RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ

Transcription

1 Denumire proiect: SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC (TUMORSENSE) Nr. Contract: 12/2014 RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ Etapa III Perioada 1 ian dec Rezumatul propunerii de proiect În prezent, chimioterapia în cancer nu este întotdeauna eficientă, iar unul dintre motive este creșterea celulelor tumorale. Acestea comprimă vasele de sange din tumoră încat medicamentele transmise prin sistemul vascular nu se răspândesc în tot volumul tumorii. Cele mai recente cercetări ale colaboratorilor noștri de la Laboratorul de Biologia Tumorilor Edwin L. Steele, Harvard Medical School, USA, au demonstrat că nivelul tensiunii mecanice (solid-stress) din țesutul tumoral poate fi utilizat ca biomarker al răspunsului la chimioterapie: o valoare redusă a tensiunii din țesutul tumoral conduce la scăderea compresiei vaselor sanguine și astfel este mai eficientă terapia oncologică. Prezentul proiect își propune pe baza acestor rezultate să îmbunătățească tratamentul cancerului. Mai exact, scopul proiectului este acela de a construi și valida prin teste, un sistem (TumorSense) de tip cateter care include un micro-senzor și care poate fi utilizat de medic în procedurile de biopsie pentru determinarea tensiunilor (solid-stress) în țesutul tumoral. În mod curent, biopsiile sunt recoltate utilizând un ac introdus printr-un cateter, la diferite etape ale tratamentului oncologic, pentru diagnosticare și stadializare. Sistemul propus va măsura cu acuratețe tensiunile în tumoră, în același timp și locație cu biopsia, fără a perturba protocoalele curente de diagnostic si tratament. Obiectivele specifice ale proiectului sunt: 1. construirea prototipului unui micro-senzor pentru măsurarea tensiunii în țesutul tumoral, inclus într-un sistem de tip cateter, 2. dezvoltarea unui sistem medical inovativ pentru realizarea unei hărți a tensiunilor în volumul tumoral, 3. testarea sistemului pe un model artificial special dezvoltat in proiect și pe țesut animal. Micro-senzorul va fi asamblat într-un cateter de o structură specială, conectat la computer, care va fi introdus în canalul de lucru al endoscopului în timpul procedurii de biopsie. Acesta va fi realizat și testat pe modelul artificial de echipa de la MEDINSYS. Tot acestă echipă va integra în cateter și un senzor electromagnetic pentru determinarea poziției micro-senzorului de solid-stress în tumoră. Testele pe țesut animal vor fi realizate de Partenerul 1 (Univ. de Medicina si Farmacie din Cluj). Sistemul de analiza a datelor special, miniaturizat și cu comunicare wireless va fi dezvoltat de către specialiștii în electronică ai Partenerului 3 (IPA SA, institut privat de cercetare și dezvoltare în automatizări și IT). TumorSense va conține primul micro-senzor de determinare a tensiunii mecanice (solid-stress) în țesuturi moi. TumorSense este construit sub forma unui sistem minm-invaziv inovativ de tip cateter cu senzor de poziționare electromagnetică pentru ghidarea precisă în tumoră. Patentul va fi împărțit conform contribuției între parteneri și colaboratorii de la Harvard Medical School, care au descoperit în premieră rolul tensiunilor mecanice tumorale ca biomarker în tratamentul oncologic. Monitorizarea tensiunilor mecanice la nivel tumoral printr-o procedură minim invazivă va reduce costurile oncologice prin eliminarea tratamentului inutil și fără rezultat și va optimiza chimioterapia. 1

2 Rezumatul etapei: Activitatea 2.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral (II) In partea a doua a acestei etapa, activitatea de cercetare a consortiului proiectului a fost legata pe de o parte, de optimizarea proceselor de obtinere de straturi subtiri pe baza de BaTiO3 dopat care sa prezinte activitate piezoelectrica, iar pe de alta parte de integrarea acestora in heterostructuri de test biocompatibile pentru testarea tensiunilor interne in tesutul tumoral. In acest scop, au fost realizate si/sau continuate activitati specifice cum ar fi: depunerea straturilor subtiri de BaTiO3 dopat cu Ca si Zr sau in solutie solida cu NaBiTiO3 pe diverse substraturi, utilizand atat tehnica Depunere Laser Pulsata (PLD) cat si tehnica de depunere din faza de vapori (MAPLE). Integrarea acestor straturi active piezoelectric in heterostructuri de test a fost realizata, in diverse configuratii electrod-material activsuport. A2.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (II) În această etapă s-au realizat finalizat variantele din versiunea 1 de senzor de stress tumoral, in care s-au utilizat timbre tensometrice din comert si s-au realizat versiuni de senzor cu integrarea straturilor active piezo-electric realizate prin tehnici PLD si MAPLE in configuratii cu electrod-material activ-suport. Varianta simpla a senzorului cu timbre tensometrice a fost realizata in scopul demonstrarii conceptului si se va testa pe un model artificial. Primele prototipuri ale senzorului realizat prin tenhnologia depunerii de straturi subtiri de BaTiO3 dopat cu Ca si Zr sau in solutie solida cu NaBiTiO3 pe diverse substraturi, utilizand atat tehnica Depunere Laser Pulsata (PLD) cat si tehnica de depunere din faza de vapori (MAPLE) vor constitui variantele finale ale prototipului senzorului ce se va finaliza in urmatoarea etapa. Totodata s-a realizat si un prototip de mecanism care sa permita miscarea repetitiva a senzorului realizat intr-un mediu de culturi celulare care sa verifice capacitatea de biocompatibilitate a noului material dezvoltat. A3.1. Cercetari asupra unei metode inovative de creare a hartii tensiunilor in tesutul tumoral (I) La baza crearii hartii tensiunilor in tesutul tumoral va sta atat determinarea caracteristicilor matricei tumorale cat si capacitatea de evaluare a presiunilor intracelulare in variate puncte ale tumorii si crearea hartii spatiale a acestora. Pentru stabilirea matricei tumorale s-au facut studii cu privire al constituentii acesteia cat si cu privire la rolul lor in comportamentul structural al acesteia. Astfel s-a determinat ca ezrin (EZR) care este un membru al familiei Ezrin-radixin-moesin şi face legatura între membrana celulară şi citoschelet, este implicat în organizarea citoscheletală. Ezrin este supraexprimat în multe cancere, incluzând şi cancerul pancreatic. Ezrin joacă, de asemenea, un rol crucial în morfogeneză şi absenţa ezrinului a fost asociată cu modificări morfologice în celulele canceroase prin remodelarea citoscheletul actinei. Progresia cancerului în ţesuturile moi este de obicei asociată cu o creştere a rigidităţii datorită acumulării locale a unei matrici dense de colagen reticulat care permite detectarea tumorii prin palpare fizică. Rigiditatea matriceală a fost sugerată ca fiind un mecanism care stă la baza tropismului tisular al metastazelor canceroase. O modalitate prin care celulele canceroase dependente de rigiditate pot răspunde la un mediu de ţesut mai puţin favorabil, este de a reduce statusul lor metabolic, oferind un mecanism potenţial pentru tropismul tisular al celulelor tumorale. Metoda Tumor Sense propusă se bazează pe rezultatele obţinute în urma investigării rolului ezrinului în cancerul pancreatic şi corelaţia expresiei acestuia cu statusul clinicopatologic si prognosticul pacienţilor cu adenocarcinom pancreatic. Pentru determinarea unei harti spatiale a tensiunilor tumorale (solid-stress) s-a realizat un algoritm al unui software de imagistica hibrida cu tracking electromagnetic care va fi folosit pentru a face o inregistrare intre tomografia tumorii si punctele in care se preia tensiunea tumorala in timpul procedurii de eco-endoscopie spre exemplu, pentru a identifica cu precizie pozitia punctului de masurare a 2

3 tensiunii inauntrul tumorii, si de a crea o harta a valorilor pentru o serie de masuratori efectuate in mai multe puncte din tumora. Aceasta ofera o intelegere mai buna a distributiei tensiunilor interne in tumora si o mai buna evaluare a raspunsului tumorii la diferite tratamente. Pentru a crea aceasta harta de masuratori, vor fi necesare operatii de calcul complexe precum registrare, segmentare si reconstructia 3D, care vor fi implementate in aplicatia software a sistemului TumorSense care va fi dezvoltata in etapa urmatoare. 3

4 RAPORT ȘTIINȚIFIC ȘI TEHNIC Activitatea 2.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral (II) Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul etapei precedente au fost determinate conditiile experimentale optime de producere a straturilor subtiri de BT-NBT atat in forma policristalina cat si epitaxiala prin PLD. Deasemenea, au fost efectuate si depuneri de strat subtire de BT-NBT pe suport flexibil de Pt/Kapton prin tehnica MAPLE. Valorile coeficientului piezoelectric efectiv- d efectiv 33, obtinute in functie de campul dc aplicat sunt egale sau superioare chiar decat celor aratate de materiale pe baza de plumb - PbZrTiO3 sau PbTiO3. Utilizarea unui suport flexibil (kapton, Pt/kapton, etc) pentru depunerea de straturi subtiri piezoelectrice reprezinta un avantaj in dezvoltarea si integrarea unui sensor de deformare in aplicatiile biomedicale, acesta fiind motivul pentru care au fost testat proprietatile functionale si pentru Ca, Zr-BaTiO 3 care benficieaza de avantajul de a nu contine specii volatile cum ar fi Na si Bi din solutia solida BaTiO3-NaBiTiO3. S-au efectuat mai multe seturi de experimente de depunere laser pulsata PLD de straturi subtiri de Ca, Zr-BTO (BCZT) folosind laserul cu Nd-YAG la a treia (355nm) si a patra armonica (266nm). S- au utilizat diverse tipuri de suporturi conductoare electric: siliciu acoperit cu platina Pt/ Si(100), Nb :STO (100) STON si Pt/Kapton. Ca si in etapa precedenta, suportul de Pt/Kapton a fost utilizat pentru ca este un suport flexibil care prezinta avantajul de putea fi integrat usor intr-un dispozitiv tip senzor de deformare. Dezavantajul acestui tip de substrat este acela ca nu rezista la temperaturi de depunere mai mari de C, ceea ce limiteaza tipul de material piezoelectric care poate fi depus sub forma de film subtire cristalin pe acest tip de suport. Din acest motiv, straturile subtiri piezoelectrice de Ca, Zr- BTO au fost depuse pe Pt/Kapton folosind si tehnica MAPLE. Caracterizarea morfologica si structurala a straturilor subtiri de BaTiO3 dopat cu Ca si Zr a fost efectuata comparativ, pentru a sublinia diferentele dintre straturile subtiri obtinute prin PLD (temepratura de depunere mare, C) si MAPLE (temperatura de depunere mica, 20 0 C). Analizele morfologice s-au efectuat pe probele de Ca, Zr-BTO depuse prin PLD si MAPLE utilizand microscopia de forta atomica si microscopia electronica de baleiaj. Din punct de vedere morfologic s- a constatat o diferenta majora a aspectului suprafetei si a valorii rugozitaii suprafetei intre probele MAPLE si PLD, dupa cum se poate vedea din figura 1 si 2. Figura 1. Imagini AFM obtinute pe probele Ca, Zr-BTO obtinute prin PLD (stanga, RMS-1.1 nm) 4

5 si MAPLE (dreapta, RMS-41 nm.) Figura 2. Imagini SEM obtinute pe probele Ca, Zr-BTO obtinute prin PLD(stanga) si MAPLE (dreapta.) Analizele structurale au fost efectuate folosind difractia de raze X (difractometru Panalytical X PERT MRD), in geometrie Bragg-Brentano si cu ajutorul unui monocromator hibrid. In figura 3 sunt prezentate difractogramele de raze x ale straturilor subtiri obtinute prin PLD si MAPLE i comparatie cu tinta bulk Ca, Zr-BaTiO3. Difractograma de raze X a materialului bulk Ca, Zr-BaTiO3 indica o structura perovskitica pura, fara faze parazite, avand o simetrie romboedrala R3m., dupa cum era de asteptat pentru acest material- Figura 2. Pentru stratul subtire PLD, se remarca cresterea policristalina, cu o usoara texturare de-a lungul (111)c. Parametrii celulei elementare au fost calculati folosind parametrii structurali ai fazei romboedrale BaTiO3 (JCPDS file ) si sunt prezentati in Tabelul 1. Nu au fost identificate faze parazite in stratul subtire obtinut prin PLD. Figura 3. Difractogramele de raze X pentru straturile subtiri de Ca, Zr- BaTiO3 obtinute prin PLD si MAPLE. Difractogramele straturilor subtiri obtinute prin MAPLE demonstreaza cresterea policristalina similara straturilor obtinute prin PLD si tintei bulk- Figura 3. Acest lucru este confirmat si de parametrii de retea calculati si prezentati in Tabelul 1, prezentand valori similare pentru ambele tipuri de straturi subtiri. In schimb, nu se observa o texturare preferentiala supa o anumita directie cristalografica, cum este cazul pentru PLD, ceea ce indica un mecanism de crestere diferit. De altfel, caracteristicile morfologice ganulare prezente in straturile MAPLE sunt deasemenea diferite de cele observate in cazul Straturilor PLD- Figura 1, 2. 5

6 Probe Date structurale Simetrie romboedrala (R3m) Simetrie pseudocubica a(å) c(å) a c (Å) D 110 (nm) PLD film 5.685(2) 6.962(2) MAPLE film (9) (8) BCZT tinta 5.680(2) 6.959(3) Tabelul 1. Parametrii structurali calculati pentru straturile subtiri de Ca, Zr-BaTiO3 obtinute prin PLD si MAPLE comparativ cu tinta volumica. A3.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (II) In cadrul acestei activitati au fost testate proprietatile piezoelectrice functionale ale straturilor subtiri de titanat de bariu dopat cu calciu si zirconiu, obtinute prin PLD si MAPLE. Deasemenea, au fost dezvoltate mai multe geometrii de heterostructuri pentru integrare in senzorul de deformare piezoelectric. Diverse tipuri de electrozi si configuratii de electrozi depuse pe straturile active piezoelectric au fost obtinute si testate. Microscopia de raspuns piezoelectric a fost efectuata utilizand un microscop de forta atomica PARK Xe-100 modificat, la fel ca in etapa precedenta. Modul de lucru fost non-contact, iar cantileverele folosite prezinta un varf conductor din Pt sau Pt/Iridiu. Valorile coeficientului piezoelectric efectiv si comportamentul fazei semnalului piezoelectric la o valoare de pana la ± 7 V a campului electric DC aplicat sunt prezentate in figura 4 pentru straturile subtiri de Ca, Zr-BaTiO3 obtinute prin PLD. Figura 4. Dependenta valorilor coeficientului piezoelectric efectiv de campul aplicat pentru straturile subtiri de BCZT obtinute prin PLD (a, b). Comportamentul de comutare este evidentiat petru diverse polaritati ale campului dc: c-f). Se poate observa comportamentul de comutare a polarizarii remanente evaluat la diverse valori ale campului electric dc aplicat, fara sa apara domenii blocate care sa nu comute pe directia campului electric aplicat. Stratul de Ca, Zr-BaTiO3 obtinut prin PLD este activ din punct de vedere pizoelectric la dimensiuni diverse (500 nm- 3 microni) ale ariei excitate de campul dc aplicat. Domeniile piezoelectrice au fost scrise de campul dc prin aplicarea acestuia intre electrodul inferior de Pt si varful 6

7 conductor al catileverului. Cu ajutorului unui camp ac- 3V, 10kHz, au fost extrase raspunsurile piezoelectrice pentru diverse valori dc. Coeficientul piezoeletric efectiv d33 masurat pe aceste probe are o valoare de pana la 63 pm/v, in acord cu valorile raportate in literatura pentru acest tip de material [1]. Pentru probele obtinute prin MAPLE, se observa un comportament de comutare a polarizarii remanente echivalent cu probele PLD- Figura 5. Figura 5. Dependenta valorilor coeficientului piezoelectric efectiv de campul aplicat pentru straturile subtiri de BCZT obtinute prin MAPLE (a, b). Comportamentul de comutare este evidentiat petru diverse polaritati ale campului dc: c, d). Valorile calculate ale coeficientului piezoelectric efectiv d pm/v sunt usor mai mari decat in cazul PLD, dupa cum se poate vedea din figura 5. Raspunsul piezoeletric out-of-plane este caracterizat de un contrast puternic- Figura 5 c, d, ceea ce inseamna ca materialul prezinta o orientare preferentiala a vectorului polarizare de-a lungul axei cristalografice c. Figura 6. Heterostructura de test bazata pe un strat subtire de BCZT depus prin PLD cu traductori interdigitali IDTpe suprafata. IDT: lungime digit 20μ, distanta interdigit 20μ. Pe baza acestor straturi active piezoelectric, au fost dezvolatate mai multe geometrii ale dispozitivului de test tip senzor de deformare. In cazul straturilor subtiri obtinutye prin PLD, beneficiind de o rugozitate a suprafetei foarte mica, au fost utilizati electrozi interdigitali depusi pe suprafata filmelor 7

8 subtiri. S-au obtinut heterostructuri cu dimensiuni de pana la 400 μ 2, dupa cum se poate vedea din figura 6. Heterostructurile de test bazate pe straturi subtiri obtinute prin PLD au fost testate ulterior la diverse valori ale campului electric dc aplicat. La analiza SEM ulterioara s-a constatat ca au aparut zone delaminate ale filmului subtire, probabil din cauza efectelor termice sau a aderentei reduse a electrozilor IDT- Figura 7 stanga. Figura 7. Imagini SEM ale heterostructurii de test piezoelectrica cu traductori IDT pe suprafata. In cazul probelor obtinute prin tehnica MAPLE, din cauza valorilor mari ale rugozitatii suprafetei- Figura 1, 2, au fost preferate alte geometrii electrod-strat activ. S-au obtinut doua tipuri de heterostructuri utilizand stratul activ depus prin MAPLE- Figura 8. Figura 8. Heterostructura de test bazata pe un strat subtire de BCZT depus prin MAPLE cu electrozii depusi anterior pe Kapton (stanga) si siliciu (dreapta). Aceste heterostructuri de test au fost testate prin aplicarea unui camp dc de pana la 40 V, nefiind observata nici o problema de delaminare sau crapaturi in film sau electrod. Pentru testarea biocompatibilitatii senzorilor si a influentei caracteristicii piezo asupra mediului de cultura, este necesara excitarea mecanica a acestora pe un interval de timp relativ mare, si anume minim 30 de zile, intr-un incubator biologic. Pentru aceasta s-a realizat urmatorul montaj automat, 8

9 actionat de un motor electric. Dispozitivul a fost proiectat in SolidWorks si realizat din material plastic (nylon) prin prototipare pe o imprimanta 3D Stratasys Fortus 450mc. a b c d Fig. 9. Dispozitiv pentru deformarea mecanica a senzorului, automatizat, cu frecventa si amplitudine variabila, in scopul testarii biocompatibilitatii acestuia in mediu de cultura. a) piezele realizate pe o imprimanta 3D, Stratasys Fortus 450, b) sania cu rumenti, c) motorul electric cu mecanism cu cama, d) dispozitivul asamblat. In scopul testarii senzorilor pe tumori extrase din pacienti s-au s-au colectat date de la pacienţi diagnosticaţi cu cancer pancreatic în perioada ianuarie iunie Pacienţii au fost înrolaţi de la Institutul Regional de Gastroenterologie si Hepatologie "O. Fodor "din Cluj-Napoca. Diagnosticul pacienţilor cu cancer pancreatic a fost confirmat histopatologic prin eco-endoscopie cu puncţie fin aspirativă sau chirurgical. Toţi subiecţii şi-au dat consimţământul informat înainte de a fi înrolaţi în studiu. Studiul a fost aprobat de comitetul de etică al spitalului. Colectarea datelor S-au colectat informaţii cu privire la: datele demografice, diagnostic, stadializare, terapie şi supravieţuire. Notă: Datele demografice au inclus vârsta şi sexul pacienţilor. Datele referitoare la cancerul pancreatic au inclus: data diagnosticului, extinderea bolii, localizarea tumorii primare, tipul histologic şi n ivelul de CA 19-9 la momentul diagnosticului. Notă: Diagnosticul şi stadializarea cancerului pancreatic au fost bazate pe teste imagistice, incluzând tomografia computerizată (CT) şi eco-endoscopia (EUS). S-a făcut distincţia între tumora primară rezecabilă, avansată loco-regional şi boala metastatică. 9

10 Supravieţuirea a fost definită ca numărul de luni de la data diagnosticului şi data decesului. Data diagnosticului a fost definit ca intervalul de timp de la prima investigaţie imagistică (CT, RMN sau EUS) confirmând diagnosticul de cancer pancreatic. Probele de sânge au fost izolate din sânge venos al pacienţilor la momentul diagnosticului, împreună cu consimţământul informat al pacienţilor (lotul de studiu) şi controalele (lotul martor), care au fost prelucrate în termen de 24 ore de la colectare şi depozitate la -80 C până la utilizare. Pentru determinarea western blot a anticorpilor anti-ezrin au fost folosite probele de plasmă. Concentraţia proteinei a fost determinată folosind un kit de determinare proteică - Quick StartTM Bradford Protein Assay (Bio Rad Laboratories, Inc.). O cantitate de 60 μg de proteină totală din fiecare probă de plasmă a fost încărcată pe godeu pe un gel de poliacrilamidă 5/12%. Electroforeza a fost realizată la 100 mv şi apoi fracţiunile proteice au fost electrotransferate pe o membrană de nitroceluloză la 100 mv timp de 1 oră. Membranele au fost blocate în decurs de 3 ore, cu 5% lapte praf fără grăsime (Bio Rad Laboratories, Inc.) în soluţie Tris salină conţinând 0,1% Tween 20 (TBS T), şi 1% BSA sub agitare constantă la temperatura camerei. Membranele au fost apoi incubate cu anticorpul primar la diluţie de 1: 250 în TBST peste noapte la 4 C cu anticorpul policlonal primar ezrin IgG anti-iepure (HPA , Sigma-Aldrich) şi apoi spălate cu tampon TBS-T o dată timp de 15 min şi din nou de două ori timp de 5 minute de fiecare dată. După spălare cu TBST, membrana a fost incubată cu anticorpul secundar conjugat horseradish peroxidase (HRP) de capră anti-iepure IgG H & L (Abcam) la diluţii de 1: la 1 h la temperatura camerei şi apoi spălată cu TBS-T o dată timp de 20 minute şi de două ori timp de 5 minute. Pentru controlul de încărcare, s-a folosit anticorpul policlonal GAPDH de iepure (Abcam), într-o concentraţie de 0,8 pg / ml, cu lapte praf degresat în soluţie TBS T. Expresia totală a ezrinului a fost normalizată prin împărţirea unităţilor ezrin la cele GAPDH pentru fiecare bandă. Proteinele au fost detectate prin sistemul de chemiluminiscenţă (BioRad Laboratories, Inc.). Toate imunobloturilor au fost incubate separat, folosind un kit Clarity Western ECL (BioRad Laboratories, Inc.), membranele au fost expuse la sistemul Chemidoc Imaging (Bio Rad Laboratories, Inc.) şi analizate folosind ImageLab Software versiunea pentru Windows (Bio Rad Laboratories, Inc.). Pentru analiza statistica s-au utilizat programele: Microsoft Excel pentru introducerea şi managementul datelor şi SPSS (versiunea 23 SPSS) pentru analiza statistică. Cu ajutorul Testului t şi ANOVA s-au examinat diferenţele în expresie ale diferitelor molecule între pacienţii cu adenocarcinom şi controalele (lotul martor), şi au fost estimate valorile lui p. Datele de supravieţuire au fost estimate folosind curba Kaplan-Meier şi testul logrank. Valorile sunt exprimate ca medii ± deviaţia standard (SD). O valoare p <0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic. Rezultate Au existat 45 de pacienţi incluşi în studiu. Vârsta medie a populaţiei a fost de 61 de ani (DS 10,2, interval: ani). Au existat mai mulţi bărbaţi decât femei (56% vs. 44%) (tabelul 1). Histologic, 24 de cazuri (53%) au avut adenocarcinom ductal (tabelul 2), în timp ce 4 pacienţi (9%) au avut leziuni premaligne. Au fost 7 cazuri (16%) de pancreatită cronică şi 10 persoane sănătoase (22%). Tabel 1. Caracteristicile pacienţilor incluşi în studiu Cancer pancreatic Control N N Total Vârstă Media 62,3 60,2 DS 10,2 10,3 Interval Sex 10

11 Femei Bărbaţi Tabel 2. Caracteristicile clinice ale pacienţilor cu adenocarcinoma pancreatic Caracteristici N % Sex Bărbaţi Femei Vârsta Media 62,3 - Interval Stadiu I 0 0 IIA 1 4 IIB 6 26 III 2 9 IV Gradul de diferenţiere Nu e raportat Localizarea primară Cap Corp 8 22 Coadă 4 11 Proces uncinat 1 3 Istm 5 14 Localizări multiple 6 17 Rezecţia chirurgicală curativă Da 1 4 Nu CA 19-9 Evaluabile 18 Media Mediana Interval Analiza western blot a Ezrinului Pentru a valida prezenţa anticorpului ezrin la pacienţii AP, au fost comparate probele de plasma de la: 24 de pacienţi cu adenocarcinom pancreatic, 10 subiecţi sănătoşi (SA), 4 pacienti cu leziuni premaligne şi 7 cu pancreatită cronică (CP), folosind analiza Western blot. Mai mult de jumătate dintre pacienţi au avut expresie Ezrin pe western blot (tabelul 3) Ezrin Adenocarcinom ductal pancreatic n=24 71% (n=15) Leziuni premaligne n=4 Alte n=22 29% (n=6) Pancreatită cronică n=7 Control n=10 14% (n=3) 5% (n=1) 10%(n=2) 11

12 Tabel 3. Frecvenţa expresiei ezrin în grupurile analizate Expresia ezrin şi corelarea clinică Supraexpresia proteinei Ezrin a fost semnificativ corelată cu stadiul clinic al adenocarcinomului pancreatic (AP) (p <0,05). Pentru stadiile clinice, rata ezrin pozitivă a fost de numai 20% (3/7) în stadiile I-II din AP, şi a fost semnificativ mai mare în stadiile III-IV (80%, 12/16), diferenţa a fost semnificativă statistic (p = 0,03). Rata ezrin pozitivă a fost mai mare la pacienţii cu mărimea tumorii 3 cm (80%, 12/17), decât la pacienţii cu o dimensiune a tumorii <3 cm (20%, 3/5). Cu toate acestea, nivelul expresiei proteinei ezrin nu a fost corelată cu vârsta pacienţilor, sexul şi mărimea tumorii (P> 0,05) (tabelul 4). Table 4. Relaţia între supraexpresia proteinei ezrin si caracteristicile clinicopatologice în adenocarcinomul pancreatic Caracteristici Număr pacienţi Cazuri pozitive (%) p-value Sex Bărbaţi Femei Vârsta (ani) 50 >50 Mărimea tumorii(cm) <3 3 Nu s-a raportat Stadializarea TNM I-II III-IV (56%) 7 (44%) 2 (13%) 13 (87%) 3 (20%) 12 (80%) 3 (20%) 12 (80%) Expresia proteinei ezrin şi supravieţuirea Pentru a confirma în continuare rolul expresiei ezrin în progresia adenocarcinomului pancreatic, s-a analizat rata de supravietuire globala la 24 de cazuri cu AP folosind metoda Kaplan-Meier, şi nu s- a determinat nicio diferenţă la pacienţii cu AP cu expresie crescută a ezrinului şi pacienţii cu PDAC cu expresie scăzută a ezrinului (p>0,05) (Fig. 1). Fig 10. Curba de supravieţuire Kaplan-Meier la 24 de pacienţi cu adenocarcino pancreatic şi expresia proteinei Ezrin 12

13 Discuţii Ezrin este implicat într-o varietate de funcţii celulare, cum ar fi organizarea citoscheletală, motilitatea celulară şi a morfogenezei celulare. Niveluri ridicate de exprimare a ezrinului în liniile celulare ale cancerului endometrial [11], colorectal [12] şi ale adenocarcinomului pancreatic cu potenţial metastatic ridicat [13] au sugerat faptul că expresia acesteia este asociată cu evenimente care pot promova adeziunea şi migrarea celulară şi pot fi legate de metastazarea tumorală [14, 15]. Rezultatele obţinute arată că proteina ezrin este mai puternic exprimată la pacienţii cu adenocarcinom ductal pancreatic decât la pacienţii cu pancreatită cronică şi la persoanele sănătoase (figura 2). Pe baza acestei constatări s-a corelat expresia Ezrinului cu statutul clinicopatologic şi prognosticul pacienţilor cu cancer pancreatic. Fig 11. Analiza western blot a pacienţilor cu adenocarcinoma pancreatic şi control (martor) Pentru a descoperi relaţia dintre expresia ezrin şi parametrii clinicopatologici, în prezenta etapă s-a efectuat analiza Western blot a ezrinului în 24 de cazuri de adenocarcinom pancreatic şi 22 de controale (7 cazuri de pancreatită cronică, 4 cazuri de leziuni premaligne şi 10 cazuri de voluntari sănătoşi). Studiul nostru a constatat ca proteina ezrin a arătat expresie mai mare in adenocarcinom pancreatic (71%, 15/24) (P = 0,009), comparativ cu lotul martor (29%, 6/22). În studiul efectuat de Piao et al [36], a fost realizată imunohistochimia proteinelor ezrin şi s-a constatat că proteina ezrin a aratat expreise mai mare in AP (82,1%, 87/106) (p = 0,01), comparativ cu ţesuturile non-tumorale adiacente (37,8%, 14/37) şi ţesuturile normale ale pancreasului (19,0%, 4/21) (figura 3). De asemenea, proteina ezrin a fost puternic exprimată în AP (68,9%, 73/106) (p = 0,01), ceea ce indică faptul că proteina ezrin este frecvent exprimată în ţesutul PDAC, comparativ cu ţesutul pancreatic normal. Fig. 12. Imunohistochimia proteinei ezrin în leziunile pancreatice. (A) Ezrin este negativă în ţesuturile pancreatice normale. (B & C) Ezrin este puternic pozitivă în citoplasma celulelor canceroase cu metastaze limfatice. (D) Celulele canceroase au aratat imunoreactivitate mai intensă în membrana celulelor canceroase. (E & F) Ezrin este slab pozitiv în citoplasma celulelor canceroase fără metastaze limfatic. 13

14 De asemenea, Meng şi colab. a arătat că ezrin este supraexprimat în leziunile precanceroase AP în comparaţie cu ţesuturile normale pancreatice [37]. Aceste rezultate pot sugera că ezrin ar putea juca un rol important în progresia AP, şi de asemenea, poate fi folosit ca un biomarker util pentru diagnosticul de AP. Diverse studii privind cancerul au sugerat că supraexprimarea ezrinului se corelează cu mulţi parametri clinicopatologici. Zhao şi Li et al. au raportat că expresia pozitivă a ezrinului se corelează cu vârsta, mărimea tumorii, localizarea, stadiul de diferenţiere, profunzimea invaziei, invazia vasculară, limfatică si metastazarea la distanţă şi stadiul TNM (P <0,05) [38, 39]. În studiul nostru, am arătat că expresia proteinei ezrin a fost strâns legată de stadiul clinic, dar nu a fost legată de vârstă, sex, mărimea tumorii. Rezultatele prezentului studiu indică faptul că ezrin pare să aibă un rol important în invazia şi metastazarea AP. Am investigat în continuare relaţia dintre expresia proteinei ezrin şi prognosticul la pacienţii cu PDAC. Rezultatele noastre au arătat că pacienţii cu AP cu expresie crescută a ezrinului au avut aceeaşi supravietuire ca şi pacienţii cu expresie scăzută a ezrinului. Acest lucru poate constitui o limitare a studiului nostru, datorat numărului mic de pacienţi incluşi în studiu. Piao et al. [40] a evaluat recent asocierea nivelului proteinei ezrin cu progresia tumorală la 106 pacienţi cu AP. Expresia crescută a ezrinului în ţesutul tumoral a fost un factor independent de prognostic negativ în PDAC cu un HR ajustat de 2,16 (95% CI ) [40]. O meta-analiză recentă care a inclus 6,675 pacienţi cu cancer de la 55 de studii au arătat ca expresia crescută a ezrinului a fost asociată cu un prognostic nefavorabil la pacienţii cu cancer [41]. A3.3. Cercetari asupra unei metode inovative de creare a hartii tensiunilor in tesutul tumoral (I) Pe baza heterostructurilor obtinute in activitatea precedenta au fost realizate teste de determinare a conversiei incarcarii mecanice in semnal electric, pentru implementarea acestora in dispozitivul de test tip senzor de deformare. Figura 13 a) Raspunsul piezoelectric pentru o proba de of BCZT/Pt/Si la aplicarea unui tren de deformare mecanica. Intarzierea dintre aplicarea deformarii si raspunsul in voltaj este datorat timpului necesar trenului de unda pentru a ajunge pe proba de la sursa. b) si c) Transformata Fourier al semnalului aplicat si al raspunsului, aratand ca frecventa raspunsului in tensiune electrica este aceeasi cu a undei de deformare aplicata (2.15 MHz). 14

15 Straturile subtiri de Ca, Zr-BatiO3 convertesc cu succes deformarea mecanica in semnal electric, dupa cum se poate vedea din figura 7. Au fost utilizate ambele tipuri de straturi subtiri, obtinute atat prin PLD cat si prin MAPLE. Raspunsul piezoelectric al straturilor subtiri a fost obtinut prin aplicarea unor trenuri de deformare mecanica prin metoda clasica de masura a activitatii piezoelectrice directe (Piezoelectric Probing Technique) [2]. Au fost testate deasemenea raspunsurile piezoelectrice locale ale probelor de Ca, Zr-BaTiO3 la diverse deformari mecanice inprimate de un cantilever cu varf conductor de Pt- Figura 8, 9. Răspunsul piezoelectric local este determinat cu un microscop de forță atomică astfel: - pe vârful AFM conductor (de platină), aflat în contact cu suprafața probei, se aplică o tensiune electrică alternativă. Câmpul electric alternativ, existent între vârful AFM și substratul conductor, duce la apariția unei oscilații locale a materialului datorită efectului piezoelectric invers. Această oscilație locală este detectată cu ajutorul vârfului AFM. Concomitent se poate aplica și un câmp electric local continuu, tot intre vârful AFM și substrat, care să modifice starea de polarizare locală a materialului d33 efectiv d33 efectiv (nm/v) apasare (nn) Figura 14. Amplitudinea raspunsului piezoelectric obtinut la diverse valori ale fortei de apasare. Se remarca o variatie aproape liniara a valorii coeficientului piezoelectric efectiv cu forta de apasare a cantileverului pe suprafata probei. Aceste masuratori denota convertirea unui stimul mecanic, chiar si de valoare foarte mica, in raspuns electric local amplitudine raspuns piezo amplitudine raspuns piezo (nm) apasare (nn) Figura 15. Variatia valorii coeficientului piezoelectric efectiv obtinut la diverse valori ale fortei de apasare. 15

16 A fost măsurat răspunsul piezoelectric la diferite valori ale câmpului electric continuu și, de asemenea, la diferite valori ale presiunii mecanice aplicate prin intermediul vârfului AFM. Se observă o creștere a amplitudinii răspunsului piezoelectric cu creșterea apăsării. La calcularea forței de apăsare s-a folosit valoarea nominală a constantei elastice a vârfului AFM specificată de producător (8 N/m), care poate să difere semnificativ de valoarea reală. De aceea, valorile respective trebuie considerate ca fiind relative. Rezultatele obtinute in aceasta etapa au fost sintetizate in lucrarea Lead-Free Piezoelectric (Ba,Ca)(Zr,Ti)O3 Thin Films for Biocompatible and Flexible Devices trimisa la revista ACS APPLIED Materials and Interfaces (ISI 6.7), care este in curs de revizuire. Rezultatele au fost deasemenea diseminate la conferinta 2nd International Congress on Biomaterials & Biosensors (BIOMATSEN 2016) 1-3 June 2016 İstanbul/Turkey prin lucrarea Biocompatibility studies on piezoelectric (Ba1 xcax)(zryti1 y)o3 thin films growth by Matrix Assisted Pulsed Evaporation by Nicu Doinel Scarisoreanu, Adrian Bercea, Valentina Dinca, Valentin Ion, Maria Dinescu (Abstract ID: 47 - Poster Presentation). In concluzie, se poate afirma ca obiectivele acestei etape au fost atinse avand in vedere rezultatele prezentate in raport. Premize teoretice clinice Cancerul pancreatic reprezintă a patra cauză de deces prin cancer. Mai mult de jumătate dintre pacienţi (53%) sunt diagnosticati într-un stadiu tardiv, cu o supravieţuire la 5 ani mai mică de 3% [1]. Diagnosticarea tardivă nu se datorează numai lipsei simptomatologiei clinice, dar şi lipsei unor metode eficiente de screening pentru diagnosticarea cancerului pancreatic în stadii precoce, atunci când intervenţia chirurgicală este încă posibilă. Detecţia timpurie a cancerului pancreatic este o strategie cheie pentru a reduce rata mortalităţii prin cancer pancreatic. Ezrin (EZR) este un membru al familiei Ezrin-radixin-moesin şi face legatura între membrana celulară şi citoschelet, fiind implicat în organizarea citoscheletală [2]. Ezrin este supraexprimat în multe cancere, incluzând şi cancerul pancreatic [3]. Se consideră că ezrin este implicat în transducţia semnalului intracelular, care este legat de migrarea celulară şi metastazare deaoarece ezrin pare a fi un substrat pentru tirozin-kinază [4] şi se leagă de moleculele de adeziune precum CD43, CD44, molecula de adeziune intercelulară 1 şi 2 [5-7] şi funcţionează de-a lungul receptorilor celulari de suprafaţa prin activarea căilor de semnalizare Rho si PI3K/Akt [8]. Ezrin reprezintă un substrat pentru tirozin kinază [16]. În prezenţa activatorilor corespunzători, precum IL-11, fosfatidilinozitol 4, 5-bifosfat şi fosforilarea moesinului (Thr558), ezrin este translocat din citoplasmă către membrană prin distrugerea legăturilor intramoleculare [16, 17]. Recent, a fost raportat că legarea EGFR determină o cascadă de fosforilare în care ezrin are un rol important, deoarece leagă citoscheletul de membrană [18, 19]. EZR este supraexprimat în mai multe forme de cancer, inclusiv adenocarcinomul pancreatic, chiar şi în cazul leziunilor PanIn premaligne [20-22] şi interacţionează cu cortactin pentru a forma rozete podosomale în celulele AP, care pot juca un rol important în invazia tumorală [23]. Aceste observaţii sprijină imunogenitatea EZR. Interesant, EZR a fost identificat atât în exosomii secretaţi de celulele mezoteliale [24] cât şi ca substrat al metaloproteinazelor matriceale capabile să genereze neo-epitopi de la autoantigene [25]. Expresia şi modelul celular al ezrinului în tumorile solide pseudopapilare (SPT), neoplasmele chistice mucinoase (MCN), tumorile papilare mucinoase intraductale (IPMN) şi 16

17 adenocarcinomul ductal pancreatic (AP) sunt de interes clinic şi oferă o perspectivă asupra tumorigenezei şi a potenţialului metastazant. Conform unui studiu realizat de Yeh et al [26], 2 din 9 tumori benigne SPT evidenţiate histopatologic au arătat expresia citoplasmatică a ezrinului, în timp ce toate cele 3 tumori maligne au evidenţiat expresia membranoasă a ezrinului. Toate tumorile benigne MCN şi IPMN au prezentat expresia citoplasmatică a ezrinului, în timp ce tumorile maligne MCN şi IPMN au prezentat în mod constant expresia membranoasă a ezrinului. În cele din urmă, adenocarcinoamele pancreatice slab diferenţiate prezintă expresia membranoasă a ezrinului mai frecvent comparativ cu AP bine diferenţiate. Akisawa et all. [13] a arătat că ezrin este exprimat de un număr de linii celulare de adenocarcinom pancreatic la diferite niveluri între diferitele linii celulare. Ezrin joacă, de asemenea, un rol crucial în morfogeneză şi absenţa ezrinului a fost asociată cu modificări morfologice în celulele canceroase prin remodelarea citoscheletul actinei [27]. Ezrin este implicat nu numai în organizarea citoscheletului, dar, de asemenea şi în mai multe căi de semnalizare. S-a demonstrat interacţiunea ezrinului cu moleculele nervoase de adeziune celulară L1 şi rolul acesteia în reglarea căii de semnalizare NF-kB în cancerul de colon [28]. În plus, metastazarea precoce Ezrin mediată a fost parţial dependentă de activarea căii ERK /protein kinaza mitogen-activată (MAPK) în osteosarcom [29], în timp ce scăderea nivelului de Ezrin reglează negativ căile MAPK şi a factorul de creştere β în carcinomul esofagian scuamos [30]. Efectele ezrin mediate asupra Akt şi activitatea ERK1 / 2 au fost legate de capacitatea sa de a promova progresia tumorală şi metastazarea [31, 32]. Printre alte proteine citoscheletale acestea sunt frecvent prezente în reacţia desmoplastică. De asemenea, este posibil ca reacţia desmoplastică din tumorile pancreatice să contribuie la creşterea migraţiei şi invaziei tumorale. Reacţia desmoplastică este, de fapt, un factor care contribuie dinamic la progresia cancerului pancreatic prin modularea activă a căilor de semnalizare care reglează proliferarea celulelor tumorale şi invazia tumorală. Într-un studiu s-a demonstrat că rigiditatea matricei extracelulare reglează metabolismul celular şi sinteza proteinelor în celulele canceroase [33]. Progresia cancerului în ţesuturile moi este de obicei asociată cu o creştere a rigidităţii datorită acumulării locale a unei matrici dense de colagen reticulat care permite detectarea tumorii prin palpare fizică [34, 35]. Rigiditatea matriceală a fost sugerată ca fiind un mecanism care stă la baza tropismului tisular al metastazelor canceroase. O modalitate prin care celulele canceroase dependente de rigiditate pot răspunde la un mediu de ţesut mai puţin favorabil, este de a reduce statusul lor metabolic, oferind un mecanism potenţial pentru tropismul tisular al celulelor tumorale. CA 19-9 este biomarkerul care a demonstrat o valoare clinică pentru monitorizarea terapeutică şi depistarea precoce a recurenţelor după tratament la pacienţii cu cancer pancreatic. Dar utilizarea CA 19-9 ca un instrument de screening s-a dovedit fără success, astfel încât alţi biomarkeri sunt necesari pentru diagnosticarea precoce a cancerului pancreatic [9]. Un studiu recent a constatat că nivelurile de autoanticorpi anti-ezrin au fost semnificativ mai mari în probele de ser prediagnostic la cazurile cu cancer pancreatic comparative cu controlurile [10]. Metoda Tumor Sense propusă se bazează pe rezultatele obţinute în urma investigării rolului ezrinului în cancerul pancreatic şi corelaţia expresiei acestuia cu statusul clinicopatologic si prognosticul pacienţilor cu adenocarcinom pancreatic. 17

18 18

19 REZULTATELE ETAPELOR SI GRADUL DE REALIZARE A OBIECTIVELOR Rezultate obtinute: - s-au realizat primele prototipuri de senzori cu strat piezorezistiv, noutate la novel mondial, in urma studiilor, un material nou, pe baza de barium titanate doped sodium si bismuth titanate sub forma de straturi subtiri (1-x)-Na0.5Bi0.5TiO3-xBaTiO3 sau NBT-BT obtinut prin procesarea cu laser folosind radiofrequency beam assisted pulsed laser deposition (RF-PLD), a tintelor de (1-x)Na0.5Bi0.5TiO3. - s-au realizat primele prototipuri inovative de senzori cu timbru tensometric, impreuna cu sistemul de achizitie pentru acestia, si software-ul aferent. - s-a realizat un studiu documentar upgradat cu ultimele informatii privind tehnologiile innovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral - s-a realizat lotul de studiu al pacienţilor cu adenocarcinom pancreatic pentru a furniza date clinice pentru modelul experimental pentru evaluarea presiunilor interstiţiale intratumorale - s-a obtinut acordul informat al pacienţilor incluşi în studiul TUMORSENSE. - s-a realizat un dispozitiv pentru testarea biocompatibilitatii sensorilor pe celulel normale si canceroase in incubator biologic. Diseminarea rezultatelor Articole 1. Seicean A, Badea R, Moldovan-Pop A, Vultur S, Botan EC, Zaharie T, Săftoiu A, Mocan T, Iancu C, Graur F, Sparchez Z, Seicean R. Harmonic Contrast-Enhanced Endoscopic Ultrasonography for the Guidance of Fine-Needle Aspiration in Solid Pancreatic Masses, Ultraschall Med Aug Seicean A, Petrusel L, Seicean R. New targeted therapies in pancreatic cancer. World J Gastroenterol May 28;21(20): V. Dinca, A. Bercea, M. Icivezi, A. Roseanu, L. Gruionu, R. Birjega, M. Dinescu, N. D. Scarisoreanu, BCZT thin films based-bio interfaces obtained by MAPLE technique, Applied Surface Science, submitted, Seicean A, Mosteanu O, Seicean R. Maximizing the endoscopic ultrasonography. World J Gastroenterology 2016; in press. 5. Seicean A, Jinga M. Harmonic contrast-enhanced endoscopic ultrasound fine needle aspiration: fact or fiction?endoscopic Ultrasound 2016; in press. 6. Scarisoreanu, Nicu Doinel; Craciun, Floriana; Ion, Valentin; Birjega, Ruxandra; Bercea, Adrian; Dinca, Valentina; Dinescu, Maria; Sima, Livia; Icriverzi, Madalina; Roseanu, Anca; Gruionu, Lucian; Gruionu, Gabriel, Lead-Free Piezoelectric (Ba,Ca)(Zr,Ti)O3 Thin Films for Biocompatible and Flexible Devices" ACS Applied Materials & Interfaces (submitted). Presentări - poster 1. EUS-plus the role of contrast harmonics, elastography and ncle. 6th European EUS Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK. 2. Operabilitatea în cancerul de pancreas. Ecoendoscopia (EUS). AL XXXV-LEA Congres National de Gastroenterologie, Hepatologie si Endoscopie Digestiva Iasi nd International Congress on Biomaterials & Biosensors (BIOMATSEN 2016) 1-3 June 2016 İstanbul/Turkey Biocompatibility studies on piezoelectric (Ba1 xcax)(zryti1 y)o3 thin films 19

20 growth by Matrix Assisted Pulsed Evaporation by Nicu Doinel Scarisoreanu, Adrian Bercea, Valentina Dinca, Valentin Ion, Maria Dinescu (Abstract ID: 47 - Poster Presentation). 4. A. Seicean. Contrast media in biliopancreatic endoscopic ultrasonography. EUS-ERCP connection. Turin, Italy A. Seicean, Endoscopic ultrasound fine needle aspiration (EUS-FNA) in bilio-pancreatic pathology. Romanian- German Symposium, Timisoara mar A. Seicean. Cancerul de pancreas- dificultati de diagnostic. AL XXXVI-LEA Congres National de Gastroenterologie, Hepatologie si Endoscopie Digestiva Cluj-Napoca A. Seicean. Fiziopatologia durerii pancreatice. AL XXXVI-LEA Congres National de Gastroenterologie, Hepatologie si Endoscopie Digestiva Cluj-Napoca Nicolae Scarisoreanu, Lucian G. Gruionu, Gabriel Gruionu, Tumor Solid-Stress Sensor for Cancer Treatment Monitoring, 2016 BMES/FDA Frontiers in Medical Devices Conference "Innovations in Modeling and Simulation: Patient-Centered Healthcare." May 23-25, 2016, Washington, DC, USA. Prezentare orală 1. Core-histology obtained during endoscopic ultrasonography for pancreatic masses by using a standard 22G needle. 6th European EUS Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK. 2. Petrusel L, Zaharie T, Badea R, Pojoga C, Seicean R, Seicean A. Factorii de risc şi supravieţuirea în adenocarcinomul pancreatic. AL XXXVI-LEA Congres National de Gastroenterologie, Hepatologie si Endoscopie Digestiva Cluj-Napoca

21 Bibliografie 1. Howlader N, Noone A, Krapcho M et al (2015) SEER Cancer Statistics Review, , National Cancer Institute. 2. Tsukita S, Yonemura S. ERM (ezrin/radixin/moesin) family: from cytoskeleton to signal transduction. Curr Opin Cell Biol 1997; 9: Meng Y, Lu Z, Yu S, Zhang Q, Ma Y, Chen J (2010) Ezrin promotes invasion and metastasis of pancreatic cancer cells. J Transl Med 8:61 4. Fazioli F, Wong WT, Ullrich SJ, Sakaguchi K, Appella E, Di Fiore PP. The ezrin-like family of tyrosine kinase substrates: receptor-specific pattern of tyrosine phosphorylation and relationship to malignant transformation. Oncogene 1993; 8: Yonemura S, Hirao M, Doi Y, et al. Ezrin/radixin/ moesin (ERM) proteins bind to a positively charged amino acid cluster in the juxta-membrane cytoplasmic domain of CD44, CD43, and ICAM-2. J Cell Biol 1998; 126: Heiska L, Alfthan K, Gronholm M, Vilja P, Vaheri A, Carpen O. Association of ezrin with intercellular adhesion molecule-1 and -2 (ICAM-1 and ICAM-2). Regulation by phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate. J Biol Chem 1998; 273: Xiaolin Wan, Arnulfo Mendoza, Chand Khanna, and Lee J. Helman. Rapamycin Inhibits Ezrin-Mediated Metastatic Behavior in a Murine Model of Osteosarcoma. Cancer Res 2005; 65: (6). March 15, Hunter KW (2004) Ezrin, a key component in tumor metastasis. Trends Mol Med 10(5): Hidalgo M: Pancreatic cancer. N Engl J Med. 2010, 362: Capello M, Cappello P, Linty FC et al (2013) Autoantibodies to Ezrin are an early sign of pancreatic cancer in humans and in genetically engineered mouse models. J Hematol Oncol 6: Ohtani K, Sakamoto H, Rutherford T, Chen Z, Satoh K, Naftolin F. Ezrin, a membranecytoskeletal linking protein, is involved in the process of invasion of endometrial cancer cells. Cancer Lett 1999; 147: Hiscox S, Jiang WG. Ezrin regulates cell-cell and cellmatrix adhesion, a possible role with E-cadherin/ h-catenin. J Cell Sci 1999; 112: Akisawa N, Nishimori I, Iwamura T, Onishi S, Hollingsworth MA. High levels of ezrin expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines with high metastatic potential. Biochem Biophys Res Commun 1999; 258: Hunter KW (2004) Ezrin, a key component in tumor metastasis. Trends Mol Med 10(5): Clucas J, Valderrama F (2014) ERM proteins in cancer progression. J Cell Sci 127(Pt 2): Fazioli F, Wong WT, Ullrich SJ, et al. The ezrin-like family of tyrosine kinase substrates: receptor-specific pattern of tyrosine phosphorylation and relationship to malignant transformation. Oncogene. 1993; 8: Ohtani K, Sakamoto H, Rutherford T, et al. Ezrin, a membrane-cytoskeletal linking protein, is highly expressed in atypical endometrial hyperplasia and uterine endometrioid adenocarcinoma. Cancer Lett. 2002; 179:

22 18. Maire F, Hammel P, Terris B, et al. Prognosis of malignant intraductal papillary mucinous tumours of the pancreas after surgical resection: comparison with pancreatic ductal adenocarcinoma. Gut. 2002; 51: Chen Z, Fadiel A, Feng Y, et al. Ovarian epithelial carcinoma tyrosine phosphorylation, cell proliferation, and ezrin translocation are stimulated by interleukin 1 and epidermal growth factor. Cancer. 2001; 92: Torer N, Kayaselcuk F, Nursal TZ, Yildirim S, Tarim A, Noyan T, Karakayali H: Adhesion molecules as prognostic markers in pancreatic adenocarcinoma. J Surg Oncol 2007, 96: Abiatari I, Esposito I, Oliveira TD, Felix K, Xin H, Penzel R, Giese T, Friess H, Kleeff J: Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer. J Cell Mol Med 2010, 14: Meng Y, Lu Z, Yu S, Zhang Q, Ma Y, Chen J: Ezrin promotes invasion and metastasis of pancreatic cancer cells. J Transl Med 2010, 8: Kocher HM, Sandle J, Mirza TA, Li NF, Hart IR: Ezrin interacts with cortactin to form podosomal rosettes in pancreatic cancer cells. Gut 2009, 58: Hegmans JP, Bard MP, Hemmes A, Luider TM, Kleijmeer MJ, Prins JB, Zitvogel L, Burgers SA, Hoogsteden HC, Lambrecht BN: Proteomic analysis of exosomes secreted by human mesothelioma cells. Am J Pathol 2004, 164: Cauwe B, Martens E, Proost P, Opdenakker G: Multidimensional degradomics identifies systemic autoantigens and intracellular matrix proteins as novel gelatinase B/MMP-9 substrates. Integr Biol (Camb) 2009, 1: Yeh TS, Tseng JH, Liu NJ et al. Significance of Cellular Distribution of Ezrin in Pancreatic Cystic Neoplasms and Ductal Adenocarcinoma, Arch Surg. 2005;140: Saito S, Yamamoto H, Mukaisho K, Sato S, Higo T, Hattori T, Yamamoto G, Sugihara H. Mechanisms underlying cancer progression caused by Ezrin over- expression in tongue squamous cell carcinoma. PLoS one. 2013; 8:e Gavert N, Ben-Shmuel A, Lemmon V, Brabletz T, Ben-Ze ev A. Nuclear factor-kappab signaling and Ezrin are essential for L1-mediated metastasis of colon cancer cells. J Cell Sci. 2010; 123: Khanna C, Wan X, Bose S, Cassaday R, Olomu O, Mendoza A, Yeung C, Gorlick R, Hewitt SM, Helman LJ. The membrane-cytoskeleton linker Ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 2004; 10: Xie JJ, Xu LY, Xie YM, Zhang HH, Cai WJ, Zhou F, Shen ZY, Li EM. Roles of Ezrin in the growth and invasiveness of esophageal squamous carcinoma cells. Int J Cancer. 2009; 124: Elliott BE, Meens JA, SenGupta SK, Louvard D, Arpin M. The membrane cytoskeletal crosslinker Ezrin is required for metastasis of breast carcinoma cells. Breast Cancer Res. 2005; 7:R Kong J, Di C, Piao J et al. Ezrin contributes to cervical cancer progression through induction of epithelial-mesenchymal transition. Oncotarget. Advance publication 2016: Tilghman R, Blais EM, Cowan CR et al. Matrix Rigidity Regulates Cancer Cell Growth by Modulating Cellular Metabolism and Protein Synthesis. PLoS ONE 7(5): e Huang S, Ingber DE (2005) Cell tension, matrix mechanics, and cancer development. Cancer Cell 8: