Raport științific sintetic final

Transcription

1 Raport științific sintetic final privind implementarea proiectului PN-II-ID-PCE Titlu proiect: Modelarea in silico a proceselor biologice din tumorile hipoxice în vederea individualizării protocolului de tratament I. Obiectivele proiectului oct 2013 dec 2013 Obiectivul major al acestei etape: Creșterea unei tumori virtuale de cap și gât folosind tehnici computaționale Monte Carlo. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 1. Adunarea parametrilor de input ai modelului pe baza datelor existente in literatura de specialitate. 2. Construirea modelului bazat pe datele de input. Rezultatul preconizat pentru această etapă conform planului de realizare a proiectului: Model virtual de bază al unei tumori reprezentative de cap și gât (diseminare: prezentare simpozion/ conferință). ian 2014 dec 2014 Obiectivul 1. Ajustarea modelului tumoral cu componente spațiale corelate cu date furnizate de imagini PET/CT. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 1.1. Incorporarea datelor PET și CT de contrast într-un parametru complex pentru a defini distribuția spațială a hipoxiei tumorale Ajustarea parametrilor de input ai modelului de bază în funcție de parametrii hipoxici și metabolici ai pacientului. Rezultatul preconizat pentru această etapă conform planului de realizare a proiectului: Model complex al unei tumori reprezentative de cap si gat avand la baza date imagistice reale. Obiectivul 2. Simularea tratamentului radioterapeutic al pacientului. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 2.1. Implementarea mecanismelor responsabile de repopularea tumorală dea lungul tratamentului cu radiatie Simularea tratamentului real folosind formalismul liniar patratic din radioterapie. Rezultatul preconizat pentru această etapă conform planului de realizare a proiectului: Rezultate simulare tratament radioterapeutic (diseminare: prezentare conferinta; articol ISI). 1

2 ian 2015 dec 2015 Obiectivul 1. Ajustarea modelului conform rezultatelor clinice. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 1.1. Compararea datelor clinice cu datele simulării având în vedere dimensiunea tumorală reziduală (dacă există), distribuția hipoxiei și comportamentului metabolic Ajustarea algoritmului modulului radioterapeutic. Obiectivul 2. Validarea modelului. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 2.1. Recrutarea unui număr mai mare de pacienți cu tumori de cap și gât pentru colectarea datelor de imagistică PET/CT. Rezultatul preconizat pentru această etapă conform planului de realizare a proiectului: Model perfecționat pe baza rezultatelor clinice. Model virtual final de tumoră de cap și gât (diseminare: prezentare conferință; articol ISI). ian 2016 sept 2016 Obiectivul 1. Validarea modelului. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 1.1. Optimizarea modelului Obiectivul 2. Aplicarea modelului pentru optimizarea tratamentului. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 2.1. Aplicarea diferitelor protocoale de tratament cu radiatie Simularea de tratamente cu radiatie tintite asupra zonelor cu hipoxie ridicata bazata pe datele PET/CT. Obiectivul 3. Analizarea datelor si validarea tratamentului virtual. Activități plănuite pentru realizarea obiectivului: 3.1. Evaluarea rezultatelor radioterapiei neconventionale folosind modele radiobiologice Compararea tratamentului optim indicat de model cu rezultatele trialurilor clinice actuale (in cazul in care exista astfel de trialuri). Rezultatul preconizat pentru această etapă conform planului de realizare a proiectului: Model virtual optimizat de tumora de cap si gat. Rezultate comparative ale tratamentelor cu radiatie neconventionale. Model virtual validat. (diseminare: prezentare conferinta; articol ISI). 2

3 II. Rezultatele cercetării din perioada octombrie 2013 septembrie 2016 II.1. Articole ISI (factor de impact cumulativ 24.45) 1. L. Marcu, D. Marcu, In silico modelling of a cancer stem cell-targeting agent and its effects on tumour control during radiotherapy Scientific Reports 6, (2016) 2. L. Marcu, Future treatment directions for HPV-associated head and neck cancer based on radiobiological rationale and current clinical evidence Critical Reviews in Oncology/Hematology 103:27-36 (2016) 3. L. Marcu, D. Marcu, S. Filip. In silico study of the impact of cancer stem cell dynamics and radiobiological hypoxia on tumour response to hyperfractionated radiotherapy Cell Proliferation 49(3): (2016) 4. R. Chirla, L. Marcu, PET-based quantification of statistical properties of hypoxic tumor subvolumes in head and neck cancer Physica Medica 32:23-35 (2016) 5. L. Marcu, The first Rs of radiotherapy - or standing on the shoulders of giants Australasian Phys Eng Sci Med, 38(4) (2015) (IF = 0.882) (invited article) 6. M. Jennings, L. Marcu, E. Bezak, PET-specific parameters and radiotracers in theoretical tumour modelling Computational and Mathematical Methods in Medicine, Article ID (2015) (IF = 1,08) 7. L. Marcu, W. Harriss-Phillips, S. Filip, Hypoxia in head and neck cancer in theory and practice: a PET-based imaging approach Computational and Mathematical Methods in Medicine, Article ID (2014) (IF = 1,08) 8. L. Marcu, Tumour repopulation and the role of abortive division in squamous cell carcinomas during chemotherapy Cell Proliferation 47(4): (2014) (IF = 3,28) 9. L. Marcu, Improving therapeutic ratio in head and neck cancer with adjuvant and cisplatin-based treatments Biomed Research International 2013: (2013) (IF = 2.880) II.2. Articole BDI 1. L. Marcu, D. Marcu, S. Filip, In silico repopulation model of various tumour cells during treatment breaks in head and neck cancer radiotherapy World Academy of Science, Engineering and Technology, International Science Index, Medicine and Health Sciences 9(3) (2015) 3

4 II.3. Prezentări la conferințe internaționale și seminarii internaționale invitate 1. L. Marcu, Cancer stem cells a new variable in the equation of tumour modelling? Karolinska Institutet, Stockholm, Sept (2016) (Invited talk) 2. L. Marcu, D. Marcu, Radiobiological effects of cancer stem cell-targeting therapy in a head and neck cancer model Ist European Congress of Medical Physics (ECMP), Athens, 1-4 Sept (2016) 3. E. Bezak, L. Marcu, Normal tissue complications in combined chemo-radiotherapy for head and neck cancer a modelling approach MASCC Congress, Adelaide, June (2016) (Invited talk) 4. L. Marcu, Promises and challenges of cancer stem cell-targeting agents in the management of head and neck cancer Sansom Institute for Health Research, Division of Health Sciences, University of South Australia, Adelaide, 21 May 3 June (2016) (Invited talk) 5. A. Dinu, T. Flonta, V. Virag, L. Marcu, Comparative techniques of adaptive radiotherapy for locoregionally advanced oropharyngeal cancer The 7 th AAMP Meeting (Alpe-Adria Medical Physics), Zagreb, May (2016) 6. L. Marcu, D. Marcu, S. Filip, The role of in silico modelling in radiotherapy optimisation and personalisation International Conference on Sciences, Oradea, May (2016) 7. L. Marcu, D. Marcu, Hyper- versus hypofractionated radiotherapy in a radioresistant head and neck cancer model ESTRO 35, Turin, Italy, 29 April 3 May (2016) 8. L. Marcu, In silico research towards optimisation of personalised treatment in head and neck cancer Conference of Diaspora in Scientific Research, Timisoara, Romania, April (2016) 9. L. Marcu, D. Marcu, E. Bezak, Monte Carlo simulation of cancer stem cell-targeting agents and their effect on tumour control The 14 th International Workshop on Radiation Damage to DNA, Melbourne, Australia, March (2016) 10. L. Marcu, D. Marcu, Modeling the effect of symmetrical division of cancer stem cells on tumour response to radiation ICTR-PHE Conference, Geneva, Switzerland, February (2016) 11. L. Marcu, D. Marcu, In silico evaluation of radiobiological hypoxia and its effect on tumour control during radiotherapy Proceedings of the 39 th ARA Congress, Frascati, Rome, Italy, July (2015) 12. L. Marcu, D. Marcu, S. Filip, Cancer stem cells in a hierarchical model of tumour regrowth in five head and neck carcinomas 4

5 World Congress on Medical Physics & Biomedical Engineering, Toronto, Canada, 7-12 June (2015) 13. L. Marcu, Medical physics or how a change in career path becomes a passion World Congress on Medical Physics & Biomedical Engineering, Toronto, Canada, 7-12 June (2015) 14. L. Marcu, The impact of cancer stem cells (CSCs) on radiotherapy outcome: an in silico approach ACPESM WA Branch Meeting, Perth, Australia, May (2015) (Invited talk) 15. L. Marcu, D. Marcu, Monte Carlo simulation of personalised radiotherapy for head and neck cancer driven by tumour growth kinetics ICRR 2015, The 15th International Congress of Radiation Research, Kyoto, Japan, May (2015) 16. L. Marcu, D. Marcu, S. Filip, In silico repopulation model of various tumour cells during treatment breaks in head and neck cancer radiotherapy IEEE, International Conference on Radiation Medicine, Dubai, UAE, March (2015) 17. D. Marcu, L. Marcu, In silico growth of a hypoxic head and neck tumour including angiogenic processes The 60 th Annual Meeting of the Radiation Research Society, Las Vegas, Sept (2014) 18. L. Marcu, The influence of repopulation mechanisms on treatment gap timing in head and neck cancer radiotherapy Workshop: Biological basis of radiotherapy where do we stand? Stockholm, 4-5 Sept (2014) 19. L. Marcu, D. Marcu, In silico simulation of tumour radiobiology towards individualised treatment The 3 rd International Congress on Personalised Medicine (UPCP), Prague, June (2014) 20. L. Marcu, The effect of abortive division as a repopulation mechanism on head and neck cancer radiotherapy ESTRO 33, Vienna, Austria, 4-8 April (2014) 21. L. Marcu, D. Marcu, S. Filip, O. Straciuc, The implementation of tumour-specific radiobiological parameters in a head & neck tumour growth model, International Conference on Sciences, Băile Felix, 8-9 November (2013) 22. O. Straciuc, C. Oncu, Zs. Lengyel, Diagnosticul imagistic modern al cancerului prostatic, International Conference on Urology, Gynecology and Urogynecology UroGyn, Oradea November (2013) 5

6 II.4. Prezentări la conferințe naționale 1. A. Dinu, O. Straciuc, FDG-PET as an imaging biomarker in head and neck carcinomas Al 2-lea Congres Național de Oncologie Medicală și Radioterapie, Sinaia, Oct (2014) 2. O. Straciuc, C. Oncu, Diagnosticul imagistic modern al cancerului, Conferința Ar-Medica, Arad, 2-4 Noiembrie (2013) II.5. Cărți /capitole de specialitate internaționale / reviste ISI număr special 1. L. Marcu (editor), Contemporary Issues in Head and Neck Cancer Management InTech Publishing, ISBN: (2015) 2. L. Marcu, E. Bezak, I. Toma-Dasu, A. Dasu (editors), Predictive Models Of Tumour Response To Treatment Using Functional Imaging Techniques (Special issue journal) Computational and Mathematical Methods in Medicine, ISSN: X (2015) 3. L. Marcu, I. Toma-Dasu, A. Dasu, The 6 Rs of head and neck cancer radiotherapy (book chapter) In: ed. L. Marcu, Contemporary issues in head and neck cancer management, InTech Publ., ISBN (2015) II.6. Lucrări / articole în pregătire 1. L. Marcu, D. Marcu, Hyper- versus hypofractionated radiotherapy in a radioresistant head and neck cancer model 2. L. Marcu, D. Marcu, Targeting cancer stem cells and their niche in advanced head and neck carcinomas using an in silico approach II.7. Teză Disertație, Universitatea din Oradea, Specializarea Fizica Explorărilor și Terapiilor Biomedicale (sesiunea iulie 2014) Titlul tezei: FDG-biomarker în diagnosticul imagistic al formațiunilor tumorale maligne din sfera capului și gâtului Masterand: Ancuța Dinu Coordonatori științifici: prof.univ.dr. Loredana Marcu & conf.univ.dr. Oreste Straciuc 6

7 III. Descrierea realizărilor științifice obținute oct 2013 dec 2013 Proiectul de față își propune realizarea unui model virtual complex al unei tumori tipice de cap și gât precum și simularea tratamentului radioterapeutic, conform protocoalelor internaționale de tratament pentru carcinoamele avansate de cap și gât. În cercetări anterioare am realizat un model virtual de bază care a incorporat o serie de parametri biologici și radiobiologici specifici creșterii și dezvoltării unei tumori de cap și gât. Unele procese însă, nu au fost incluse în modelul de bază, prin urmare scopul proiectului de față constă în cuprinderea elementelor radiobiologice principale care influențează răspunsul tumorii la radiația ionizantă urmând ca în final să se evalueze răspunsul tumorii virtuale la tratamentul cu radiație. Repopularea celulară și hipoxia sunt factori cheie în ceea ce privește comportamentul tumorii și succesul tratamentului cu radiație. Mecanismele de repopulare tumorală trebuie să fie cuprinse în modelul de bază, pentru a putea analiza evoluția tumorii de-a lungul tratamentului. Un element important cu care ne-am ocupat în această primă fază a proiectului a fost studiul amănunțit al literaturii de specialitate cu privire la mecanismele de repopulare ale celulelor scuamate din componența tumorilor de cap și gât. Mecanismele de repopulare tumorală care au fost puse în evidență experimental sau semiempiric sunt următoarele: recrutarea celulară, diviziunea abortivă, repopularea accelerată a celulelor stem și pierderea diviziunii asimetrice a celulelor stem (Withers 1993, Dörr 1997) (tabelul 1 include definițiile acestor mecanisme). Tabelul 1. Mecanismele de repopulare tumorală și efectul lor asupra diferitelor tipuri de celule tumorale Mecanismul de repopulare Recrutare celulară Repopulare accelerată Pierderea diviziunii asimetrice Diviziunea abortivă Efect / definiție Recircularea celulelor din faza G0 în cicul celular Scăderea duratei ciclului celular Diviziunea simetrică a celulelor stem în mitoză (adică două celule fiică de tip stem) Număr limitat de diviziune celulară, după care celula devine sterilă Tipul celulei afectate Celule pasive sau neproliferative Celule stem proliferative Celule stem proliferative Celule proliferative diferențiate (cu proliferare finită) În această fază a proiectului am simulat mecanismele de repopulare, punând accent cu precădere pe mecanismul cel mai puțin studiat în literatura de specialitate și anume diviziunea abortivă a celulelor cu proliferare finită și influența acestui mecanism asupra celorlalte fenomene de repopulare tumorală. 7

8 Diviziunea accelerată a celulelor stem și diviziunea abortivă sunt mecanisme controlate de hipoplazia tisulară, pe când pierderea asimetriei în mitoză este un fenomen rezultat în urma epuizării celulelor stem (Dörr 2003). Recrutarea celulelor din faza G0 a ciclului celular este, probabil, cel mai natural și mai la îndemână mecanism de repopulare, datorită existenței celulelor neproliferative din afara ciclului mitotic care prin stimuli specifici (cum ar fi radioterapia sau chimioterapia) pot reintra în ciclul celular și contribui astfel la procesul de diviziune celulară. Cu toate că existența acestui mecanism în cadrul tumorilor este unanim acceptată de comunitatea științifică, datele cantitative cu privire la tipurile și cantitatea de celule recrutate lipsesc din literatura de specialitate. Tubiana (Tubiana 1988) a arătat că într-o populație tumorală netratată de celule hematopoietice, proporția de celule stem recirculate este sub 2% din numărul total de celule. Deoarece rata de proliferare a cancereor hematologice este mult mai mare decât cea a malignităților solide, limita de 2% de celule stem recrutate poate reprezenta o limită superioară în tumorile solide. Modelarea in silico a tumorilor de cap și gât cu considerentele de mai sus a fost realizată de către directorul de proiect pentru a elucida rolul și contribuția acestui mecanism de repopulare (Marcu 2004). Am arătat că recrutarea celulară este un mecanism mai slab decât repopularea accelerată a celulelor stem sau decât lipsa diviziunii asimetrice a celulelor stem, indiferent de numărul de celule recrutate. În radioterapie, repopularea accelerată și mecanismul de diviziune simetrică a celulelor stem sunt anihilate prin creșterea dozei de radiație (Dörr 2009). Diviziunea abortivă poate, de asemenea, interacționa cu răspunsul clinic, prin rebalansarea pierderii continue a celulelor prin tratamentul cu radiație. Astfel, este nevoie de o analiză cantitativă a acestui mecanism pentru a evalua impactul său asupra creșterii tumorale induse de tratament. La ora actuală nu există date în literatura de specialitate cu privire la influența diviziunii abortive, doar a mecanismelor legate de repopularea celulelor stem (Trott 1999, Marcu 2004, Marcu 2010, Harriss-Phillips 2011). Pentru a evalua mecanismul de repopulare în cauză, s-a simulat întâi creșterea tumorii virtuale de cap și gât având în componență trei categorii de celule care pot influența dezvoltarea și comportamentul tumorii: celule stem, celule cu proliferare finită și celule neproliferative (cele din faza G0). Celulele proliferative se divid de un număr finit de ori (doar câteva generații) proces care poartă numele de diviziune abortivă. Pentru a obține o tumoră virtuală cu proprietăți similare celei reale, creșterea tumorii trebuie să fie ghidată de parametri cinetici bine definiți, cum ar fi: durata ciclului celular, lungimea/durata fiecărei faze a ciclului celular, rata de creștere, volumul de dublare tumorală și, nu în ultimul rând, procentul de celule din fiecare categorie sus-amintită. Astfel, am realizat un studiu cu privire la numărul maxim de diviziuni prin care poate trece o celulă proliferativă fără a altera caracteristicile cinetice ale tumorii. Modelarea in silico a arătat că un număr mai mare de 3 diviziuni succesive ale unei celule proliferative conduce la o rată de creștere nerealistă din punct de vedere biologic. Cum volumul mediu de dublare tumorală a cancerelor de cap și gât este de 45 de zile, am arătat că 8

9 numărul maxim de generații noi create în urma diviziunii unei celule proliferative pentru care tumora se încadrează în rata de creștere biologic validă este de 3 (figura 1). Orice număr de generații peste 3, după cum reiese și din figura 1, ar rezulta într-un timp de dublare volumică foarte scurt nefiind în concordanță cu realitatea. No of cells 1.E+13 1.E+11 1.E+09 1.E+07 1.E+05 1.E+03 1.E No of generations Figura 1. Numărul de celule tumorale în funcție de numărul de generații atribuite celulelor cu proliferare finită. O altă observație a simulării se referă la raportul dintre procentul de celule proliferative (P) versus stem (S) în timpul activării mecanismelor de repopulare celulară, și anume, raportul (P/S) crește cu durata/lungimea ciclului celular al celulelor stem atunci când mecanismul de repopulare accelerată este activat. Creșterea este chiar supra-liniară (figura 2), ceea ce înseamnă că repopularea prin diviziune abortivă depășește pe aceea cauzată de celulele stem. Pe de altă parte, în cazul ciclurilor mitotice scurte (sub 10 ore) raportul P/S descrește de-a lungul tratamentului cu până la 12%, ceea ce indică o scădere a contribuției mecanismului de diviziune abortivă în comparație cu repopularea prin celule stem. Cu toate acestea, atunci când durata medie a ciclului celular este de 33 de ore (adică media caracteristică tumorilor de cap și gât), raportul P/S este aproape constant de-a lungul tratamentului (figura 2). Figura 2. Raportul de celule proliferative versus stem (P/S) în funcție de durata ciclului celular al celulelor stem. 9

10 Am arătat că pe lângă mecanismele de repopulare specifice celulelor stem, celulele proliferative cu potențial finit de proliferare pot contribui la creșterea tumorală. De asemenea, raportul P/S este puternic dependent de durata ciclului celular al celulelor stem, sugerând faptul că ar exista un efect sinergetic între repopularea accelerată și mecanismul de diviziune abortivă a celulelor cu proliferare finită. Cercetarea din această primă fază a proiectului a condus la rezultate cu privire la relația de legatură dintre variate mecanisme de repopulare tumorală specifice carcinoamelor de cap și gât și posibilul impact asupra răspunsului tumoral, urmând ca în fazele următoare, să studiem a doua mare componentă care dictează rezultatul tratamentului cu radiație, și anume hipoxia tumorală. ian 2014 dec 2014 În această etapă s-a urmărit răspunsul tumorii avasculare la efectul radiației cu/fără chimioterapie, urmând ca implementarea parametrilor referitori la hipoxie, să permită apoi evaluarea răspunsului tumorii vasculare și hipoxice. A. Mecanismele de repopulare tumorală care au fost puse în evidență experimental sau semi-empiric sunt următoarele: recrutarea celulară, diviziunea abortivă, repopularea accelerată a celulelor stem și pierderea diviziunii asimetrice a celulelor stem (Withers 1993, Dörr 1997). Diviziunea accelerată a celulelor stem și diviziunea abortivă sunt mecanisme controlate de hipoplazia tisulară, pe când pierderea asimetriei în mitoză este un fenomen rezultat în urma epuizării celulelor stem (Dörr 2003). În radioterapie, repopularea accelerată și mecanismul de diviziune simetrică a celulelor stem sunt anihilate prin creșterea dozei de radiație (Dörr 2009). Diviziunea abortivă poate, de asemenea, interacționa cu răspunsul clinic, prin rebalansarea pierderii continue a celulelor prin tratamentul cu radiație. Astfel, este nevoie de o analiză cantitativă a acestui mecanism pentru a evalua impactul său asupra creșterii tumorale induse de tratament. Până în momentul începerii proiectului nu existau date în literatura de specialitate cu privire la influența diviziunii abortive, doar a mecanismelor legate de repopularea celulelor stem (Trott 1999, Marcu 2004, Marcu 2010, Harriss-Phillips 2011), motiv pentru care acest tip de repopulare a fost amplu studiat în cadrul acestui proiect iar rezultatele obținute au fost publicate în revista ISI Cell Proliferation (Marcu 2014a) iar altele prezentate la conferința internațională ESTRO 33, Viena, Mecanismele de repopulare au un impact major asupra răspunsului tumorii la radioterapie și chimioterapie. Astfel, următorul pas în cadrul proiectului a fost studiul efectului repopulării asupra programării întreruperilor tratamentului cu radiație. Întreruperea sau pauza de tratament în cazul protocoalelor agresive pentru pacienții cu tumori de cap și gât se practică pentru a oferi țesutului sănătos timp de reparare a leziunilor ADN-ului și de recreștere/repopulare a țesutului normal. Folosind formalismul liniar-pătratic de supraviețuire celulară: S = e!!"!!!!, unde S reprezintă populația de celule supraviețuitoare, D reprezintă doza totală de radiație iar α și β sunt coeficienți specifici tumorali ce caracterizează radiosensibilitatea țesutului, s-au simulat, asupra tumorii virtuale, tratamente de radioterapie alterată (non-convențională) pe baza trialului RTOG (Radiation Therapy and Oncology Group): 1.6 Gy/fracție, de 2 ori pe zi, la 6 ore diferență, 5 zile pe săptămână și un număr total de 42 de fracțiuni de doză. Folosind modelul liniar-pătratic din radiobiologie, s-au simulat trei timpi diferiți pentru întreruperea 10

11 tratamentului și anume: după 20, 24 și 28 de fracțiuni de doză. Au fost monitorizate atât celulele stem cât și cele diferențiate, iar contribuția acestora la repopularea tumorală analizate (rezultate prezentate la Workshop: Biological basis of radiotherapy where do we stand? Stockholm, 2014). Datorită activării mecanismelor de repopulare pe parcursul tratamentului radioterapeutic, există o creștere procentuală semnificativă atât a celulelor stem (%S) cât și a celulelor diferențiate (%P) care contribuie la dezvoltarea continuă a tumorii. Dacă înainte de începerea tratamentului tumora a inclus 6% celule stem și 10% celule diferențiate, de-a lungul radioterapiei, ambele procentaje au crescut drastic, creștere care a depins și de momentul la care a avut loc întreruperea tratamentului în vederea refacerii țesutului sănătos. Astfel, procentul celulelor stem a variat de la 41.3% (pentru pauza după 20 fracții de doză) la 36.6% (pentru pauza după 28 fracții de doză). În cazul celulelor diferențiate, procentul lor a variat de la 30.5% (pentru pauza după 20 fracții de doză) la 33.7% (pentru pauza după 28 fracții de doză) (figura 1). O observație interesantă este faptul că procentul de celule stem descrește odată cu întârzierea întreruperii tratamentului. Acest lucru se explică prin faptul că prin întreruperea timpurie nu au loc pierderi celulare suficient de mari în rândul celulelor stem pentru un control tumoral adecvat. Comportamentul celulelor diferențiate pare a fi opus, ceea ce oferă astfel perderi celulare constante de-a lungul tratamentului. Percentage of cells % S % P After 20 fx After 24 fx After 28 fx Timing of treatment gap Figura 1. Influența momentului de întrerupere a tratamentului cu radiație asupra celulelor stem (S) respectiv diferențiate (P). Modelul virtual a arătat că atât celulele stem cât și cele diferențiate contribuie la repopularea tumorii pe parcursul tratamentului. Acest lucru se observă din curbele de supraviețuire celulară ilustrate în figura 2. Diferența esențială între contribuția celor două categorii de celule constă în faptul că diviziunea limitată (adică numărul limitat de generații) a celulelor diferențiate duce, în ultimă instanță, la extincția lor de-a lungul iradierii, pe când celulele stem, având proprietatea de imortalitate, pot recrește tumora, chiar și de la o singură celulă stem. Astfel, pentru eradicarea acestora, tratamentul cu radiație necesită ajustări care să țină cont de abilitatea de proliferare rapidă a tumorilor de cap și gât. 11

12 Stem cells Differentiated cells 1.E+04 Number of cells 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E Treatment time (days) Figura 2. Curbele de supraviețuire celulară ale populațiilor de celule stem și diferențiate sub efectul tratamentului accelerat cu radiație și întreruperea tratamentului după 20 de fracții de doză. B. Tumorii de cap și gât crescute in silico (figura 3 și 3a) i s-au atribuit parametrii care descriu starea de oxigenare a tumorii (Marcu 2014b), care sunt reprezentați prin po2 (presiunea parțială a oxigenului), gradientul oxigenului și distanța de difuzie de la capilar la celulă. Valorile și principalele caracteristici ale tumorii hipoxice sunt trecute în tabelul 1 iar schema logică de dezvoltare a tumorii în figura 4. Figura 3. Ilustrarea grafică a distribuției celulelor tumorale de cap și gât crescute in silico. Figura 3a. Imaginea mărită a unei secțiuni tumorale, unde cu roșu sunt reprezentate celulele stem, cu verde cele diferențiate iar cu portocaliu celulele neproliferative. În vederea simulării dezvoltării spațiale a tumorii, au fost incluse și celule endoteliale, care sunt stimulate de lipsa oxigenului celular să pornească procesul de angiogeneză tumorală (rezultate prezentate la The 60 th Annual Meeting of the Radiation Research Society, Las Vegas, Sept. 2014). 12

13 Tabel 1. Proprietățile tumorii hipoxice de cap și gât crescute in silico Proprietăți / caracteristici Compoziția celulară (calitativă) Compoziția celulară (cantitativă) Celule tumorale Celule vasculare Celule tumorale Cuantificarea Stem Diferențiate Neproliferative Endoteliale 2.6 % stem 12 % diferențiate 85.4% neproliferative 33 ore Durata medie a ciclului celular Variația duratei medii a ± 10% din ciclul celular mediu ciclului ceular Durata diferitelor faze M (7%), G1 (40%), S (30%), Cinetica tumorală ale ciclului celular G2 (23%) Timpul de dublare 53 zile volumetrică Factorul de pierdere 85% celulară De la 20% (în apropierea Oxigenarea tumorală po 2 vaselor de sânge) la 0.3% Figura 4. Schema logică a creșterii tumorii hipoxice 13

14 Imagistica PET/CT joacă un rol crucial în tratamentul tumorilor de cap și gât datorită informațiilor pe care le poate furniza cu privire la malignitatea acestor tumori, stadiul tumoral și, nu în ultimul rând, informații ce privesc agresivitatea tumorală care în multe situații este strâns legată de nivelul de oxigenare. Pentru obținerea acestor detalii, un număr de 40 de leziuni maligne de cap și gât, de la pacienți scanați la Centrul PET Diagnosztika din Oradea au fost studiate și analizate. În urma examinării acestor imagini, s-a observat că formațiunile tumorale local-avansate sunt cele mai numeroase (65%). Un parametru important care a fost investigat a fost SUV (Standardised Uptake Value). SUV nu este o mărime echivalentă cu radiodensitatea dată de unitățile Hounsfield din imagistica CT sau încărcarea post-contrast. Cantitatea de FDG (fluoro-deoxiglucoză) care se fixează în tumoră / organism în urma injectării radiofarmaceuticului depinde de metabolismul glucidic caracteristic fiecărui organ, ceea ce atrage după sine și modificări ale parametrului SUV. Acest parametru specific FDG-PET este un indice fizico-biologic care oferă informații despre agresivitatea tumorii și activitatea metabolică tumorală. Acest lucru reiese și din figura 5, unde s-a reprezentat evoluția SUV pre-tratament și de-a lungul tratamentului la un pacient care a avut 4 examinări PET. Valorile SUV ridicate (și în continuă creștere de-a lungul examinărilor) denotă agresivitatea tumorii și rezistența sa la tratamentul radio- și chimioterapeutic. Un astfel de comportament tumoral este adesea pus pe seama hipoxiei tumorale, care împiedică eficiența tratamentului cu radiație datorită radiorezistenței celulelor hipoxice și a tratamentului chiomioterapeutic datorită perfuziei neadecvate a agentului medicamentos. FDG poate fi considerat astfel, un marker al nivelului de proliferare tumorală in vivo SUV Numar examinari PET Figura 5. Evoluția SUV tumoral în cursul unor examinări succesive ale unui pacient cu tumoră de cap și gât tratat cu radiație și chimioterapie. Valorile crescute ale SUV în cazul pacienților care prezintă tumori radiorezistente explică, de asemenea, efectul hipoxiei tumorale asupra metabolismului glucozei. Această observație este în concordanță cu rezultatele studiilor clinice raportate în literatură, conform cărora, tumorile hipoxice tind spre valori crescute ale SUV (> 9) (Zimny 2006). Tumorile de cap și gât sunt adesea hipoxice și prezintă, în afară de zona de hipoxie cronică și zone cu hipoxie acută care se datorează blocajului temporal al capilarelor formate prin angiogeneză tumorală (Marcu 2014b). Acestea prezintă un aspect neregulat, aleator, datorită instabilității spațio-temporale ale regiunilor cu hipoxie acută. Cu aceste considerente, în modelul in silico oxigenarea celulelor depinde de distanța până la cel mai apropiat capilar, iar gradientul po2 stimulează celulele endoteliale pentru a forma noi vase de sânge în direcția zonelor hipoxice. Datorită cineticii celulare, vasele nou formate pot fi strangulate, moment în care regiunea respectivă devine acut hipoxică. Pe acest model hipoxic se va simula, în etapa următoare, efectul radioterapiei. 14

15 ian 2015 dec 2015 Obiectivul major al proiectului de față este creșterea in silico a unei tumori virtuale de cap și gât urmată de modelarea răspunsului tumoral la tratamentul cu radiație. În cadrul simulării răspunsului la radioterapie, este nevoie de implementarea parametrilor care duc la creșterea accelerată a celulelor tumorale în timpul tratamentului precum și a condițiilor de oxigenare tumorală, condiții care pot schimba semnificativ efectul radiației asupra tumorii. Fiind factori cheie în comportamentul tumorii și al succesului tratamentului cu radiație - repopularea celulară și hipoxia au fost ținta cercetării și a modelării. Astfel, evoluția proiectului a urmat două căi: 1. Cea de studiu și simulare a mecanismelor de repopulare celulară în decursul tratamentului cu radiație 2. Cea de studiu și simulare a proceselor legate de hipoxia tumorală și distribuția hipoxiei în tumoră. Pentru realizarea obiectivelor acestui an (ajustarea și validarea modelului conform datelor clinice) am realizat un studiu al efectului variației inter-pacient asupra răspunsului la tratament, adică impactul cineticii de creștere tumorală, a hipoxiei și a fracției de celule stem canceroase (CSC) asupra răspunsului la tratament (obiectivul 1). Datorită faptului că tumorile ORL sunt puternic heterogene din punctul de vedere al conținutului și distribuției hipoxice, precum și datorită lipsei abilității FDG-ului de a cuantifica hypoxia în aceste tumori, am efectuat o meta-analiză a tuturor studiilor PET/CT publicate în ultimul deceniu care au implementat radiotrasori specifici hipoxiei pentru imagistica tumorilor ORL (obiectivul 2). Rezultatele / concluziile au fost folosite în continuare pentru optimizarea și validarea modelului. Nevoia de cuantificare a hipoxiei tumorale Datorită faptului că tumorile sunt entități neomogene, având subpopulatii de de celule hipoxice radiorezistente, doza administrată în decursul radioterapiei ar trebui să fie neuniformă pentru a permite escalarea dozei în regiunile hipoxice și reducerea dozei în zonele de radiorezistență scăzută. Radioterapia țintită pe hipoxie folosește tehnica dose painting având potențialul de a crește doza tumorală fără a crește complicațiile țesutului sănătos. Modelarea biologică folosind imagistica moleculară specifică hipoxiei este puternic încurajată pentru progresul tratamentului individualizat și pentru implementarea sistemelor de planificare a tratamentului având bază biologică (Marcu 2014a, Jennings 2015). Astfel, se pune problema corelării cantitative între parametrii imagistici și caracteristicile tumorale. Acest obiectiv are în vedere cuantificarea proprietăților statistice ale subvolumelor tumorale hipoxice în cancerele ORL având la bază imagistica PET, precum și impactul acestor subcategorii de celule asupra răspunsului tumorii la tratamentul chimio-radioterapeutic convențional. Meta-analiza datelor PET având la bază radiotrasori specifici hipoxiei tumorale (Chirla & Marcu 2015) În tumorile de cap și gât (ORL), cei mai utilizați radiotrasori specifici hipoxiei sunt F-FMISO și mai recent, F-FAZA, pe când alți marker utilizați pentru aceste tumori, cum ar fi F-FETNIM, Cu- 15

16 ATSM, F-EF3, F-EF5 și F-HX4, sunt reprezentați foarte slab în literatura de specialitate. Markerii PET hipoxici trebuie să se acumuleze în țesutul hipoxic și să fie eliminați eficient din țesuturile nehipoxice. Imaginile F-FAZA prezintă un raport tumoră-semnal de fond mai mare decât F-FMISO, datorită unei eliminări mai rapide ale trasorului din țesutul nehipoxic. Alți trasori ce prezintă potențial în imagistica hipoxiei prin PET sunt: Cu-ATSM, F-FETNIM și F- HX4. 62-Cu-ATSM prezintă cel mai bun contrast, în mai puțin de 30 minutes post-injectare. EF3 are o eliminare rapidă din țesutul normal comparativ cu EF5, iar metaboliții acestui trasor contribuie mult mai puțin la semnal decât în cazul FETNIM, FAZA și FMISO. Prin compilarea datelor clinice a sute de pacienți diagnosticați cu tumori ORL, dar încă netratați (vezi Tabelul 1), am observat că în medie 73% din totalul cancerelor ORL sunt hipoxice după cum reiese din imagistica PET. Cum marea majoritate a pacienților prezintă tumori primare sau nodale, am determinat fracțiile hipoxice relativ la numărul tumorilor. Table 1. Frecvența hipoxiei și impactul asupra răspunsului la tratamentul standard. În acolade s-a reprezentat numărul de tumori / pacienți considerați. Trasor PET Fracția de pacienți hipoxici Fracția de tumori hipoxice primare Fracția de tumori hipoxice nodale Fracția de tumori hipoxice* Fracția de eșec în pacienți nehipoxici Fracția de eșec în pacienți hipoxici Raportul eșecurilor în pacienți hipoxici/ nehipoxici Sursa F-FMISO F-FAZA 0.74 {207} 0.72 {79} 0.58 {113} 0.69 {68} 0.66 {58} 0.57 {56} 0.54 {169} 0.63 {124} {65} 0.59 {97} 4.1** 0.07 {14} 0.40 {26} 5.7 Lee et al Tachibana et al Kikuchi et al Hendrickson et al Rajendran et al Dirix et al Rischin et al Yasuda et al Sato et al Zips et al Norikane et al Postema et al Grosu et al Servagi-Vernat et al Mortensen et al Minagawa et al Sato et al 62-Cu ATSM {40} {16} 0.64 {24} 4.7 F-FETNIM {19} - Lehtio et al F-EF Komar et al {6} 0.47 {16} - {22} F-HX Chen et al {10} {12} Zegers et al Total Nr. tumori Nr pacienți *Doar studii care au inclus ambele tipuri de tumori **S-au exclus pacienții tratați cu tirapazamină (agent sensibilizator al celulelor hipoxice). 16

17 Pacienții cu tumori hipoxice tratați cu chimio-radioterapie standard au fost, în medie, de 4,6 ori mai expuși la eșec decât pacienții cu tumori oxigenate. În timpul tratamentului standard cu radiație are loc o reoxigenare celulară considerabilă după cum se observă și în Tabelul 2 din care s-au exclus pacienții cu tumori nehipoxice și s-au analizat datele provenite de la pacienți cu cel puțin o tumoră hipoxică ORL. HV-P, HV-N și HVall reprezintă volumele hipoxice pentru tumorile primare, nodale respectiv ambele tipuri. Scanurile de la mijlocul tratamentului au fost realizate în perioada dintre sfârșitul celei de-a doua săptămâni și a cincea săptămână de radioterapie, prin urmare există o variație considerabilă între rezultate. Tabel 2. Volumul hipoxic pre- și mid-tratament in pacienți cu tumori hipoxice. În acolade s-a reprezentat numărul de tumori / pacienți considerați. Trasor PET F-FMISO F-FAZA HV-P (ml) baseline media (median)* 8.2 (3.4) {44} 9.8 (4.5) {46} Raport HV-P media mid/pre terapie (mediana) HV-N (ml) baseline media (mediana) Raport HV-N media mid/pre terapie (mediana) (0.08) {14} 11.5 (3.4) {32} 0.11 (0.0) {5} HV-all (ml) baseline average (mediana)** 15.2 (8.1) {18} 10.5 (3.8) {78} Raport HV-all media mid/pre terapie (mediana) 0.07 (0.004) {8} 0.17 (0.03) {23} Raport pacienți hipoxici mid/pre terapie 0.27 {92} 0.52 {23} Sursa Choi et al Lee et al Hendrickson et al Chang et al Dirix et al Rischin et al Figueiredo et al Zips et al Bittner et al Okamoto et al Lin et al Grosu et al Servagi-Vernat et al Mortensen et al Bollineni et al F (4.5) 3.6 (1.4) 10.7 (3.6) - - FETNIM {18} {9} {27} - - Lehtio et al 6.0 (1.2) F-EF5 {16} Komar et al F-HX4 6.5 (2.3) {6} Zegers et al Total 9.6 (3.6) 0.23 (0.08) 9.8 (2.5) 0.11 (0.0) 11.0 (4.0) 0.15 (0.01) 0.32 Deviația standard Gama de valori 0.67 Nr. tumori Nr. pacienți * Doi pacienți cu HV-P > 157 ml au fost excluși ** Doar studii care au inclus ambele tipuri de tumori. Unele studii au prezentat doar cel mai mare HV. 17

18 În Figurile 1 și 2 sunt reprezentate distribuțiile statistice ale fracțiilor hipoxice (HF) (excluzând tumorile nehipoxice) compilate dintr-un număr mare de surse. Se observă o tendință spre fracțiuni mici, când volumul tumoral GTV este deliniat pe baza imagisticii CT, distribuția HF prezentând o descreștere exponențială, indiferent de tipul de trasor folosit sau de originea tumorii (primară sau nodală). Figura 1. Distribuția statistică a fracției hipoxice (HF), măsurată prin PET și CT, excluzând tumorile nehipoxice, pentru: (a) F-FMISO și (b) F-FAZA pentru toate tumorile, (c) F-FAZA pentru tumorile primare și (d) F-FAZA pentru tumorile nodale. 18

19 Figura 2. Distribuția statistică a fracției hipoxice (HF), măsurată prin PET și F-FDG PET, excluzând tumorile nehipoxice, pentru: (a) F-FMISO și (b) F-FETNIM, toate tumorile. Nu s-a observat o corelație semnificativă între SUV maxim și volumul hipoxic fracțional (folosing delinierea prin CT) în cazul folosirii radiotrasorului F-FAZA PET. S-a găsit, însă, o corelație puternică (r = 0.96) între valoarea SUV mediană T/M (tumour to muscle ratio) și HF, așa după cum reiese din Figura 3. Figure 3. Corelarea fracției hipoxice și a valorii mediane SUV T/M (tumoră/mușchi) măsurată prin F-FAZA PET in tumorile primare, excluzând tumorile nehipoxice. Coeficientul de corelație Pearson, r, este prezentat în imagine. S-au procesat datele din diferite studii realizate cu F-FAZA pentru verificarea legăturii dintre HF și volumul tumoral GTV (Figura 4), fără însă a se observa vreo corelație. Tumorile mai mari tind să prezinte o fracție hipoxică similară tumorilor de dimensiuni mai mici. Figura 4. Corelarea fracției hipoxice și a volumului tumoral GTV măsurat prin F-FAZA PET și CT pentru toate tumorile hipoxice. Coeficientul de corelație Pearson, r, este prezentat în imagine. Graficul echivalent F-FMISO duce la concluzii similare, dar datele prezintă o statistică mai redusă. 19

20 Sumar: S-a efectuat o meta-analiză a tuturor datelor clinice din literatura de specialitate pe trasorii PET specifici hipoxiei și s-au extras datele relevante pentru statistica distribuției voxelilor hipoxici din imaginile PET, a comportamentului tumoral în timpul chimioradioterapiei și corelarea cu rezultatul tratamentului. O proporție mare de tumori ORL sunt hipoxice (vezi Tabelul 1) și cu toate că prezintă un răspuns semnificativ la tratament (vezi Tabelul 2), probabilitatea de eșec al tratamentului este de 4,6 ori mai mare decât în cazul tumorilor nehipoxice. S-a analizat distribuția fracției hipoxice pentru diferiți trasori și tipuri tumorale (primar vs nodal) și s-a ajuns la concluzia că izolarea volumului tumoral metabolic activ este eficient în vederea excluderii voxelilor nehipoxici din tumorile scanate. Fracția hipoxică se corelează cu raportul median al SUV tumoră-mușchi pentru un prag T/M prestabilit. Cu toate acestea, HF nu se corelează cu volumul tumoral GTV, sugerând faptul că dimensiunea tumorală deliniată de CT nu influențează procentul de voxeli hipoxici.. Modelul optimizat de tumoră ORL (de cap și gât) hipoxică Considerând rezultatele de mai sus, modelul a fost optimizat pentru diferite nivele ale hipoxiei radiobiologice, de la hipoxie severă (3 mmhg) până la oxigenare (10 mmhg), cu un raport de intensificare al oxigenului (OER) egal cu 3. Radiorezistența celulelor hipoxice a fost cuantificată prin parametrul SFhypoxic care reprezintă fracția de supraviețuire a celulelor hipoxice și este exprimată în funcție de raportul de intensificare al oxigenului și al fracției de supraviețuire a celulelor oxice (normoxice) corespunzătoare fiecărei faze a ciclului celular (rezultate prezentate la The 39 th ARA Congress, Frascati, July 2015). Astfel: SF!"#$%&' = 1 1 SF!"#$"%&' OER Alături de hipoxie, modelul consideră și populația de celule stem canceroase (Marcu 2004, 2010, 2014b, 2015) (rezultate prezentate la World Congress on Medical Physics & Biomedical Engineering, Toronto, June 2015). Prima identificare a celulelor stem canceroase (CSC) în tumorile ORL este legată de munca lui Prince et al (2007) care a reușit să izoleze o subgrupă de celule prezentând proprietăți tipice celulelor de tip stem (sușe). Până în prezent, numărul de rapoarte cantitative referitoare la CSC în tumorile ORL este foarte redus. Rezultatele arată că există diferențe semnificative între studii. Astfel, în experimentele conduse de Tang et al. (2013) proporția de CSC în diferite linii celulare ORL variază între 1.7% și 13.5%. Un alt experiment similar condus de Harper et al. (2007) a arătat că proporția de CSC în linia celulară CaLH3 este de 12.3%. Acest număr limitat de studii cantitative ale CSC în tumorile ORL pot însă asista la analiza in silico ale diferitelor efecte asupra răspunsului tumoral și comportamentului din timpul tratamentului ale fracțiilor/proporțiilor de CSC. Pentru studiul variabilității inter-pacient a răspunsului la tratament, s-au dezvoltat trei grupe tumorale ORL cu cinetici de creștere diferite (moderată, medie și rapidă) (figura 5 și tabelul 3) (rezultate preliminare au fost prezentate la The 15th International Congress of Radiation Research, Kyoto, May 2015). Ierarhia celulelor tumorale are următorul aranjament: (1) celule stem canceroase (CSC) care se pot divide atât simetric cât și asimetric, (2) celule diferențiate, care au o viață mai scurtă și nu au proprietăți de tip stem (3) celule pasive, care sunt localizate în afara ciclului celular. Ca rezultat al unor iterații multiple, s-a ajuns la valoarea de 1.9 ca și probabilitate de diviziune simetrică a CSC astfel ca tumora in silico să respecte caracteristicile de creștere ale unei tumori ORL biologice. Cu fiecare generare de noi celule, atât celulei mame cât și celulei fiice li se alocă o durată a ciclului celular. Valorile ciclului celular sunt create 20

21 conform unei distribuții gaussiene asimetrice truncate la o deviație standard spre valorile mai mici și două deviații standard spre valorile mai mari (figura 6). Cells 20cct Cells 33cct Cells 60cct Number of tumour cells 1.E+06 1.E+04 1.E+02 1.E Growth 1me (days) Figura 5. Creșterea exponențială a trei grupe de tumori ORL având cinetici de creștere diferite. Figura 6. Distribuția Gaussiană a ciclului celular (cct) în jurul valorii medii pentru tumora cu o durată medie a ciclului celular de 20h. Durata ciclului celular este reprezentată pe abscisă iar numărul de celule tumorale pe ordonată. Tabel 1. Parametri de creștere tumorală conform modelului in silico Parametru Tumora 1 Tumora 2 Tumora 3 Date literatură (gama valori) [sursa] Durata fazei S 11 h 6.67 h 11 h 20 h 13.7 h ( ) [Tannock 1998] Durata medie a ciclului celular (gama valori) 33 h (20-60) [Forster 1992] 20 h (12 36) 33 h (20 60) 60 h (36-108) 21

22 Timp de dublare în volum Index de marcare (labelling index) Rata de diviziune celulară (24h) Procentul de celule stem tumorale pretratament Factor de pierdere celulară 31 d 52 d 96 d 4.71% 4.69% 4.67% 2.3% 1.3% 0.74% 5.37% 5.42% 5.36% 85% 45 d (33-150) [Tannock 1998] 8% (1.2-30) [Forster 1992] - (derivat din model) - (derivat din model) 85% [Wigg 2001] S-a simulat tratamentul hiperfracționat asupra tumorii virtuale (1.2Gy de două ori pe zi, 5 zile pe săptămână, 7 săptămâni, doza totală de 84Gy) crescute în condiții diferite de hipoxie și având fracții diferite de celule stem tumorale. Modelul in silico a arătat că există un efect sinergetic puternic între hipoxia tumorală și fracția de celule stem tumorale (rezultate preliminare au fost prezentate la ACPESM WA Branch Meeting, Perth, Australia, May 2015 în cadrul unei prezentări invitate). Mai mult, modelul a demonstrat că cinetica creșterii tumorale în cadrul tumorilor cu aceeași histopatologie, influențează, de asemenea, răspunsul tumorii la tratament. Astfel, tumorile ORL cu creștere mai lentă, prezintă o dependență liniară cu nivelul hipoxiei / al fracției celulelor stem tumorale, în timp ce tumorile ORL cu o proliferare rapidă, prezintă o creștere exponențială cu nivelul hipoxiei / al fracției celulelor stem tumorale (figurile 7 și 8). Number of 1.2Gy fractions for tumour kill 60 cct 33 cct 20 cct % 2% 4% 6% 8% 10% 12% Probability of CSC symmetrical division Figura 7. Interacțiunea dintre cinetica de creștere și tiparul de diviziune a celulelor stem tumorale pentru tumorile cu hipoxie redusă (9mmHg). 22

23 Number of 1.2Gy fractions for tumour kill 60 cct 33 cct 20 cct % 2% 4% 6% 8% 10% 12% Probability of CSC symmetrical division Figura 8. Interacțiunea dintre cinetica de creștere și tiparul de diviziune a celulelor stem tumorale pentru tumorile cu hipoxie severă (3mmHg). Legenda: CSC = cancer stem cell (celule stem tumorale); cct = cell cycle time (durata ciclului celular) Acest comportament tumoral ar necesita teste predictive înaintea începerii tratamentului tumorilor ORL în vederea realizării unei terapii personalizate. ian 2016 sept 2016 Scopul acestei etape a fost simularea diferitelor protocoale de radioterapie, în vederea evaluării tratamentului optim pe baza considerentelor radiobiologice studiate în fazele anterioare (hipoxia tumorală și populația de celule stem canceroase-csc). Pentru îndeplinirea acestui obiectiv, am realizat un studiu comparativ între diferite protocoale de tratament cu radiație neconvenționale: hperfractionare și hipofractionare. Așa cum am demonstrat în rapoartele și publicațiile anterioare, comportamentul agresiv al tumorilor ORL avansate, se manifestă prin repopularea accelerată a celulelor de tip stem și prin prezența hipoxiei care induce radiorezistență. Aceste procese de obicei duc la eșecul tratamentului cu radiație. Prin alterarea modului de fracționare de la cea convențională la mai multe doze de radiație pe zi (hiperfracționare) sau prin scurtarea duratei de tratament (radioterapia accelerată) s-a arătat că repopularea tumorală este limitată. În ultima vreme, hipofracționarea, care implică fracții mai mari de doză decât tratamentul convențional (> 2Gy), a devenit un protocol foarte popular în rândul anumitor malignități solide, motiv pentru care am ales să simulăm acest protocol pentru tumorile ORL (rezultate prezentate la ESTRO 35 Congress, Turin, Italy, 29 April 3 May, 2016). Patru tipuri de fracționări au fost simulate, așa după cum indică Tabelul 1. Fracțiile de supraviețuire au fost determinate folosind modelul Liniar Pătratic pornind de la dovada biologică care suportă valoarea de 54% a supraviețuirii celulare dupa o doză de 2Gy (SF2). Valoarea radiorezistenței CSC a fost stabilită be baza unor rezultate din literatura de specialitate (Phillips 2006) și adaptată pentru tumorile ORL. 23

24 Tabelul 1. Tipuri de fracționări de doză simulate în acest studiu Protocolul de radioterapie Conventional Hipofractionat 5-zile Hipofractionat 6-zile Hiperfractionat Mod de fracționare 2 Gy/zi; 5 zile/sapt; 7 saptamani 2.2 Gy/zi; 5 zile/sapt; 6 saptamani 2.2 Gy/day; 6 zile/sapt; 5 saptamani 1.2 Gy/x 2 pe zi; 5 zile/sapt; 7 saptamani Figura 1 prezintă cele patru curbe de supraviețuire celulară pentru o tumoră cu hipoxie redusă (9 mmhg), unde tratamentul hiperfractionat prezintă cel mai bun control asupra CSC. Acest nivel de hipoxie se poate controla și cu ajutorul radioterapiei hipofractionate. Dintre cele două protocoale hipofracționate, cel accelerat (6 zile pe săptămână) oferă același control tumoral după 68.2Gy ca și tratamentul de 5 zile pe săptămână, doar că într-un timp de tratament redus (35 vs 42 zile). Cancer stem cell population 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E+00 Conventional RT Hypofractionated RT 6d Hypofractionated RT 5d Hyperfractionated RT Treatment time (days) Figura 1. Efectul diferitelor protocoale de tratament cu radiație asupra populației de celule stem canceroase întro tumoră cu hipoxie scăzută (po 2 = 9 mmhg). Tumorile cu nivel ridicat al hipoxiei însă, necesită doze mai mari de radiație (Figura 2) și un protocol mai agresiv pentru un control mai eficient al celulelor stem canceroase. Un astfel de protocol este tratamentul hiperfracționat, care este singurul protocol din cele patru simulate care este capabil să controloze tumora în timp clinic util (7 săptămâni). Protocolul hipofracționat-accelerat nu mai concurează cu radioterapia hiperfracționată datorită creșterii fracției de celule radiorezistente care își are originile în cele două subpopulații de celule: hipoxice și celule stem canceroase. 24

25 Cancer stem cell population 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E+00 Conventional RT Hypofractionated RT 6 days Hypofractionated RT 5 days Hyperfractionated RT Treatment time (days) Figura 2. Efectul diferitelor protocoale de tratament cu radiație asupra populației de celule stem canceroase întro tumoră cu hipoxie moderată (po 2 = 6 mmhg). Având în vedere faptul că celulele stem canceroase prezintă radiorezistență ridicată (Marcu 2016c), deci au nevoie de terapii țintite pentru a obține un control tumoral, am făcut un pas în plus în optimizarea tratamentului și am investigat agenții care au acțiune specifică asupra CSC. Un astfel de agent cu rezultate in vitro promițătoare este ATRA (All-trans-retinoic acid) care are potențialul de a induce diferențierea celulelor CSC, redistribuirea celulelor în ciclul celular (prin arest celular) și moarte celulară prin apoptoză. Pentru a contribui la datele limitate din literatură, în această etapă am simulat efectele produse de ATRA asupra tumorii virtuale ORL și am evaluat răspunsul tumorii la tratamentul hiperfracționat. Agenții cu acțiune țintită asupra celulelor CSC, incluzând ATRA, reprezintă o abordare inovativă în managementul cancerului, motiv pentru care aceștia sunt actualmente investigați în studii pre-clinice (rezultate prezentate la numeroase conferințe și seminarii: Karolinska Institutet, Stockholm, Sept 2016; Ist European Congress of Medical Physics (ECMP), Athens, 1-4 Sept 2016; Sansom Institute for Health Research, Division of Health Sciences, University of South Australia, Adelaide, 21 May 3 June 2016; The 14 th International Workshop on Radiation Damage to DNA, Melbourne, Australia, March 2016; ICTR-PHE Conference, Geneva, Switzerland, Febr 2016). ATRA este un membru al familiei retinoizilor și un metabolit activ al vitaminei A. Retinoizii prezintă un efect semnificativ asupra creșterii celulare, diferențiere și apoptoză, influențând multiple căi de semnalizare care sunt implicate în păstrarea statusului celulelor stem. Atât studii pre-clinice in vitro cât și in vivo au demonstrat că ATRA prezintă efecte puternice asupra CSC prin inducerea arestului celular datorită complexității nivelului de deteriorare a ADN-ului și prin inducerea apoptozei (Lim 2012, Bertrand 2014). Efectele ATRA ca și agent țintit pentru CSC au fost implementate în această etapă în modelul dezvoltat de-a lungul proiectului. Mecanismul de diferențiere a fost simulat prin reducerea probabilității de diviziune simetrică de la valoarea inițială de 1.9% la 0.1% în mod treptat. Arestul celular în faza G2 a ciclului celular a fost simulat pe baza rezultatelor din literatură (Bertrand 2014). Bertrand et al au arătat că administrarea ATRA înainte de radioterapie a condus la creșterea populației de CSC în faza G2/M pentru aproximativ 48h, cu un peak de 80% celule blocate după 24h de la administrarea radioterapiei. Studii în șoareci au arătat că efectul ATRA asupra CSC este dependent de doză. În model am considerat efectul a diferite doze de ATRA care conduc la procente variate de celule blocate în faza G2 (de la 10% la 90% arest celular). În condiții 25

26 normale, celulele sunt blocate în faza G2 pentru a urma procesul de reparare a leziunilor ADNului. În cazul interacțiunii cu ATRA, o parte din celulele blocate nu sunt capabile să-și repare leziunile, motiv pentru care vor urma calea apoptozei. Pentru a simula populația de celule care este eliminată prin apoptoză, am realizat un studiu de sensibilitate cu valori cuprinse între 10% și 90%. Astfel, cele trei categorii de variable care au fost modelate cu privire la efectul ATRA asupra CSC sunt: Diferențierea, prin varierea probabilității de diviziune simetrică (0.1% - 1.9%); Arestul celular, prin varierea procentului de celule blocate in G2 (10% - 90%) Apoptoza, prin varierea procentului de celule blocate in G2 care mor prin apoptoză (10% - 90%). Pentru ilustrarea impactului probabilității de diviziune simetrică (SDP) asupra subpopulației de celule CSC am simulat un scenariu prin care am considerat o tumoră ORL cu un nivel mediu al hipoxiei și diferite valori ale SDP (Figura 3). SDP a fost variat de la valoarea initială de 1.9% până la un procent care a rezultat într-o creștere tumorală necontrolată (30% SPD). Scopul a fost determinarea timpului de tratament necesar pentru o eradicare tumorală completă și evaluarea relației cantitative dintre probabilitatea de diviziune simetrică și procentul de CSCs în tumoră. 1.9% sym div 10% sym div 20% sym div 30% sym div Percentage of CSC during treatment Treatment time (days) Figura 3. Impactul probabilității de diviziune simetrică supra subpopulației CSC într-o tumoră ORL cu nivel mediu al hipoxiei Eradicarea tumorală nu s-a obținut în limitele timpului clinical de tratament alocat (7 săptămâni) pentru procentajele de SDP ale CSC mai mari de (sau egale cu) 10%. Pentru valorile procentelor egale sau mai mari de 30%, tumora pare să fie necontrolabilă, cel puțin prin tehnica de tratament simulată. Comparând valorile platoului din Figura 3, se poate observa că pentru fiecare creștere cu 10% a probabilității de diviziune simetrică a CSC, are loc o creștere de 10% a procentului de celulele CSC (în special pentru tumorile cu SDP mai mare decât 10%). 26

27 Efectul ATRA asupra celulelor stem canceroase După cum am menționat mai sus, trei proprietăți de bază ale ATRA au fost simulate: diferentierea (ATRA 1), arestul celular (ATRA 2), și inducerea apoptozei (ATRA 3). Atât mecanismele independente cât și combinația acestora (ATRA1+2+3) a fost studiată (Figura 4). RT-only RT ATRA 1 RT ATRA 1+2 RT ATRA CSC subpopulation 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 Figura 4. Curbe de supraviețuire celulară ale subpopulatiei CSC după tratamentul hiperfractionat și efectul ATRA pentru 0.1% SDP 1.E Treatment time (days) Cum diferentierea duce la o reducere a valorii SDP, efectul acestui mecanism se poate deduce din Figura 3. Pentru o tumoră care prezintă o valoare de 20% a SDP, daca diferențierea reduce acesată valoare la 10%, Figura 3 arată că efectul indus de ATRA echivalează cu o deescaladare a dozei de radiație cu 32%. Aplicând același principiu asupra tumorii cu un procent de 30% SDP prezentat în Figura 3, se observă o scădere cu 10% datorită mecanismului de diferențiere indus de ATRA, ducând astfel la controlul unei tumori care înainte a fost necontrolabil. Tumora ORL studiată în acest model in the employed model prezintă o valoare naturală mică a SDP de 1.9%, care anulează efectul de diferențiere indus de ATRA în această tumoră. Astfel, după cum se arată în Figurile 4 și 5, nu există diferență semnificativă a răspunsului subpopulației CSC când SDP variază între 1.9% și 0.1%. Curbele de supraviețuire din Figura 4 care reprezintă simularea cu radiație (RT) (fără ATRA) și RT+ATRA1 arată o diferență minimală (3 fracții de doză). Figura 5 ilustrează efectul diferențierii combinate cu efectul arestului celular, cu și fără apoptoză. Diferențele în doza totală pentru a controla subpopulatia CSC în tumori în care s-a variat SDP sunt de 1.1Gy cu arest celular și 1.2Gy cu arest celular și apoptoză. Efectul diferențierii prin reducerea SDP a fost marginal, datorită valorii inițiale mici a parametrului SDP de 1.9%. Acest parametru are avea un impact mai mare în tumori cu valori inițiale largi ale SDP, similar scenariului ipotetic prezentat în Figura 5. Datorită acestui rezultat, toate simulările ulterioare au fost procesate cu valoarea de 1.9% SDP, păstrând astfel parametrul inițial de cinetică tumorală. 27

28 Este important însă de menționat, că prin simplul arest celular în faza G2, ATRA inhibă proliferarea, inducând astfel o îmbunătățire semnificativă în răspunsul CSC la tratamentul hiperfracționat. Prin arest celular (ATRA1+2), obținem o diferență de 12 fracții de doză comparativ cu tratamentul cu radiație (fără ATRA), pentru același răspuns tumoral. Acest rezultat corespunde unei de-escaladări a dozei de 14.4Gy. De asemenea, efectul apoptozei descrește doza totală necesară eradicării CSC cu alți 10.8Gy % SDP 0.9% SDP 1.9% SDP Dose (Gy) ATRA 1+2 ATRA Figura 5. Efectul diferențierii când acest mecanism este combinat cu arest celular fără apoptoză (ATRA 1+2) și cu apoptoză (ATRA 1+2+3) Efectul ATRA asupra redistribuției celulare în fazele ciclului celular Pentru a investiga dependența de doză a răspunsului CSC la ATRA, diferite scenarii implicând diferite procente ale CSC în faza G2 au fost simulate, pentru un procent prestabilit al celulelor apoptotice dintre celulele blocate. Valori extreme ale procentelor (10% și 90%) au fost modelate pentru a evalua atât scenariul cel mai puțin optim cât și cel mai bun. CSC subpopulation 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01 1.E+00 10% arrest 50% arrest 90% arrest Treatment time (days) Figura 6. Efectul arestului celular indus de ATRA asupra subpopulației de CSC 28