă sau absentă o pată de culoare albă, ori slab vizibilă, ori bine definită de formă rotundă sau pătrată. Pată albă la baza celulei M1, poziţionată mai mult proximal, ceea ce face să se observe o zonă în zig-zag de culoare albă care traversează aripa longitudinal. Cu toate acestea, atât zona bazală, cât şi cea apicală sunt colorate (nici una din ele nu este albă); pată de culoare albă la apexul lui r5, mare şi bine definită, cu marginea anterioară foarte clar conturată ; în lungul venei M2 se află o pată cu partea orientată apical excizată, de culoare albă ; celula anală cu aspect de pudel 7 Aripa cu aspect păros şi cu o pată rotundă, distinctă, plasată călare pe vena M1 Tabelul 4 Pasul următor Se trece la punctul 2 Proba se ignoră Se trece la punctul 3 Se trece la punctul 5 Se trece la punctul 4 Proba se ignoră Proba încadrată în complexul Culicoides nubeculosus Se trece la punctul 7 Proba încadrată în complexul Culicoides pulicaris Se trece la puntul 6 Proba încadrată în compelxul Culicoides obsoletus Proba încadrată în complexul Culicoides imicola Proba încadrată în complexul Culicoides paloe

66 Page 66 of 72 Figura 25. Culicoides imicola mascul: 12-antena; 13-palp maxilar; 14-aripa; 15- scutelum; 16-spin genital; 17-.; 18- paromere separate

67 Page 67 of 72 Figura 26. Culicoides pulicaris A aripă ; B flagel anterior ; C sensile pe articulaţiile antenare ; D palp maxilar, E ochi sudaţi, F articole tarsale ; G spermateci

68 Page 68 of 72 Figura 27. Culicoides obsoletus : A aripă ; B flagel antenar ; C sensile pe articulaţiile antenare ; D palp maxilar, E ochi sudaţi, F articole tarsale ; G spermateci

69 Page 69 of 72 Figura 28. Femele gravide şi parous de Culicoides Figura 29. Femelă de Culicoides obsoletus

70 Page 70 of 72 Figura 30. Femelă de Culicoides pulicaris Figura 31. Femelă de Culicoides imicola